CN111349177B

CN111349177B - 一种融合抗菌肽cat的制备方法和应用

Info

Publication number: CN111349177B
Application number: CN202010175372.3A
Authority: CN
Inventors: 郭抗抗; 刘勇; 姬生跃; 张彦明
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-03-13
Also published as: CN111349177A

Abstract

本发明公开了一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明将CAT基因与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA‑CAT抗菌肽融合基因；之后分别用限制性内切酶双酶切XynA‑CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18质粒，连接，构建表达载体pUC18‑XynA‑CAT转化至大肠杆菌E.coli XL10‑Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；然后通过培养EXCT菌株，表达获得Xyn A‑CAT抗菌肽融合蛋白；最后应用Factor Xa蛋白酶酶切，纯化，获得融合抗菌肽CAT。融合抗菌肽CAT具有良好的抑菌活性，为在生物医药、畜牧生产等产业的应用奠定了基础。

Description

一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobialpeptides)是一类小分子多肽，是生物非特异性免疫防御系统的一个重要组成部分。第一个真正意义上的抗菌肽是1972年瑞典科学家GBoman等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到的一种抑制细菌生长的多肽，并将其命名为天蚕素抗菌肽(Cecropin)。抗菌肽通常由10～50个氨基酸残基组成，N端一般具有近乎完美的双亲螺旋结构，多数多肽的C端乙酰化，其对抗菌肽的抗菌活性具有重要作用。

天蚕素A(CecropinA)抗菌肽由37个氨基酸残基组成，分子质量大约为4kDa，不含半胱氨酸，无分子内二硫键的α螺旋肽。CecropinA抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑菌性能，如对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为明显。另外CecropinA抗菌肽具有抗病毒活性，对艾滋病病毒(HIV)的半抑制浓度(IC50)达到2-3μmol/L。同时它对肿瘤细胞也具有明显的抑制作用。另外，CecropinA抗菌肽还具有调节免疫，促中性粒细胞、T细胞的趋化以及促进伤口愈合等作用。因此CecropinA一直来受到很多科学家们的极高关注。

死亡素(Thanatin)是抗菌谱最广的抗菌蛋白之一，由21个氨基酸残基组成。它不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有良好的抑菌活性，而且对多种真菌也有良好的杀灭活性。其作用方式为阻断细胞膜上的呼吸链正常进行。一个Thanatin分子含2个Cys残基及由此形成的一个二硫桥，分子内有4个区域与良好的杀菌活性密切相关。

目前，国内外在利用基因工程工具生物合成抗菌肽方面开展了大量的研发工作，应用比较广泛的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、昆虫杆状病毒载体表达系统、以及哺乳动物细胞表达体系等。昆虫病毒载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生产；酵母表达系统不仅培养密度低，抗菌肽的表达量有限，而且抗菌肽表达酰胺化不完全，影响其抗菌活性，同时酵母表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点；枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶比较容易降解目的蛋白，并且给纯化目的蛋白带来困难；昆虫杆状病毒载体表达系统和哺乳动物细胞表达体系同样存在表达量较低、不易产业化等不足。

目前，细菌特别是大肠杆菌是以重组技术、工业规模生产蛋白质的主要宿主菌细胞。大肠杆菌具有诸多重要优点：基因组及遗传信息清楚，便于遗传操作并能保持工程菌株的稳定性；经短时间培养可获得高产率的产物；具有多种蛋白标签易于目的蛋白的纯化；培养细胞周期短且易于培养，生产成本低等优点。因此，提供一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种融合抗菌肽CAT的制备方法，具体步骤如下：

(1)将天蚕素与死亡素的杂合抗菌肽基因CAT与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA-CAT抗菌肽融合基因；所述XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

(2)用限制性内切酶EcoRI与PstI分别对XynA-CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18进行双酶切，酶切后连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；

(3)将步骤(2)构建的表达载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coli XL10-Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；

(4)培养步骤(3)获得的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌，获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；对XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行分离纯化，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；

(5)利用FactorXa蛋白酶切除XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的XynA蛋白标签，经纯化获得融合抗菌肽CAT；所述融合抗菌肽CAT的的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，步骤(1)采用固相亚磷酰胺三酯法合成XynA-CAT抗菌肽融合基因：在XynA对应核苷酸序列的N-末端添加亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列；在其C-末端连上FactorXa蛋白酶识别位点Ile-Asp-Gly-Arg和目的蛋白CAT的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。

