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CN111315880A - 突变型aim - Google Patents

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CN111315880A
CN111315880A CN201880074098.1A CN201880074098A CN111315880A CN 111315880 A CN111315880 A CN 111315880A CN 201880074098 A CN201880074098 A CN 201880074098A CN 111315880 A CN111315880 A CN 111315880A
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amino acid
aim
gly
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cysteine
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Harasaki Takashi
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Abstract

本发明提供一种维持功能、未发生多聚体化、并且未被IgM失活的重组AIM(例如，包含SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列的蛋白等)。

Description

突变型AIM
技术领域
本发明涉及突变型AIM、编码该突变型AIM的核酸、包含该核酸的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞、使用了该宿主细胞的突变型AIM的制备方法、以及包含该突变型AIM的药物组合物。
背景技术
AIM(巨噬细胞凋亡抑制剂(apoptosis inhibitor of macrophage)、或CD5L)是由本发明人鉴定的巨噬细胞特异性地产生、并抑制巨噬细胞自身的细胞凋亡(apoptosis，凋亡)的因子，迄今为止已暗示其与一些疾病有关。例如，AIM的血中浓度随着肥胖而上升，通过由CD36介导的胞吞作用(endocytosis，内吞作用)被摄入脂肪细胞内，诱导蓄积的中性脂肪的分解(lipolysis，脂解)，由此暗示了其与抗肥胖的关系(非专利文献2)。另外，AIM通过中性脂肪的分解由脂肪细胞释放游离脂肪酸，释放的脂肪酸经由toll样受体的刺激在脂肪组织中引起/维持慢性炎症。代谢综合征虽然是以获得肥胖所伴随的胰岛素抵抗性作为其基础，但脂肪组织中的慢性炎症较为重要，由此认为AIM与代谢综合征有关(非专利文献3)。本发明人还明确了AIM抑制脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化，诱导脂肪细胞中的脂肪滴的分解，报道了AIM应用于肥胖的可能性(专利文献1)。而且，本发明人还明确了负载有高卡路里食物的肥胖AIM敲除(KO)小鼠显示出肥胖、脂肪肝、肝实质纤维化、致癌这样的与人NASH病态近似的病态，报道了AIM应用于肝脏疾病的可能性(专利文献2)。而且，本发明人明确了：进行了两侧性的一过性肾缺血再灌流的AIM KO小鼠会发生急性肾功能不全，导致已坏死的肾小管细胞的蓄积和随之而来的肾障碍的快速进行，发生全身状态的恶化，可确认高频率的死亡。而且，在发明人对该AIM KO小鼠给予AIM时显示以下状况：BUN值改善，确认到肾功能的快速改善，确认到随之而来的全身症状和死亡率的改善，报道了通过补充AIM来治疗急性肾功能不全和预防或治疗慢性肾病的可能性(专利文献3)。另外，发明人报道了：在血中AIM在Fc区与IgM五聚体形成复合物，由此保护AIM免于肾过滤，血中AIM维持在高水平(非专利文献4、5)。
通常，在使用具有药理效果的蛋白作为药品的情况下，需要调制满足既维持功能又不会凝集等条件的均匀的蛋白。作为蛋白的调制方法，列举以下方法作为代表性的方法：培养导入了具有编码所期望的蛋白的核酸的表达载体的细胞，分离和纯化细胞内或由细胞分泌至培养液中的重组蛋白。在该方法中，从基因导入或培养等操作的容易性方面考虑，优选使用大肠杆菌作为宿主细胞，但在与原来的环境不同的条件下调制蛋白时有时会产生问题。例如，源自真核生物的蛋白在形成高级结构时有时会在半胱氨酸间形成分子内二硫键。在通过转化大肠杆菌来调制这样的蛋白的情况下，由于大肠杆菌的细胞质内处于强还原条件下，因此妨碍了二硫键的形成。作为结果，可产生如下问题：原来的高级结构无法重现，纯化的重组蛋白丧失了原来的功能、或者显示出毒性等。另外，在使用哺乳动物细胞作为宿主细胞的情况下，根据目标蛋白，在细胞内以通常存在的以上的浓度使之表达的情况下，重组蛋白之间通过二硫键发生多聚体化，有时还对重组蛋白的纯化或生物体内的药物动力学产生影响。AIM包含3个由含有多个半胱氨酸的约100个氨基酸构成的清道夫受体富含半胱氨酸(Scavenger Receptor Cysteine-Rich，SRCR)结构域，因此在制备重组AIM的情况下，大肠杆菌不适合作为宿主细胞，即使在使用哺乳动物细胞的情况下，在验证了重组AIM是否发生多聚体化之后还确认到多聚体化的情况下，也需要研究使其不发生多聚体化的方法。然而，迄今为止关于重组AIM的多聚体化还未进行报道。而且，由于与IgM五聚体形成了复合物的AIM已失活，因此在将重组AIM作为药物进行给药的情况下，需要控制AIM与IgM五聚体的复合物的形成。然而，该课题仍未解决。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/140531；
专利文献2：WO2013/162021；
专利文献3：WO2015/119253；
非专利文献
非专利文献1：T. Miyazaki等人, J Exp Med. 189: 413-422, 1999；
非专利文献2：J. Kurokawa等人, Cell Metab. 11: 479-492, 2010；
非专利文献3：J. Kurokawa, Proc Natl Acad Sci U S A., 108: 12072-12077,2011；
非专利文献4：S. Arai等人, Cell Rep. 3: 1187-1198, 2013；
非专利文献5：T. Miyazaki等人, Cell Mol Immunol. 15: 562-574, 2018。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明以提供维持功能、未发生多聚体化、并且未被IgM失活的重组AIM为课题。
用于解决课题的手段
