CN111343998A - 哺乳动物特异性的生长缺陷的虫媒病毒 - Google Patents
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Abstract
虫媒病毒携带改变的弗林蛋白酶切割位点，导致增强的对前体多聚蛋白(如prE2或prM)的切割。登革病毒粒子可在prM的第80‑130位氨基酸内具有氨基酸改变。寨卡病毒粒子可在弗林蛋白酶切割位点处和/或其周围的氨基残基处具有改变。该病毒可在昆虫细胞中产生。该病毒在哺乳动物细胞中不会形成子代病毒。
Description
技术领域
本发明总体上涉及虫媒病毒，一小群在昆虫细胞和人类细胞中具有独特和不寻常的复制特性的少数病毒。本发明涉及突变的虫媒病毒及其作为免疫原的用途。在某些方面，本发明涉及改变的(altered)虫媒病毒，其在哺乳动物宿主细胞中不再复制，但继续在昆虫细胞中复制并可从中收获，仍继续在哺乳动物免疫系统中表达并向哺乳动物免疫系统呈递虫媒病毒抗原。
本发明涉及病毒的虫媒病毒科。虫媒病毒的一个基本特性是在哺乳动物和昆虫细胞中复制。许多虫媒病毒通过蜱或蚊子传播给哺乳动物。在一种分类方案下，虫媒病毒包括黄病毒属(Flavivirus)、甲病毒属(Alphavirus)和正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)。在另一种分类方案下，虫媒病毒包括布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。虫媒病毒的实例包括非洲猪瘟病毒(African Swine Fever virus)、蜱传脑炎病毒(Tick-borneEncephalitis virus)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus)、科罗拉多蜱热病毒(Colorado Tick Fever virus)、马脑病病毒(Equine Encephalosis virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、登革热病毒(Dengue virus)(DV)、寨卡病毒(Zika virus)(ZV)和西尼罗病毒(West Nile virus)。
已经研究了黄病毒，部分是由于人类病理，参见例如Gubler&Kuno,eds.:Dengueand Dengue Hemorrhagic Fever.Wallingford,CAB International,1997；和Porterfield；Exotic Viral Infections.Chapman and Hall Medical,London,1995。
黄病毒基因组由单个线性、单链、正义RNA组成。正链RNA感染合适的宿主细胞。总基因组可为10至11kb。没有3’多聚腺苷酸化。5’端有一个甲基化帽。
黄病毒基因组不含为宿主核糖体提供翻译起始位点的内部核糖体进入位点(IRES)。相反，黄病毒采用核糖体扫描开始蛋白质合成。
黄病毒病毒体可以是直径为40-65nm的球体。在脂质包膜下是直径约为25-30nm的二十面体衣壳包衣。
DV(1-5型)、黄热病病毒(Yellow Fever virus)、日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitis virus)、蜱传脑炎病毒和西尼罗病毒是人类中具有重大发病率和死亡率的病原体。
例如，黄热病病毒能够引起流行病。在第一个链(cycle)中，病毒是通过非洲伊蚊(Aedes africanus)和其他伊蚊(Aedes mosquitoes)(在非洲)或通过Hemogogus蚊(在美洲)传播；猴子作为病库，一般而言，被感染的人类是那些进入森林和丛林深处，并暴露于这些媒介的人。在第二个链中，生活与人类关系密切的家蚊、埃及伊蚊(Aedes aegypti)可能直接将病毒传播给人类——该链中的唯一宿主。
黄病毒引起其他疾病，如墨累山谷脑炎(Murray Valley Encephalitis)、罗氏脑炎(Rocio Encephalitis)和波瓦生脑炎(Powassan Encephalitis)，以及最近在美洲观察到的西尼罗热和寨卡热。
几种黄病毒，包括导致绵羊神经疾病的羊跳跃病病毒(Louping Ill virus)、导致马脑炎的西尼罗病毒，以及也导致马脑炎以及猪死胎的日本脑炎病毒，是具有商业重要性的兽医病原体。
考虑到对虫媒病毒治疗方法的迫切需要，需要一种可靠的制备安全有效的虫媒病毒治疗组合物的方法。理论上，减毒活疫苗能产生最有效的、长期的、特异性的免疫，而灭活病毒疫苗，包括重组亚单位疫苗，则提供更高水平的安全性。理想的疫苗应该是能产生活疫苗的效力和亚单位疫苗的安全性的疫苗。
在开发用于制备哺乳动物特异性的生长受限的虫媒病毒的可规模化方法中实现了那些目标。生长缺陷的目的病毒存在于在感染的哺乳动物中并表达虫媒病毒抗原，并引起对虫媒病毒抗原的免疫应答，但在哺乳动物细胞中不产生子代病毒，因此感染的细胞无助于在哺乳动物宿主中传播细胞感染和病状(pathology)。在昆虫细胞中生长受限的目的病毒的增殖不会受到干扰。因此，可以在昆虫细胞系中经济地产生功能障碍的目的病毒。
发明内容
本发明涉及用于制备生长受限的虫媒病毒粒子的材料和方法，这些粒子在昆虫细胞中继续复制，但在哺乳动物细胞(如人类细胞)中不再复制(或以低水平复制)，因此感染的哺乳动物细胞不产生子代病毒。目的虫媒病毒感染宿主哺乳动物细胞，可以在该宿主哺乳动物细胞中复制，产生被哺乳动物宿主免疫系统识别(例如通过细胞和/或体液反应)的虫媒病毒蛋白，但不产生且不释放子代虫媒病毒粒子。有缺陷的目的病毒包含所有必需基因，以确保病毒基因组复制和产生虫媒病毒蛋白，这些蛋白可以从感染的细胞中释放出来，或可以在宿主细胞的表面表达，但不会从感染的宿主哺乳动物细胞中产生子代病毒。因此，目的虫媒病毒粒子可以像野生型病毒一样具有免疫原性，但这些粒子应该对感染的宿主中的疾病或病状没有太大的贡献(如果有的话)，因为改变的目的虫媒病毒在哺乳动物细胞中的复制减少(如果有的话)。
与被同一种的野生型虫媒病毒感染的同一类型细胞中产生的子代病毒的水平或数量，或与进行处理以变得生长受限前的样本的野生型虫媒病毒感染的同一类型细胞中产生的子代病毒的水平或数量相比，生长受限的目的虫媒病毒不容易在哺乳动物或人类细胞中增殖，产生和释放的病毒粒子减少4logs或以下、5logs或以下、6logs或以下、7logs或以下、8logs或以下、9logs或以下，或没有子代虫媒病毒。
另一方面，生长受限的或生长缺陷的目的虫媒病毒容易在昆虫细胞(如节肢动物细胞)中增殖，产生类似子代虫媒病毒。由昆虫细胞产生的子代虫媒病毒的水平可以约等于或可以超过由同一种的适合的对照野生型虫媒病毒产生的子代病毒的水平或数量，或用于进行处理以在同一昆虫细胞中变得生长受限的样本的适合的对照野生型虫媒病毒产生的子代病毒的水平或数量。
在实施方案中，有缺陷的目的虫媒病毒包含增强的弗林蛋白酶活性(即，与同一种的野生型虫媒病毒或与进行处理以变得生长受限前的样本的野生型虫媒病毒相比，可以更高的速率切割，可以更有效地切割或两者都可)。前体多聚蛋白的弗林蛋白酶切割对于虫媒病毒子代粒子成熟而言是必需的。在一些虫媒病毒中，弗林蛋白酶切割发生在pr和M的连接处(juncture)。因此，有缺陷的目的虫媒病毒包含在prM蛋白或多肽处、在其中或其周围的增强的弗林蛋白酶活性。在一些虫媒病毒中，弗林蛋白酶切割发生在E3和E2的连接处。因此，有缺陷的目的虫媒病毒包含在前体E2蛋白或多肽处、在其中或其周围的增强的弗林蛋白酶活性。
生长受限的目的虫媒病毒包含在弗林蛋白酶共有四肽处的改变，其可能是在例如pr和M的连接处；共有四肽上游的改变(例如在pr多肽中的氨基末端方向)；共有四肽下游的改变(例如在M蛋白中的羧基末端方向)；或其组合。
在实施方案中，虫媒病毒是登革病毒(DV)，其包含prM多聚蛋白。
在实施方案中，在pr和M之间的弗林蛋白酶切割位点中和/或其周围的一个或多个氨基酸置换，导致病毒具有增强的prM弗林蛋白酶切割；在昆虫细胞中增殖；以及不在哺乳动物或人类细胞中增殖。
在实施方案中，通过以下一种或多种方式获得DV中增强的弗林蛋白酶活性：1)从DV的prM多肽第80位氨基酸开始的弗林蛋白酶识别和切割位点上游(氨基末端方向)的8个氨基酸段中的改变，即prM的第80-87位氨基酸；2)四肽弗林蛋白酶识别位点中的改变；3)弗林蛋白酶识别和切割位点下游(羧基末端方向)的39个氨基酸段中的改变，即prM的第92-130位氨基酸；4)第80位氨基酸上游的改变；5)第130位氨基酸下游的改变。可存在上述任意组合，例如，可存在1)、2)和3)。可存在改变1)、2)和3)。
在实施方案中，prM蛋白中的DV弗林蛋白酶切割位点NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH/(SEQ ID NO:1)，其中切割发生在Lys-Arg残基之后(并用上面表示的切割识别位点中的“/”表示)，在Glu位点处被改变以增强弗林蛋白酶切割。
在实施方案中，Glu可被任意氨基酸所替换。
在实施方案中，替换Glu的氨基酸是非酸性、非中性氨基酸，如Gln、Asn、Gly、Lys、Arg、His、Thr、Ser、Tyr、Met或Cys。在实施方案中，替换氨基酸不含硫。在实施方案中，替换氨基酸在R基侧链中不含羟基。在实施方案中，替换氨基酸是碱性氨基酸。在实施方案中，替换氨基酸为Lys、Arg或His。在实施方案中，替换氨基酸为Arg。
