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CN111328347A - 通过与p21共表达来增加植物中感兴趣基因的表达的方法和组合物 - Google Patents

通过与p21共表达来增加植物中感兴趣基因的表达的方法和组合物 Download PDF

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CN111328347A
CN111328347A CN201880072979.XA CN201880072979A CN111328347A CN 111328347 A CN111328347 A CN 111328347A CN 201880072979 A CN201880072979 A CN 201880072979A CN 111328347 A CN111328347 A CN 111328347A
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plant
polynucleotide
cell
gene
heterologous
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李兴鹏
何逸建
E·E·海特三世
D·M·劳森
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RJ Reynolds Tobacco Co
Original Assignee
RJ Reynolds Tobacco Co
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Abstract

提供通过感兴趣基因与p21多核苷酸共表达来增加植物中感兴趣基因表达的方法和组合物。感兴趣的基因可以是相对于植物内源的或异源的。还提供含有异源p21多核苷酸的植物，例如烟草植物。当与对照植物进行比较时，植物中p21多核苷酸与感兴趣基因的共表达增加了感兴趣基因的表达。因此，p21共表达可以增加对蛋白进行编码的感兴趣基因的表达，所述蛋白为例如植物中的防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。

Description

通过与P21共表达来增加植物中感兴趣基因的表达的方法和 组合物
发明领域
本公开涉及用于增强植物中感兴趣基因的表达的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及采用p21多核苷酸与感兴趣基因共表达的方法和组合物。
背景技术
使用重组蛋白作为药物和用于工业过程正在迅速增加，并将继续增加。低生产水平限制了许多有价值的工业和药用蛋白的商业生产。外来蛋白可能易受细胞内和细胞外蛋白酶的降解作用以及其他生产条件的影响。相应地，所产生的蛋白通常对宿主细胞的代谢和生长有害。过去已经开发了各种各样的宿主细胞体系。一个示例是植物细胞，其优点是被认为安全且便宜。
长期以来，植物蛋白和酶已被用于许多目的，从可行的食物来源到生物催化试剂或治疗剂。转基因和转染植物的开发以及遗传分析的改进为这些应用带来了新的科学意义和经济激励。分子植物育种和分子植物耕种的概念受到了极大的关注，其中，植物体系被用作生物反应器以产生重组生物活性材料。因此，用于增加感兴趣基因表达的方法可以创建呈现出商业上重要的表型特性的植物。因此，希望提供一种改进的方法来增加植物中感兴趣基因的表达。
发明内容
本公开提供了增加植物中感兴趣基因表达的方法和组合物，包括使p21多核苷酸与感兴趣基因共表达。p21多核苷酸可以具有与SEQ ID NO：1或其活性片段或变体具有至少80％序列相同性的核酸序列。在具体实施方式中，p21多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1的核酸序列的多核苷酸。同样，异源p21多核苷酸可以编码p21多肽，该p21多肽包含与SEQ IDNO：2具有至少80％相同性的氨基酸序列。在具体实施方式中，异源p21多核苷酸可以对包含SEQ ID NO:2的p21多肽进行编码。在一些实施方式中，p21多核苷酸的片段和变体编码含pfam11757结构域(domain)的多肽。当与对照植物进行比较时，感兴趣基因的表达可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。对照植物可以包括感兴趣基因，但是不会表达p21多核苷酸。
在一些实施方式中，与p21多核苷酸共表达的感兴趣基因对选自下组的蛋白或肽进行编码：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。例如，防御蛋白可以是抗体，例如，单克隆抗体。酶可以是α-半乳糖苷酶或溶酶体酸性脂肪酶。信号蛋白可以是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。报告蛋白可以是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方式中，感兴趣的基因编码治疗性蛋白。在具体实施方式中，感兴趣基因是相对于植物内源的或相对于植物异源的。
p21多核苷酸可以操作性连接至植物中有活性的启动子。在具体实施方式中，启动子是植物中有活性的组成型启动子。例如，组成型启动子可以是CaMV 35S启动子。在一些实施方式中，p21多核苷酸操作性连接至植物中有活性的启动子和/或感兴趣基因。
将p21多核苷酸引入植物中可以通过用包含p21多核苷酸的农杆菌tDNA载体转化植物来完成。在一些实施方式中，可以用包含表达构建体的载体(例如病毒载体)将p21多核苷酸引入植物中，所述表达构建体包含p21多核苷酸。
本文所公开的组合物和方法中所用植物包括作物植物，例如烟草植物。烟草植物可以是：例如，普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、或黄花烟草(Nicotiana rustica)。因此，本文提供包含异源p21多核苷酸的转基因植物。p21多核苷酸可以具有与SEQ ID NO：1或其活性片段或变体具有至少80％序列相同性的核酸序列。在具体实施方式中，p21多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方式中，p21多核苷酸的片段和变体编码含pfam11757结构域(domain)的多肽。除了异源p21多核苷酸之外，转基因植物还可以包含对选自下组的蛋白或肽进行编码的至少一种感兴趣基因：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。
附图说明
图1显示当与P19、P21共表达或无共表达时绿色荧光蛋白(GFP)的表达。括号中的数字是代表农杆菌浓度的OD600数。各浸润处理的总OD600数和总浓度相同。如图所示，p21和p19两者均可增强GFP的表达。然而，与p21共表达的GFP表达可能比与p19共表达的GFP表达更高。
图2显示了用GFP构建体浸润后在UV光下检查本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中GFP基因的表达水平。
图3显示了使用GFP ELISA试剂盒比较GFP蛋白表达水平。与P21和P19共表达的表达针对无共表达的GFP表达进行标准化。该图显示了三个技术重复的结果。误差线代表标准差。
具体实施方式
现在，本发明将在下文进行更详细地描述。本发明可以以许多不同的形式实施，不应解释为限于本文所述方面；并且，这些方面用来使得本发明的公开内容满足法律上的要求。本文中，类似的附图标记指代类似的元件。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代物，除非上下文中另有明确的说明。
本公开提供了通过植物中的p21多核苷酸与感兴趣基因共表达来增加植物中感兴趣基因表达的方法和组合物。如本文所用“p21”多核苷酸是指从烟草病毒(例如烟草病毒1，一种来自普通烟草(Nicotiana tabacum)的线性病毒(closteovirus))分离的p21多核苷酸。在具体实施方式中，本文所公开的方法和组合物中使用的p21多核苷酸包括SEQ ID NO:1或其片段或变体。下表1中提供了p21多核苷酸和多肽的完整核苷酸和氨基酸序列。感兴趣基因与p21多核苷酸的共表达可以是指感兴趣基因与p21多核苷酸的重叠时序表达。在一些实施方式中，共表达是指感兴趣基因与p21多核苷酸的表达，以使得p21多核苷酸表达的产物存在于感兴趣基因表达期间。
因此，当与对照植物进行比较时，植物中p21多核苷酸与感兴趣基因的共表达增加了感兴趣基因的表达。因此，本文提供了通过将p21多核苷酸引入包含感兴趣基因的植物细胞中来增加感兴趣基因表达的方法。同样，提供了包含异源p21多核苷酸和感兴趣基因的植物。
p21多核苷酸的共表达可以增加植物中任意感兴趣基因的表达。感兴趣基因的表达可以增加约10％至大于约90％，包括大于约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、和约80％。在具体实施方式中，当与对照植物的感兴趣基因的表达进行比较时，p21多核苷酸共表达使感兴趣基因的表达增加约100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。p21或感兴趣基因的表达可以通过本领域中用于测定基因表达的任意方法来测定。在一些实施方式中，表达可以通过测定mRNA、蛋白或任何其他基因表达产物的总量来测定。例如，基因表达可以通过核酸分析法(如PCR或RT-PCR)来测定，或者可以通过蛋白检测法(如Western印迹分析)或任意免疫检测法来测定。
感兴趣基因可以是植物细胞中能够表达的任意基因。在具体实施方式中，感兴趣基因对包括如下的蛋白或肽进行编码：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。例如，感兴趣基因可以编码蛋白，例如抗体。抗体可以是单克隆抗体，包括治疗性单克隆抗体。治疗性单克隆抗体包括但不限于：阿昔单抗(abciximab)(Reopro)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira、Amjevita)、阿多曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumab emtansine)、阿拉发普特(alefacept)(Amevive)、阿仑组单抗(alemtuzumab)(Campath)、巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)、贝利木单抗(belimumab)(Benlysta)、贝伐单抗(bevacizuma)(Avastin)、贝兹罗妥单抗(bezlotoxumab)(Zinplava)、布妥昔单抗(brentuximab vedotin)(Adcetris)、卡那单抗(canakinumab)(Ilaris)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol)(Cimzia)、西昔妥单抗(cetuximab)(Erbitux)、达克珠单抗(daclizumab)(Zenapax、Zinbryta)、地诺珠单抗(denosumab)(Prolia、Xgeva)、依库珠单抗(eculizumab)(Soliris)、依法珠单抗(efalizumab)(Raptiva)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)、戈利木单抗(golimumab)(Simponi、Simponi Aria)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)、英夫利昔单抗(inflectra)(Remicade)、伊匹单抗(ipilimumab)(Yervoy)、伊希珠单抗(Ixekizumab)(Taltz)、莫维珠单抗(motavizumab)(Numax)、莫罗单抗-CD3(muronomab-CD3)(OKT3)、那他珠单抗(natalizumab)(Tysabri)、纳武单抗(nivolumab)(Opdivo)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)(Gazyva)、奥拉单抗(olaratumab)(Lartruvo)、奥法木单抗(ofatumumab)(Arzerra)、奥马珠单抗(omalizumab)(Xolair)、帕利珠单抗(palivizumab)(Synagis)、帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(Perjeta)、兰尼单抗(ranibizumab)(Lucentis)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)(ABThrax)、利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan)、托珠单抗(tocilizumab)(Actemra)、托西莫单抗-I-131(tositumomab-I-131)(Bexxar)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin)、尤特科单抗(ustekinumab)(Stelara)、苏金单抗(secukinumab)(Cosentyx)、优特克单抗(ustekinumab)(Stelara)。
感兴趣基因可以编码酶，例如α-半乳糖苷酶或溶酶体酸性脂肪酶。在具体实施方式中，感兴趣基因可以编码信号蛋白，所述信号蛋白包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在一些实施方式中，感兴趣的基因编码报告蛋白，所述报告蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)。
可以使用本文所公开方法和组合物由感兴趣基因产生的酶的示例包括但不限于：葡聚糖酶、凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、糖酶(saccharidase)、脱氢酶、核酸酶、葡萄糖氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶(如真菌过氧化物酶和漆酶)、木聚糖酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶。该发明还可以用于产生酶，例如用于洗涤剂的酶、凝乳酶、辣根过氧化物酶、来自其他植物的淀粉酶、土壤修复酶和其他此类工业蛋白。
使用本发明可以产生的蛋白的示例包括但不限于：血液蛋白(例如血清白蛋白、因子VII、因子VIII(或修饰的因子VIII)、因子IX、因子X、组织纤溶酶原因子、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶III和促红细胞生成素(EPO)、尿激酶、尿激酶原、阿法依泊汀(epoetin alfa)、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、细胞因子(例如白介素或干扰素、干扰素-β-1a)、整合素、地址素、选择素、归巢受体、表面膜蛋白(例如表面膜蛋白受体)、T细胞受体单元、免疫球蛋白、可溶的主要组织相容性复合抗原、结构蛋白(如胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、生长因子受体、生长因子、生长激素、细胞周期蛋白、疫苗、纤维蛋白原、凝血酶、细胞因子、透明质酸和抗体如治疗性抗体。
在一些实施方式中，感兴趣的基因编码治疗性蛋白。根据本文所公开方法和组合物表达的治疗性蛋白可以是在给予蛋白时为对象(例如，人对象)提供有益效果的任意蛋白。通常，感兴趣的治疗性蛋白包括但不限于：激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳激素、催产素、多巴胺、牛生长激素、猪生长激素、牛凝乳酶、瘦体素等)、生长激素(例如人生长激素)、生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子(IGF-1)等)、生长因子受体、细胞因子和免疫系统蛋白(例如白介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(interfersons)、整合素、地址素、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、可溶的主要组织相容性复合抗原、免疫活性抗原(例如细菌抗原、寄生虫抗原或病毒抗原)或过敏原)、自身抗原、抗体)、乙型肝炎病毒的包膜蛋白、酶(组织纤溶酶原激活物(TPA)、链霉菌激酶、生物合成或降解性(biosynthestic or degradative)胆固醇、甾类生成酶(steriodogenic enzyme)、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶(adenylate or guanylaste cyclases)、神经酰胺酶、α-L-艾杜糖氨酸酶(rhIDU、拉罗尼酶(laronidase))、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB；加硫酶)、α-链道酶等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、癌蛋白或原癌蛋白(例如细胞周期蛋白)、肌肉蛋白(肌球蛋白或原肌球蛋白等)、骨髓蛋白(myeloprotein)、神经活性蛋白(neuroactive protein)、肿瘤生长抑制蛋白(血管抑制素或内皮抑制素、两者均抑制血管生成)、抗脓毒症蛋白(杀菌通透性增加蛋白(bactericidal permeability-increasing protein))、结构蛋白(例如胶原蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII(抗血友病因子)、胰岛素(BHI、人胰岛素(humulin))、促卵泡激素(FSH)、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶III、葡萄糖脑苷脂酶、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或修饰的因子VIII、抗凝剂例如水蛭素)等。