本发明人在使用HEK293表达野生型人重组AIM时，确认到形成多聚体，作为多聚体化的原因，着眼于人AIM中所含的半胱氨酸。本发明人根据人AIM的立体结构预测，预测到SEQ IDNO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸和氨基酸编号277的半胱氨酸参与多聚体形成，在制作该半胱氨酸已取代成了丝氨酸的突变型人重组AIM时，确认到突变型人重组AIM未发生多聚体化。另外，与野生型重组AIM相比，突变型重组AIM的回收效率上升。而且，突变型人重组AIM维持着作为野生型人AIM所具有的功能之一的向巨噬细胞中的胞吞作用活性，令人惊奇的是，直到将SEQ ID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸取代成了丝氨酸的AIM，才确认到该活性大幅提高。另外，还确认到野生型小鼠重组AIM形成二聚体，还发现了SEQ ID NO: 2所表示的野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸是导致二聚体形成的原因。而且，发现了将野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸和野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸分别取代成了丝氨酸的突变型人AIM和突变型小鼠AIM未与IgM五聚体形成复合物。本发明人根据上述认知进一步反复进行研究，结果完成了本发明。
即，本发明提供下述[1]～[11]等：
[1] 突变型人AIM，其包含以下(1)～(5)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型人AIM的活性：
(1) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列、
(2) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列、
(3) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列、
(4) 实质上与(1)～(3)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1)～(3)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸的氨基酸序列、
(5) 在(1)～(3)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列；
[2] [1]所述的突变型人AIM，其中，该其他氨基酸为选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸；
[3] [1]所述的突变型人AIM，其中，该其他氨基酸为丝氨酸；
[4] 突变型小鼠AIM，其包含以下(1)～(3)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型小鼠AIM的活性：
(1) SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列、
(2) 实质上与(1)的氨基酸序列同源、并且残留有(1)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的氨基酸的氨基酸序列、
(3) 在(1)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列；
[5] [4]所述的突变型小鼠AIM，其中，该其他氨基酸为选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸；
[6] [4]所述的突变型小鼠AIM，其中，该其他氨基酸为丝氨酸；
[7] 核酸，其包含下述(1)或(2)的核苷酸序列：
(1) 编码[1]～[3]中任一项所述的突变型人AIM的核苷酸序列、
(2) 编码[4]～[6]中任一项所述的突变型小鼠AIM的核苷酸序列；
[8] 表达载体，其包含[7]所述的核酸；
[9] 宿主细胞，其包含[8]所述的表达载体；
[10] 突变型人AIM或突变型小鼠AIM的制备方法，该制备方法包括：培养[9]所述的宿主细胞；
[11] 药物组合物，其包含下述(1)或(2)的突变型AIM：
(1) [1]～[3]中任一项所述的突变型人AIM、
(2) [4]～[6]中任一项所述的突变型小鼠AIM。
发明效果
本发明的突变AIM具有以下特征：维持与野生型重组AIM同等的功能、或者具有已提高的该功能，并且在以重组AIM的形式表达的情况下未发生多聚体化。因未发生多聚体化，故重组AIM不溶化而未沉淀(析出)，作为结果，关系到提高重组AIM的回收率和避免体内给药时的危险性。另外，本发明的突变AIM还具有以下特征：在对生物体给药的情况下，未与IgM五聚体形成复合物，作为结果，未被失活。因此，可防止所给予的突变AIM的效价降低，可减少给药量。
附图说明
[图1] 图1显示纯化和浓缩后的野生型人rAIM的电泳图。Monomer：显示单体，Dimer：显示二聚体，Polymer：显示多聚体。凝胶上部深色存在的部分(用箭头显示)为具有巨大分子量的多聚体。
[图2] 图2显示纯化和浓缩后的野生型小鼠rAIM的电泳图。Monomer：显示单体，Dimer：显示二聚体。
[图3] 图3显示野生型、2CS、3CS和2/3CS人AIM的氨基酸序列。下划线部分显示连接SRCR结构域间的铰链。
[图4] 图4显示野生型人AIM的立体结构。
[图5] 图5显示野生型小鼠AIM的立体结构。
[图6] 图6显示野生型和2CS小鼠AIM的氨基酸序列。下划线部分显示连接SRCR结构域间的铰链。
[图7] 图7显示纯化和浓缩后的野生型、2CS、3CS和2/3CS人rAIM的电泳图。Monomer：显示单体、Dimer：显示二聚体、Polymer：显示多聚体。需要说明的是，除此以外的谱带为AIM以外的非特异性蛋白的混入。
[图8] 图8显示纯化和浓缩后的野生型和2CS小鼠rAIM的电泳图。Monomer：显示单体，Dimer：显示二聚体。
[图9] 图9是显示通过腹腔巨噬细胞摄入rAIM的图。纵轴显示荧光强度。
[图10] 图10显示针对由包含野生型或2CS小鼠rAIM和小鼠IgM五聚体的培养上清得到的蛋白的蛋白质印迹图(A)、以及针对由包含野生型或2CS人rAIM和人IgM五聚体的培养上清得到的蛋白的蛋白质印迹图(B)。a-mAIM：抗小鼠AIM，a-hAIM：抗人AIM，a-mIgM：抗小鼠IgM，a-hIgM：抗人IgM。
具体实施方式
本发明提供突变型人AIM(以下，也称为本发明的突变型人AIM)，其包含以下(1a)～(5a)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型人AIM的活性。
(1a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(2a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(3a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(4a) 实质上与(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸的氨基酸序列。
(5a) 在(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
另外，本发明的突变型人AIM优选包含以下(1b)～(5b)中的任一条氨基酸序列。
(1b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)；
(2b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)；
(3b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)。
(4b) 实质上与(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的丝氨酸的氨基酸序列。
(5b) 在(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的丝氨酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
本发明中SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列表示野生型人AIM的氨基酸序列。野生型人AIM是主要存在于血中的蛋白，包含3个含有多个半胱氨酸的清道夫受体富含半胱氨酸(Scavenger-Receptor Cysteine-Rich，SRCR)结构域。野生型人AIM中所含的SRCR1结构域、SRCR2结构域和SRCR3结构域分别包含8个、9个、9个半胱氨酸，这些半胱氨酸中分别有8个、8个、8个半胱氨酸有助于分子内二硫键的形成，野生型人AIM形成高级结构。另一方面，作为不参与生物体内的野生型人AIM的高级结构形成的半胱氨酸，可列举SEQ ID NO: 1的氨基酸编号168的半胱氨酸和氨基酸编号277的半胱氨酸。野生型人AIM中存在的这两个半胱氨酸无助于分子内二硫键，取而代之的是在重组人AIM间形成分子间二硫键。其结果，重组人AIM发生多聚体化，以不溶化蛋白的形式沉淀。而且，上述SEQ ID NO: 1的氨基酸编号168的半胱氨酸通过与IgM五聚体中的特定的半胱氨酸形成分子间二硫键，从而形成由野生型人AIM和人IgM五聚体构成的复合物，使野生型人AIM失活。
如上所述，本发明的突变型人AIM包含下述(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列。
(1a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(2a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(3a) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列。
本发明的突变型人AIM通过将上述SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸和/或氨基酸编号277的半胱氨酸分别取代成其他氨基酸，可妨碍重组人AIM间的分子间二硫键的形成，可防止重组人AIM的多聚体化。另外，通过将上述SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸取代成其他氨基酸，可妨碍重组人AIM与IgM五聚体间的分子间二硫键的形成，可防止重组人AIM的失活。作为用于取代上述SEQID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸和/或氨基酸编号277的半胱氨酸的其他氨基酸，只要所得的突变型人AIM可维持或提高与野生型人AIM所具有的活性(这里，“活性”例如是指向巨噬细胞中的胞吞作用活性、巨噬细胞的细胞凋亡抑制活性、动脉硬化的维持/促进活性、脂肪细胞分化抑制活性、脂肪细胞的脂肪滴溶解活性、脂肪细胞缩小活性、CD36结合活性、向脂肪细胞中的胞吞作用活性、FAS结合活性、FAS功能抑制活性、抗肥胖活性、肝病(脂肪肝、NASH、肝硬化、肝癌)的预防或治疗活性、肾病(急性肾功能不全、慢性肾炎、慢性肾功能不全、肾病综合征、糖尿病性肾病、肾硬化症、IgA肾病、高血压性肾病、胶原病所伴随的肾病或IgM肾病)的预防或治疗活性等。)同样的活性即可，没有特别限定，优选列举在物理化学性质上与半胱氨酸类似的氨基酸。需要说明的是，用于取代上述的SEQID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸的其他氨基酸和用于取代氨基酸编号277的半胱氨酸的其他氨基酸彼此可以相同也可以不同。作为半胱氨酸的类似氨基酸，可列举分类为极性中性氨基酸的氨基酸，具体而言，可列举：选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸。其中，从结构上最类似的角度考虑，优选丝氨酸。因此，包含上述(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列的本发明的突变型人AIM可优选为包含下述的任一条氨基酸序列的突变型人AIM。
(1b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)；
(2b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)；
(3b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)。
特别是，如后述的实施例所述，暗示了包含(1b) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)的突变型人AIM向巨噬细胞中的胞吞作用活性较野生型人AIM的该活性高，作为AIM的功能更优异。
另外，本发明的突变型人AIM可包含下述(4a)或(5a)的氨基酸序列以代替上述(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列。
(4a) 实质上与(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸的氨基酸序列；
(5a) 在(1a)～(3a)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
另外，本发明的突变型人AIM可包含下述(4b)或(5b)的氨基酸序列以代替上述(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列。
(4b) 实质上与(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的丝氨酸的氨基酸序列；
(5b) 在(1b)～(3b)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的丝氨酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