在实施方案中，有缺陷的目的DV在SEQ ID NO:1上游的多肽序列中包含一个或多个改变，例如，在Arg-Glu残基上游的8个氨基酸中。在实施方案中，有缺陷的目的DV在SEQID NO:1下游的多肽序列中包含一个或多个改变，例如，在Lys-Arg残基下游的39个氨基酸中。改变可以在弗林蛋白酶识别或切割位点处或所述位点中。改变可以在M蛋白中。改变可以位于膜蛋白的前39个氨基末端氨基酸中。改变可以在pr多肽中。改变可以位于pr多肽的最后8个羧基末端氨基酸中。
这种改变或改变的组合减少DV的复制、成熟以及从感染的哺乳动物细胞中释放，或使这些失效。因此，感染的哺乳动物细胞含有DV抗原并将其呈递给哺乳动物宿主免疫系统，但感染的哺乳动物细胞不释放传染性的子代DV粒子。
然而，在弗林蛋白酶切割位点处或其周围的这些改变并不会使昆虫细胞内目的DV的复制无效，从而提供了一种用于产生DV粒子的方法和手段，该粒子包含本文公开的改变的弗林蛋白酶位点，用于感染哺乳动物细胞但不在哺乳动物细胞中复制。昆虫细胞中的增殖是强劲的(robust)，提供高的病毒产量，以及昆虫细胞中DV的生长或产生是可规模化的，以便以更大的体积、数量和反应来产生病毒粒子。
在实施方案中，虫媒病毒是寨卡病毒(ZV)，其包含prM多聚蛋白。
ZV的弗林蛋白酶切割位点位于prM的第93位氨基酸之后。在实施方案中，在四肽弗林蛋白酶识别位点的丝氨酸残基处，对位于ZV弗林蛋白酶识别位点His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/(SEQ ID NO:2)上游的且包括所述ZV弗林蛋白酶识别位点的prM序列进行修饰(切割发生在上述序列中的第4个Arg之后)，以提供5个精氨酸残基的序列以增强弗林蛋白酶切割。在实施方案中，该区域的谷氨酸残基可以被改变为组氨酸，以增强弗林蛋白酶切割。可以对上述残基的序列进行其他改变。改变可以在第82位氨基酸上游和/或第93位氨基酸下游进行。
ZV中增强的弗林蛋白酶活性可以通过以下一个或多个方法获得：(1)ZV弗林蛋白酶切割位点上游的一个或多个氨基酸的改变，例如，在prM N末端的第82位氨基酸残基开始的8个残基序列(即prM的第82-89位氨基酸残基)中，但可以在第82位氨基酸上游；(2)ZV弗林蛋白酶四肽切割位点中的改变；和(3)弗林蛋白酶切割位点下游的一个或多个氨基酸残基的改变(即第94位氨基酸及以下)，例如在四肽下游的26个残基的氨基酸段。可以存在(1)、(2)和(3)的任意组合。
哺乳动物细胞中目的ZV的生长被最小化或实质上不存在，而昆虫细胞中这种功能障碍的ZV的生长则实质上没有受到影响。
本发明的其他特征和优点记载于下文的具体实施方式和附图中，并可从其中明显看出。
附图说明
图1描述了存活率曲线，其包含在用野生型DV激发之前，从接受作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或目的DV突变体(D2-89R)的小鼠获得的数据。
图2描述了生存曲线，其包含在用野生型SV激发之前，从接受作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或目的SV突变体(M2)的小鼠获得的数据。
图3描述了安全性曲线，其包含从接受野生型SV或SV M2突变体的小鼠获得的数据。
具体实施方式
如本文所用，“功能障碍”或其语法形式，表示与在该变化或改变之前或没有该变化或改变时观察到的功能水平或特性的存在情况相比，由该变化或改变而引起的特性或功能的增强。例如，改变的和功能障碍的酶位点可能是这样的酶位点：即其总被酶识别的或者被同源酶以更高的速率、更有效的方式等切割，结果是酶反应产物的水平或数量增加。例如，在实施方案中，功能障碍的弗林蛋白酶切割位点以增强的或高于非功能障碍的弗林蛋白酶切割位点所观察到的速率或值被切割。因此，结果是感染细胞中prM的数量或水平下降。功能障碍的同义词是“缺陷的”或其语法形式。
“增强的”或其语法形式，是高于基础或参考水平或度量的度量或水平。基础水平可以通过采样一些单位并取平均值来确定，或通过从文献中获得来源群体(derivedpopulation)平均值来确定。在实施方案中，增强的水平是高于对照样本中存在的水平的任何水平。因此，在生物测定、化学测定等中，例如，可以并排运行两个样品，一个疑似具有增强的度量的实验样品和一个对照，它可以是来自已知野生型、正常的、未改变的、非突变的等等的群体代表的样品，在实验样品中显示出更高的度量，例如，更大的产品数量、更快的动力学、更大的产品等等。在实施方案中，基础水平是在野生型单位中存在的水平。在实施方案中，增强的包括增加的酶活性水平。在实施方案中，增强的包括增加的催化活性水平。在实施方案中，增强的包括增加的溶解活性水平。在实施方案中，增强的包括增加的弗林蛋白酶的多肽切割水平。在实施方案中，通过比较来自目的突变体感染的细胞和来自野生型病毒感染的细胞的样品中prM数量，可以揭示增强的弗林蛋白酶活性。在实施方案中，增强的弗林蛋白酶活性可以通过突变体和野生型比较中降低的prM水平或增加pr或M的水平来揭示。
“改变”或其语法形式，是野生型氨基酸序列在一个或多个残基处的变化或修饰。因此，改变的多肽可以包含等位基因。这种变化可以是氨基酸置换、缺失或插入，它可以在野生型序列的一个位点处包含两个或多个氨基酸。改变产生了功能障碍的目的病毒。
“段(stretch)”或其语法形式，是指核酸的连续核苷酸，或蛋白质的连续氨基酸。核酸的连续核苷酸(一段核苷酸)被聚合成一条线性寡核苷酸。蛋白质的连续氨基酸(一段氨基酸)被聚合成一条线性寡肽。
“增殖”或其语法形式包括以下过程：病毒感染相容性宿主细胞；在该感染细胞中复制以产生子代病毒；以及感染细胞将子代病毒释放到细胞外间隙。同义词包括“再生”、“复制”、“生长”等等。
“免疫原性”或其语法形式，包括在宿主中产生或引起免疫应答。因此，在实施方案中，免疫原性包括具有表位或决定簇。在实施方案中，例如，免疫原性组合物是携带表位或决定簇的组合物，当所述表位或决定簇被引入宿主时，其会引发宿主免疫系统对该表位或决定簇的免疫应答。免疫应答在某种程度上可以从宿主中“去除”所述免疫原性组合物，其中“去除”可以包括实际破坏所述组合物，即所述组合物的变性或消化；隔离所述组合物，使所述组合物被包含在使所述组合物惰性的结构中；解毒所述组合物；中和所述组合物；使所述组合物在生物学上惰性；使所述组合物对宿主安全并在宿主中安全等等。免疫原性并不意味着或保证在任意暴露的宿主中均产生免疫保护。免疫应答可以是体液的、细胞的等，或其组合。
“不在人类或哺乳动物细胞中复制”、“不在人类或哺乳动物细胞中增殖”、“不在人类或哺乳动物细胞中生长”、“不在人类或哺乳动物细胞中再生”、“在人类或哺乳动物细胞中生长受限”、“生长受限”、“生长缺陷”，这些短语的等价物、这些短语的语法形式等是同义词或同义术语或短语(如本文中所述)，且包括被目的突变型病毒感染的人类或哺乳动物细胞，与由用同一种、株、系等的野生型虫媒病毒感染的同一类型细胞；由用非功能障碍的病毒感染的类似细胞(如本文中所述)；或由适当的和可接受的阴性对照产生的子代病毒的水平或数量相比，该病毒产生4logs或更少、5logs或更少、6logs或更少、7logs或更少、8logs或更少、9logs或更少或不产生子代虫媒病毒。
“在昆虫细胞中复制”、“在昆虫细胞中增殖”、“在昆虫细胞中生长”、“在昆虫细胞中再生”、“在昆虫细胞中无生长受限”、“无生长缺陷”、“无生长受限”，这些短语的等价物、这些短语的语法形式等是同义词或同义术语或短语(如本文中所述)，且包括被目的突变型病毒感染的昆虫细胞，与由用同一种、株、系等野生型虫媒病毒感染的同一类型昆虫细胞；由用非功能障碍的病毒感染的类似细胞(如本文中所述)；或由适当的和可接受的阴性对照产生的子代病毒的水平或数量相比，产生差不多的或更多的子代病毒。
“约”是相对于某个值的近似值，使得存在一定量的可变性，其反映在例如误差或偏差中，提供了围绕该值的范围，其中该范围的极限为小于该值的10％(包括该值)和大于该值的10％。因此，如本文所用，通过述及约50，应理解该值的范围可为45至55。同义术语包括“基本上”和“实质上”。
“可规模化”或其语法形式，是一种在工作台或实验室规模上实施的方法，其可以转变为更大的规模或表现，例如，实施用于食品、饮料、消费品、工业化学品等的商业化生产的方法，其中反应容器的体积可达数百或数千升。因此，在本发明的上下文中，昆虫细胞培养物可以在数十、数百或数千升体积、数量、反应等或更大的体积、数量、反应下实施。
“野生型”或其语法形式，涉及天然存在的虫媒病毒，其通常是群体中最常见或最普遍的形式、性状、基因、蛋白质、表型等。在实施方案中，同义词是“典型(type)”或“参照(reference)”虫媒病毒。群体性状可以由单个基因座的多个等位基因或由多基因决定。因此，当等位基因或多基因产生相同的性状或实质上相同的性状时，等位基因或多基因集在本文被认为是等价的。野生型虫媒病毒不包含功能障碍的弗林蛋白酶位点，所述位点导致弗林蛋白酶切割增强，如改变的目的虫媒病毒中所存在的。在实施方案中，本文进行了比较，以显示与不包含功能障碍的目的弗林蛋白酶切割位点的正常或野生型虫媒病毒相比，经修饰的目的虫媒病毒的特性。在实施方案中，目的虫媒病毒具有正常的特性或与参照虫媒病毒中的特性大致相同的特性，例如在昆虫细胞中的生长。例如，在实施方案中，参照DV是血清型2、可获自ATCC的新几内亚(New Guinea)毒株(登录号VR-1584)。因此，本文提及DVprM及其氨基酸编号可以是相对于VR-1584的prM；或相对于突变型DV的野生型形式的prM及其氨基酸编号。在实施方案中，参照ZV可以登录号VR-1838获自ATCC。因此，本文提及ZV prM及其氨基酸编号可以是相对于VR-1838的prM；或相对于突变型ZV的野生型形式。目的虫媒病毒，与野生型虫媒病毒一样，在昆虫细胞中增殖。然而，对于本文的氨基酸编号，由于固有种群变异、种群中的多态性或变异性，在一个株、系、种等中的编号可能与在另一个株、系、种等中的编号不直接对应。因此，本文中对于任意一种多肽、切割位点等的位置的编号不是绝对的，因为由于天然存在的变异，即使在一个系、株、种等中的编号也可以变化。因此，本文中使用的编号是相对于特定的细胞、病毒等，而不应被解释为绝对代表所有的虫媒病毒，且所有虫媒病毒中的编号均与本文中呈现的编号相同。相反，各种特征均提供了界标(landmark)以用于鉴别位点，并使得技术人员能够以任意虫媒病毒作为设计选择来实施所要求保护的主题。例如，在pr和M的连接处的弗林蛋白酶共有四肽、pr的下游或羧基末端、M的上游或氨基末端是可用于定向操纵和改变蛋白质的界标。因此，在一个实施方案中，编号考虑到四肽的氨基酸数目，以确定pr和M的大小是否存在可变性，并且如果存在的话，则在不同的虫媒病毒中，在本文中所教导的内容与技术人员所使用的内容之间进行调整或关联，以提供适当的参照框架。