在具体实施方式中，本文所公开的方法和组合物可以用于产生疫苗成分。通常，疫苗成分可以是当人或动物感染病原体或遭受某些其他不良事件(例如肿瘤发育)时，人或动物免疫系统所暴露的蛋白或蛋白的一部分。因此，可以配制在疫苗中的蛋白或多肽包括：例如病毒包衣蛋白、病毒G蛋白、微生物细胞壁蛋白、微生物毒素蛋白，肿瘤特异性抗原等。
感兴趣的基因可以是相对于植物内源的或相对于植物异源的。如本文所用，当用于核苷酸序列时，根据本发明的术语“异源”意图表示源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，则是指由其组成上和/或基因组基因座上的天然形式通过故意的人为干预进行实质性修饰而获得的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以此方式，“异源”或“重组”的核酸构建体意图表示源自外来物种的构建体，或者，如果来自相同物种，则是指由其组成上和/或基因组基因座上的天然形式通过故意的人为干预进行实质性修饰而获得的构建体。异源核酸构建体包括但不限于：已引入植物或其植物部分中的重组核苷酸构建体，例如，通过转化方法或随后使转基因植物与另一感兴趣植物育种来引入。在具体实施方式中，相对于包含内源的感兴趣基因的植物，p21多核苷酸是异源的。在具体实施方式中，相对于包含异源的感兴趣基因的植物，p21多核苷酸是异源的。
本文所公开的表达构建体(即，表达盒)可以包含操作性连接至要在植物中表达的p21多核苷酸的异源启动子。术语“操作性连接”意图表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，感兴趣的多核苷酸(例如，p21多核苷酸和/或感兴趣的基因)与调节序列(即，启动子)之间的操作性连接是允许表达感兴趣的多核苷酸的功能性连接。操作性连接的元件可以是邻近的或非邻近的。当用于指代两个蛋白编码区域之间的接合时，述及操作性连接意在表示这些编码区域处于同一阅读框中。在一些实施方式中，p21多核苷酸操作性连接至启动子和/或感兴趣基因。
操作性连接至异源多核苷酸的启动子来自与衍生多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似物种，则一个或两者都由其原始形式和/或基因组基因座进行了实质性修饰，或该启动子不是操作性连接至多核苷酸的天然启动子。另外，如本文所用“嵌合基因”包含操作性连接至与编码序列异源的转录起始区域的编码序列。
在一些实施方式中，本文所提供的表达构建体可以与组成型、组织优先型(tissue-preferred)、发育优先型或其它启动子组合用于植物中p21多核苷酸或感兴趣基因的表达。组成型启动子的示例包括花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S转录起始区域，源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1'-或2'-启动子，泛素1启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)，Nos启动子，pEmu启动子，rubisco启动子，GRP1-8启动子和来自本领域技术人员已知的多种植物基因的其它转录起始区域。如果需要低水平的表达，可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利号6,072,050)，核心35S CaMV启动子等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463和5,608,142。参见美国专利号6,177,611，其通过引用纳入本文。
诱导型启动子的示例是可通过缺氧或冷应激诱导的Adh1启动子，可通过热应激诱导的Hsp70启动子，可通过光诱导的PPDK启动子和PEP羧化酶(pepcarboxylase)启动子。同样可用的是化学诱导的启动子，如安全剂诱导的In2-2启动子(美国专利号5,364,780)，雄性激素诱导的ERE启动子，和Axig1启动子，其经植物生长素诱导并且是绒毡层特异性，但是同样在愈伤组织具有活性(PCT US01/22169)。
受发育控制的启动子的示例包括在某些组织诸如叶、根、果实、种子或花中优先起始转录的启动子。“组织特异性”启动子是仅在某些组织中起始转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是基因调控的几个相互作用水平的结果。因此，来自同源性或密切相关的植物品种的启动子可以优先用于实现特定组织中高效和可靠的转基因表达。在一些实施方式中，表达盒包括组织优先型启动子。“组织优先型”启动子是主要在某些组织中起始转录、但并不必需完全或仅在该某些组织中起始转录的启动子。例如，编码p21多核苷酸或感兴趣基因的核酸分子可以操作性连接至叶优先型或茎优先型启动子。
在一些实施方式中，表达构建体包括细胞类型特异性启动子。“细胞类型特异性”启动子是主要在一个或多个器官(例如，根、叶中的维管细胞、柄细胞和茎细胞)中的某些细胞类型中驱动表达的启动子。表达构建体还可以包括细胞类型优先型启动子。“细胞类型优先型”启动子是主要在一个或多个器官(例如，根、叶中的维管细胞、柄细胞和茎细胞)中的某些细胞类型中驱动表达、但并不必需完全或仅在该某些细胞类型中驱动表达的启动子。本文所述表达构建体还可以包括种子优先型启动子。在一些实施方式中，种子优先型启动子在胚囊、早期胚胎、早期胚乳、糊粉和/或基底胚乳转移细胞层(BETL)中表达。种子优先型启动子的示例包括但不限于，27kDγ玉米蛋白启动子和糯性基因启动子(waxy promoter)，Boronat,A.等(1986)Plant Sci.47:95-102；Reina,M.等Nucl.Acids Res.18(21):6426；和Kloesgen,R.B.等(1986)Mol.Gen.Genet.203:237-244。胚、果皮和胚乳中表达的启动子公开于美国专利号6,225,529和PCT公开WO 00/12733中。这些引用文献各自的公开内容通过引用其全文的方式纳入本文。
可以以植物种子优先方式驱动基因表达的、在胚囊、早期胚胎、早期胚乳、糊粉和/或基底胚乳转移细胞层(BETL)中表达的启动子可以用于本文所公开的组合物和方法。这样的启动子包括但不限于天然地连接至如下物质的启动子：玉米(Zea mays)早期胚乳5基因、玉米早期胚乳1基因、玉米早期胚乳2基因、GRMZM2G124663、GRMZM2G006585、GRMZM2G120008、GRMZM2G157806、GRMZM2G176390、GRMZM2G472234、GRMZM2G138727、玉米CLAVATA1、玉米MRP1、水稻(Oryza sativa)PR602、水稻PR9a、玉米BET1、玉米BETL-2、玉米BETL-3、玉米BETL-4、玉米BETL-9、玉米BETL-10、玉米MEG1、玉米TCCR1、玉米ASP1、水稻ASP1、硬粒小麦(Triticum durum)PR60、硬粒小麦PR91、硬粒小麦GL7、AT3G10590、AT4G18870、AT4G21080、AT5G23650、AT3G05860、AT5G42910、AT2G26320、AT3G03260、AT5G26630、AtIPT4、AtIPT8、AtLEC2、LFAH12。其它这类启动子述于美国专利号7803990、8049000、7745697、7119251、7964770、7847160、7700836、美国专利申请公开号20100313301、20090049571、20090089897、20100281569、20100281570、20120066795、20040003427；PCT公开号WO/1999/050427、WO/2010/129999、WO/2009/094704、WO/2010/019996和WO/2010/147825，其各自通过引用纳入其全部内容用于所用目的。本文所述启动子的功能变体或功能片段也可与本文公开的核酸操作性连接。
化学调节启动子通过应用外源化学调节物可以用于调整植物中基因的表达。取决于目标，启动子可以是应用化学物时诱导基因表达的化学诱导型启动子，或是应用化学物时抑制基因表达的化学阻遏型启动子。本领域已知化学诱导型启动子并且包括但不限于：由苯磺酰胺除草安全剂活化的玉米In2-2启动子，由用作芽前除草剂的疏水亲电子化合物活化的玉米GST启动子，以及由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其它感兴趣的化学调节启动子包括类固醇响应性启动子(参见例如，Schena等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2):247-257)中的糖皮质激素诱导型启动子，以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如，Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，通过引用纳入本文。
组织优先型启动子可以用于靶向在特定植物组织内表达的构建体的增强表达。组织优先型启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto等，(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等，(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等，(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343；Russell等，(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等，(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等，(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等，(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等，(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等，(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等，(1993)Plant J.4(3):495-505。必要时，此类启动子可经修饰以用于弱表达。
叶优先型启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等，(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon等，(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等，(1994)Plant CellPhysiol.35(5):773-778；Gotor等，(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等，(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138；和Matsuoka等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。此外，也可以使用cab和rubisco启动子。参见例如，Simpson等(1958)EMBO J 4:2723-2729和Timko等(1988)Nature 318:57-58。
根优先型启动子是已知的并且可以选自文献中可得的许多或由各种相容物种从头分离。参见例如，Hire等(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell3(10):1051-1061(法国豆GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1):11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。同样参见Bogusz等(1990)Plant Cell 2(7):633-641，其中描述了分离自血红蛋白基因的两种根特异性启动子，该血红蛋白基因来自固氮非豆科植物山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮非豆科植物山油麻(Trema tomentosa)。这些基因的启动子连接至β-葡萄糖醛酸酶报告基因，并且被引入非豆科普通烟草和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)，并且在两个实例中，根特异性启动子的活性均被保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)高表达roIC和roID根诱导型基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1):69-76)。他们总结了增强子和组织优先型DNA决定簇在这些启动子中是分离的。Teeri等(1989)使用与lacZ的基因融合体显示编码章鱼碱合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖表皮中活性特别高，TR2'基因在完整植物中具有根特异性，并因叶组织的损伤而被刺激，一种特别理想的特性组合，可与杀虫或杀幼虫基因联用(参见EMBO J.8(2):343-350)。融合至nptII(新霉素磷酸转移酶II)的TR1'基因显示相似的特征。其它根优先型启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772)；和roIB启动子(Capana等(1994)PlantMol.Biol.25(4):681-691。同样参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。菜豆素基因(Murai等(1983)Science 23:476-482和Sengopta-Gopalen等(1988)PNAS 82:3320-3324。
已知其他序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。其包括消除编码伪多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和其他可能对基因表达有害的此类充分表征的序列。异源核苷酸序列的G-C含量可以调节至给定细胞宿主的平均水平，如参照宿主细胞中表达的已知基因所计算的。可能的话，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可另外包含5'前导序列。该前导序列可以用于增强翻译。翻译前导部(translation leader)是本领域已知的，并且包括但不限于：小核糖核酸病毒前导部(leader)，例如EMCV前导部(脑心肌炎5'非编码区域)(Elroy-Stein等人，(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导部，例如，TEV前导部(烟草蚀纹病毒)(Allison等人，(1986)病毒学(Virology)154：9-20)；MDMV前导部(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)自然(Nature)353：90-94)；苜蓿花叶病毒包衣蛋白mRNA的未翻译前导部(AMV RNA 4)(Jobling等人，(1987)自然325：622-625)；烟草花叶病毒前导部(TMV)(Gallie等人，(1989)RNA分子生物学(Molecular Biology of RNA)，第237-256页)和玉米褪绿斑驳病毒前导部(MCMV)(Lommel等人，(1991)病毒学81：382-385)，这些文献通过引用以全文纳入本文。同样参见Della-Cioppa等人(1987)，植物生理学(Plant Physiology)84:965-968，其通过引用以全文纳入本文。还可以使用已知增强mRNA稳定性的方法，例如内含子，例如玉米泛素内含子(maizeUbiquitin intron)(Christensen和Quail，(1996)转基因研究(Transgenic Res.)5：213-218；Christensen等人，(1992)植物分子生物学(Plant Molecular Biology)18：675-689)或玉米AdhI内含子(Kyozuka等人，(1991)Mol.Gen.Genet.228：40-48；Kyozuka等人，(1990)Maydica 35：353-357)等，其通过引用以全文纳入本文。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，从而以适当的取向并酌情以适当的阅读框提供DNA序列。为此，可以使用衔接子或接头来连接DNA片段，或者可以涉及其他操作以提供方便的限制位点，去除多余的DNA，去除限制位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性、退火、再替换(resubstitution)例如转换和颠换。
