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CN111363056B - 沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111363056B CN202010187236.6A CN202010187236A CN111363056B CN 111363056 B CN111363056 B CN 111363056B CN 202010187236 A CN202010187236 A CN 202010187236A CN 111363056 B CN111363056 B CN 111363056B
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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：(1)、将沼泽红假单胞菌GJ‑22的种子液发酵培养，获得发酵液；(2)、将发酵液离心处理取上清液，过滤，醇沉、离心收集沉淀，获得粗多糖；(3)、采用蛋白酶酶解和Sevag法去除蛋白，将去除蛋白的粗多糖进行透析处理以去除小分子物质和有机溶剂，获得多糖样品；(4)、将多糖样品经过阴离子交换柱和分子排阻色谱柱纯化，获得沼泽红假单胞菌GJ‑22胞外多糖。本发明的沼泽红假单胞菌GJ‑22胞外多糖的制备方法，通过对沼泽红假单胞菌GJ‑22进行发酵培养，醇沉，分离纯化获得沼泽红假单胞菌GJ‑22胞外多糖，表达稳定，应用于烟草和水稻的促生和病虫防治，效果显著。

Description

沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，特别地，涉及一种沼泽红假单胞菌胞外多糖。此外，本发明还涉及一种上述沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法以及上述沼泽红假单胞菌胞外多糖在植物促生以及病害防控等方面的应用。
背景技术
对于植物病害的防治，目前主要还是以化学防治为主，但由于抗药性增强以及发现不及时，农药施用不科学，农药施用剂量与次数严重超标，引起环境污染和农产品质量安全等重大问题。近年来，生物防治以其无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点，在植物病虫害防治中越来越受到人们的重视。微生物源生物农药发展较快，但对于微生物中具体是哪部分对植物促生和抑制病虫害起作用的研究很少，这对于开发具有针对性、高效的生物农药来说非常不利。
微生物胞外多糖是由某些细菌、真菌在各种碳源上生长过程中合成的，并分泌到细胞外的水溶性或水不溶性多糖物质。相比于植物多糖和海洋藻类多糖，微生物胞外多糖具有生长周期短、不受气候影响、生产工艺简便、成本低、便于大量制备等优点。微生物胞外多糖普遍具有无毒、结构独特、理化性质稳定等特点，有的多糖具有抗氧化、免疫抑制、免疫促进、抗肿瘤等活性，在医药、化工、石油开采以及环境保护等方面被广泛应用，如果能开发一种可以用于植物促生以及生物防治的微生物胞外多糖去替代被滥用的化学农药将大有裨益。
发明内容
本发明提供了一种沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用，以解决现有生物防治具体活性成分不明确导致生防功效尚不够好的技术问题。
根据本发明的一个方面，提供一种沼泽红假单胞菌胞外多糖，所述胞外多糖的结构式为：
Figure 214840DEST_PATH_IMAGE001
。
进一步地，所述胞外多糖由沼泽红假单胞菌GJ-22（RhodopseudomonaspalustrisGJ-22）发酵液中醇沉提取得到。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
1）、将沼泽红假单胞菌GJ-22（Rhodopseudomonas palustris GJ-22）的种子液在发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；
2）、将发酵液离心处理取上清液，采用膜过滤除去上清液中的悬浮质后进行醇沉，离心收集沉淀，将沉淀冷冻干燥获得粗多糖；
3）、采用蛋白酶酶解法和Sevag法去除粗多糖中的蛋白，将去除蛋白的粗多糖用蒸馏水进行透析处理以去除小分子物质和有机溶剂，获得多糖样品；
4）、将多糖样品依次经过阴离子交换柱和分子排阻色谱柱进行纯化，获得所述沼泽红假单胞菌胞外多糖。
进一步地，步骤1）中，发酵培养基的成分包括：（NH4）2SO4 0.1g，MgSO4 0.02g，Na2CO3 0.5g，K2HPO4 0.05g，NaCl 0.02g，酪蛋白氨基酸0.2g，琼脂 1.5g，pH值为7.0~7.5；
所述发酵培养的条件为：发酵培养温度为30℃，光照强度为7000lx～8000lx，培养时间为10天。
进一步地，步骤2）中，所述醇沉包括以下步骤：加入过滤后上清液两倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃条件下静置24h，
所述离心收集采用离心力10000~13000g，优选为10000g，在4℃条件下离心20min。
进一步地，步骤3）中，蛋白酶酶解法的步骤包括：将步骤获得的粗多糖溶于去离子水中，加入木瓜蛋白酶；调节pH为6.0~6.2，60℃水浴下处理6h，水浴处理期间每1个小时振荡一次，混匀样品，冷却后，加入两倍体积无水乙醇，静置后离心收集沉淀。