在DV的血清型1-4中，DV的“prM”蛋白或多肽的长度为166个氨基酸，并在第91位氨基酸之后被弗林蛋白酶切割以产生pr多肽和M蛋白。DV2的NGC毒株的野生型prM氨基酸序列为：FHLTTRNGEP HMIVSRQEKG KSLLFKTEDG VNMCTLMAMD LGELCEDTIT YNCPLLRQNEPEDIDCWCNS TSTWVTYGTC TTTGEHRREK RSVALVPHVG MGLETRTETW MSSEGAWKHA QRIETWILRHPGFTIMAAIL AYTIGTTYFQ RVLIFILLTA VAPSMT(SEQ ID NO:8)。众所周知，自然变异可以发现野生型毒株在SEQ ID NO:8提供的序列中有一个或多个氨基酸变化，而不破坏或增强弗林蛋白酶对prM的切割，也不减少在哺乳动物细胞中的增殖。改变的目的SEQ ID NO:8是这样的序列，即其呈现出增强的弗林蛋白酶切割；病毒在昆虫细胞中增殖，但该病毒在哺乳动物细胞中几乎不增殖或不增殖。
ZV的“prM”蛋白或多肽的长度为168个氨基酸，并在第93位氨基酸之后被弗林蛋白酶切割以产生pr多肽和M蛋白。野生型prM氨基酸序列为AEITRRGSAY YMYLDRSDAGKAISFATTLG VNKCHVQIMD LGHMCDATMS YECPMLDEGV EPDDVDCWCN TTSTWVVYGT CHHKKGEARRSRRAVTLPSH STRKLQTRSQ TWLESREYTK HLIKVENWIF RNPGFALVAV AIAWLLGSST SQKVIYLVMILLIAPAYS(SEQ ID NO:9)。众所周知，自然变异可以发现野生型毒株在SEQ ID NO:9提供的序列中有一个或多个氨基酸变化，而不会破坏或增强弗林蛋白酶对prM的切割，也不会减少在哺乳动物细胞中的增殖。改变的目的SEQ ID NO:9是这样的序列，即其呈现出增强的弗林蛋白酶切割；病毒在昆虫细胞中增殖，但该病毒在哺乳动物细胞中不增殖。
如本文所用，“弗林蛋白酶切割位点”、“弗林蛋白酶识别位点”和“弗林蛋白酶识别和切割位点”是可互换和等价的，众所周知，弗林蛋白酶通常识别共有四肽Arg-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:16)，其中X是任意氨基酸(该四肽的上游和/或下游的序列还可以包括弗林蛋白酶切割位点)，并切割该四肽下游的肽键或羧基末端上的肽键。一般来说，在虫媒病毒中，弗林蛋白酶切割位点存在于前体多聚蛋白中的两个多肽的连接处，如prM和前体E2(prE2)。在一些虫媒病毒中，弗林蛋白酶切割位点存在于pr和M的连接处。在其他具有不同基因组组织且不含prM的虫媒病毒中，例如，一些甲病毒(alphaviruses)，弗林蛋白酶切割位点存在于E3和E2的连接处。
如本文所用，“X logs或更低(lower)”、“X logs或更少(less)”或“X logs或更少(fewer)”(其中X是有理数)，是指用于描述病毒粒子数量的对数尺度。如已知，该尺度是非线性的，基于以10为底数的数量级计。当参数的值的范围很大时，就会使用log尺度。因此，4logs反映了两个值之间的差异为104，即一个值比另一个值少或大10,000个单位，5logs反映了两个值之间的差异为105，即一个值比另一个值少或大100,000个单位，等等。包含词语“更低(lower)”、“更少(less)”或“更少(fewer)”的短语涉及数值更低、数量更少等等的量，或在本文的上下文中，涉及数量较少的病毒粒子。因此，“4logs或更少”意味着两个值之间的差异为104、104.5、105等，这意味着在一个样本中产生的病毒粒子的数量比另一个样本少10,000个，大约少31,600个或大约少100,000个，并且在本文的上下文中，意味着一个样本中包含的病毒粒子比另一个样本少10,000个。
本发明的重点是操纵虫媒病毒基因组来产生哺乳动物细胞特异性、生长缺陷的虫媒病毒，其中感染这种虫媒病毒的哺乳动物细胞不释放成熟的子代病毒，而是继续表达可被哺乳动物宿主识别的虫媒病毒表位和决定簇，例如由M和E蛋白表达的决定簇。在哺乳动物宿主中可以产生对虫媒病毒的细胞和/或体液反应。目的虫媒病毒基本上类似于野生型病毒，因此向哺乳动物宿主免疫系统提供了可以在虫媒病毒、野生型虫媒病毒中找到的通用(universe)虫媒病毒表位。目的虫媒病毒根本不能在宿主哺乳动物细胞中复制，因此不能导致对其他宿主哺乳动物细胞的感染且不能导致宿主中的病状或疾病。
因此，本发明涉及有缺陷的或功能障碍的虫媒病毒，其包括并表达大部分(如果不是全部)结构蛋白，或至少大多数多肽，其包含感染的宿主产生的针对虫媒病毒的抗体或免疫细胞的决定簇或表位。因此，例如，对于黄病毒属，优选由此表达大多数pr、M和/或E蛋白，因为这些蛋白包含野生型病毒的免疫原性位点。C蛋白基本不会成为宿主免疫系统的靶标，但可以存在。
所有已知的虫媒病毒都需要对前体多聚蛋白的弗林蛋白酶切割，以进行适当的病毒成熟并从宿主细胞中释放，例如在某些甲病毒属中将prE2切割成E3和E2，在某些黄病毒属中将prM切割成pr和M，以进行适当的病毒成熟并最终从感染的细胞中释放子代病毒。
目的突变型虫媒病毒包含改变的或功能障碍的弗林蛋白酶切割位点，例如在prE2或prM处，以及可选择地包含从弗林蛋白酶共有切割位点上游和/或下游的改变，导致弗林蛋白酶对例如prE2或prM的切割增强，产生在昆虫细胞中继续复制，但在哺乳动物(当然包括人类)细胞中不再复制或复制很弱的病毒。因此，在虫媒病毒中的如prE2或prM弗林蛋白酶切割位点处或其周围的改变产生了生长受限的病毒，该病毒在昆虫细胞中继续生长，但在人类或哺乳动物细胞中不再生长或生长较弱，其中生长表明感染的细胞释放了子代病毒。
一般来说，在高尔基体中的早期黄病毒属粒子的成熟过程中，未成熟的粒子呈现包含prM和E蛋白的三聚体的刺突(spike)，其在通过高尔基体过程中(可能由于pH的变化)被重新排列以在粒子上形成光滑表面。刺突的重排或转化暴露了prM的弗林蛋白酶切割位点。prM被弗林蛋白酶切割，一些pr片段(也许是基于高尔基体中的pH值)仍然与粒子相连。认为pr片段可以防止膜融合。当初始粒子被从高尔基体释放到细胞外环境中时，pr被从初始粒子中释放以形成成熟粒子，其可以与细胞膜融合以从细胞中释放。一些发育中的粒子可能不会成熟。然而，病毒蛋白与细胞内膜相连，并且被纳入到细胞膜中，其中病毒蛋白在细胞表面上表达。病毒粒子和成分可以在细胞死亡和裂解时释放到环境中。
虽然不想被理论所束缚，但包含prM中改变的弗林蛋白酶切割位点(使得可以增强prM的切割)的目的突变型病毒基因组可能会诱使prM在发育中的病毒粒子进入高尔基体之前被切割，这可能是在不同的PH条件下，导致pr不与粒子表面相连，因为粒子进入并驻留在高尔基体中。因此，没有pr来防止膜融合，在病毒粒子通过高尔基体时恰当地阻止其成熟，并将其捕获在高尔基体中。由于prM在进入高尔基体之前被过早地切割，目的虫媒病毒粒子不含pr，因此不能在高尔基体中进行恰当的加工，结果是病毒粒子结合并融合至高尔基体膜，但不会从高尔基体膜中释放，因此不能从细胞中释放。
然而，这一过程在昆虫细胞中没有改变，其中例如prE2或prM的弗林蛋白酶切割的时间和/或效率与适当的虫媒病毒粒子的成熟和从宿主昆虫细胞中的释放无关或妨碍其成熟和释放。因此，感染的昆虫细胞产生子代虫媒病毒的水平与在感染了野生型病毒的昆虫细胞中发现的水平相当、相同或更高。
目的虫媒病毒的弗林蛋白酶共有四肽(R-X-K/R-R(SEQ ID NO:16))位于例如E3和E2的连接处，以及pr多肽和M蛋白的连接处。四肽的氨基酸通过以下方式进行改变：氨基酸置换，编码该氨基酸的核酸的定向突变等，实施已知的方法，如构建四肽使其含有如Arg作为第二或X位点。改变的弗林蛋白酶位点通过例如实施已知方法的同源重组被放置在例如全长核酸中。可以对cDNA进行核酸操作，然后如本文所教导的并实施本领域中已知的方法，将其转录形成包含改变的弗林蛋白酶切割编码序列的病毒RNA。病毒核酸可以被包装成粒子，例如，通过将病毒RNA电穿孔到合适的宿主细胞中。培养转染细胞，监测病毒粒子的产生，并获得携带包括改变的弗林蛋白酶切割位点编码区的RNA的病毒粒子。DNA、RNA、载体、宿主细胞等是已知的，一些试剂也可商购的，参见例如Polo et al.,Zeng et al.,Khromykh et al.J Virol 75(10)4633-4640,2001；Gehrke et al.,J Virol 77(6)8924-8933,2003；和Shustov et al.,J Virol 81(21)11737-11748,2007。然后将病毒粒子用于感染合适的细胞，并如本领域中已知的进行培养。利用本文所教导的方法监测子代病毒的产生，以确定改变是否影响哺乳动物细胞中的病毒复制，而不影响昆虫细胞中的病毒复制，以及在这两种类型的细胞中增殖的改变程度。