报告基因或可选择标志物基因也可以包括在本发明的表达盒中。本领域已知的合适的报告基因的示例可见于：例如，Jefferson等人，(1991)植物分子生物指南(PlantMolecular Biology Manual)中，Gelvin等人编著，卢克沃学术出版社(Kluwer AcademicPublishers)，第1-33页；和DeWet等人，(1987)Mol.Cell.Biol.7:725-737；Goff等人，(1990)EMBO J.9:2517-2522；Kain等人，(1995)生物技术(Bio Techniques)19：650-655；和Chiu等人，(1996)当代生物学(Current Biology)6:325-330，所述文献通过引用以全文纳入本文。
用于选择转化细胞或组织的可选择标志物基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的可选择标志物基因的示例包括但不限于：编码氯霉素抗性的基因(Herrera Estrella等，(1983)EMBO J.2：987-992)；编码卡那霉素抗性的基因；编码新霉素抗性的基因；编码甲氨蝶呤抗性的基因(Herrera Estrella等，(1983)自然303：209-213；Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820)；编码潮霉素抗性的基因(Waldron等人，(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108和Zhijian等人，(1995)植物科学(Plant Science)108：219-227)；编码链霉素抗性的基因(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)；编码壮观霉素抗性的基因(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.5：131-137)；编码博来霉素抗性(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)；编码磺酰胺抗性的基因(Guerineau等人，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-36)；编码溴草腈抗性的基因(Stalker等人，(1988)科学(Science)242：419-423)；编码草甘膦抗性的基因(Shaw等，(1986)科学233：478-481和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,69)；编码草丁膦抗性的基因(DeBlock等人，(1987)EMBO J.6：2513-2518)，所述文献通过引用以全文纳入本文。
在本文所公开表达盒上可以采用的其它多核苷酸包括但不限于：GUS(β-葡萄糖醛酸酶；Jefferson，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等人，(1994)科学263：802)、荧光素酶(Riggs等人，(1987)Nucleic Acids Res.15(19):8115和Luehrsen等人，(1992)Methods Enzymol216：397-414)和编码花色素苷产生的玉米基因(Ludwig等人，(1990)科学247：449)，所述文献通过引用以全文纳入本文。
在其它实施方式中，表达盒可以包括编码农艺学重要性状的其它核苷酸序列，如植物激素、植物防御蛋白、营养转运蛋白、生物结合蛋白、所需输入性状、所需输出性状、应激抗性基因、疾病/病原体抗性基因、雄性不育基因、发育基因、调节基因、DNA修复基因、转录调节基因或任何其他感兴趣的多核苷酸和/或多肽。在一些实施方式中，表达盒可以包括下调负责农艺学重要性状的基因表达的其它多核苷酸。例如，在一些实施方式中，本文所公开的表达盒可以包括下调烟碱表达的核酸序列。
如本文所用，“载体”是指用于将核苷酸构建体(例如表达盒)引入宿主细胞的DNA分子，例如，质粒、粘粒或噬菌体(bacterial phage)。克隆载体通常包含一个或少量限制性内切酶识别位点、以及适用于识别和选择用克隆载体转化的细胞的标志物基因，在所述限制性内切酶识别位点可以以可确定的方式插入外源DNA序列而不会丧失载体的基本生物学功能。标志物基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。本文提供了表达盒，该表达盒包括位于载体上的编码p21多核苷酸的核酸分子。
在具体实施方式中，p21多核苷酸可以整合到植物的基因组中。在一些实施方式中，可以在表达盒中提供p21多核苷酸，而不整合到植物的基因组中。例如，可以在载体上提供表达盒，例如设计用于农杆菌转化的载体，包括转移DNA(tDNA)序列。在一些实施方式中，tDNA载体包括侧接p21多核苷酸的两个tDNA序列。在一些实施方式中，在病毒载体上提供表达盒，例如，烟草病毒1(TV1)载体、烟草花叶病毒(TMV)载体或烟草脆裂病毒(TRV)。
一些植物病毒具有分区段的基因组，其中，两个或更多个物理上分离的核酸片(piece)共同组成了病毒基因组。在特定情况下，这些分离的片打包在同一病毒衣壳中；在其他病毒(即具有多分体基因组(multipartite genome)的病毒)中，各基因组区段都打包在其自己的病毒颗粒中。病毒基因组对植物的感染通常可以通过递送植物病毒核酸(例如，RNA)或包含打包的基因组的衣壳来完成。为了进入并感染植物细胞，除蜡和果胶的保护层外，植物病毒还需要穿过细胞壁。大多数或所有植物病毒被认为依靠细胞壁的机械破坏而不是依靠细胞壁表面受体进入细胞。这种破坏可以例如由对细胞的物理损害，由可以递送病毒的生物体例如细菌、真菌、线虫、昆虫或螨虫导致。在实验室中，通常仅通过在植物上摩擦病毒即可将病毒给予植物细胞。
一旦病毒进入(感染)细胞，通常会在感染的细胞内复制，然后在局部(locally)传播。例如，该病毒可以在最初感染的叶片内复制并在细胞之间传播。在局部传播后，病毒可能移动进入未感染的叶子，例如植物的上部叶子，这被称为系统感染或系统传播。通常，许多植物病毒的细胞间传播需要功能性移动蛋白(movement protein)，而系统传播则需要功能性包衣蛋白(并且，通常还需要功能性移动蛋白)。除功能性移动和包衣蛋白编码成分外，病毒可能还包含局部或系统传播或促进这种传播所需的其他成分。这些顺式作用成分可以是编码或非编码成分。例如，其可以对应于病毒转录物的3'非翻译区域(UTR，也称为NTR)的部分(即，其可以提供用于转录病毒转录物的3'非翻译区的模板)。因此，用于感染的重要病毒成分可以是病毒基因组的编码区域或非编码区域。
为了成功建立局部(叶内)或系统感染，病毒必须能够复制。许多病毒包含编码参与复制过程的一种或多种蛋白的基因(在本文中称为复制蛋白或复制酶蛋白)。例如，许多RNA植物病毒编码RNA聚合酶。还可能需要其他蛋白(例如解旋酶或甲基转移酶蛋白)。除编码复制蛋白的功能性基因外，病毒基因组还可包含各种序列成分，其也是复制或促进复制所需的。局部叶内感染需要病毒在移动促进蛋白介导下在细胞间移动。例如，在TMV的情况下，需要MP蛋白表达用于叶内感染。并不需要CP。其它病毒(例如，如马铃薯病毒马铃薯X病毒属(potatovirus potexvirus))，需要移动蛋白和CP表达以在细胞间移动并建立叶内感染。
在具体实施方式中，本文所公开的方法和组合物中使用的病毒是ssRNA病毒，具体来说是具有(+)-链基因组的ssRNA病毒。用于操作存在于该病毒中的遗传物质的技术和试剂是本领域熟知的。通常，例如，制备病毒基因组的DNA拷贝，并将其克隆到表达载体，特别是细菌载体或Ti质粒中。某些ssDNA病毒(特别包括双生病毒)也可以用于向植物细胞递送功能性编辑成分。应理解，本发明的载体和病毒基因组通常可以RNA或DNA形式存在。另外，当提及存在于DNA载体中的特征如RNA病毒的基因组或其部分时，应理解该特征以RNA形式的DNA拷贝存在。通过使用T7或其它聚合酶进行体外转录，或使用农杆菌或颗粒递送的TiDNA作为模板，使用宿主DNA依赖性RNA聚合酶II进行体内转录，将该cDNA转化为感染性RNA转录物(transcript)。
可以根据本文所公开的方法和组合物使用多种不同类型的病毒共表达p21多核苷酸和感兴趣基因。示例性病毒包括：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)(例如，雀麦花叶病毒(bromoviruses)、苜蓿花叶病毒(alfamoviruses)、等轴不稳定环斑病毒(ilarviruses))和烟草花叶病毒科的成员。某些病毒种包括：例如，苜蓿花叶病病毒(Alfalfa Mosaic Virus，AlMV)，苹果褪绿叶斑病毒(Apple Chlorotic Leaf Spot Virus)、苹果凹茎病毒(AppleStem Grooving Virus)、大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosiac Virus)、大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus)、甜菜黄化病毒(Beet Yellow Virus)、蚕豆斑驳病毒(Broad Bean Mottle Virus)、蚕豆萎蔫病毒(Broad Bean Wilt Virus)、雀麦草花叶病毒(Brome Mosaic Virus，BMV)、香石竹潜伏病毒(Carnation Latent Virus)、香石竹斑驳病毒(Carnation Mottle Virus)、香石竹环斑病毒(Carnation Ringspot Virus)、胡萝卜斑驳病毒(Carrot Mottle Virus)、木薯潜隐病毒(Cassava Latent Virus，CL V)、豇豆褪绿斑驳病毒(Cowpea Chlorotic Mottle Virus)、豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic Virus，CPMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic Virus)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus)、莴苣传染性黄化病毒(Lettuce Infectious Yellow Virus)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)、玉米雷亚多非纳病毒(MaizeRayado Fino Virus)、玉米条纹病毒(Maize Streak Virus，MSV)、欧防风黄点病毒(Parsnip Yellow Fleck Virus)、豌豆耳突花叶病毒(Pea Enation Mosaic Virus)、马铃薯病毒X(Potato Virus X)、马铃薯病毒Y(Potato Virus Y)、悬钩子茂密矮小病毒(Raspberry Bushy Dwarf Virus)、水稻坏死病毒(Rice Necrosis Virus，RNV)、水稻条叶枯病毒(Rice Stripe Virus)、水稻东格鲁球形病毒(Rice Tungro Spherical Virus)、黑麦草花叶病毒(Ryegrass Mosaic Virus)、土传小麦花叶病毒(Soilborne Wheat MosaicVirus)、南方菜豆花叶病毒(Southern Bean Mosaic Virus)、烟草蚀纹病毒(Tobacco EtchVirus，TEV)、烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、烟草坏死病毒(TobaccoNecrosis Virus)、烟草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus)、烟草环斑病毒(Tobacco RingSpot Virus)、番茄丛矮病毒(Tomato Bushy Stunt Virus)、番茄金黄花叶病毒(TomatoGolden Mosaic Virus，TGMV)和芜菁黄花叶病毒(Turnip Yellow Mosaic Virus，TYMV)。在具体的实施方式中，该病毒是马铃薯Y病毒(potyvirus)、缸豆花叶病毒(cucomovirus)、雀麦花叶病毒(bromovirus)、烟草脆裂病毒(tobravirus)或马铃薯X病毒(potexvirus)。
这些植物病毒的要素可以根据已知技术(例如，参见(例如，参见Sambrook等人，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约，1989；Clover等人，分子克隆，IRL出版社，牛津，1985；Dason等人，病毒学(Virology)，172：285-292，1989；Takamatsu等人，EMBO J6：307-311，1987；French等人，科学231：1294-1297，1986；Takamatsu等人，FEBS Lett.269：73-76，1990；Yusibov和Loesch-Fries，病毒学，208(1)：405-7，1995；Spitsin等人，Proc Natl Acad Sci USA，96(5):2549-53,1999等)进行遗传工程改造以产生病毒载体，用于根据本文所公开的用于p21多核苷酸和感兴趣基因共表达的方法和组合物。
在具体实施方式中，本文所公开的方法和组合物中使用的病毒载体是经修饰以表达p21多核苷酸和/或感兴趣基因的TMV载体。本文所用的“TMV载体”是包含TMV基因组的至少一个功能性要素的DNA或RAN载体。TMV是一种正义单链RNA病毒，其可感染各种各样的植物，尤其是烟草和茄科的其他成员。TMV基因组由6.3-6.5kb单链(ss)RNA组成。3'末端具有tRNA样结构。5'末端具有甲基化核苷酸帽(nucleotide cap)(m7G5’pppG)。基因组可以编码4个开放阅读框(ORF)，其中，两个由于泄漏的UAG终止密码子的核糖体通读(ribosomalreadthrough)而产生单个蛋白。这4个基因编码复制酶(具有甲基转移酶[MT]和RNA解旋酶[Hel]结构域)，RNA依赖性RNA聚合酶，所谓的移动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)。
如本文所用的TMV基因组的要素或TMV基因组要素是指编码TMV复制和/或TMV感染所必需的功能性蛋白的至少一种核酸分子(即，基因)。例如，TMV基因组的要素是指编码功能性复制酶或其部分(例如，MT或Hel结构域)、RNA依赖性RNA聚合酶、移动蛋白和/或衣壳蛋白的基因。在一些实施方式中，经修饰的TMV(mTMV)基因组包括编码复制酶、移动蛋白、和衣壳蛋白的基因，但没有RNA依赖性RNA聚合酶。
在本文所公开的方法和组合物的体实施方式中，TMV载体包括TMV基因组的所有要素。在其它实施方式中，MV基因组要素在至少两个单独载体之间进行划分，使得由各载体表达TMV要素后可以组装成完整的功能性TMV。因此，当使用至少两个载体时，一个或两个载体不能单独进行系统感染，但是可以一起提供支持系统TMV感染所需的所有功能，并允许表达功能性编辑成分以修饰植物基因组的靶位点。因此，本文公开的方法和组合物提供了一种认识：病毒成分可以反式互补，从而提供系统感染能力和/或用于修饰植物基因组中的靶位点的功能性编辑成分的表达。在具体实施方式中，TMV载体基于TMV的U1株。例如，TMV载体可以是DN15载体或GENEWARE载体。GENEWARE载体可以基于pUC19骨架。参见WO 99/091630，其通过引用纳入本文。
在具体实施方式中，RNA复制中涉及的病毒蛋白从基因组RNA直接转录，而内部基因的表达通过亚基因组RNA的产生而发生。亚基因组RNA的产生受TMV基因组中RNA序列控制，该序列用作亚基因组启动子。包衣蛋白是从亚基因组RNA中翻译出来的，并且是感染细胞中所产生的最丰富的蛋白和RNA。在受TMV感染的植物中，每克感染组织产生几毫克包衣蛋白。烟草花叶病毒表达载体利用了该强大的亚基因组启动子活性的强度和持续性。
GENEWARE载体允许通过两种不同的方法表达外源蛋白或肽：1)独立的基因表达：通过添加用于表达的外源基因来代替病毒包衣蛋白，以由内源病毒包衣蛋白启动子表达。例如，编码p21多核苷酸和/或感兴趣基因的核酸序列可以操作性连接至病毒包衣蛋白启动子。将转录活性较低且序列不相同的第二包衣蛋白启动子置于异源编码区域的下游，然后可以添加病毒包衣蛋白或可选择标志物编码基因。其编码了第三亚基因组RNA(包括表达MP的RNA)，除了用于过表达的异源基因外，还允许病毒载体表达用于病毒复制和系统移动的所有必需基因。2)在病毒颗粒表面上展示免疫原性肽：TMV病毒体是直径约18nm、长度约300nm的刚性杆。通过X射线衍射确定病毒体和包衣蛋白的结构，揭示了约2,130个包衣蛋白亚单元(subunit)的结构设置在包裹基因组RNA的右旋螺旋中，并且每转16.3个亚单元。
本文所用p21多核苷酸包括维持增加感兴趣基因表达能力的p21多核苷酸的活性片段和变体。例如，在具体实施方式中，p21多核苷酸是SEQ ID NO:1的片段或变体。“片段”是指多核苷酸序列的部分。所公开的核苷酸序列的片段范围可以为至少约10、16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个连续核苷酸，或至多为本文所公开的全长p21多核苷酸中存在的核苷酸数量(例如，SEQ ID NO:1为10,948个核苷酸)，只要片段达到期望的目的，即，在共表达时增加感兴趣基因的表达。
“变体”是指基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包括在天然多核苷酸中一个或多个内部位点处包含一个或多个核苷酸的缺失和/或添加的变体；和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点处包含一个或多个核苷酸的取代的变体。本文所用的"天然"多核苷酸包含天然产生的核苷酸序列，例如，天然产生的p21多核苷酸。对于多核苷酸，可以用熟知的分子生物学技术(例如，如本文其他地方概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)来识别天然产生的变体。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，例如，通过定点诱变产生的多核苷酸。一般而言，本发明的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相同性，如由本领域已知的序列比对程序和参数所确定。
在具体实施方式中，本文所公开的p21多核苷酸可以包括SEQ ID NO:1的全长核苷酸序列或SEQ ID NO:1的核苷酸序列的片段。另外，本文所公开的p21多核苷酸可以包括SEQID NO:1的全长核苷酸序列的变体或SEQ ID NO:1的核苷酸序列的片段的变体。该变体将与衍生该变体的天然全长序列或片段的核苷酸序列保持至少80％的序列相同性。在一些实施方式中，异源p21多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2和其活性片段或变体的多肽。例如，p21多核苷酸可以编码任意活性p21蛋白，例如，与SEQ ID NO:2全长具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列相同性的蛋白。
认为p21多核苷酸突变体可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于该操作的方法通常是本领域熟知的。p21多核苷酸的核苷酸序列变体和片段可以通过在DNA中的突变来制备。诱变和改变多核苷酸的方法是本领域中熟知。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等人，(1987)Methods inEnzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)的分子生物学技术(Techniques in Molecular Biology)，纽约麦克米兰出版公司(MacMillanPublishing Company)；以及其中所引用的参考文献。
在具体实施方式中，p21多核苷酸的片段和变体编码具有pfam11757中所列的保守结构域的蛋白。pfam 11757结构域可以从ssRNA正链病毒(例如线性病毒(Closterovirus)、马铃薯y病毒(Potyvirus)和黄瓜花叶病毒(Cucumovirus)家族)中识别出RNA沉默蛋白的推定抑制子大家族，P20-P25。RNA沉默是防御病毒的主要机制之一，因此，在应答时，一些病毒已经进化或获得了抑制RNA沉默的功能。这些具有RNA沉默抑制子(RSS)活性的抗防御病毒蛋白最初是在马铃薯y病毒(Potyvirus)和黄瓜花叶病毒(Cucumovirus)植物病毒属的成员中发现的。在p21样蛋白中发现的氨基酸各保守区块对应于计算机预测的α螺旋，其最C末端(most C-terminal)要素的长度为42个残基。这表明在p21样蛋白中主要α-螺旋二级结构的保守。在一些实施方式中，p21多核苷酸的活性片段和变体可以编码含pfam11757域的片段或变体的多肽。
因此，本文所公开的表达盒可以基于天然产生的p21多核苷酸序列以及其变体和修饰形式。该变体将继续具有所需活性。在欲表达功能性多肽的情况下，编码变体多肽的DNA中将发生的突变绝不能将序列置于阅读框之外，并且最好不产生可能生成二级mRNA结构的互补区域。参见欧洲专利申请公开号75,444。
预期本文涵盖的编码多肽的缺失、插入和取代不会在任何活性p21 RNA或蛋白的特性上产生根本性变化。然而，当难以在这样做之前准确预测取代、缺失或插入的确切效果时，本领域技术人员应理解该效果将通过常规筛选试验进行评估。在p21多核苷酸内进行缺失、插入和取代，使得变体多核苷酸保留所需活性，即，在共表达时增加感兴趣基因的表达。
通过将包含p21多核苷酸的核酸分子引入植物或植物细胞中，提供了用于使p21多核苷酸与感兴趣基因在植物中共表达的方法。术语“引入”和“引入的”意图表示将核酸(例如，重组表达构建体)或蛋白提供至细胞内。引入包括将核酸纳入真核或原核细胞中，其中，核酸可以纳入到细胞的基因组中，并且包括向细胞瞬时提供核酸或蛋白。引入包括稳定或瞬时转化法，以及有性杂交法(sexually crossing)。因此，在将核酸(例如，p21多核苷酸或表达构建体)插入细胞的上下文中“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸片段纳入真核或原核细胞中，其中，核酸片段可以纳入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成独立复制的复制子，或瞬时表达。
“稳定转化”是指将引入宿主(即，烟草植物)的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代遗传。"瞬时转化"意图表示将多核苷酸引入宿主(即，植物)并暂时表达。
转化方案以及将多核苷酸序列引入植物的方案可根据转化靶向的植物或植物细胞的类型(即，单子叶或双子叶)而变化。将多核苷酸序列引入植物细胞的合适方法包括微注射(Crossway等人，(1986)生物技术(Biotechniques)4:320-334)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转化(Paszkowski等，(1984)EMBOJ.3:2717-2722)、和弹道颗粒加速(参见例如，Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人，美国专利号5,879,918；Tomes等人，美国专利号5,886,244；Bidney等人，美国专利号5,932,782；在Gamborg和Phillips编辑的(Springer-Verlag,Berlin)(1995)植物细胞、组织和器官培养中的基础方法(Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:FundamentalMethods)中Tomes等人的“通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中”(Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment)；McCabe等人，(1988)生物技术6:923-926)；和Lec1转化(WO 00/28058)。还参见Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等，(1987)粒子科学与技术(Particulate scienceand technology)5:27-37(洋葱)；Christou等，(1988)植物生理学(Plant Physiol.)87:671-674(大豆)；McCabe等，(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等，(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等，(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)生物技术(Biotechnology)6:559-563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等人，美国专利号5,322,783和5,324,646；在Gamborg和Phillips编辑的(Springer-Verlag,Berlin)(1995)植物细胞、组织和器官培养中的基础方法(Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods)中Tomes等人的“通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中”(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment)(玉米)；Klein等，(1988)植物生理学91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等，(1984)自然(伦敦)311:763-764；Bowen等人，美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合)；De Wet等，(1985)《胚珠组织实验操作》(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues)，Chapman等编，(纽约朗文出版社(Longman,New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等，(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等，(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-563(须介导的转化)；D'Halluin等，(1992)植物细胞(Plant Cell)4:1495-1505(电穿孔)；Li等，(1993)Plant CellReports 12:250-255以及Christou和Ford(1995)植物学年报(Annals of Botany)75:407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)自然生物技术(Nature Biotechnology)14:745-750(玉米，通过根癌农杆菌)；所述文献全部通过引用纳入本文。
在具体实施方式中，使用多种瞬时转化法，可以将本文所公开的重组表达构建体提供至烟草植物。该瞬时转化法包括但不限于：将重组表达构建体直接引入植物中。该方法包括：例如，微注射或粒子轰击。参见例如，Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185；Nomura等人，(1986)植物科学44:53-58；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:2176-2180和Hush等人，(1994)The Journal of Cell Science 107:775-784，这些文献通过引用纳入本文。或者，使用本领域已知的技术，可以将多核苷酸瞬时转化至植物中。该技术包括：病毒载体系统和以防止随后释放DNA方式的多核苷酸沉淀。因此，可以从颗粒结合的DNA发生转录，但是其释放以整合到基因组中的频率大幅降低。该方法包括使用涂覆有聚乙烯亚胺(PEI；Sigma#P3143)的颗粒。
在其它实施方式中，通过使烟草植物或植物部分与病毒或病毒核酸接触，可以将本文所述的重组表达构建体引入烟草植物中。通常，该方法包括：将本文所提供的核苷酸构建体纳入病毒DNA或RNA分子中。用于将多核苷酸引入植物中并表达在其中编码的涉及病毒DNA或RNA分子的蛋白的方法是本领域熟知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，以及Porta等人，(1996)分子生物技术(MolecularBiotechnology)5:209-221；所述文献通过引用纳入本文。
用于在烟草植物或植物部分的基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方式中，使用位点特异性重组体系来实现在所需基因组位置插入多核苷酸。例如，参见WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、and WO99/25853，所述文献通过引用纳入本文。简而言之，包含p21多核苷酸的重组表达构建体可以包含在侧接有两个不同重组位点的转移盒中。将转移盒引入已将靶位点稳定纳入其基因组的植物中，所述靶位点侧接有对应于转移盒位点的两个不同重组位点。提供适当的重组酶，并将转移盒整合到靶位点处。重组表达构建体由此整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
可以使用任意方法将本文所公开的核酸分子和表达盒引入植物或植物细胞中以表达p21多核苷酸。例如，精确的基因组编辑技术可用于将本文所公开的表达盒引入植物基因组中。以此方式，通过使用本领域可找到的方法将核酸序列插入编码转运蛋白的天然植物序列附近。该方法包括但不限于：针对感兴趣植物基因组序列设计的大范围核酸酶(D’Halluin等，2013Plant Biotechnol J 11:933-941)；CRISPR-Cas9，TALEN，和其他精确编辑基因组的技术(Feng等，细胞研究(Cell Research)23:1229-1232,Podevin等，TrendsBiotechnology 31:375-383,2013,Wei等，2013J Gen Genomics 40:281-289,Zhang等，2013WO 2013/026740)；Cre-lox位点特异性重组(Dale等，(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik等，(2007)Transgenic Plant J 1:1-9；FLP-FRT重组(Li等，(2009)Plant Physiol151:1087-1095)；Bxb1介导的整合(Yau等，Plant J(2011)701:147-166)；锌指介导的整合(Wright等，(2005)Plant J 44:693-705)；Cai等，(2009)Plant Mol Biol 69:699-709)；和同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol 701:51-65)；Puchta,H.(2002)Plant Mol Biol 48:173-182)。
按照常规方式，已经转化的烟草植物细胞可生长成植物。参见，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，并识别所获得的具有所需表型特征(即，感兴趣基因)的组成型表达的子代。可以生长两代或更多代，以确保稳定地维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。以此方式，提供了有本文公开的重组表达构建体的转化种子(也称为“转基因种子”)，所述重组表达构建体被稳定地整合入其基因组中。
已转化以具有本文提供的表达构建体的烟草植物细胞可以生长成完整植物。从单个植物原生质体转化体(protoplast transformants)或从各种转化的外植体再生、发育和栽培植物是本领域中熟知的。参见，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84；Weissbach和Weissbach，在：植物分子生物学方法，(编)，加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，(1988)。该再生和生长过程通常包括如下步骤：选择转化细胞，在生根的植株阶段通过胚胎发育的常规阶段来培养那些个体化细胞。转基因的胚胎和种子以类似方式再生。然后将所得的转基因生根嫩枝种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合转基因植物。否则，使从再生植物中获得的花粉与农学上重要的品系的种子生长植物杂交。反过来，将来自这些重要品系的植物的花粉用于对再生植物进行授粉。可以生长两代或更多代，以确保稳定地维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。以此方式，本文存在的组合物提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，所述种子具有稳定纳入其基因组中的本文提供的多核苷酸，例如，miRNA重组表达构建体。
在具体实施方式中，可以将包含编码如本文所述p21多核苷酸的核苷酸序列的核酸分子引入烟草(Nicotiana)植物、植物部分、或植物细胞。随后，使用本领域技术人员已知的方法选择具有引入的本发明p21多核苷酸序列的烟草(Nicotiana)植物或植物部分，所述方法例如但不限于：Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。通过前述实施方式改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下生长一段时间，该段时间足以增加感兴趣基因表达。植物形成条件是本领域众所周知的，并且在本文其他地方进行了简要讨论。
提供了包含本文其它地方所述的感兴趣基因和p21多核苷酸的植物、植物细胞、植物部分和种粒以及谷物。在具体实施方式中，所述植物和/或植物部分包含稳定纳入基因组中的至少一个表达盒，所述表达盒包含操作性连接至启动子的p21多核苷酸和感兴趣的异源基因。如本文所述，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、和在植物或植物部分中完整的植物细胞如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、仁、穗、穗轴、外壳、柄、根、根尖、花粉囊等。谷物是指由商业种植者出于生长或繁殖物种以外的目的产生的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的多核苷酸。
本发明所公开的表达盒可用于任意植物物种(包括但不限于单子叶和双子叶)的转化。在具体实施方式中，该植物是烟草植物。例如，任意烟草物种可以根据本文公开的方法进行修饰以表达p21多核苷酸。“烟草”或“烟草植物”是指烟草属中产生烟碱生物碱的任意物种。在某些实施方式中，可采用的烟草包括烤烟或弗吉尼亚烟草(如K326)、白肋烟烟草、晒干烟烟草(例如，印度卡努尔(Indian Kurnool)和东方烟烟草，包括卡特里尼(Katerini)烟草、普利利普(Prelip)烟草、科莫蒂尼(Komotini)烟草、克桑蒂(Xanthi)烟草和扬博尔(Yambol)烟草)、马里兰烟草、深色烟草、深色烤烟草、深色风干烟草(例如，Passanda烟草、Cubano烟草、Jatin烟草和Bezuki烟草)或者微风干烟草(例如，北威斯康星烟与Galpoa烟草)、印度风干烟草、俄罗斯红(Red Russian)烟草和黄花烟草，以及其他各种稀有的或特种烟草；以及任意上述烟草的各种掺混物。在Davis等(编)的《烟草生产、化学和技术》(Tobacco Production,Chemistry and Technology)(1999)中对各种类型的烟草、生长技术和收获技术进行了描述，该文献通过引用纳入本文。来自烟草种的各种其他代表性植物见述于：Goodspeed，烟草属(The Genus Nicotiana)(Chonica Botanica)(1954)；Sensabaugh,Jr.等人的美国专利号4,660,577；White等人的美国专利5,387,416；Lawson等人的美国专利号7,025,066；Lawrence,Jr.的美国专利申请公开号2006/0037623；和Marshall等人的美国专利申请公开号2008/0245377；这些文献均通过引用纳入本文。示例性的烟草种包括：普通烟草(N.tabacum)、黄花烟草(N.rustica)、花烟草(N.alata)、阿仑特氏烟草(N.arentsii)、高烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、哥西氏烟草(N.gossei)、川上烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、朗氏烟草(N.langsdorffi)、耳状烟草(N.otophora)、赛特式烟草(N.setchelli)、林烟草(N.sylvestris)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、波叶烟草(N.undulata)、红花烟草(N.x sanderae)、非洲烟草(N.africana)、抱垄烟草(N.amplexicaulis)、贝纳米特氏烟草(N.benavidesii)、博内里烟草(N.bonariensis)、迪勃纳氏烟草(N.debneyi)、长花烟草(N.longiflora)、海滨烟草(N.maritina)、拟似烟草(N.megalosiphon)、西方烟草(N.occidentalis)、圆维烟草(N.paniculata)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、莲座叶烟草(N.rosulata)、拟似烟草(N.simulans)、斯托克通氏(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、荫生烟草(N.umbratica)、颤毛烟草(N.velutina)、斧叶烟草(N.wigandioides)、无茎烟草(N.acaulis)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、本氏烟草(N.benthamiana)、洞生烟草(N.cavicola)、克里夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、香烟草(N.fragrans)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、狭叶烟草(N.linearis)、摩西氏烟草(N.miersii)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布特斯烟草(N.obtusifolia)、西方烟草赫斯帕斯亚种(N.occidentalis subsp.Hersperis)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、残波烟草(N.repanda)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、茄叶烟草(N.solanifolia)、和斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)。
烟草种可通过使用基因－修饰或杂交技术衍生(例如，烟草植物可通过基因工程改造或杂交从而升高或降低成分、特征或属性的产生)。例如，参见见述于如下文献的各种类型的植物基因修饰：Fitzmaurice等人的美国专利号5,539,093；Wahab等人的美国专利号5,668,295；Fitzmaurice等人的美国专利号5,705,624；Weigl的美国专利号5,844,119；Dominguez等人的美国专利号6,730,832；Liu等人的美国专利号7,173,170；Colliver等人的美国专利号7,208,65和Benning等人的美国专利号7,230,160；Conkling等人的美国专利申请公开号2006/0236434；和Nielsen等人的PCT WO 2008/103935。还参见见述于如下文献的烟草类型：Sensabaugh,Jr.等人的美国专利号4,660,577；White等人的美国专利号5,387,416；Dominguez等人的美国专利号6,730,832；这些文献均通过引用纳入本文。最优选地，烟草材料是已经适当烤制(cured)和老化的那些。用于烤制烤烟的特别优选的技术和条件见述于Nestor等人的Beitrage Tabakforsch.Int.,20(2003)467-475和Peele的美国专利号6,895,974；所述文献通过引用纳入本文。用于风干烟草的代表性技术和条件见述于deRoton,C.等人的Beitrage Beitrage Tabakforsch.Int.,2005,21,6,305-320和Staaf,M.等人的Beitrage Tabakforsch.Int.2005,21,6,321-330；所述文献通过引用纳入本文。某些类型的不寻常或稀有烟草可以晒干。用于改进东方烟草吸烟质量的方式和方法见述于Lawson等人的美国专利第7,025,066号，该文献通过引用纳入本文。代表性的东方烟草包括卡特里尼(katerini)烟草、普利利普(prelip)烟草、科莫蒂尼(komotini)烟草、克桑蒂(xanthi)烟草和扬博尔(yambol)烟草。包括深色风干烟草的烟草组合物见述于Marshall等人的美国专利申请公开第2008/0245377号，该文献通过引用纳入本文。还参见见述于Beeson等人的美国专利申请公开第2011/0247640号中的烟草类型，该文献通过引用纳入本文。当与对照植物进行比较时，来自烟草植物的感兴趣基因与p21多核苷酸的共表达增加了感兴趣基因的表达。
感兴趣植物物种的其他示例包括但不限于，玉米(Zea mays)，油菜种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))，尤其是用作菜籽油来源的那些油菜物种，苜蓿(Medicago sativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)，粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)，黍(Panicum miliaceum)，小米(Setaria italica)，穇子(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachishypogaea)，棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)，甘薯(Ipomoeabatatas)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananas comosus)，柠檬树(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camelliasinensis)，香蕉(Musa spp.)，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Caricapapaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(如Lactuca sativa)，青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)以及黄瓜属成员如黄瓜(C.sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和麝香瓜(C.melo)。观赏植物包括：杜鹃花(Rhododendron spp.)、绣球花(Macrophylla hydrangea)，木槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。
可以实施本发明的针叶树包括：例如，松树，如火炬松(Pinus taeda)，湿地松(Pinus elliotii)，黄松(Pinus ponderosa)，美国黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红木(Sequoia sempervirens)；真正的冷杉，如银杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松，如西方红色雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)，以及白杨(Poplar)和桉树(Eucalyptus)。在具体实施方式中，本发明的植物是作物植物(例如，玉米，苜蓿，向日葵，芸苔属植物(Brassica)，大豆，棉花，红花，花生，高粱，小麦，小米，烟草等)。在其它实施方式中，玉米和大豆植物是最佳的，在其他实施方案中，大豆植物是最佳的。
其他感兴趣植物包括提供感兴趣种子的谷物植物、油籽植物和豆科植物。感兴趣种子包括：谷物种子，例如玉米，小麦，大麦，稻米，高粱，黑麦等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。。豆科植物包括豆类(beans)和豌豆(peas)。豆类包括瓜尔豆，刺槐豆(locust bean)，葫芦巴，大豆，四季豆，缸豆，绿豆，利马豆，蚕豆，小扁豆，鹰嘴豆等。
如本文所用的术语“植物”包括完整植物、植物部分如植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子，分化或未分化的植物细胞及其后代。植物材料包括但不限于：种子，悬浮培养物，胚胎，分生组织区域(meristematic region)、愈伤组织、叶、根、嫩枝、茎、果实、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测量对象植物或植物细胞的表型变化的参照点。对照植物或植物细胞可包含：例如，(a)野生型植物或细胞，即具有与用于产生对象植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型；(b)与起始材料有相同基因型但已经用空构建体(即，用没有表达本文所述p21多核苷酸的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)植物或植物细胞，其是对象植物或植物细胞的后代中的非转化分离体；或(d)在不表达异源p21多核苷酸的条件下的对象植物或植物细胞本身。在一些实施方式中，对照表达水平可以是仅在与植物中未表达的其他基因相似的最低或背景水平检测到的表达水平。
可以收获共表达p21多核苷酸和感兴趣基因的本文公开的经修饰的烟草植物，并将其加工成烟草产品。如本文所用，烟草产品包括：烟叶，烟丝，生切烟丝(cut tobacco)，烟草末，粉末烟草，烟草提取物，烟碱提取物，无烟烟草，湿鼻烟或干鼻烟，丁香香烟(kretek)，烟斗用烟丝(pipe tobacco)，雪茄烟草(cigar tobacco)，小雪茄烟草(cigarillotobacco)，卷烟烟草，嚼用烟草，比迪烟(bidis)，比特烟(bits)，卷烟，小雪茄，非通风凹槽过滤嘴卷烟(non-ventilated recess filter cigarettes)，通风凹槽过滤嘴卷烟(ventedrecess filter cigarett)，雪茄和含烟草的口香糖、锭剂、贴剂，电子烟或其任意组合。
表1：p21核酸序列
Figure BDA0002486161400000331
提供以下实施例进一步说明与本公开相关的方面，但是不应解释为限制其范围。除非另有说明，所有份数和百分比以干重计。
实验部分
实施例1-通过电穿孔转化农杆菌
人工合成了p21核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，并在转化前将其克隆至表达载体pRI-101_AN载体的MCS(多克隆位点)区域。根据根癌农杆菌LBA4404电转感受态细胞(Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells)(宝生物公司(Takara Bio lnc))的用户手册进行农杆菌的转化。总之，该程序包括在冰上解冻根癌农杆菌LBA4404电转感受态细胞管。将约1ng表达p21多核苷酸或p19多核苷酸的载体质粒DNA加入到1.5ml管中的冰上20μl感受态细胞中，并用移液管轻轻混合。将混合物转移到冰冻的0.1cm电穿孔比色皿(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)批号3110)中，并使用具有如下设定的BTX ECM630细胞电穿孔操作器(BTX ECM630 Electro Cell Manipulator)进行电穿孔：25μF、200Ω和2kV。
取出比色皿，加入1ml SOC培养基并转移到15ml Falcon管中。将混合物在30℃、100rpm振摇下孵育1小时。将100μl细胞涂在含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的LB琼脂板上，然后在28℃下孵育至多3天。
实施例2.农杆菌细胞浸润到本氏烟草中
按如下使农杆菌细胞浸润到宿主本氏烟草植物中：
将单个农杆菌集落接种到5ml具有适当抗生素(例如50μg/ml卡那霉素、50μg/ml链霉素和25μg/ml利福平)的LB中，并在30℃下生长过夜。取出1ml培养物，并加入25ml含适当抗生素的LB中，并在30℃下生长过夜。
培养物在室温下以3000rpm离心10分钟。将所得的培养物细胞沉淀物重悬于1ml浸润缓冲液[10mM MES(pH 5.6)，10mM MgSO4和150μM乙酰丁香酮]中。悬浮液在室温下以3000rpm离心10分钟，并将培养物细胞沉淀物重悬于1.5ml浸润缓冲液中。悬浮液在室温下轻轻振摇2～3小时。
将农杆菌悬浮液混合在一起以达到所需的最终OD600值，并用1mL无针注射器共浸润至本氏烟草的叶中。将带有EGFP载体的农杆菌稀释至最终OD600＝0.8。将P19或TV-P21稀释至最终OD600＝0.2。使用农杆菌LBA4404使各共浸润混合物的总OD600＝1.0，从而使所有混合物具有相同的细胞密度。在浸润后5～7天，用紫外光测定本氏烟草叶中的EGFP表达。如图1所示，p21和p19两者均可增强GFP的表达。然而，与p21共表达的GFP表达可能比与p19共表达的GFP表达更高。
实施例3.p21表达
病毒表达载体必须解决有效异源基因表达的多个问题。整个植物中蛋白质表达的测定是病毒复制、通过载体表达编码异源基因序列的mRNA、这些mRNA的翻译、包含全部异源基因要素的病毒基因组的遗传稳定性、相关局部和系统移动蛋白的表达、规避宿主RNA沉默和其他免疫反应的函数。异源基因要素的相对尺寸和位置影响表达(综述于Pogue等人，2002和赫芬生物医学研究国际(Hefferon BioMed Research International)，2014卷(2014)，文章编码(Article ID)785382，6页)。异源基因插入越大，发现载体的“适配性(fit)”越低，观察到的基因表达越少。这通常是由于病毒RNA增殖减缓的结果，也是病毒基因组的遗传不稳定性和异源基因序列丢失的结果。影响RNA病毒基因组中异源序列遗传稳定性的因素是病毒RNA局部和系统移动的效率，以及规避植物宿主响应病毒复制过程中产生的dsRNA而增强(mount)的RNA抑制性免疫反应。RDR6、DCL4和HEN1是在生长组织中引发或维持病毒诱导的基因沉默所必需的因子。DCL4产生21nt病毒siRNA，其通过RDR6扩增(Blevins等人，2006；Dunoyer等人，2005)。然后，扩增的21nt siRNA靶向于病毒RNA以使病毒感染沉默并限制病毒感染。其他病毒基因沉默抑制子(如马铃薯Y病毒HC-Pro、番茄丛矮病毒(tombusvirus)P19和线性病毒(Closterovirus)p21)可通过HEN1结合siRNA并阻止蛋白微小RNA甲基化(Blevins等人，2006；Lakatos等人，2004、2006；Merai等人，2006；Yu等人，2006)。RNAi活性的该抑制作用与基于优化不良的TMV基载体以创建高效表达体系的能力有关。p21和其他沉默抑制子的共表达使无内含子的TMV载体能够在农杆菌浸润后成功地从植物细胞核中传播，并产生增强水平的异源蛋白(参见美国专利号8,936,937、美国专利号8,871,997、美国专利号6,632,980、美国专利号6,395,962、美国专利号5,939,541，和Pogue,GP等人(2002)Ann.Rev.Phytopathol.40：45-74)。
TMV移动蛋白30K的转基因过表达极大地促进了TMV基载体中的大型基因插入(例如，完全单克隆抗体(Mab)和抗体片段(FAb)(Reinl，美国专利申请公开2004/0110930)。30K蛋白不是重要的沉默抑制子基因，但已显示出显著增强病毒在细胞之间的移动。此外，已经表明沉默抑制子HC-Pro的表达增强了病毒载体的表达。预期可以通过沉默抑制子p21的共表达看到该促进作用。
通过农杆菌介导转化所产生的CaMV 35S启动子–p21–nos终止子构建体，对转基因本氏烟草植物进行工程加工以表达p21。用TMV-GFP载体以及PXV-GFP和TRV-GFP载体感染过表达p21的植物，以产生增强的GFP荧光。与野生型本氏烟草植物相比，在表达p21的本氏烟草植物中，增强了通过TMV载体的Fab片段表达。最后，与野生型本氏烟草植物相比，在表达p21的本氏烟草植物中，通过双载体农杆菌浸润增强了使用表达抗体重链的TMV载体和表达抗体轻链的PVX载体的mAb表达。
实施例4.过表达的定量
TV-P21和P19表达载体的构建
产生了两个表达载体(TV1-P21_pRI_101-An和P19-pRI_101-An)，以测试与P21的共表达是否可以增加绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达水平，并比较P21与P19。用限制性内切酶NdeI和BamHI来消化P21(SEQ ID NO:1)或P19基因(SEQ ID NO:3)的合成DNA，并将其克隆到NdeI-BamHI消化的pRI_101-表达载体(Takara目录号：3262)中，以产生TV1-P21_pRI_101-An或P19-pRI_101-An载体。
表达载体pEGAD(拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCenter)库存号：CD3-389，参照物1)用于表达具有P21或P19基因的GFP基因。
通过电穿孔转化农杆菌
根据根癌农杆菌LBA4404电转感受态细胞(Takara目录号:18313015)的用户手册进行农杆菌的转化。该过程包括：
1.在冰上解冻根癌土壤杆菌LBA4404电转感受态细胞管。
2.将1ng的TV1-P21_pRI_101-An、P19-pRI_101-An或pEGAD的质粒DNA加入到1.5ml管中的冰上20μl感受态细胞中，并用移液管轻轻混合。
3.将混合物转移到冰冻的0.1cm电穿孔比色皿(西格玛奥德里奇公司目录号：Z706078-50EA)中，并使用具有如下设定的BTX ECM630电穿孔系统进行电穿孔：25μF、200Ω和2kV。
4.取出比色皿，加入1ml SOC培养基(宝生物公司(Takara Bio)目录号：18313015)，并将混合物转移到15ml Falcon管中。
5.将混合物在30℃、100rpm振摇下孵育1小时。
6.在孵育后，将具有100μl细胞的混合物涂在含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的LB琼脂板上，并在28℃下孵育至多3天。
农杆菌细胞浸润到本氏烟草植物中
按如下使农杆菌细胞浸润到宿主本氏烟草植物中：
1.使单个农杆菌集落孵育至具有适当抗生素(例如50μg/ml卡那霉素、50μg/ml链霉素和25μg/ml利福平)的5ml LB培养基中。
2.在30℃下生长过夜。
3.取出1ml培养物，并加入25ml的具有适当抗生素的LB中。
4.在30℃下生长过夜。
5.培养物在室温下以3000rpm离心10分钟。
6.使培养物的细胞沉淀物悬浮于1ml浸润缓冲液[10mM MES(pH 5.6)，10mM MgSO4和150μM乙酰丁香酮]中。
7.悬浮液在室温下以3000rpm离心10分钟。
8.使培养物的细胞沉淀物悬浮于1.5ml浸润缓冲液中。悬浮液在室温下轻轻振摇2～3小时。
9.将农杆菌悬浮液混合在一起以达到所需的最终OD600值，并用1mL无针注射器共浸润至本氏烟草的叶中。将带有pEGAD载体的农杆菌稀释至最终OD600＝0.8。将带有TV1-P21_pRI_101-An或P19-pRI_101-An的农杆菌稀释至最终OD600＝0.2。使用农杆菌LBA4404使各共浸润混合物的总OD600＝1.0，从而使所有混合物具有相同的细胞密度。
10.在浸润3天和4天后，在UV光下检查本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中GFP基因的表达水平。结果(图2)显示，与p21共表达的GFP基因表达水平高于与p19共表达的GFP基因表达水平。
使用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量GFP蛋白表达
GFP蛋白的表达水平用GFP ELISA试剂盒(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)目录号：AKR-121)按如下进行定量：
1.在浸润3天后，使用直径为0.5厘米的叶穿孔器，用液氮收集接种的本氏烟草叶盘。使组织在-80℃下冷冻直至待用。
2.冷冻的组织用0.05M的含有完全迷你蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete MiniProtease Inhibitor Cocktail)(西格玛奥德里奇公司目录号：11836153001)的pH 7.0的磷酸钠缓冲液(参照物2)匀浆(150μL缓冲液，用于4个叶盘)。
3.允许裂解物在冰上孵育10分钟，然后在4℃、10000x g下离心5分钟。将上清液转移至新管中，并置于冰上。使用Pierce 660nm蛋白检测试剂盒(赛默飞世尔公司(Thermofisher)目录号：22660)来测定总蛋白浓度。
11.按照制造商的说明，使用GFP ELISA试剂盒(细胞生物实验室公司目录号：AKR-121)对蛋白提取物中的GFP蛋白进行定量。ELISA试验的结果(图4)证实了与p21共表达的GFP蛋白表达高于与p19共表达的GFP蛋白表达水平。
序列表
<110> R.J.雷诺兹烟草公司
<120> 通过与P21共表达来增加植物中感兴趣基因的表达的方法和组合物
<130> R60999 10490WO (2197.6)
<150> 62/556,661
<151> 2017-09-11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> 烟草病毒 1, 从普通烟草中分离出的线性病毒（closteovirus）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(555)
<400> 1
atg aag ttg tat atc caa gtc aag ttc tac gaa agc tac ttg aaa cta 48
Met Lys Leu Tyr Ile Gln Val Lys Phe Tyr Glu Ser Tyr Leu Lys Leu
1 5 10 15
atc act gac ttg ttg gaa gcg ata aac gca tcc aac tca tct aac gaa 96
Ile Thr Asp Leu Leu Glu Ala Ile Asn Ala Ser Asn Ser Ser Asn Glu
20 25 30
aaa cta gta gag tgg gtg aca gac ttc acc gat ctg tgt tcc cgc ttg 144
Lys Leu Val Glu Trp Val Thr Asp Phe Thr Asp Leu Cys Ser Arg Leu
35 40 45
cag gct tta aaa agc gac gta aat gac gct aaa cgc gaa gaa agc gcg 192
Gln Ala Leu Lys Ser Asp Val Asn Asp Ala Lys Arg Glu Glu Ser Ala
50 55 60
aac aac ttg acc agg aag gcg aac ata cta aaa cta gct gga gac aac 240
Asn Asn Leu Thr Arg Lys Ala Asn Ile Leu Lys Leu Ala Gly Asp Asn
65 70 75 80
ctc gct tcc ata cgg gat gag ttg cga aag aga gtg ttt cgc gat att 288
Leu Ala Ser Ile Arg Asp Glu Leu Arg Lys Arg Val Phe Arg Asp Ile
85 90 95
atc gat ctg agc aca gaa gac acc ctt agg ttt ttt gtt gcg agg ttc 336
Ile Asp Leu Ser Thr Glu Asp Thr Leu Arg Phe Phe Val Ala Arg Phe
100 105 110
atg gaa gtg act tca cat aca aag gac gag tct ctt tcg tac aac gtg 384
Met Glu Val Thr Ser His Thr Lys Asp Glu Ser Leu Ser Tyr Asn Val
115 120 125
cgc gac atc gta aac aca gtt ctg agg aga ata tcg tcg gaa cgt agc 432
Arg Asp Ile Val Asn Thr Val Leu Arg Arg Ile Ser Ser Glu Arg Ser
130 135 140
cta gat gtg tcg acg aac acg ttc aaa cag tgc gat ttg cta cgc atg 480
Leu Asp Val Ser Thr Asn Thr Phe Lys Gln Cys Asp Leu Leu Arg Met
145 150 155 160
cag aaa tcc cta cga agt gtg tgg aaa cac act cta ggg cac agc gaa 528
Gln Lys Ser Leu Arg Ser Val Trp Lys His Thr Leu Gly His Ser Glu
165 170 175
gct gag cta ttt gtg gaa gaa aaa tag 555
Ala Glu Leu Phe Val Glu Glu Lys
180
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> 烟草病毒 1, 从普通烟草中分离出的线性病毒（closteovirus）
<400> 2
Met Lys Leu Tyr Ile Gln Val Lys Phe Tyr Glu Ser Tyr Leu Lys Leu
1 5 10 15
Ile Thr Asp Leu Leu Glu Ala Ile Asn Ala Ser Asn Ser Ser Asn Glu
20 25 30
Lys Leu Val Glu Trp Val Thr Asp Phe Thr Asp Leu Cys Ser Arg Leu
35 40 45
Gln Ala Leu Lys Ser Asp Val Asn Asp Ala Lys Arg Glu Glu Ser Ala
50 55 60
Asn Asn Leu Thr Arg Lys Ala Asn Ile Leu Lys Leu Ala Gly Asp Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Ile Arg Asp Glu Leu Arg Lys Arg Val Phe Arg Asp Ile
85 90 95
Ile Asp Leu Ser Thr Glu Asp Thr Leu Arg Phe Phe Val Ala Arg Phe
100 105 110
Met Glu Val Thr Ser His Thr Lys Asp Glu Ser Leu Ser Tyr Asn Val
115 120 125
Arg Asp Ile Val Asn Thr Val Leu Arg Arg Ile Ser Ser Glu Arg Ser
130 135 140
Leu Asp Val Ser Thr Asn Thr Phe Lys Gln Cys Asp Leu Leu Arg Met
145 150 155 160
Gln Lys Ser Leu Arg Ser Val Trp Lys His Thr Leu Gly His Ser Glu
165 170 175
Ala Glu Leu Phe Val Glu Glu Lys
180
<210> 3
<211> 519
<212> DNA
<213> 番茄丛矮病毒（Tombusvirus）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(519)
<400> 3
atg gaa cga gct ata caa gga aac gac gct agg gaa caa gct aac agt 48
Met Glu Arg Ala Ile Gln Gly Asn Asp Ala Arg Glu Gln Ala Asn Ser
1 5 10 15
gaa cgt tgg gat gga gga tca gga ggt acc act tct ccc ttc aaa ctt 96
Glu Arg Trp Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Thr Ser Pro Phe Lys Leu
20 25 30
cct gac gaa agt ccg agt tgg act gag tgg cgg cta cat aac gat gag 144
Pro Asp Glu Ser Pro Ser Trp Thr Glu Trp Arg Leu His Asn Asp Glu
35 40 45
acg aat tcg aat caa gat aat ccc ctt ggt ttc aag gaa agc tgg ggt 192
Thr Asn Ser Asn Gln Asp Asn Pro Leu Gly Phe Lys Glu Ser Trp Gly
50 55 60
ttc ggg aaa gtt gta ttt aag aga tat ctc aga tac gac agg acg gaa 240
Phe Gly Lys Val Val Phe Lys Arg Tyr Leu Arg Tyr Asp Arg Thr Glu
65 70 75 80
gct tca ctg cac aga gtc ctt gga tct tgg acg gga gat tcg gtt aac 288
Ala Ser Leu His Arg Val Leu Gly Ser Trp Thr Gly Asp Ser Val Asn
85 90 95
tat gca gca tct cga ttt ttc ggt ttc gac cag atc gga tgt acc tat 336
Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Phe Gly Phe Asp Gln Ile Gly Cys Thr Tyr
100 105 110
agt att cgg ttt cga gga gtt agt atc acc gtt tct gga ggg tcg cga 384
Ser Ile Arg Phe Arg Gly Val Ser Ile Thr Val Ser Gly Gly Ser Arg
115 120 125
act ctt cag cat ctc tgt gag atg gca att cgg tct aag caa gaa ctg 432
Thr Leu Gln His Leu Cys Glu Met Ala Ile Arg Ser Lys Gln Glu Leu
130 135 140
cta cag ctt gcc cca atc gaa gtg gaa agt aat gta tca aga gga tgc 480
Leu Gln Leu Ala Pro Ile Glu Val Glu Ser Asn Val Ser Arg Gly Cys
145 150 155 160
cct gaa ggt act gag acc ttc gaa aaa gaa agc gag taa 519
Pro Glu Gly Thr Glu Thr Phe Glu Lys Glu Ser Glu
165 170
<210> 4
<211> 172
<212> PRT
<213> 番茄丛矮病毒（Tombusvirus）
<400> 4
Met Glu Arg Ala Ile Gln Gly Asn Asp Ala Arg Glu Gln Ala Asn Ser
1 5 10 15
Glu Arg Trp Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Thr Ser Pro Phe Lys Leu
20 25 30
Pro Asp Glu Ser Pro Ser Trp Thr Glu Trp Arg Leu His Asn Asp Glu
35 40 45
Thr Asn Ser Asn Gln Asp Asn Pro Leu Gly Phe Lys Glu Ser Trp Gly
50 55 60
Phe Gly Lys Val Val Phe Lys Arg Tyr Leu Arg Tyr Asp Arg Thr Glu
65 70 75 80
Ala Ser Leu His Arg Val Leu Gly Ser Trp Thr Gly Asp Ser Val Asn
85 90 95
Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Phe Gly Phe Asp Gln Ile Gly Cys Thr Tyr
100 105 110
Ser Ile Arg Phe Arg Gly Val Ser Ile Thr Val Ser Gly Gly Ser Arg
115 120 125
Thr Leu Gln His Leu Cys Glu Met Ala Ile Arg Ser Lys Gln Glu Leu
130 135 140
Leu Gln Leu Ala Pro Ile Glu Val Glu Ser Asn Val Ser Arg Gly Cys
145 150 155 160
Pro Glu Gly Thr Glu Thr Phe Glu Lys Glu Ser Glu
165 170
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种增加植物、植物部分或植物细胞中感兴趣基因表达的方法，该方法包括将编码多肽的异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中，所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至植物、植物部分或植物细胞中有活性的启动子，并且，与感兴趣基因在对照植物、植物部分或植物细胞中的表达相比，共表达的感兴趣基因的表达增加。
2.一种制备植物、植物部分或植物细胞的方法，所述方法包括：将与启动子操作性连接的异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中，其中，该启动子在植物、植物部分或植物细胞中有活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:2具有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，异源p21多核苷酸编码包含氨基酸序列SEQ IDNO：2的多肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或其活性片段或变体具有至少80％序列相同性的核酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括将感兴趣基因引入植物、植物部分或植物细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞内源的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是治疗性蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因编码选自下组的蛋白或肽：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述防御蛋白是抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述酶是α-半乳糖苷酶或溶酶体酸性脂肪酶。
15.如权利要求11所述的方法，其中，所述信号蛋白是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
16.如权利要求11所述的方法，其中，所述报告蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述启动子是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述启动子是在植物、植物部分或植物细胞中有活性的组成型启动子。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述启动子是CaMV 35S启动子。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，启动子是在所述植物、植物部分或植物细胞中有活性的诱导型启动子。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至感兴趣基因。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，将异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中包括：用农杆菌T-DNA载体来转化植物、植物部分或植物细胞，所述农杆菌T-DNA载体包含含有异源p21多核苷酸的表达构建体。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，将异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中包括：用包含含有异源p21多核苷酸的表达构建体的病毒载体接种植物、植物部分或植物细胞。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，当与对照植物比较时，感兴趣基因的表达增加了至少20％。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是作物植物、植物部分或植物细胞。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是烟草植物、植物部分或植物细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述烟草植物、植物部分或植物细胞是普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、或黄花烟草(Nicotianarustica)。
28.转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含异源p21多核苷酸，所述异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽。
29.转基因植物、植物部分或植物细胞，其通过权利要求2所述的方法产生。
30.转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含异源p21多核苷酸，所述异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽。
31.如权利要求30所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
32.如权利要求28或29所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2具有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽。
33.如权利要求28-32中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
34.如权利要求28-33中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物还包括编码选自下组的蛋白或肽的至少一种感兴趣基因：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。
35.如权利要求28-34中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是治疗性蛋白。
36.如权利要求28-35中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞内源的。
37.如权利要求28-35中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
38.如权利要求28-37中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至在植物、植物部分或植物细胞中有活性的启动子。
39.如权利要求28-38中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至感兴趣基因。
40.如权利要求28-39中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是作物植物、植物部分或植物细胞。
41.如权利要求28-40中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是烟草植物、植物部分或植物细胞。
42.如权利要求41所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述烟草植物、植物部分或植物细胞是普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、或黄花烟草(Nicotiana rustica)。
43.如权利要求28-42中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，转基因植物、植物部分或植物细胞是包含异源p21多核苷酸的转基因种子。
44.如权利要求43所述的转基因种子，其中，转基因种子包括具有稳定纳入基因组中的异源p21多核苷酸的基因组。
45.一种包含操作性连接至异源启动子的p21多核苷酸的表达载体，其中，所述启动子在植物细胞中有活性。
46.如权利要求45所述的表达载体，其中，启动子是组成型启动子。
47.如权利要求45所述的表达载体，其中，启动子是诱导型启动子。
48.如权利要求45-47中任一项所述的表达载体，其中，表达载体是病毒表达载体。
49.如权利要求45-47中任一项所述的表达载体，其中，表达载体是tDNA表达载体。

Claims (49)

1.一种增加植物、植物部分或植物细胞中感兴趣基因表达的方法，该方法包括将异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至植物、植物部分或植物细胞中有活性的启动子，并且，与感兴趣基因在对照植物、植物部分或植物细胞中的表达相比，共表达的感兴趣基因的表达增加。
2.一种制备植物、植物部分或植物细胞的方法，所述方法包括：将与启动子操作性连接的异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中，其中，该启动子在植物、植物部分或植物细胞中有活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，异源p21多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或其活性片段或变体具有至少80％序列相同性的核酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括将感兴趣基因引入植物、植物部分或植物细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞内源的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因是治疗性蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，感兴趣基因编码选自下组的蛋白或肽：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述防御蛋白是抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述酶是α-半乳糖苷酶或溶酶体酸性脂肪酶。
15.如权利要求11所述的方法，其中，所述信号蛋白是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
16.如权利要求11所述的方法，其中，所述报告蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，启动子是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，启动子是在植物、植物部分或植物细胞中有活性的组成型启动子。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述启动子是CaMV 35S启动子。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，启动子是在所述植物、植物部分或植物细胞中有活性的诱导型启动子。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至感兴趣基因。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，将异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中包括：用农杆菌T-DNA载体来转化植物、植物部分或植物细胞，所述农杆菌T-DNA载体包含含有异源p21多核苷酸的表达构建体。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，将异源p21多核苷酸引入植物、植物部分或植物细胞中包括：用包含含有异源p21多核苷酸的表达构建体的病毒载体接种植物、植物部分或植物细胞。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，当与对照植物比较时，感兴趣基因的表达增加了至少20％。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是作物植物、植物部分或植物细胞。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是烟草植物、植物部分或植物细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述烟草植物、植物部分或植物细胞是普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、或黄花烟草(Nicotianarustica)。
28.转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含异源p21多核苷酸。
29.转基因植物、植物部分或植物细胞，其通过权利要求2所述的方法产生。
30.如权利要求28或29所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸包含具有核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与SEQ ID NO：1或其活性片段或变体具有至少80％序列相同性。
31.如权利要求28-30中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
32.如权利要求28或29所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽。
33.如权利要求28-32中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
34.如权利要求28-33中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物还包括编码选自下组的蛋白或肽的至少一种感兴趣基因：防御蛋白、酶、信号蛋白、报告蛋白、抗体及其片段、生长因子、细胞表面受体分子、种子储存蛋白和杀真菌剂。
35.如权利要求28-34中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是治疗性蛋白。
36.如权利要求28-35中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞内源的。
37.如权利要求28-35中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，感兴趣基因是相对于植物、植物部分或植物细胞异源的。
38.如权利要求28-37中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至在植物、植物部分或植物细胞中有活性的启动子。
39.如权利要求28-38中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，异源p21多核苷酸操作性连接至感兴趣基因。
40.如权利要求28-39中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是作物植物、植物部分或植物细胞。
41.如权利要求28-40中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述植物、植物部分或植物细胞是烟草植物、植物部分或植物细胞。
42.如权利要求41所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，所述烟草植物、植物部分或植物细胞是普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、或黄花烟草(Nicotiana rustica)。
43.如权利要求28-42中任一项所述的转基因植物、植物部分或植物细胞，其中，转基因植物、植物部分或植物细胞是包含异源p21多核苷酸的转基因种子。
44.如权利要求43所述的转基因种子，其中，转基因种子包括具有稳定纳入基因组中的异源p21多核苷酸的基因组。
45.一种包含操作性连接至异源启动子的p21多核苷酸的表达载体，其中，启动子在植物细胞中有活性。
46.如权利要求45所述的表达载体，其中，启动子是组成型启动子。
47.如权利要求45所述的表达载体，其中，启动子是诱导型启动子。
48.如权利要求45-47中任一项所述的表达载体，其中，表达载体是病毒表达载体。
49.如权利要求45-47中任一项所述的表达载体，其中，表达载体是tDNA表达载体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342247A (zh) * 2020-11-10 2021-02-09 江苏科技大学 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6806400B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-19 University Of South Carolina Method for enhancing pathogen resistance in plants