进一步，步骤(4)通过培养重组大肠杆菌EXCT基因工程菌获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的具体步骤如下：将筛选的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌单克隆，接种到加有氨苄青霉素的LB培养基中，在温度37℃、转速200rpm条件下振荡培养9～10小时；再按3％的比例转接到新鲜LB培养基中，在温度28℃、转速200rpm下培养至菌液OD₅₉₅为0.7～0.9，用0.6mM的IPTG诱导后继续振荡培养9～11小时；低温离心收集菌体，加入裂解液，超声波破菌体后离心，取上清液，进行Ni-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白。

进一步，所述超声条件如下：超声功率为300w，超声3s，停3s，共50～60个周期。

所述的融合抗菌肽CAT在抑制细菌活性中的应用。

进一步，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌。

基于抗菌肽的组成特点，仅由氨基酸残基组成，基本化学修饰翻译后加工很少，因而本发明采用原核表达系统进行表达。抗菌肽对大肠杆菌有较强的细胞毒性，且分子量较小不易直接表达，本发明借助融合蛋白来封闭抗菌肽的细胞毒性。同时，使用大肠杆菌生物合成活性蛋白质的另一个突出不足是目的产物在宿主胞浆内容易形成无生物活性的不溶性包涵体；为了克服大肠杆菌表达体系容易形成包涵体的缺点，本发明通过引入融合蛋白标签的方式表达外源蛋白。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过XynA标签蛋白与融合抗菌肽CAT基因融合，以借助XynA蛋白来封闭融合抗菌肽CAT的细胞毒性，使融合抗菌肽的毒性减弱；

(2)本发明通过与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，由于XynA具有较高的水溶性，增强了其所融合的目的蛋白CAT的在后处理工艺中的可溶性。

(3)本发明以木聚糖酶XynA以及FactorXa蛋白酶的酶切位点的氨基酸序列作为融合标签，可以使FactorXa蛋白酶准确无误地切除融合标签，产生具有天然N端的目标蛋白CAT；通过Ni-NTA柱亲和层析、SephadexG-25脱盐以及FactorXa蛋白酶酶切等处理，最终获得蛋白CAT的纯度超过95％；

(4)本发明的表达系统构建方便易行，成本经济，为应用于医药、兽药、水产、饲料添加剂等产业替代抗生素奠定了一定的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明融合抗菌肽CAT制备工艺关键环节的Tricine-SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1为NEB公司蛋白marker#P7702；泳道2为大肠杆菌表达宿主菌E.coliXL10-Gold可溶蛋白上清部分；泳道3为EXCT基因工程菌可溶蛋白上清部分，箭头所示为XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；泳道4为分离纯化后的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白，箭头所示为XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；泳道5为应用FactorXa蛋白酶切除XynA蛋白标签的融合抗菌肽CAT，箭头所指为融合抗菌肽CAT；泳道6为纯化的融合抗菌肽CAT，箭头所指为融合抗菌肽CAT；

图2附图为本发明融合抗菌肽CAT对不同细菌的抑菌圈图；

其中，A为融合抗菌肽CAT对大肠杆菌的抑菌圈图；B为融合抗菌肽CAT对沙门氏菌的抑菌圈图；C为融合抗菌肽CAT对绿脓杆菌抑菌圈图；D为CAT对金黄色葡萄球菌的抑菌圈图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

CAT基因由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，载体pUC18购自Biovector公司，宿主细胞大肠杆菌E.coliXL10-Gold购自上海康朗生物科技有限公司。

实施例1XynA-CAT抗菌肽融合基因的人工合成

根据大肠杆菌的偏爱密码子优化木聚糖酶XynA和融合抗菌肽CAT的核苷酸序列，应用固相亚磷酰胺三酯法合成XynA-CAT抗菌肽融合基因：在XynA对应核苷酸序列的N-末端添加亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列；在其C-末端添加上FactorXa蛋白酶的识别位点Ile-Asp-Gly-Arg和目的蛋白CAT的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI酶切位点(GAATTC)及相应保护碱基(GTGC)和PstI酶切位点(CTGCAG)及相应保护碱基(GAGC)。

XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如下：

GTGCGAATTCATGCATCACCATCATCATCACATGAATCTKGATAATGAAAGAAGATATATTCAAATGTTTAAATTTAAAAAAAATTTTCTKGTTGGCCTKTCAGCAGCACTKATGTCAATTTCACTKTTTTCAGCAACAGCATCAGCAGCATCAACAGATTATTGGCAAAATTGGACAGATGGCGGCGGCATTGTTAATGCAGTTAATGGCTCAGGCGGCAATTATTCAGTTAATTGGTCAAATACAGGCAATTTTGTTGTTGGCAAAGGCTGGACAACAGGCTCACCGTTTAGAACAATTAATTATAATGCAGGCGTTTGGGCACCGAATGGCAATGGCTATCTKACACTKTATGGCTGGACAAGATCACCGCTKATTGAATATTATGTTGTTGATTCATGGGGCACATATAGACCGACAGGCACATATAAAGGCACAGTTAAATCAGATGGCGGCACATATGATATTTATACAACAACAAGATATAATGCACCGTCAATTGATGGCGATAATACAACATTTACACAATATTGGTCAGTTAGACAATCAAAAAGACCGACAGGCTCAAATGCAGCAATTACATTTTCAAATCATGTTAATGCATGGAAATCACATGGCATGAATCTKGGCTCAAATTGGGCATATCAAGTTCTKGCAACAGAAGGCTATAAATCATCAGGCTCATCAAATGTTACAGTTTGGATTGATGGCAGAAAATGGAAACTKTTTAAAAAAATTGAAAAAGTTGGCCAAAATATTAGAGATGGCATTATTGTTCCGATTATTTATTGCAATAGAAGAACAGGCAAATGCCAAAGAATGTAGCTGCAGGAGC；SEQ ID NO.1。

在SEQ ID NO.1中，加下划线部分为亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列，加粗部分为FactorXa蛋白酶的识别位点Ile-Asp-Gly-Arg，加波浪线部分为目的蛋白CAT的DNA序列，斜体加下划线部分EcoRI酶切位点(GAATTC)，斜体加粗部分为PstI酶切位点(CTGCAG)。

XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的氨基酸序列如下：

MHHHHHHMNLDNERRYIQMFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASAASTDYWQNWTDGGGIVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPFRTINYNAGVWAPNGNGYLTLYGWTRSPLIEYYVVDSWGTYRPTGTYKGTVKSDGGTYDIYTTTRYNAPSIDGDNTTFTQYWSVRQSKRPTGSNAAITFSNHVNAWKSHGMNLGSNWAYQVLATEGYKSSGSSNVTVWIDGRKWKLFKKIEKVGQNIRDGIIVPIIYCNRRTGKCQRM；SEQ ID NO.2。

在SEQ ID NO.2中，加下划线部分为亲和层析纯化标签6×His的氨基酸序列，加粗部分为FactorXa蛋白酶的识别位点Ile-Asp-Gly-Arg，加波浪线部分为CAT氨基酸序列。

实施例2pUC18-XynA-CAT表达载体的构建

用限制性内切酶EcoRI和PstI对XynA-CAT抗菌肽融合基因进行双酶切，并与相同方法处理的表达载体pUC18质粒连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；将所构建的载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coli XL10-Gold，用氨苄青霉素抗性平板筛挑选阳性转化子，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌。

实施例3XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的获得

(1)将筛选的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌单克隆，接种到添加有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃，摇速200rpm下振荡培养9～10小时；

(2)扩大培养：按3％的比例转接到新鲜LB培养基中，在温度28℃、转速200rpm下培养至菌液OD₅₉₅为0.7～0.9，应用0.6mM的IPTG诱导后继续振荡培养9～11小时；

(3)离心收集菌体：低温离心收集菌体，加入裂解液；超声波(功率300w下，超声3s，停3s，共50～60个周期)破菌体后离心，取上清液，用12％Tricine-SDS-PAGE进行检测，结果见图1泳道3。