本发明部分涉及黄病毒属，其中一些包括prM多聚蛋白。
在实施方案中，本发明涉及DV(例如血清型1-5中的任一种)。
DV基因组由单个线性、单链、正义RNA组成。总基因组可为10至11kb。没有3’多聚腺苷酸化。5’端有一个甲基化帽。DV基因组不包含为宿主核糖体提供翻译起始位点的内部核糖体进入位点(IRES)。相反，DV采用核糖体扫描以开始蛋白质合成。
登革病毒体是直径为40-65nm的球形。在脂质包膜下是直径为约25-30nm的二十面体衣壳包衣。
登革热是一种急性传染病，其特征在于双相性发热、头痛、身体各部位的疼痛、虚脱、皮疹、淋巴结病和白细胞减少(Holstead,1980,Immunological parameters oftogavirus disease syndromes,p.107-173,in Schlesinger(ed.),“The Togaviruses,”Academic Press,Inc.,NY；和Sabin,1959,Dengue,p.361-373,in Rivers&Horsfall(eds.),“Viral and Rickettsial Infections of Man,”JB Lippincott Co.,Philadelphia)。DV是通过蚊子传播的。感染一种登革热血清型可提供对该亚型的终身免疫，但没有对其他血清型的交叉保护免疫。
登革出血热(DHF)是一种严重的发热性疾病，其特征在于止血异常和血管通透性增加，其在某些情况下导致低血容量休克综合征、登革休克综合征(DSS)(WHO:1975.Technical Guides for Diagnosis,Treatment,Surveillance,Prevention andControl of Dengue Hemorrhagic Fever,Geneva,CH)。在不同的情况下，DHF/DSS的机制可能有所不同。导致DHF/DSS的主要因素可能包括病毒毒力、患者健康状况和不同血清型DV的继发感染。
目前有5种DV血清型，DV1、2、3、4和5。对一种血清型的免疫一般不赋予对另一种血清型的免疫。
令人困惑的是，人类并不总是对各种血清型作出同样的反应。因此，同时感染至少两种DV血清型的人可能只会对一种血清型产生免疫应答。此外，通常与原发或在先感染的血清型不同的血清型的随后感染(但当第一次或在先感染是良性的、轻度的或无症状时)，可导致更严重的疾病和病状。
血清型优势、选择性或干扰的原因尚不清楚。可能是由于原位病毒复制、生长、成熟和从宿主细胞中释放，或抗原呈递可能指导宿主对特定血清型的免疫应答。
无论如何，可预测性较低的宿主反应、血清型干扰和无症状感染为开发有效的多价疫苗带来了许多障碍。
即使当改变疫苗中每种血清型的相对量以试图补偿偏斜的免疫应答时，目前的多价活疫苗也不能对所有血清型产生同等的免疫。
在实施目的主题时，用在以下位置的不同的氨基酸置换构建了各种DV基因组：在prM弗林蛋白酶切割位点的Glu残基处；共有四肽的上游，例如，与共有序列(即第88-91位氨基酸)相邻的8个氨基酸的上游段中；共有四肽的下游，例如，与第88-91位氨基酸的共有序列相邻的39个氨基酸下游段中，即第92-130位氨基酸中(即在prM的第80-130位氨基酸(包含)中)。氨基酸的变化增强了prM的弗林蛋白酶切割。当引入哺乳动物宿主细胞时，随着病毒粒子的产生，发生复制和表达。然而，没有获得将要从宿主细胞中移出的成熟粒子。因此，目的粒子一旦感染哺乳动物细胞，突变型病毒基因组在哺乳动物宿主细胞中复制并表达，但成熟的子代病毒粒子不会被感染的宿主哺乳动物或人类细胞释放。
在实施方案中，prM蛋白中的DV弗林蛋白酶四肽切割位点NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH(SEQ ID NO:1)(其中切割发生在Lys-Arg残基的下游)在Glu位点被改变，以增强弗林蛋白酶切割。
在实施方案中，Glu可被任何氨基酸所替换。替换氨基酸可以是非酸性、非中性氨基酸，如Gln、Asn、Gly、Lys、Arg、His、Thr、Ser、Tyr、Met或Cys。在实施方案中，替换氨基酸不含硫。因此，替换氨基酸是除Met或Cys以外的非酸性、非中性氨基酸。在实施方案中，替换氨基酸不含R羟基。因此，在实施方案中，替换氨基酸不是Tyr、Ser或Thr。在实施方案中，替换突变型氨基酸为碱性氨基酸。在实施方案中，替换氨基酸为Lys、Arg或His。在实施方案中，替换氨基酸为Arg。
在实施方案中，四肽共有序列上游的氨基酸被改变。例如，紧靠弗林蛋白酶切割位点的共有序列上游的8个氨基酸段中的1个氨基酸(或氨基末端侧)被改变，以增强prM的弗林蛋白酶切割(“改变的上游位点”)。因此，改变可发生在prM多肽的第80-87位氨基酸处。
在实施方案中，四肽共有序列下游的氨基酸被改变。例如，紧靠弗林蛋白酶切割位点的共有序列下游的39个氨基酸段中的1个氨基酸(或羧基末端侧)被改变，以增强prM的弗林蛋白酶切割(“改变的下游位点”)。这种改变可发生在M多肽的第92-130位氨基酸处。
目的DV包括以下的至少一种：(1)改变的弗林蛋白酶四肽切割位点；(2)改变的上游位点；和(3)改变的下游位点。目的DV可包括(1)、(2)和(3)中任两个的组合。目的DV可包括所有三种改变。
在实施方案中，虫媒病毒是一种包含prM多聚蛋白的ZV。
ZV基因组由单个、单链、具有10,794个碱基的正义RNA组成(虽然一些分离株的大小不同[例如Baronti et al.,Genome Announc 2(3)1-2,2014])。除了结构和非结构基因外，还有3’和5’非编码末端。
ZV中存在较低水平的多态性。例如，识别了至少两种亚型，一种非洲病毒谱系和一种亚洲/南美病毒谱系。这两种谱系可以在血清学上加以区分，即包膜蛋白中可能存在变异。
寨卡热的症状可能包括发烧、红眼、关节疼痛、头痛和斑丘疹，一般持续不到七天。虽然不认为最初的感染对正常成年人是致命的，但怀孕期间的感染会导致发育中的胚胎和/或胎儿的畸形和异常，例如小头畸形。已经将成人感染与格林巴利综合征关联起来。
ZV主要是蚊子传播的。在2015年巴西的寨卡大爆发后，ZV已蔓延到拉丁美洲和加勒比，现在蔓延到美国。
ZV生命周期开始于病毒体附着在宿主细胞的表面，随后通过受体介导的胞吞作用进入细胞。如目前所理解的，内体小泡的酸化触发病毒体的构象变化、病毒和细胞膜的融合以及粒子分解。一旦基因组被释放到细胞质中，正义RNA被翻译成单一的多聚蛋白，其被病毒和宿主蛋白酶加工成10种基因产物：3种结构蛋白：核心蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E)，以及7种非结构(NS)蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。
ZV的弗林蛋白酶切割位点位于prM的第93位氨基酸之后。在实施方案中，prM蛋白序列位于弗林蛋白酶四肽切割位点上游并包括弗林蛋白酶四肽切割位点His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/(SEQ ID NO:2)，其中切割发生在末端Arg之后并用斜线表示，其中丝氨酸残基被(四肽位点Arg-Ser-Arg-Arg(SEQ ID NO:10)的)Arg替换，以提供5个精氨酸残基的序列来增强弗林蛋白酶切割。此外，上游段的谷氨酸残基可以改变为，例如组氨酸，以增强弗林蛋白酶切割。上游段中残基的其他改变增强了弗林蛋白酶切割。四肽下游的改变增强了弗林蛋白酶切割。例如，改变可以发生在四肽下游的任何或所有26个氨基酸段以增强弗林蛋白酶切割。
增强的弗林蛋白酶活性是通过以下一种或多种获得的：(1)弗林蛋白酶切割位点上游的一个或多个氨基酸的改变，例如从ZV的prM多肽的N末端的第82位氨基酸残基开始的8个残基序列(即prM的第82-89位氨基酸残基)；(2)弗林蛋白酶切割位点中的改变；和(3)弗林蛋白酶切割位点下游的一个或多个氨基酸残基(从第94位氨基酸及以下)的改变，例如弗林蛋白酶切割位点下游的26个残基序列。可以存在(1)、(2)和(3)的任何组合。
对于黄热病病毒、加利福尼亚脑炎病毒、裂谷热病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、马脑病病毒、科罗拉多蜱热病毒、基孔肯雅病毒、非洲猪瘟病毒和其他虫媒病毒，弗林蛋白酶共有四肽识别位点是基于已知的共有弗林蛋白酶识别序列定位的，并对其进行氨基酸置换，以鉴别在哺乳动物细胞中不再增殖或增殖较差的突变体。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也可以在弗林蛋白酶共有切割位点的上游和/或下游进行。
病毒在细胞系和动物中的制备、生长和维持是已知的。通过利用分子技术改变编码序列来制备虫媒病毒突变体是已知的。确定细胞中病毒的生长、子代病毒从细胞的产生的各种测试以及在本发明的实施中使用的其他测定法是已知的，且其选择是设计选择。
本发明的另一个目标是开发一种可规模化的系统，其用于产生具有目的组成的免疫原性虫媒病毒。这一目标是通过产生目的虫媒病毒来实现的，所述目的虫媒病毒表达在昆虫细胞系(如节肢动物细胞系，如蜱或蚊子细胞系，)中以增强的水平被弗林蛋白酶切割的功能障碍的弗林蛋白酶切割位点，其中由昆虫细胞大规模产生病毒的材料和方法是已知的和可获得的。节肢动物细胞系是可商购的，如蚕细胞系和蚊子细胞系。
目的虫媒病毒在昆虫细胞中生长而不受阻碍。因此，携带功能障碍的弗林蛋白酶切割位点的目的虫媒病毒生长、复制、成熟，并可由宿主昆虫细胞以与野生型虫媒病毒大约相同的程度或相同的水平释放到环境中。因此，目的虫媒病毒可以产生与不包含昆虫细胞中功能障碍的目的弗林蛋白酶切割位点的虫媒病毒相比相同程度或更高水平的子代病毒。
子代病毒产生(或增殖)的程度可以，例如以噬菌斑测定法或血凝素测定法进行评估，如本领域中已知并如本文所教导的。一种简单且灵敏的评估病毒产生的方法是在流式细胞仪中计数荧光标记的细胞，如Drayman&Oppenheim,“Rapid Titration of Viruses byFlow Cytometry,”Curr Prot Cell Biol 26.11.1-26.11.7,2011中所记载的。因此，收集连续稀释的感染细胞(必要时进行分离)，收集细胞、固定并暴露于一种或多种抗体试剂，其中具有至少一个针对病毒蛋白的Ab和至少一个荧光标记的Ab，然后例如通过流式细胞仪读取至少约10,000个细胞，以显示表达该病毒蛋白的荧光标记的细胞的数量。因此，与由在C6/36细胞(ATCC登录号No.CRL-1660)中用参照虫媒病毒(例如，对于DV，血清型2，新几内亚毒株，ATCC No.VR-1584)感染的细胞产生的子代病毒的数量相比，或与不包含目的突变型病毒(包括增强的弗林蛋白酶活性或表现出增强的prM的弗林蛋白酶切割)的同一株或同一系的野生型病毒产生的子代病毒的数量相比，目的虫媒病毒可以产生大约相同水平或数量或更多的子代病毒。
目的虫媒病毒在哺乳动物细胞中不能恰当地成熟，粒子不是由宿主哺乳动物细胞释放的(或不增殖)，相反未成熟的粒子被捕获在宿主哺乳动物细胞内并在其中积累。因此，目的虫媒病毒在人类或哺乳动物细胞中几乎不产生或不产生子代病毒。与野生型虫媒病毒相比，目的虫媒病毒产生的子代病毒更少，例如与使用HT 1080细胞(ATCC登录号No.CCL-121)时产生的子代数量相比，4logs或更少、5logs或更少、6logs或更少、7logs或更少、8logs或更少、9logs或更少或没有子代。
需要不在哺乳动物细胞中增殖的目的突变型病毒，因为需要最小化或避免疾病或病状。然而，子代病毒释放非常少到不释放不是必需的或必要的。与感染野生型病毒的类似细胞相比，当在哺乳动物细胞中感染时产生例如4logs或更少、5logs或更少、6logs或更少，或更少的子代病毒的功能障碍的病毒可以用作免疫原，尽管存在子代病毒的低的或少量释放，因为宿主免疫系统最终将清除病毒和表达病毒抗原的细胞。
包含改变的和功能障碍的目的弗林蛋白酶位点的病毒具有传染性，但不能或不会从哺乳动物细胞的感染中产生传染性的子代病毒体。因此，不复制的粒子是感染宿主哺乳动物细胞(如人类细胞)，但宿主细胞不产生或释放由该感染产生的子代病毒粒子的粒子。但是，感染的哺乳动物宿主细胞在感染的细胞内和细胞上表达虫媒病毒表位。
缺陷的目的病毒的独特性质提供了有效和安全的虫媒病毒免疫原性组合物的来源，通过在昆虫细胞中生长目的病毒，可以成本效益地获得大量的病毒。功能障碍的目的病毒在感染到同一类型的昆虫细胞中时，可以产生与参照病毒大约相同数量的子代病毒。在实施方案中，功能障碍的目的病毒从昆虫细胞中产生的病毒多于感染到该昆虫细胞类型中的参照病毒产生的病毒。在实施方案中，功能障碍的目的病毒的病毒少于参照病毒产生的病毒。一种高度免疫原性功能障碍的病毒株模仿了虫媒病毒的自然感染过程，使得哺乳动物宿主能够生成和产生持久的且广泛的虫媒病毒免疫，没有或具有最小的病状。因此，改变的目的虫媒病毒是这样的虫媒病毒，即其含有遗传物质以表达许多或所有由野生型prM、M和E蛋白，并且可能还有野生型虫媒病毒的C蛋白表达的表位。
目的虫媒病毒可在适当滴定后感染许多(如果不是全部)易感细胞。传染性的程度可以用标准的和已知的测定法来评估。例如，将6孔培养皿中的Vero细胞以连续稀释的虫媒病毒感染，并将所述细胞在37℃下于摇床平台中摇动。在48h时收集细胞培养液。释放到培养基中的病毒数量可以采用已知的方法(例如本文中教导的方法)来确定。
为了制备部分纯化的虫媒病毒粒子，例如，培养液是通过例如在4℃下在微量离心机中以16,000xg离心15分钟澄清的，并且所述粒子是通过在Sorvall OTD55B离心机的AH650转子中在4℃下以40,000rpm超速离心2小时从上清液中沉淀。所述沉淀被重悬在50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在4℃下静止溶解过夜。
为了确定虫媒病毒的滴度，例如，在37℃下，将8孔室切片上的小仓鼠肾(BHK)-21细胞用50μl连续10倍稀释的细胞培养液或重悬的沉淀材料感染2小时。然后将该液体替换为1ml补充有2％胎牛血清的杜尔贝科氏最小必需培养基。将细胞在CO2培养箱中在37℃下孵育24小时，然后用以下物质进行免疫荧光(IF)分析：虫媒病毒特异性Ab或mAb(可商购的或如本领域中已知制备的)、下文所述的HMAF或具有必要特异性的多克隆抗血清，与携带可检测报道分子的病毒特异性试剂形成夹心的试剂，并使用适当的对照。
在收获的培养液(CF)中存在的病毒滴度(单位为感染单位(IU)/毫升)也是通过以下方式确定：感染例如恒河猴肾上皮细胞(例如LLC-MK2(ATCC)细胞)，然后用虫媒病毒特异性试剂和标记试剂(例如包含mAb的超免疫小鼠腹水液(HMAF))进行间接免疫荧光分析(IF)。
体液抗体和细胞免疫应答都与针对DV感染的保护和恢复有关。目的虫媒病毒诱导两臂的免疫应答。这些粒子由prM、M和/或E蛋白组成，因此，目的粒子是广泛的免疫原，并模拟野生型病毒的感染。但目的粒子感染哺乳动物宿主细胞，在这些细胞中，额外的prM、M和/或E蛋白在宿主细胞上表达或由宿主细胞表达。prM、M和/或E蛋白可以从这些细胞中释放出来，为宿主提供额外的抗原刺激，或可以在感染的宿主细胞表面表达，为宿主提供另一种抗原刺激模式。目的虫媒病毒可任选地表达非结构蛋白，如NS1。以前的报道表明，这些NS病毒蛋白可以诱导保护性免疫应答(Heinz&Roehrig,1990,in,“Immunochemistry of Viruses,Vol II,”Amsterdam-NY-Oxford,Elsevier,p.289-305；Heinz,1986,Adv Virus Res 31:103-168；Bray&Lai,1991,Virol,185:505-508；Henchal et al.,1988,J Gen Virol 69:2101-2107；和Schlesinger et al.,1986,J Virol 60:1153-1155)。
测试目的药物组合物的功效的合适模型包括模拟虫媒病毒感染的动物模型。例如，已经记载了一种用于小鼠免疫接种并且随后用虫媒病毒激发的方案(Bray et al.,1989,J Virol 63:2853-2856)。简单地说，在每组10只小鼠中，雌性BALB/c小鼠通过腹腔内(ip)接种病毒(如DV)在3周龄(第1天)进行免疫接种，并在第14天再次免疫接种。对照动物接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在第0天和第21天对所有动物进行采血。在DV的情况下，小鼠在第22天通过脑内注射病毒的50％致死剂量(LD50)的100倍来进行激发。在激发后，观察小鼠21天的病理征象，并每天记录有症状的(脑炎、瘫痪或死亡)小鼠。也从幸存者中收集血清，用于与激发前的血清进行比较。
每种病毒的剂量是确定的。免疫接种的小鼠对单个虫媒病毒蛋白的血清反应是使用可商购的标记试剂盒和抗体通过例如ELISA或标记的虫媒病毒抗原的放射性免疫沉淀进行分析。噬菌斑减少测定法可用于测量小鼠血清中虫媒病毒特异性中和抗体的滴度。例如，首先通过在56℃下孵育30分钟对待在测定法中使用的约0.5ml血清样品进行热灭活。以2％热灭活的胎牛血清(FBS)为稀释剂，用培养基M199制备血清的四倍稀释液，最终体积为0.3ml，从1:10稀释开始。向稀释血清的每个0.3ml等分试样中加入等体积的含有150-180个噬菌斑形成单位(PFU)的病毒的培养基。将病毒与血清混合，并在37℃下孵育30min。在每个测定中，还包括无血清对照和由每种虫媒病毒类型特异型Ab(例如，在两种稀释度下)组成的对照。将病毒/血清和对照混合物以0.2ml/孔铺板于例如Costar 6孔板(Corning Inc.,Corning,NY)中LLC-MK2细胞的汇合单层上。每个样本均感染重复的孔。病毒吸附在室温下进行1小时，每15分钟手动摇动。然后用在厄尔氏平衡盐溶液中(加上10％的FBS，加入必需维生素和氨基酸(Invitrogen))的含有1％琼脂糖(SeaKem LE；BioWhittaker,Rockland,ME)的培养基以6ml/孔覆盖在孔上。平板在5％CO2中在37℃下孵育7天。然后用含有1％琼脂糖的4％中性红溶液(4ml中性红色溶液加入到96ml PBS中)覆盖在孔上。平板在37℃下孵育24小时。噬菌斑计数的平均值用于计算噬菌斑数量水平降低50％。
在实施方案中，目的病毒组合物是多价的病毒组合物，即二价、三价、四价等，并且是使宿主对通常一种病毒的多种虫媒病毒血清型免疫的病毒组合物，但可能包括来自多种病毒种(例如，包括多种目的突变型病毒)的抗原。没有观察到一种血清型在以一种或多种其他血清型为代价的情况下的干扰或优势。这可能是因为免疫原性不依赖于病毒产生和新病毒的持续复制。
目的虫媒病毒被纳入适合作为免疫原给药的药物组合物中，如免疫学领域中已知的。这种组合物通常包含活性成分和药学上可接受的载体。如本文所用的，词语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的，且作为设计选择。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其用于组合物中的用途。补充的药理活性化合物如佐剂，也可以纳入到组合物中。
如本文公开使用的本发明的药物组合物被配制成与预期的给药途径相容。给药途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经皮(包括例如局部)、经粘膜和直肠给药。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬液可包括下列成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的试剂，如氯化钠或右旋糖等。pH可以用酸或碱(如HCl或NaOH)调节。肠胃外制剂可封闭在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其为水溶性)或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor
(BASF；Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是达到可注射性程度的液体。该组合物在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保存起来以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂预防微生物的作用，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等来实现。组合物中可优选地包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇和山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中加入延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现。
无菌注射液可通过以下步骤制备：将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，并根据需要加入上述一种成分或多种成分的组合，然后过滤灭菌。通常，分散液是通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上文所述的所需的其他成分的无菌载体中来制备。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。该组合物可封闭在明胶胶囊中或压缩成片剂(包衣或处理)，例如提供肠溶组合物、延迟释放制剂等。出于口服治疗给药的目的，活性化合物可与赋形剂混合并以片剂(tablet)、锭剂(troche)或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用液体载体制备，以产生糖浆、酏剂或液体制剂，或用作漱口水，其中液体载体中的化合物被口服施用、抽吸(swish)、咳出(expectorate)或吞咽。
药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂(tablet)、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任一种以成分或具有类似特性的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。目的粒子可以被包封成通过胃环境时能够存活的形式。这种形式通常称为肠溶衣制剂。
对于吸入给药，化合物可以从含有合适的推进剂(例如气体，如二氧化碳或雾化剂或雾)的加压容器或分配器中以例如喷雾剂的形式输送。该制剂可以是液体、干燥粉末(如细分粉末)等。
全身给药也可通过透膜或透皮方式进行。对于透膜或透皮给药，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的，并可以包括，例如对于透膜给药，洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。透膜给药可以通过使用鼻喷雾或灌肠剂来完成。对于透皮给药，可以将活性化合物配制成如通常在本领域中已知的软膏剂、药膏剂、泡沫剂、凝胶剂或乳膏剂。所述组合物可以使用施用于皮肤上的贴剂来递送。
当目的组合物为栓剂形式时，其可以包含常规的栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯。
在实施方案中，活性化合物是用保护化合物不被身体迅速消除的载体制备的，例如在控制释放制剂中，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
此类制剂的制备方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些材料可以从商业来源获得，如Johnson&Johnson and Encapsula Nano Sciences(Brentwood,TN)。
脂质体悬液(包括用单克隆抗体和其他这类靶向分子靶向的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。那些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所记载的。
为了便于给药和剂量的均匀性，配制单位剂型的口服或肠胃外组合物是有利的。本文使用的“单位剂型”是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含经计算以产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。
药物组合物可与给药说明书一起被包含在容器、包装、试剂盒或分配器中。
另一种给药方法包括将目的化合物添加到食物或饮料中或与食品或饮料一起添加，作为食品补充剂或添加剂，或作为在预防性基础上服用的剂型，类似于维生素。
剂量(例如优选的给药途径和数量)是可以基于通过实施本领域中已知的方法从临床前和临床研究中获得的经验数据得到的。对于几天或更长时间的重复给药，视病情而定，持续治疗直到出现所需的疾病症状抑制为止。然而，可使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法监测治疗进展。在WO 94/04188中公开了一种示例性的给药方案。本发明的单位剂型的规范是由活性化合物的独特特性和所要达到的特定治疗效果以及配制这种活性化合物以治疗个体的领域中固有的限制所决定，并且可以直接取决于此。因此，给予成年人类的病毒粒子的数量可以从递送给模型动物(如小鼠、大鼠、猴子等)的治疗量中外推出来。例如，根据小鼠研究，大约106个粒子(或IU)，大约107个粒子，大约108个粒子，大约109个粒子或更多可以单剂量或分剂量给药。如本领域中已知的，当经验数据变得可用时，可以调整数量或剂量。
目的病毒可用于在个体中产生有效的免疫应答，其中有效包括最小化、减少或预防个体中的症状或病状。由于宿主免疫应答在获得治疗反应方面是决定性的，其可以像使用任何药物一样在任一个体中分级，目的病毒可能也可能不是是治疗性的，并且可能或不可能从病毒受体产生所需应答。剂量、病毒呈递途径和手段、佐剂和其他免疫学因素的使用可以解决个体缺乏宿主免疫应答或较弱(tepid)宿主免疫应答的问题。
这种现象在群体水平是明显的，并不是目的病毒群体中的每一个受体都会产生治疗性免疫应答，而且任何一个群体中的应答者的数量可能与另一个群体的数量不同。
功能障碍的目的病毒的效用并不取决于群体中更大比例的应答者、群体中更高水平的免疫保护、商业活力、商业成功等等，而是即使仅在一个个体中时，功能障碍的目的病毒也会产生减轻或预防症状或疾病的治疗性免疫应答。
现将在下列非限制性实施例中举例说明本发明。
实施例1
DV病毒体是由6％RNA、66％蛋白质、9％碳水化合物和17％脂质组成(Russell etal.,Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses,in,Schlesinger eds.,“TheTogaviruses:Biology,Structure,Replication,”New York,Academic,1980,p.503-529；和Trent&Naeve,Biochemistry and Replication,in Monath,ed.,“St.LouisEncephalitis,”Washington,DC,American Public Health Association,1980,p.159-199)。电子致密核衣壳是由C(衣壳)蛋白和基因组RNA组成。包膜蛋白E和膜(M)蛋白通过C末端疏水锚嵌入脂质双层中。然而，在细胞内囊泡中发现的未成熟粒子含有完全未经处理的pre-M(prM)，并且传染性低于释放的病毒体(Morens,Clin Infect Dis,1994,19:500-512)。
DV的基因组是均匀的，是约10-11kb的单链、正义RNA分子，含有单个ORF，约占基因组的95％(Chambers et al.,Ann Rev Microbiol,1990,44:649-688)。全长基因组RNA似乎是DV感染的细胞中唯一的病毒特异性信使RNA(mRNA)分子。在感染时，病毒RNA被翻译成具有大约3400个氨基酸的多聚蛋白，其被加工成10种基因产物：3种结构蛋白，C、prM和E；和7种非结构(NS)蛋白，1、2A、2B、3、4A、4B和5(Bhamarapravati&Yokan,Live attenuatedtetravalent vaccine,in Gubler&Kuno,eds.,“Dengue and Dengue HemorrhagicFever,”Wallingford,CAB International,1997,pp 367-377；和Falgout&Markoff,1995,The family flaviviridae and its diseases,p.47-66,in,Porterfield,ed.,“ExoticViral Infections,”Chapman and Hall Medical,London,United Kingdom)。
实施例2
突变型DV是由DV2新几内亚C毒株(ATCC No.VR-1584)的全长感染性cDNA克隆产生的。突变型DNA片段是通过PCR产生的，并如所记载的(Zeng et al.,J Virol.1998Sep；72(9):7510-22)通过同源重组引入全长克隆。通过DNA测序证实了所述突变。突变型DV的RNA是通过体外转录合成的，如Polo et al.,J Virol.1997；71(7):5366-74所记载的。
突变型DV的生长动力学显示感染的Vero细胞(ATCC CCL-81)(人)和感染的C6/36细胞(CRL-1660)(蚊子)之间病毒生长的差异。在人Vero细胞和蚊子C6/36细胞中测试了野生型DV2(DENV2)prM(SEQ ID NO:3)和四个突变体的生长，其中弗林蛋白酶识别位点的Glu(DENV2的E)被替换为Arg(R)(D2-89R,SEQ ID NO:4)、Val(V)(D2-89V,SEQ ID NO:5)、Ser(S)(D2-89S,SEQ ID NO:6)或Gly(G)(D2-89G)，SEQ ID NO:7)。
D2-89R突变体(其中Glu被R替换)在昆虫细胞中增殖，且显示在人类细胞中没有复制。
实施例3
由来自DV1，Western Pacific,74毒株(Genbank No.U88536)的全长感染性cDNA克隆，用DV的第二种血清型产生突变体。突变型DNA片段是由PCR产生，并如所记载的(arkoffet al.,J Virol.2002；76(7):3318-28)通过同源重组引入全长克隆。通过DNA测序证实了所述突变。突变型DV的RNA是通过体外转录合成的，如Polo等人所记载的。
DV突变体的生长动力学显示感染的Vero细胞(ATCC CCL-81)(人)和感染的C6/36细胞(CRL-1660)(蚊子)之间病毒生长的差异。
实施例4
如实施例2和3所述制备DV1突变体，其包含以下序列：
CSQTGEHRRRKRSVALAPHVGLGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRH(SEQ ID NO:17)。
该序列从DV1 prM多肽的第80位氨基酸开始，并且在共有弗林蛋白酶四肽中，D被改为R。在上述序列中，R和S之间发生切割。
突变型DV1的生长动力学显示感染的Vero细胞(ATCC CCL-81)(人)和感染的C6/36细胞(CRL-1660)(蚊子)之间病毒生长的差异。
实施例5
采用已知的方法使用可商购的DV prM mAb，并比较条带强度和条带大小以推断分子量的蛋白质印迹分析表明，突变型DV的弗林蛋白酶切割效率在Vero细胞(CCL-81)和C6/36细胞(CRL-1660)中均有提高。
实施例6
通过间接免疫荧光染色法研究了突变型DV在哺乳动物细胞中的生长。在Polo等人的方法中使用了来自ATCC(HB-112)的mAb 4G2。
对于使用亲代DV2病毒的阳性对照，在感染后1天至3天观察到阳性荧光，其具有增加的亮度，以及增加的阳性细胞数。另一方面，当使用突变型D2-89R进行感染时，荧光细胞的强度和数量在这段时间内逐渐减少。感染后1至3天没有形成新菌落。
因此，突变型D2-89R在人类细胞中仅引发单独一轮感染，不产生传染性子代病毒粒子。
实施例7
为了验证突变型D2-89R在人类细胞中的生长受限，在体外用DV2或D2-89R感染皮肤成纤维细胞(CRL-2522，ATCC)，并如本文所述的通过在感染后的不同时间(小时)(hpi)的免疫荧光评估病毒包膜抗原的存在。DV2在CRL-2522细胞中增殖并产生子代病毒，而突变型D2-89R则没有。
在野生型DV2病毒感染的细胞中观察到病毒粒子的产生随时间逐渐增加，表明感染细胞中的病毒复制活跃。
另一方面，突变型D2-89R感染的细胞没有产生任何病毒子代。
实施例8
为了评估目的突变型DV的哺乳动物细胞特异性生长限制针对DV激发的保护功效，使6周龄AG129小鼠组(N＝6/组)接受105感染单位(IU)的突变型D2-89R的单次腹腔内(ip)免疫接种。对照组小鼠腹腔内(ip)注射50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
这两组小鼠在免疫接种后没有表现出任何明显不同的运动(mobility)和行为。
免疫接种后10天，使注射D2-89R的小鼠和PBS对照AG129小鼠腹腔内(ip)注射105噬菌斑形成单位(PFU)的DV2(其为100倍LD50接种)。
接种DV2的注射PBS的对照小鼠出现病毒血症。相反，突变型D2-89R的单次免疫接种在任意时间点(N＝10)均针对DV2激发提供了完全的保护，而没有可检测的病毒血症(<100拷贝/ml)。
此外，所有暴露于D2-89R的小鼠在整个实验过程中都是健康的，而所有仅暴露于PBS的小鼠在DV2激发后死亡，参见图1。
实施例9
为了评估DV突变体的安全性，使用AG129小鼠，因为AG129小鼠可被低至1PFU病毒的DV2致命地感染。
一组6个成年AG129接受106IU的突变型D2-89R，腹腔内(ip)。对于对照组，使每组数量相等的小鼠腹腔内(ip)注射101、102和103PFU的DV2。通过RT-PCR定量DV2和D2-89R注射后的病毒载量。
感染DV2的小鼠组出现了可检测的病毒血症，并且在感染后全部死亡。
在另一方面，暴露于突变型D2-89R的小鼠没有可检测的病毒血症，并且所有小鼠在实验期间(15天)均存活下来，没有任何疾病迹象和体重变化。
实施例10
ZV电子致密核衣壳是由C(衣壳)蛋白和基因组RNA组成。包膜蛋白E和膜(M)蛋白嵌入脂质双层中(Russell et al.,Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses,in Schlesinger,ed.,The Togaviruses:Biology,Structure,Replication.New York:Academic；1980:503-529；和Trent&Naeve,Biochemistry and Replication,in Monath,ed.St.Louis Encephalitis.Washington,DC:American Public Health Association；1980p.159-199)。
ZV基因组是约10-11kb的单链正义RNA分子，含有单个ORF，约占基因组的95％(Chambers et al.,Ann Rev Microbiol 1990,44:649-688)。感染时，传染性病毒RNA被翻译并加工成结构蛋白和非结构蛋白(Bhamarapravati&Yokan:Live attenuatedtetravalent vaccine,in Gubler&Kuno,eds.,Dengue and Dengue HemorrhagicFever.Wallingford,CAB International,1997,pp 367-377；和Falgout&Markoff,1995,The family flaviviridae and its diseases,p.47-66.in:JS Porterfield(ed.),Exotic Viral Infections.Chapman and Hall Medical,London,United Kingdom)。
实施例11
对来自ATCC的ZV MR766的全长传染性cDNA克隆进行点突变，以在哺乳动物细胞中产生生长限制。通过DNA测序证实了所述突变。通过体外转录合成突变型ZV基因组RNA，并根据制造商的说明，通过
(Mirus Bio,Madison,WI)用突变型病毒RNA转染C6/36蚊子细胞。转染后7天收集突变型ZV。在哺乳动物(Vero)细胞和C6/36细胞中测定病毒生长动力学。
在ZV基因组中诱导点突变，以改变弗林蛋白酶切割位点附近的序列，如下所示的：
野生型：
HHKKGEARRSRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN(SEQ ID NO:11)
突变体：
HHKKGEARRRRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN(SEQ ID NO:12)。
从丝氨酸到精氨酸的单个改变导致在Vero细胞中的增殖减少，而在蚊子细胞中的增殖与对照相比保持相对不变。
实施例12
遵循实施例11的方法。使用相同的Ser到Arg的置换，并用His(H)替换Glu(E)(在G和A之间)，以产生具有两个点突变的突变体。
人类细胞中的增殖减少到低于实施例11突变体中所观察到的水平，但对昆虫细胞中的复制没有影响。
实施例13