US20100071085A1 (en) * 2007-01-29 2010-03-18 The Ohio State University Research Foundation System for Expression of Genes in Plants from a Virus-Based Expression Vector
CN101978066A (zh) * 2007-11-27 2011-02-16 麦迪卡格公司 表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)
CN103403170A (zh) * 2011-01-17 2013-11-20 菲利普莫里斯生产公司 植物中的蛋白质表达
CN104962579A (zh) * 2007-06-15 2015-10-07 麦迪卡格公司 修饰植物中的糖蛋白产生

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4660577A (en) 1982-08-20 1987-04-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Dry pre-mix for moist snuff
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
JP3046063B2 (ja) 1989-03-17 2000-05-29 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 遺伝子の発現の外部の調節
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5668295A (en) 1990-11-14 1997-09-16 Philip Morris Incorporated Protein involved in nicotine synthesis, DNA encoding, and use of sense and antisense DNAs corresponding thereto to affect nicotine content in transgenic tobacco cells and plants
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
JPH06510187A (ja) 1991-08-27 1994-11-17 ノバルティス　アクチエンゲゼルシャフト 同翅類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法
CA2112999C (en) 1991-10-04 2007-04-24 Mark A. Conkling Pathogen-resistant transgenic plants
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5387416A (en) 1993-07-23 1995-02-07 R. J. Reynolds Tobacco Company Tobacco composition
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5539093A (en) 1994-06-16 1996-07-23 Fitzmaurice; Wayne P. DNA sequences encoding enzymes useful in carotenoid biosynthesis
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5637785A (en) 1994-12-21 1997-06-10 The Salk Institute For Biological Studies Genetically modified plants having modulated flower development
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5705624A (en) 1995-12-27 1998-01-06 Fitzmaurice; Wayne Paul DNA sequences encoding enzymes useful in phytoene biosynthesis
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US5939541A (en) 1997-03-28 1999-08-17 University Of South Carolina Method for enhancing expression of a foreign or endogenous gene product in plants
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
ES2245487T3 (es) 1997-11-18 2006-01-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
PT1032680E (pt) 1997-11-18 2006-05-31 Pioneer Hi Bred Int Um novo metodo para a integracao de adn estranho em genomas eucarioticos
CA2306053C (en) 1997-11-18 2003-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
EP1045899A2 (en) 1998-01-16 2000-10-25 Biosource Technologies, Inc. Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
ATE342985T1 (de) 1998-02-26 2006-11-15 Pioneer Hi Bred Int Mais alpha-tubulin 3-18 promoter
EP1066394B1 (en) 1998-03-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Novel basal endosperm transfer cell layer (betl) specific genes
ES2252964T3 (es) 1998-08-20 2006-05-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotores preferidos de semillas.
WO2000012733A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from end genes
AU768243B2 (en) 1998-11-09 2003-12-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Transcriptional activator LEC1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US7531723B2 (en) 1999-04-16 2009-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of cytokinin activity in plants
US6805134B2 (en) 1999-04-26 2004-10-19 R. J. Reynolds Tobacco Company Tobacco processing
US6395962B1 (en) 1999-06-22 2002-05-28 University Of South Carolina Enhancing expression of a silenced target sequence in plants using plant viral enhancers and amplicons
ATE460490T1 (de) 1999-11-22 2010-03-15 Plant Bioscience Ltd Erhöhte expression von transgenen durch co- exprimierung mit einen suppressor der post- transkriptionelle genabschaltung (ptgs)
AU2001286843A1 (en) 2000-08-30 2002-03-13 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
WO2002072775A2 (en) 2001-03-08 2002-09-19 Michigan State University Lipid metabolism regulators in plants
US7208659B2 (en) 2001-05-02 2007-04-24 Conopco Inc. Process for increasing the flavonoid content of a plant and plants obtainable thereby
US6730832B1 (en) 2001-09-10 2004-05-04 Luis Mayan Dominguez High threonine producing lines of Nicotiana tobacum and methods for producing
EP1556403A4 (en) 2002-10-03 2006-06-28 Large Scale Biology Corp ENGINEERING MULTIMERIC PROTEINS
US7025066B2 (en) 2002-10-31 2006-04-11 Jerry Wayne Lawson Method of reducing the sucrose ester concentration of a tobacco mixture
EP1528104A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 Biogemma MEG1 endosperm-specific promoters and genes
US7798153B2 (en) 2004-08-23 2010-09-21 Us Smokeless Tobacco Co. Nicotiana Kawakamii smokeless tobacco
KR100679715B1 (ko) * 2005-04-07 2007-02-15 대한민국 한국산 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자를 이용한 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법
EP2129243A4 (en) 2007-02-23 2010-08-04 Us Smokeless Tobacco Co NEW TOBACCO COMPOSITIONS AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR
US8186360B2 (en) 2007-04-04 2012-05-29 R.J. Reynolds Tobacco Company Cigarette comprising dark air-cured tobacco
US20090049569A1 (en) 2007-08-13 2009-02-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-Preferred Regulatory Elements
US7847160B2 (en) 2007-08-15 2010-12-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters
US7964770B2 (en) 2007-09-28 2011-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from Sorghum kafirin gene
WO2009094704A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 The University Of Adelaide Seed specific expression in plants
AU2009284691B2 (en) 2008-08-18 2015-07-09 Australian Centre For Plant Functional Genomics Pty Ltd Seed active transcriptional control sequences
US20100281570A1 (en) 2009-05-04 2010-11-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize 18kd oleosin seed-preferred regulatory element
US8466341B2 (en) 2009-05-04 2013-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize 17KD oleosin seed-preferred regulatory element
CA2761533A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 German Spangenberg Plant promoter operable in basal endosperm transfer layer of endosperm and uses thereof
WO2010147825A1 (en) 2009-06-09 2010-12-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Early endosperm promoter and methods of use
US9039839B2 (en) 2010-04-08 2015-05-26 R.J. Reynolds Tobacco Company Smokeless tobacco composition comprising tobacco-derived material and non-tobacco plant material
EP2748323B1 (en) 2011-08-22 2019-05-01 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6806400B1 (en) * 1999-11-12 2004-10-19 University Of South Carolina Method for enhancing pathogen resistance in plants
US20100071085A1 (en) * 2007-01-29 2010-03-18 The Ohio State University Research Foundation System for Expression of Genes in Plants from a Virus-Based Expression Vector
CN104962579A (zh) * 2007-06-15 2015-10-07 麦迪卡格公司 修饰植物中的糖蛋白产生
CN101978066A (zh) * 2007-11-27 2011-02-16 麦迪卡格公司 表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(vlp)
CN103403170A (zh) * 2011-01-17 2013-11-20 菲利普莫里斯生产公司 植物中的蛋白质表达

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANG WANG等: "Complete genome sequence of tobacco virus 1, a closterovirus from Nicotiana tabacum" *
LUCAS ARZOLA等: "Transient Co-Expression of Post-Transcriptional Gene Silencing Suppressors for Increased in Planta Expression of a Recombinant Anthrax Receptor Fusion Protein" *
MARIN CHIBA等: "Diverse suppressors of RNA silencing enhance agroinfection by a viral replicon" *
麻鹏达,贺红霞,伏秀青,奚丽丽,吕付佳,朱筱娟,王兴智: "植物转录后基因沉默抑制蛋白研究进展" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342247A (zh) * 2020-11-10 2021-02-09 江苏科技大学 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法

Also Published As

Publication number Publication date
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