进一步地，所述透析处理采用截留分子量为8000 D～14000 D的透析袋。
进一步地，步骤4）中，所述阴离子交换柱采用Hi Trap Q Sepharose HighPerformance，
所述分子排阻色谱柱采用Seharose CL-6B层析柱。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述的沼泽红假单胞菌胞外多糖在促进烟草或水稻生长中的应用。
根据本发明的再一个方面，还提供了一种上述的沼泽红假单胞菌胞外多糖在防治烟草花叶病毒或水稻稻瘟病中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的制备方法，通过对沼泽红假单胞菌GJ-22进行发酵培养，醇沉，分离纯化获得沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖，其生产工艺简单，表达稳定，易于获得。本发明首次对于叶际生防菌胞外多糖进行研究，研究发现纯化后的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖能显著促进植物生长和增强植物抗病性，且促生长和抗病性优于沼泽红假单胞菌GJ-22，为生防菌剂的开发提供了一种可能性，将在农业领域发挥重要的应用价值。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的多糖阴离子交换柱洗脱曲线示意图；
图2是本发明优选实施例的Seharose CL-6B柱洗脱曲线示意图；
图3是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖分子量谱图示意图；
图4是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖单糖组成示意图；
图5是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖GC-MS示意图；
图6是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖氢谱谱图；
图7是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖碳谱谱图；
图8是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖DEPT135核磁谱图；
图9是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖HH-COSY谱图；
图10是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖HMBC谱图；
图11是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖NOESY谱图；
图12是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖处理植物后鲜重图；
图13是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖诱导烟草抵抗TMV病毒粒子检测图；以及
图14是本发明优选实施例的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖诱导水稻抵抗稻瘟病斑检测图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由下述所限定和覆盖的多种不同方式实施。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备纯化
本发明的微生物为沼泽红假单胞菌GJ-22，分类命名为红假单胞菌（Rhodopseudomonas sp.），是一种叶际生防菌，从水中分离纯化得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：17356，保藏单位地址位于中国北京。
本实施例中，沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
1）、将沼泽红假单胞菌GJ-22的种子液在发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；种子液的获得方法为：将沼泽红假单胞菌GJ-22经过平板活化后，挑取单菌落进行种子培养，4天后得到种子液。发酵培养的条件为：以10%接种量接种到发酵培养基，发酵培养温度为30℃，光照强度为7000lx～8000lx，培养时间为10天。
2）、将发酵液离心处理取上清液，离心的条件为离心力15000g，4℃下离心50min，离心的目的是分离残留的菌体和不溶性杂质；上清液采用膜过滤除去悬浮质后进行醇沉，离心收集沉淀，将沉淀冷冻干燥获得粗多糖；膜优选为0.45μm的膜，用于过滤掉离心后的上清液中的非常微小的悬浮颗粒物。
3）、采用蛋白酶酶解法和Sevag法去除粗多糖中的蛋白，将去除蛋白的粗多糖用蒸馏水进行透析处理以去除小分子物质和有机溶剂，获得多糖样品；
4）、将多糖样品依次经过阴离子交换柱和分子排阻色谱柱进行纯化，获得沼泽红假单胞菌胞外多糖。