其中，裂解液是由Tris-HCl缓冲液，pH8.0的CaCl₂溶液和pH8.0的NaCl溶液混合而成的反应体系；其用量为：在50ml混合体系中，Tris-HCl为20mM，NaCl为100mM，CaCl₂为2mM。

实施例4XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的纯化

用细菌裂解缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，250mmol/LNaCl，8mmol/L咪唑，pH8.0)将上述离心收集的工程菌菌体重悬后加入溶菌酶至终浓度为1g/L，放置冰浴中30min，超声波破碎，10000×g4℃离心30min，收集上清。利用AKTApurifier100系统和HisTrapTMFFcrude亲和层析处理上清，用清洗缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，250mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0)洗去杂质蛋白，再用洗脱缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，250mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱，对唯一的洗脱峰即XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行收集，并应用Tricine-SDS-PAGE检测，结果见图1泳道4。

实施例5应用FactorXa蛋白酶切除XynA蛋白标签

将收集到的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行脱盐处理，参照NEB公司FactorXa蛋白酶的工作条件(50mg融合蛋白底物加入1mg的FactorXa蛋白酶)，加入终浓度为2mmol/L的DTT与FactorXa蛋白酶，于23℃温育5小时，应用12％Tricine-SDS-PAGE进行电泳检测，结果见图1泳道5。

实施例6融合抗菌肽CAT的纯化

利用BandScan软件和蛋白条带灰度法检测XynA-CAT抗菌肽融合蛋白完全酶切后，将酶切样品应用HisTrapTMFFcrude进行亲和层析：先用平衡缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，180mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0)润洗亲和柱，之后酶切样品过柱，再收集穿过液(融合抗菌肽CAT)，上样结束后用清洗缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，180mmol/LNaCl，40mmol/L咪唑，pH8.0)进行洗涤，收集洗涤液。最后，以洗脱缓冲液(60mmol/LNa₃PO₄，180mmol/LNaCl，300mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱纯化XynA标签蛋白，保存于-20℃。应用Tricine-SDS-PAGE分析纯化后的融合抗菌肽CAT，结果见图1泳道6，分子量大小4.3kD，与蛋白marker#P7702条带浓度标准对比得出，融合抗菌肽CAT的浓度≥500mg/L。利用BandScan软件和蛋白条带灰度法测定可溶性目的蛋白占菌体总目的蛋白的80％以上。

经考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析，证实本发明制备的融合抗菌肽CAT，其蛋白纯度达90％以上。

融合抗菌肽CAT的核苷酸序列如下：

AAATGGAAACTKTTTAAAAAAATTGAAAAAGTTGGCCAAAATATTAGAGATGGCATTATTGTTCCGATTATTTATTGCAATAGAAGAACAGGCAAATGCCAAAGAATG；SEQ ID NO.3。

融合抗菌肽CAT的氨基酸序列如下：

KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIVPIIYCNRRTGKCQRM；SEQ ID NO.4。

实施例7融合抗菌肽CAT抑菌活性的鉴定

采用标准琼脂孔扩散法，以大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌株，将20μl在OD₅₉₅波长读数约为0.3的指示菌株悬浮液(OD₅₉₅≈0.3)与20ml温度为50℃左右的LB固体培养基摇匀后平铺于放置有牛津杯的平皿板，凝固后移去牛津杯，孔中加200μl纯化的融合抗菌肽CAT，37℃过夜培养，结果见图2和表1。

表1

指示菌株	抑菌圈直径(mm)
		大肠杆菌	25.6
沙门氏菌	23.5
		绿脓杆菌	15.8
金黄色葡萄球菌	26.3

图2和表1结果表明，本发明制备的融合抗菌肽CAT对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等都有良好的抑菌作用，所以其在生物医药、畜牧养殖等领域中具有潜在而广泛的应用价值。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 836