遵循实施例11的方法。实施例11中给出的序列的前12个氨基酸被TTTGEHRRRKRS(SEQ ID NO:13)所替换。
人类细胞中的增殖减少到低于实施例11突变体中所观察到的水平，但对昆虫细胞中的复制没有影响。
实施例14
遵循实施例11的方法。实施例11中给出的序列的前22个氨基酸被TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMG(SEQ ID NO:14)所替换。
人类细胞中的增殖减少到低于实施例11突变体中所观察到的水平，但对昆虫细胞中的复制没有影响。
实施例15
遵循实施例11的方法。实施例11中给出的序列的前37个氨基酸被TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAW(SEQ ID NO:15)所替换以形成ZV M2突变体。
人类细胞中的增殖减少到低于实施例11突变体中所观察到的水平，但对昆虫细胞中的复制没有影响。
实施例16
为了评估目的突变型SV的哺乳动物细胞特异性生长限制对SV激发的保护功效，使6周龄AG 129小鼠组(N＝6/组)接受105感染单位(IU)的实施例15的突变型M2的单次腹腔内(ip)免疫接种。对照小鼠腹腔内(ip)注射50μl PBS。
这两组小鼠在免疫接种后没有表现出任何明显不同的运动和行为。
免疫后14天，使注射M2的小鼠和PBS对照AG 129小鼠腹腔内(ip)注射103噬菌斑形成单位(PFU)的野生型SV(其为100倍LD50接种)。
注射PBS的对照小鼠接种SV后出现病毒血症。相比之下，用突变型M2的单次免疫接种在任意时间点(N＝10)均针对SV激发提供了完全的保护，而没有检测的病毒血症(<100拷贝/ml)。
此外，所有暴露于M2的小鼠在整个实验过程中都是健康的，而所有仅暴露于PBS的小鼠在SV激发后死亡，参见图2。
实施例17
为了评估目的突变型SV的哺乳动物细胞特异性生长限制的安全性，使6周龄AG129小鼠组(N＝6/组)接受105感染单位(IU)的突变型M2或野生型ZV的单次腹腔内(ip)免疫接种。
在整个实验过程中，暴露于M2的小鼠都是健康的，而所有仅暴露于PBS的小鼠在SV激发后死亡，参见图3。
实施例18
实施例2-9的材料和方法是使用黄热病病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的黄热病病毒突变体。
实施例19
实施例2-9的材料和方法是使用加利福尼亚脑炎病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的加利福尼亚脑炎病毒突变体。
实施例20
实施例2-9的材料和方法是使用裂谷热病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的裂谷热病毒突变体。
实施例21
实施例2-9的材料和方法是使用蜱传脑炎病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的蜱传脑炎病毒突变体。
实施例22
实施例2-9的材料和方法是使用西尼罗病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在哺乳动物细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在哺乳动物细胞中复制成功率较低的西尼罗病毒突变体。
实施例23
实施例2-9的材料和方法是使用马脑病病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在哺乳动物细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在哺乳动物细胞中复制成功率较低的马脑病病毒突变体。
实施例24
实施例2-9的材料和方法是使用科罗拉多蜱热病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的科罗拉多蜱热病毒突变体。
实施例25
实施例2-9的材料和方法是使用基孔肯雅病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的基孔肯雅病毒突变体。
实施例26
实施例2-9的材料和方法是使用非洲猪瘟病毒的典型株进行。
定位prM弗林蛋白酶识别位点，并根据上文所提供的和本领域中已知的方式进行氨基酸置换。目的突变体被鉴定为那些在人类细胞中不再增殖或以较低水平增殖的突变体，如上文所提供的。氨基酸的改变，如置换、插入、缺失、化学修饰等，也是在弗林蛋白酶切割位点的上游和/或下游进行的。
鉴定了在昆虫细胞中复制，但在人类细胞中复制成功率较低的非洲猪瘟病毒突变体。
实施例27
将成年恒河猴分为实验组和对照组，每组4-6只动物。实验组动物接受不同剂量(105-1010IU)的实施例2的突变型D2-89R。对照组动物接受等体积的PBS。
在此期间，对动物进行4周的饲养，对动物进行循环抗登革抗体、病毒载量和细胞免疫荧光测试，以检测病毒的存在、程度和数量及宿主对其的反应，并监测登革感染的任何症状，如发烧和体重减轻。
然后，使用野生型DV2激发动物，并监测症状(如发烧和体重减轻)和血清学参数(如病毒载量和登革抗体)。
对照动物表现出登革感染的症状，而接受目的突变体的猴子则无症状。
实施例28
将成年恒河猴分为实验组和对照组，每组4-6只动物。实验组动物接受不同剂量(105-1010IU)的实施例4的DV1突变体。对照组动物接受等体积的PBS。
在此期间，对动物进行4周的饲养，对动物进行循环抗登革抗体、病毒载量和细胞免疫荧光测试，以检测病毒的存在、程度和数量及宿主对其的反应，并监测登革感染的任何症状，如发烧和体重减轻。
然后，使用野生型DV1激发动物，并监测症状(如发烧和体重减轻)和血清学参数(如病毒载量和登革抗体)。
对照动物表现出登革感染的症状，而接受目的突变体的猴子则无症状。
实施例29
将成年恒河猴分为两个实验组和两个对照组，每组4-6只动物。实验组动物接受不同剂量(105-1010IU)的实施例14的突变型寨卡病毒。对照组动物接受等体积的PBS。
在此期间，对动物进行4周的饲养，对动物进行循环抗寨卡抗体、病毒载量和细胞免疫荧光测试，以检测病毒的存在、程度和数量及宿主对其的反应，并监测寨卡感染的任何症状，如发烧、病毒血症、皮疹和体重减轻。
然后，使用野生型ZV激发动物。一对实验组和对照组用野生型ZV非洲毒株激发，另一对实验组和对照组用野生型ZV亚洲毒株激发。监测动物的症状(如发烧、皮疹和体重减轻)和血清学参数(如病毒载量和寨卡抗体)。
对照动物表现出寨卡感染的症状，而接受目的突变体的猴子则无症状。
实施例30
将成年恒河猴分为两个实验组和两个对照组，每组4-6只动物。实验组动物接受不同剂量(105-1010IU)的实施例15的突变型寨卡病毒。对照组动物接受等体积的PBS。
在此期间，对动物进行4周的饲养，对动物进行循环抗寨卡抗体、病毒载量和细胞免疫荧光测试，以检测病毒的存在、程度和数量及宿主对其的反应，并监测寨卡感染的任何症状，如发烧、病毒血症、皮疹和体重减轻。
然后，使用野生型ZV激发动物。一对实验组和对照组用野生型ZV非洲毒株激发，另一对实验组和对照组用野生型ZV亚洲毒株激发。监测动物的症状(如发烧、皮疹和体重减轻)和血清学参数(如病毒载量和寨卡抗体)。
对照动物表现出寨卡感染的症状，而接受目的突变体的猴子则无症状。
本文引用的所有参考文献均通过引用的方式全文纳入本文。
应当理解的是，对本文所描述的目前优选的实施方案的各种变化和修饰对本领域技术人员来说将是显而易见的。此类变化和修饰可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行，并且不削弱其预期的优势。因此，这些变化和修饰旨在包括在所附权利要求中。
Claims (20)
1.一种虫媒病毒粒子，其包含生长受限的虫媒病毒，该虫媒病毒包含在前体多聚蛋白中的功能障碍的弗林蛋白酶四肽切割位点，和任选地，所述位点上游的第一段氨基酸中的改变和/或所述位点下游的第二段氨基酸中的改变。
2.权利要求1所述的粒子，其中所述位点包含共有序列Arg-X-Lys/Arg-Arg(SEQ IDNO:16)。
3.权利要求2所述的粒子，其中X包含Arg。
4.权利要求1所述的粒子，其中所述第一段包含与所述位点相邻的8个氨基酸。
5.权利要求1所述的粒子，包含在所述第一段中的改变。
6.权利要求1所述的粒子，包含在所述第二段中的改变。
7.权利要求1所述的粒子，其中所述多聚蛋白包括prM。
8.权利要求1所述的粒子，其中所述多聚蛋白包括prE2。
9.权利要求1所述的粒子，包含登革病毒(DV)。
10.权利要求1所述的粒子，包含寨卡病毒(ZV)。
11.一种组合物，其包含权利要求1所述的粒子和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.一种昆虫细胞，其包含权利要求1所述的粒子。
13.权利要求12所述的细胞，其中所述昆虫包括节肢动物。
14.权利要求12所述的细胞，其中所述昆虫包括蜱或蚊子。
15.一种哺乳动物细胞，其包含权利要求1所述的粒子。
16.权利要求15所述的细胞，其中所述细胞表达DV抗原。
17.权利要求15所述的细胞，其中所述细胞在所述细胞的表面表达DV抗原。
18.权利要求15所述的细胞，其中所述细胞表达ZV抗原。
19.权利要求15所述的细胞，其中所述细胞在所述细胞的表面表达ZV抗原。
20.权利要求15所述的细胞，其包括人类细胞。
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