本发明的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的制备方法，通过对沼泽红假单胞菌GJ-22进行发酵培养，醇沉，分离纯化获得沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖，其生产工艺简单，表达稳定，易于获得。本发明首次对于叶际生防菌胞外多糖进行研究，研究发现纯化后的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖能显著促进植物生长和增强植物抗病性，且促生长和抗病性优于沼泽红假单胞菌GJ-22，为生防菌剂的开发提供了一种可能性，将在农业领域发挥重要的应用价值。
本实施例中，步骤1）中，发酵培养基的成分包括：（NH4）2SO4 0.1g，MgSO4 0.02g，Na2CO3 0.5g，K2HPO4 0.05g，NaCl 0.02g，酪蛋白氨基酸 0.2g，琼脂 1.5g，pH值为7.0~7.5。本实施例的发酵培养基加入了酪蛋白氨基酸，提高了胞外多糖的产量。
本实施例中，步骤2）中，醇沉具体包括以下步骤：加入过滤后上清液两倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃条件下静置24h，醇沉后离心收集沉淀是采用离心力10000~13000g，在4℃条件下离心20min，优选离心力为10000g。沉淀优选采用无水乙醇洗涤三次，除去其中的杂质，然后冷冻干燥获得粗多糖。通过醇沉的方式收集粗胞外多糖，提取的多糖纯度更高，结构更完整和稳定。
本实施例中，步骤3）中，蛋白酶酶解法去蛋白的步骤包括：将步骤2）获得的粗多糖溶于适量的去离子水中（去离子水用量需使粗多糖全部溶解），加入木瓜蛋白酶；调节pH为6.0~6.2，60℃水浴下处理6h，水浴处理期间每1个小时振荡一次，混匀样品，冷却后，加入两倍体积无水乙醇，静置后离心收集沉淀。木瓜蛋白酶能够在酸性，中性和碱性条件下分解蛋白质，具有蛋白酶和酯酶的活性，对细菌胞外多糖具有较强的水解能力，且对胞外多糖的结构不会产生破坏作用，使提取的胞外多糖的含量较高。
Sevag法去蛋白的步骤包括：将经过蛋白酶处理的多糖溶于适量去离子水中（去离子水用量需使多糖全部溶解），加入1/4（v/v）sevag试剂（氯仿：正丁醇=5:1）。剧烈震荡2h，10000g离心10min，去除水相和有机相交界处变性蛋白。取水相重复操作，直至交界处无明显蛋白。
本实施例中，步骤3）中，透析处理采用截留分子量为8000 D～14000 D的透析袋。具体操作为：将去除完蛋白的多糖装于截留分子量为8000~14000D的透析袋中，用蒸馏水透析2天，每4h换一次水，去除小分子化合物和有机溶剂，透析结束后，将样品减压浓缩，冷冻干燥，获得多糖样品。沼泽红假单胞菌胞外多糖的分子量在10KD 左右，因此选择截留分子量为8000D-14000D的透析袋。
本实施例中，步骤4）中，阴离子交换柱采用Hi Trap Q Sepharose HighPerformance，分子排阻色谱柱采用Seharose CL-6B层析柱。
阴离子交换柱纯化的具体操作为：将蛋白脱除的多糖样品用适量蒸馏水溶解后，过阴离子交换柱进行纯化。阴离子交换柱为 Hi Trap Q Sepharose High Performance（1.6×2.5 cm,GE Healthcare），上样量为5 mL，上样浓度为20mg/mL，流速为5mL/min，2 mL离心管进行收集。先用Tris-HCl（20Mm，pH 7.60）洗涤两个柱体积，再用0.5 M Tris-HCl 和0.5 M NaCl 梯度洗脱。采用苯酚-硫酸法逐管检测多糖含量，以收集的管数为横坐标，各管在490nm下的吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，如图1所示。合并含糖量相同的管数，用蒸馏水透析2天去除小分子物质，将透析液减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化后的组分。SeharoseCL-6B 柱层析纯化的具体操作为：将经过阴离子交换柱纯化后的组分采用平衡液溶解，平衡液采用洗脱缓冲液（20mM PBS），配制为20mg/mL多糖溶液，离心去除不溶部分，上清经过0.22μm膜过滤后，用注射器推入进样口，上样量为：2 mL。使用洗脱缓冲液洗脱2个体积，自动收集样品。蒸馏水中透析2天，冷冻干燥，得到纯化后的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖。采用苯酚-硫酸法检测，得到洗脱曲线，如图2所示。
由图1可知，通过阴离子交换柱洗脱，洗脱峰为一个单峰，由图2可知，通过Seharose CL-6B柱洗脱，洗脱峰也为一个单峰，由此可以得出获得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖纯度比较高。
实施例2
沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的结构鉴定
取实施例1制备得到的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖进行分子量鉴定，包括以下步骤：
（1）标准品分子量标准曲线的制作：以不同相对分子质量的葡聚糖（Mw1152、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800）作为标准品（Sigma-Aldrich公司），用高效液相色谱仪（岛津LC-10A），示差折光检测器进行检测，色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱8×300mm（Borui Saccharide, Biotech. Co. Ltd.）；以保留时间为横坐标，相对分子质量为纵坐标，绘制单糖标准品的标准曲线。
（2）样品的分子量的测定：精密称沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖（简称样品），将样品配制成5 mg/mL溶液，12000 rpm离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，将样品转置于1.8 mL进样小瓶中，进样量20 μl，用高效液相色谱仪（岛津LC-10A），示差折光检测器对多糖分子量及纯度进行测定，色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱8×300mm（BoruiSaccharide, Biotech. Co. Ltd.）。
根据系列葡聚糖标准品的分子量，以标准葡聚糖分子量对数LogMW 对样品出峰时间进行回归处理，得到葡聚糖标准曲线，然后根据样品保留时间，计算样品的分子量。
图3是测得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的分子量谱图，将所测得样品的保留时间代入单糖标准品的标准曲线，计算得到样品的相对分子量为10026D。
取实施例1制备得到的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖进行单糖组分分析，包括以下步骤：
（1）多糖的完全水解：准确称取沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖50mg，溶于3mL 2 M三氟乙酸中，在氮气保护下110℃反应6h，水解液旋转蒸发后，加入少量甲醇减压蒸干，重复5次，去除残留的TFA，加入少量蒸馏水溶解，冻干，得到完全水解后的单糖样品；
（2）多糖乙酰化：将步骤（1）得到的水解的单糖样品加入2mL双蒸水，100mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110℃烘箱烘干，然后加入1 mL乙酸酐乙酰化，100℃反应1h，冷却后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4次，以除去多余的醋酐，将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，重复5次，氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10 mL。
（3）多糖组分分析方法：将步骤（2）中得到的产物采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱质谱联用仪测定乙酰化产物样品进行分析，GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30*0.25*0.25mm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。得到的胞外多糖的单糖组成图如图4所示，由图4可知沼泽红假单胞菌GJ-22由甘露糖和葡萄糖两种单糖组成。
取实施例1制备得到的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖进行甲基化分析，具体方法包括以下步骤：
（1）甲基化反应：取沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖10 mg加入2mL无水二甲基亚砜充分溶解，将反应瓶内充满氮气，室温下静置30min，后加入10 mg NaOH，再次充满氮气，室温下，磁力搅拌条件下反应1h，后加入0.5mL碘甲烷，充入氮气，室温下继续反应1h，反应结束后，向反应管中加入0.5mL蒸馏水终止反应，用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，干燥后的样品继续甲基化，反应结束后，加入3mL蒸馏水终止反应，用三氯甲烷萃取三次，每次2mL，后合并萃取液，再用蒸馏水洗涤两次，旋转蒸发至干，后加入少量蒸馏水，冷冻干燥，此步骤重复两次，
（2）糖醇甲基乙酸化：将步骤（1）得到的完全甲基化后的样品5mg溶于2 mL 2 MTFA中，在氮气保护下100℃反应6 h，冷却后，减压蒸干，加入3mL甲醇，再旋蒸至干，重复三次，样品经过氮吹仪吹干，加入0.5mL吡啶，90℃反应0.5h，再加入0.5 mL醋酸酐，90℃反应4h，反应结束后，将样品用氮气吹干，即得到完全酸水解的糖醇甲基乙酸酯，样品经过二氯甲烷溶解，进行GC-MS分析，GC-MS分析条件：分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱质谱联用仪测定乙酰化产物样品； 得到GJ-22胞外多糖甲基化结果的GC-MS谱图如图5所示。
（3）GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30*0.25*0.25mm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。
取实施例1制备得到的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖进行NMR分析，具体包括以下内容：
NMR分析：取沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖100mg 溶于1mL D2O，进行600 MHz核磁共振仪分析。得到沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖氢谱谱图如图6所示，碳谱谱图如图7所示，DEPT135核磁谱图如图8所示，HH-COSY谱图如图9所示，HMBC谱图如图10所示，NOESY谱图如图11所示。
由图6、7、8、9、10和图11可得出，NMR分析测定的结果如下：
（1）1H NMR：由样品氢谱谱图分析可知，氢谱信号主要集中在3.0ppm～5.5ppm之间，δ3.2ppm～4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.23、5.10、5.06、5.04、5.01、4.85的信号峰集中分布在4.3ppm～5.5ppm区域内；
（2）13C NMR：由样品的碳谱谱图分析可知，碳谱信号主要集中在60ppm～120ppm之间，通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰，103.45、101.84、99.51，异头碳区域主要在，93ppm～105ppm之间；
（3）2D NMR：DEPT135：由样品的DEPT135谱图分析可知，66.86ppm、62.26ppm峰为倒峰，表明为C6的化学位移，且66.86ppm处的峰向低场迁移，表明存在取代；
（4）HH-COSY：通过HH-COSY，H1-2的信号为5.23/4.06；H2-3的信号为4.06/3.86；H3-4的信号为3.86/3.79；H4-5的信号为3.79/3.65；H5-6a的信号为3.65/3.71，推断出H1，H2，H3，H4，H5，H6a分别为5.23、4.06、3.86、3.79、3.65、3.71其H6b为3.82，对应的碳谱为δ101.89、79.67、71.62、67.74、74.63、62.16；
（5）HMBC：→3-Man-1→的异头氢与→2-Man-1→的C2有相关峰，表明该多糖存在→3-Man-1→2-Man-1→；
→2-Man-1→的异头氢与→2,6-Man-1→的C2有相关峰，表明该多糖存在→2-Man-1→2,6-Man-1→；
→2,6-Man-1→的异头氢与自身的C2有相关峰，表明该多糖存在→2,6-Man-1→2,6-Man-1→；
因此我们可以推出：→3-Man-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2,6-Man-1→的糖链接方式；
（6）NOESY：Man-1→的异头氢与→6-Man-1→的H6b有相关峰，表明存在Man-1→6-Man-1→；
→6-Man-1→的异头氢与→2,6-Man-1→的H6b有相关峰，表明存在→6-Man-1→2,6-Man-1→；
结合甲基化分析和NMR分析，得出实施例1制备得到的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖的结构式为：
Figure 29212DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明鉴定获得了从沼泽红假单胞菌GJ-22中提取的胞外多糖的结构，使得生物防治的防控活性成分更加明确化。通过对沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖进行全面、系统性的研究，为沼泽红假单胞菌GJ-22功能与结构之间的构效关系提供基础理论。并且沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖生产方便，效果稳定，适宜大规模生产制备。
沼泽红假单胞菌胞外多糖的生防活性及应用
实施例3
将实施例1制得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖配制成1g/L的溶液，均匀的喷施于移栽7天烟草叶面，每天早晚各喷一次，保持湿润，7天后测量植株鲜重，其中以沼泽红假单胞菌GJ-22的发酵液上清液、发酵培养基和水分别为空白试验。
实施例4
将实施例制得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖配制成1g/L的溶液，均匀的喷施于移栽14天水稻叶面，每天早晚各喷一次，保持湿润，7天后测量植株鲜重，其中以沼泽红假单胞菌的发酵液上清液、发酵培养基和水分别为空白试验。
图12为实施例3和实施例4中的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖处理烟草、水稻后的鲜重图，沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖以EPS表示，沼泽红假单胞菌的发酵液上清以Fermentation表示，发酵培养基以medium表示，水以ddH2O表示，烟草以Tobacco表示，水稻以Rice表示。由图12可知沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖能显著促进烟草和水稻的生长，其促生效果优于沼泽红假单胞菌的发酵液上清液以及发酵培养基。
实施例5
将实施例1制得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖配制成1 g/L的溶液，喷施于6叶的健康的烟草叶片表面，第2天摩擦接种TMV病毒粒子，接种后第1天，第2天，第3天，第4天提取植物RNA，测定植物中TMV病毒粒子数量，如图13所示，以沼泽红假单胞菌发酵液上清液和水为空白试验。
由图13显示，沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖能显著增强烟草对于病毒TMV的抵抗能力。
实施例6
将实施例1制得的沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖配制成1 g/L的溶液，喷洒于生长2周的健康的水稻叶片上，第2天喷洒稻瘟孢子悬浮液至水稻叶片上，置于光暗交替的培养箱中培养，观测喷洒稻瘟孢子悬浮液的第7天、第9天、第11天、第13天水稻叶片病斑数量，如图14所示，以沼泽红假单胞菌发酵液上清液和水为空白试验。
由图14显示，沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖能显著增强水稻对于稻瘟菌的抑制效果。
由实施例3~6可得出：沼泽红假单胞菌GJ-22胞外多糖可应用于烟草和水稻的促生，亦可应用于烟草花叶病毒和稻瘟病的防治。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种沼泽红假单胞菌胞外多糖，其特征在于，
所述胞外多糖由沼泽红假单胞菌GJ-22(Rhodopseudomonas palustris GJ-22)发酵液醇沉提取得到，沼泽红假单胞菌GJ-22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：17356。
2.根据权利要求1所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将沼泽红假单胞菌GJ-22(Rhodopseudomonas palustris GJ-22)的种子液在发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；
2)、将发酵液离心处理取上清液，采用膜过滤除去上清液中的悬浮质后进行醇沉，离心收集沉淀，将沉淀冷冻干燥获得粗多糖；
3)、采用蛋白酶酶解法和Sevag法去除粗多糖中的蛋白，将去除蛋白的粗多糖用蒸馏水进行透析处理以去除小分子物质和有机溶剂，获得多糖样品；
4)、将多糖样品依次经过阴离子交换柱和分子排阻色谱柱进行纯化，获得所述沼泽红假单胞菌胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
步骤1)中，发酵培养基的成分包括：(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4 0.02g，Na2CO3 0.5g，K2HPO40.05g，NaCl 0.02g，酪蛋白氨基酸0.2g，琼脂1.5g，pH值为7.0～7.5，
所述发酵培养的条件为：发酵培养温度为30℃，光照强度为7000lx～8000lx，培养时间为10天。
4.根据权利要求3所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
步骤2)中，所述醇沉包括以下步骤：加入过滤后上清液两倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃条件下静置24h，
所述离心收集采用离心力10000～13000g，在4℃条件下离心20min。
5.根据权利要求4所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
所述离心收集采用离心力10000。
6.根据权利要求3所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
步骤3)中，蛋白酶酶解法的步骤包括：将步骤2)获得的粗多糖溶于去离子水中，加入木瓜蛋白酶；调节pH为6.0～6.2，60℃水浴下处理6h，水浴处理期间每1个小时振荡一次，混匀样品，冷却后，加入两倍体积无水乙醇，静置后离心收集沉淀。
7.根据权利要求3所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
所述透析处理采用截留分子量为8000D～14000D的透析袋。
8.根据权利要求3所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，
步骤4)中，所述阴离子交换柱采用Hi Trap Q Sepharose High Performance，
所述分子排阻色谱柱采用Seharose CL-6B层析柱。
9.根据权利要求1所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖在促进烟草或水稻生长中的应用。
10.根据权利要求1所述的沼泽红假单胞菌胞外多糖在防治烟草花叶病毒或水稻稻瘟病中的应用。
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