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtgcgaattc atgcatcacc atcatcatca catgaatctk gataatgaaa gaagatatat 60

tcaaatgttt aaatttaaaa aaaattttct kgttggcctk tcagcagcac tkatgtcaat 120

ttcactkttt tcagcaacag catcagcagc atcaacagat tattggcaaa attggacaga 180

tggcggcggc attgttaatg cagttaatgg ctcaggcggc aattattcag ttaattggtc 240

aaatacaggc aattttgttg ttggcaaagg ctggacaaca ggctcaccgt ttagaacaat 300

taattataat gcaggcgttt gggcaccgaa tggcaatggc tatctkacac tktatggctg 360

gacaagatca ccgctkattg aatattatgt tgttgattca tggggcacat atagaccgac 420

aggcacatat aaaggcacag ttaaatcaga tggcggcaca tatgatattt atacaacaac 480

aagatataat gcaccgtcaa ttgatggcga taatacaaca tttacacaat attggtcagt 540

tagacaatca aaaagaccga caggctcaaa tgcagcaatt acattttcaa atcatgttaa 600

tgcatggaaa tcacatggca tgaatctkgg ctcaaattgg gcatatcaag ttctkgcaac 660

agaaggctat aaatcatcag gctcatcaaa tgttacagtt tggattgatg gcagaaaatg 720

gaaactkttt aaaaaaattg aaaaagttgg ccaaaatatt agagatggca ttattgttcc 780

gattatttat tgcaatagaa gaacaggcaa atgccaaaga atgtagctgc aggagc 836

<210> 2

<211> 271

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met His His His His His His Met Asn Leu Asp Asn Glu Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Ile Gln Met Phe Lys Phe Lys Lys Asn Phe Leu Val Gly Leu Ser Ala

20 25 30

Ala Leu Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ser

35 40 45

Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val Asn Ala

50 55 60

Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly

65 70 75 80

Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr

85 90 95

Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu

100 105 110

Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val

115 120 125

Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val

130 135 140

Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Asn Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser

165 170 175

Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Ala Ile Thr Phe

180 185 190

Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser

195 200 205

Asn Trp Ala Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Lys Ser Ser Gly

210 215 220

Ser Ser Asn Val Thr Val Trp Ile Asp Gly Arg Lys Trp Lys Leu Phe

225 230 235 240

Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg Asp Gly Ile Ile Val

245 250 255

Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met

260 265 270

<210> 3

<211> 108

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaatggaaac tktttaaaaa aattgaaaaa gttggccaaa atattagaga tggcattatt 60

gttccgatta tttattgcaa tagaagaaca ggcaaatgcc aaagaatg 108

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg

1 5 10 15

Asp Gly Ile Ile Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys

20 25 30

Cys Gln Arg Met

35

Claims

1.一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将天蚕素与死亡素的杂合抗菌肽基因CAT与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA-CAT抗菌肽融合基因；所述XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

（2）用限制性内切酶EcoR I与Pst I分别对XynA-CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18进行双酶切，酶切后连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；

（3）将步骤（2）构建的表达载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coli XL10-Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；

（4）培养步骤（3）获得的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌，获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；对Xyn A-CAT抗菌肽融合蛋白进行分离纯化，获得纯化的Xyn A-CAT抗菌肽融合蛋白；

（5）利用Factor Xa蛋白酶切除Xyn A-CAT抗菌肽融合蛋白的XynA蛋白标签，经纯化获得融合抗菌肽CAT；所述融合抗菌肽CAT的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，步骤（1）采用固相亚磷酰胺三酯法合成XynA-CAT抗菌肽融合基因：在XynA对应核苷酸序列的N-末端添加亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列；在其C-末端连上Factor Xa蛋白酶识别位点Ile-Asp-Gly-Arg和目的蛋白CAT的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和Pst I酶切位点及相应保护碱基。

3.根据权利要求2所述的一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，步骤（4）通过培养重组大肠杆菌EXCT基因工程菌获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的具体步骤如下：将筛选的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌单克隆，接种到加有氨苄青霉素的LB培养基中，在温度37℃、转速200 rpm条件下振荡培养9~10小时；再按3%的比例转接到新鲜LB培养基中，在温度28℃、转速200rpm下培养至菌液OD₅₉₅为0.7～0.9，用0.6 mM的IPTG诱导后继续振荡培养9～11小时；低温离心收集菌体，加入裂解液，超声波破菌体后离心，取上清液，进行Ni-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，获得纯化的Xyn A-CAT抗菌肽融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，所述超声条件如下：超声功率为300w，超声3s，停3s，共50~60个周期。

5.权利要求1-4任一项所述的融合抗菌肽CAT在制备抑制细菌活性药物中的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌。