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CN111334471A - Pbmc体外3d琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 - Google Patents

Pbmc体外3d琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 Download PDF

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CN111334471A CN202010228113.2A CN202010228113A CN111334471A CN 111334471 A CN111334471 A CN 111334471A CN 202010228113 A CN202010228113 A CN 202010228113A CN 111334471 A CN111334471 A CN 111334471A
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韩莉
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Abstract

本发明公开了一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基溶液10mg/mL,胎牛血清10‑20v/v%,琼脂糖0.3‑0.5wt%;其制备方法包括以下步骤:步骤一、配制4%琼脂糖溶液;步骤二、配制1%琼脂糖溶液;步骤三、所需细胞液体量计算;步骤四、配制3D培养基。本发明提供的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基配方简单、制备容易、成本可控,有利于大规模、标准化生产,可用于体外诊断目的的PBMC培养,可以充分模拟和反映PBMC在体内的生理活性,从而为进一步检测奠定基础。

Description

PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域,具体涉及一种人外周血单个核细胞体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法。
背景技术
体外细胞培养是指通过模拟机体内的生理条件,将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等,在体外进行培养,并使其继续生存、生长和繁殖的过程。体外细胞培养已经成为现代生物研究的基本技术之一,广泛应用于现代生物医学和生物科学研究的各个方面。
目前,体外细胞水平的研究很大程度上是在二维培养条件下完成的。当细胞在二维条件下生长时,由于细胞与其基质之间复杂的细胞信号无法再现,细胞逐渐丧失了其体内原有的性状,在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远,因此体外实验数据无法完全转化为临床试验。近年来发展的3D(三维,three-dimensional)细胞培养技术则是应对这一挑战,作为一个更好的模型而更准确地体现体内生理条件,因此3D体外细胞培养方法获得的细胞在形态结构、增殖分化、基因表达及细胞的功能活动等方面均与二维培养存在显著不同。3D细胞培养能更好的模拟体内细胞生长的微环境,克服二维细胞培养方式的缺陷,为细胞水平的研究提供了一种更简单、更安全、更可靠的方法。
细胞在体外培养主要呈现悬浮型和贴壁型两种状态。其中贴附型细胞包括1、成纤维细胞型;2、上皮型细胞;3、游走细胞型;4、多型细胞型。悬浮型细胞见于少数特殊的细胞,如PBMC(外周血单个核细胞)、某些类型的癌细胞及白血病细胞。悬浮型细胞胞体呈圆形,不贴于支持物上,呈悬浮生长。与之对应,细胞体外培养也分为两大类如下:
一、贴壁培养法:指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长,大多数动物细胞,包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。其基本操作过程是:先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液,经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中,再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察,适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性,一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制,细胞产量有限。如要继续培养,还需将已形成单层的细胞再分散,稀释后重新接种,然后进行传代培养。
二、悬浮培养法:指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程,使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。悬浮培养法是在微生物发酵的基础上发展起来的,主要用于非贴壁依赖型细胞培养,如人外周血单个核细胞(PBMC)、杂交瘤细胞等。该法将采集到的活体动物组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种到适宜的培养液中,并置于特定条件下进行自由悬浮培养。便于进行定量研究。适于悬浮培养的动物细胞种类很少,大多数动物细胞属于贴壁依赖性的,因此不能悬浮培养。
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶,分为一般琼脂糖和经化学修饰后熔点降低的低熔点琼脂糖。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。低熔点琼脂糖的熔点在62~65℃之间,融化后在37℃下可维持液态数小时,30℃时凝固成胶。标准熔点的琼脂糖凝胶可用于制备适于鉴定小片段DNA,RNA和≦1kb的PCR产物,主要用于分析电泳,以提高跑胶和印迹的速度。低熔点琼脂糖所制凝胶具有更高的筛过特性,更透明,是理想的DNA和RNA电泳产品,也适合组织培养细胞的克隆和病毒空斑分析。
发明内容
PBMC作为悬浮型细胞,更适合于使用3D培养体系进行体外培养,本发明提供了一种均一、稳定的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法。具体技术方案如下:
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基溶液10mg/mL,胎牛血清10-20v/v%,琼脂糖0.3-0.5wt%。
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、配制4%琼脂糖溶液:称取0.4g琼脂糖溶液,准备100mL试剂瓶加入10mL三蒸水,将称取完成的琼脂糖溶液缓慢撒入三蒸水溶液内,进行溶解;采用高温高压灭菌锅灭菌,灭菌结束后,取出放入50℃水浴箱60min,冷却至50℃,待用;
步骤二、配制1%琼脂糖溶液:取步骤一配制的10mL 4%琼脂糖溶液,依次加入4X1640培养基(40mg/mL)10mL,三蒸水14-17mL,胎牛血清3-6mL;最终配制成40mL总体积;
步骤三、所需细胞液体量计算:按琼脂糖最终浓度为H计算,(1)确定最终需要的细胞培养体积,假设为X mL;确定需要的最终细胞培养浓度,假设E万细胞/mL;如果待培养细胞液浓度为F万/mL,则需要细胞液体Y mL=E X/F;(2)所需1%琼脂糖液体量Z计算:Z mL=H*X;(3)所需1640培养液:M mL=X-Y-Z;
步骤四、配制3D培养基:根据步骤四的计算结果,将Y mL的细胞液、Z mL的1%琼脂糖溶液及M mL的1640培养液充分混合后备用。
进一步地,步骤一中溶解操作具体为微波炉低火2min。
进一步地,步骤一中灭菌条件为高温高压灭菌锅120℃,20min。
本发明通过将琼脂糖与适合的培养基结合,通过对二者配比进行优化,配制成稳定的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,对PBMC细胞培养能够达到较高的扩增倍数及细胞纯度,在细胞形态、增殖分化、基因表达及细胞的功能活动方面与体内接近,可用于体外诊断目的的PBMC培养,从而为进一步的检测奠定了基础。
本发明提供的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法,与现有技术相比具有以下有益效果:
1.本发明提供的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基配方简单、制备容易、成本可控,有利于大规模、标准化生产;
2.本发明提供的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基用于体外诊断目的的PBMC培养,可以充分模拟和反映PBMC在体内的生理活性,从而为进一步检测奠定基础。
附图说明
图1为不同琼脂糖含量的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基PBMC细胞培养刃天青染色结果。
图2为不同琼脂糖含量的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基PBMC细胞培养活性细胞荧光结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合附图及本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基10mg/mL,胎牛血清15v/v%,琼脂糖0.3wt%。
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、配制4%琼脂糖溶液:称取0.4g琼脂糖溶液,准备100mL试剂瓶加入10mL三蒸水,将称取完成的琼脂糖溶液缓慢撒入三蒸水溶液内,采用微波炉低火处理2min进行溶解;灭菌:采用高温高压灭菌锅灭菌,灭菌条件120℃,20min,灭菌结束后,取出放入50℃水浴箱60min,冷却至50℃,待用;
步骤二、配制1%琼脂糖溶液:取步骤一配制的10mL 4%琼脂糖溶液,依次加入4X1640培养基(40mg/mL)10mL,三蒸水14mL,胎牛血清6mL;最终配置成40mL总体积;
步骤三、细胞分离:
1.取血液5mL
2.加Hanks液2mL适度稀释血液
3.稀释血液
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内,在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)
4.离心
4.1.离心条件:2500rpm,25min
5.吸取白膜层
6.洗涤白膜层
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中,加两倍PBS稀释后离心(1500rpm,5min)
6.2.离心(1500rpm,5min)后,再次弃去上清液,加同等量PBS再次洗涤
7.计数
7.1.离心后,弃去上清液,加入1mL培养基吹打均匀
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为:10ul cell悬液+90ul培养基)
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/mL
8.细胞培养
8.1.配置细胞培养液:主要成份为1640培养基(10mg/mL)、的胎牛血清(15%v/v%)
8.2.每一百万细胞加1mL培养液(根据实验调整密度,最大密度不超过200万/mL),如:计数为一千三百万,即加培养液10.3mL
8.3.阴性对照:从上步已配好的细胞培养液中抽取1mL,作为阴性对照
8.4.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本,加入PHA(3ul/mL),混匀待用
步骤四、所需细胞液体量计算:按琼脂糖最终浓度为0.3%计算,(1)确定最终需要的细胞培养体积X为60mL;确定需要的最终细胞培养浓度为50万细胞/mL;待培养细胞液浓度为120万/mL,则需要细胞液体Y mL=50*60/120=25mL;(2)所需1%琼脂糖液体量Z计算:Z mL=30%*60=18mL;(3)所需胎牛血清用量:M mL=15%*60=9mL;(4)所需1640培养液:M mL=X-Y-Z-M=60-25-18-9=8mL;
步骤五、配制3D培养基:根据步骤四的计算结果,将25mL的细胞液、18mL的1%琼脂糖溶液、9mL的胎牛血清及8mL的1640培养液充分混合后备用。
步骤六、细胞培养:将所有孔内液体混匀,室温下(25-30℃)约30分钟形成水凝胶,然后放入二氧化碳培养箱(37℃,5%CO2)培养。
实施例2
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基10mg/mL,胎牛血清15v/v%,琼脂糖0.4wt%。
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、配制4%琼脂糖溶液:称取0.4g琼脂糖溶液,准备100mL试剂瓶加入10mL三蒸水,将称取完成的琼脂糖溶液缓慢撒入三蒸水溶液内,采用微波炉低火处理2min进行溶解;灭菌:采用高温高压灭菌锅灭菌,灭菌条件120℃,20min,灭菌结束后,取出放入50℃水浴箱60min,冷却至50℃,待用;
步骤二、配制1%琼脂糖溶液:取步骤一配制的10mL 4%琼脂糖溶液,依次加入4X1640培养基(40mg/mL)10mL,三蒸水14mL,胎牛血清6mL;最终配置成40mL总体积;
步骤三、细胞分离:
1.取血液5mL
2.加Hanks液2mL适度稀释血液
3.稀释血液
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内,在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)
4.离心
4.1.离心条件:2500rpm,25min
5.吸取白膜层
6.洗涤白膜层
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中,加两倍PBS稀释后离心(1500rpm,5min)
6.2.离心(1500rpm,5min)后,再次弃去上清液,加同等量PBS再次洗涤
7.计数
7.1.离心后,弃去上清液,加入1mL培养基吹打均匀
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为:10ul cell悬液+90ul培养基)
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/mL8.细胞培养
8.1.配置细胞培养液:主要成份为1640培养基(10mg/mL)、的胎牛血清(15%v/v%)
8.2.每一百万细胞加1mL培养液(根据实验调整密度,最大密度不超过200万/mL),如:计数为一千三百万,即加培养液10.3mL
8.3.阴性对照:从上步已配好的细胞培养液中抽取1mL,作为阴性对照
8.4.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本,加入PHA(3ul/mL),混匀待用
步骤四、所需细胞液体量计算:按琼脂糖最终浓度为0.3%计算,(1)确定最终需要的细胞培养体积X为60mL;确定需要的最终细胞培养浓度为50万细胞/mL;待培养细胞液浓度为120万/mL,则需要细胞液体Y mL=50*60/120=25mL;(2)所需1%琼脂糖液体量Z计算:Z mL=40%*60=24mL;(3)所需胎牛血清用量:M mL=15%*60=9mL;(4)所需1640培养液:M mL=X-Y-Z-M=60-25-24-9=2mL;
步骤五、配制3D培养基:根据步骤四的计算结果,将25mL的细胞液、24mL的1%琼脂糖溶液、9mL的胎牛血清及2mL的1640培养液充分混合后备用。
步骤六、细胞培养:将所有孔内液体混匀,室温下(25-30℃)约30分钟形成水凝胶,然后放入二氧化碳培养箱(37℃,5%CO2)培养。
实施例3
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基10mg/mL,胎牛血清15v/v%,琼脂糖0.5wt%。
一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、配制4%琼脂糖溶液:称取0.4g琼脂糖溶液,准备100mL试剂瓶加入10mL三蒸水,将称取完成的琼脂糖溶液缓慢撒入三蒸水溶液内,采用微波炉低火处理2min进行溶解;灭菌:采用高温高压灭菌锅灭菌,灭菌条件120℃,20min,灭菌结束后,取出放入50℃水浴箱60min,冷却至50℃,待用;
步骤二、配制1%琼脂糖溶液:取步骤一配制的10mL 4%琼脂糖溶液,依次加入4X1640培养基(40mg/mL)10mL,三蒸水14mL,胎牛血清6mL;最终配置成40mL总体积;
步骤三、细胞分离:
1.取血液5mL
2.加Hanks液2mL适度稀释血液
3.稀释血液
3.1.取淋巴细胞分离液置于离心管内,在分离液上层1cm处缓慢加入稀释血液(稀释血液与分离液体积比例为2:1)
4.离心
4.1.离心条件:2500rpm,25min
5.吸取白膜层
6.洗涤白膜层
6.1.将白膜层吸取到新的离心管中,加两倍PBS稀释后离心(1500rpm,5min)
6.2.离心(1500rpm,5min)后,再次弃去上清液,加同等量PBS再次洗涤
7.计数
7.1.离心后,弃去上清液,加入1mL培养基吹打均匀
7.2.将吹打均匀的细胞予以稀释(稀释比例为:10ul cell悬液+90ul培养基)
7.3.计数得:细胞总数/4×10cells/mL
8.细胞培养
8.1.配置细胞培养液:主要成份为1640培养基(10mg/mL)、的胎牛血清(15%v/v%)
8.2.每一百万细胞加1mL培养液(根据实验调整密度,最大密度不超过200万/mL),如:计数为一千三百万,即加培养液10.3mL
8.3.阴性对照:从上步已配好的细胞培养液中抽取1mL,作为阴性对照
8.4.其它含细胞的培养液作为试验细胞培养标本,加入PHA(3ul/mL),混匀待用
步骤四、所需细胞液体量计算:按琼脂糖最终浓度为0.3%计算,(1)确定最终需要的细胞培养体积X为60mL;确定需要的最终细胞培养浓度为50万细胞/mL;待培养细胞液浓度为150万/mL,则需要细胞液体Y mL=50*60/150=20mL;(2)所需1%琼脂糖液体量Z计算:Z mL=50%*60=30mL;(3)所需胎牛血清用量:M mL=15%*60=9mL;(4)所需1640培养液:M mL=X-Y-Z-M=60-20-30-9=1mL;
步骤五、配制3D培养基:根据步骤四的计算结果,将20mL的细胞液、30mL的1%琼脂糖溶液、9mL的胎牛血清及1mL的1640培养液充分混合后备用。
步骤六、细胞培养:将所有孔内液体混匀,室温下(25-30℃)约30分钟形成水凝胶,然后放入二氧化碳培养箱(37℃,5%CO2)培养。
PBMC细胞体外培养试验
采用本发明实施例1~3和对比例1提供的PBMC体外培养基对PBMC细胞进行培养,在培养第4天采取刃天青染色及酶标仪读取荧光读数(反映活细胞数量),结果如图1、图2所示。
结果分析:
1、通过对比阳性和阴性培养结果(阴、阳性的区别在于是否添加淋巴细胞增生刺激剂PHA)可以看出,在本发明涉及的琼脂糖3D培养体系下,淋巴细胞在阴、阳性环境下均保持了细胞的活性;
2、本发明涉及的琼脂糖3D培养体系下,阳性环境检测到的活性细胞荧光数显著高于阴性环境,表明可以反映代表细胞数量和活性,从而为体外定性和半定量检测淋巴细胞数量和活性建立基础。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换,只要不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基,其特征在于,所述培养基含有以下组分:1640培养基、胎牛血清、琼脂糖;各组分含量如下:1640培养基溶液10mg/mL,胎牛血清10-20v/v%,琼脂糖0.3-0.5wt%。
2.一种权利要求1所述PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、配制4%琼脂糖溶液:称取0.4g琼脂糖溶液,准备100mL试剂瓶加入10mL三蒸水,将称取完成的琼脂糖溶液缓慢撒入三蒸水溶液内,进行溶解;采用高温高压灭菌锅灭菌,灭菌结束后,取出放入50℃水浴箱60min,冷却至50℃,待用;
步骤二、配制1%琼脂糖溶液:取步骤一配制的10mL 4%琼脂糖溶液,依次加入4X1640培养基(40mg/mL)10mL,三蒸水14-17mL,胎牛血清3-6mL;最终配制成40mL总体积;
步骤三、所需细胞液体量计算:按琼脂糖最终浓度为H计算,(1)确定最终需要的细胞培养体积,假设为X mL;确定需要的最终细胞培养浓度,假设E万细胞/mL;如果待培养细胞液浓度为F万/mL,则需要细胞液体Y mL=E X/F;(2)所需1%琼脂糖液体量Z计算:Z mL=H*X;(3)所需1640培养液:M mL=X-Y-Z;
步骤四、配制3D培养基:根据步骤四的计算结果,将Y mL的细胞液、Z mL的1%琼脂糖溶液及M mL的1640培养液充分混合后备用。
3.根据权利要求2所述PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基的制备方法,其特征在于,步骤一中溶解操作具体为微波炉低火2min。
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