作为实质上与上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)的氨基酸序列，具体而言，可列举：上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列的氨基酸编号10、26、39、44、73、83、91、101、124、140、153、158、168、185、195、205、215、230、246、259、264、277、292、302、312和322的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)没有变化、并且在除该氨基酸以外的氨基酸序列部分与SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列具有约85%以上、优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选约98%以上的同源性的氨基酸序列等。这里，“同源性”是指，在利用该技术领域中已知的数学算法比对2条氨基酸序列的情况下的最适比对(优选在该算法中可考虑向其中一条或两条序列中导入缺口以达到最适比对)中的、同源氨基酸和类似氨基酸残基与重叠的总氨基酸残基的比例(%)。“类似氨基酸”是指在物理化学性质上类似的氨基酸，例如可列举：芳族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等分类为同一组的氨基酸。预测利用这样的类似氨基酸进行的取代不会给蛋白的表现型带来变化(即为保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代的具体例子在该技术领域众所周知，记载在各种文献中(例如，参照Bowie等人, Science, 247: 1306-1310(1990))。
本说明书中的氨基酸序列的同源性可利用同源性计算算法NCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，按照以下条件(期望值=10；允许缺口；矩阵=BLOSUM62；过滤=OFF)进行计算。作为用于确定氨基酸序列同源性的其他算法，例如可列举：Karlin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993)中记载的算法[该算法纳入NBLAST和XBLAST程序(版2.0)中(Altschul等人, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needleman等人, J. Mol. Biol.,48: 444-453 (1970)中记载的算法[该算法纳入GCG软件包中的GAP程序中]、Myers和Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)中记载的算法[该算法纳入作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中]、Pearson等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448(1988)中记载的算法[该算法纳入GCG软件包中的FASTA程序中]等，这些算法也可同样地优选使用。
更优选，实质上与上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)的氨基酸序列是指，上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列的氨基酸编号10、26、39、44、73、83、91、101、124、140、153、158、168、185、195、205、215、230、246、259、264、277、292、302、312和322的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)没有变化、并且在除该氨基酸以外的氨基酸序列部分与SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列具有约85%以上、优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选约98%以上的同源性的氨基酸序列。
具体而言，上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)以外的位置，只要是上述(1a)～(3a)(或上述(1b)～(3b))中的任一条氨基酸序列的除氨基酸编号10、26、39、44、73、83、91、101、124、140、153、158、168、185、195、205、215、230、246、259、264、277、292、302、312和322的氨基酸以外的位置、且包含缺失、添加、插入或取代或其组合的突变型人AIM可维持或提高野生型人AIM所具有的活性的位置即可，没有特别限定。缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸数为1～多个、优选1～5个、1～4个、1～3个、或1～2个。需要说明的是，作为用于取代的氨基酸，可以和上述的类似氨基酸同样。
另外，本发明提供突变型小鼠AIM(以下，还称为本发明的突变型小鼠AIM)，其包含以下(1c)～(3c)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型小鼠AIM的活性。
(1c) SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(2c) 实质上与(1c)的氨基酸序列同源、并且残留有(1c)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的氨基酸的氨基酸序列；
(3c) 在(1c)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
另外，本发明的突变型小鼠AIM优选包含以下(1d)～(3d)中的任一条氨基酸序列。
(1d) SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)；
(2d) 实质上与(1d)的氨基酸序列同源、并且残留有(1d)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的丝氨酸的氨基酸序列；
(3d) 在(1d)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的丝氨酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
本发明中SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列表示野生型小鼠AIM的氨基酸序列。与野生型人AIM同样，野生型小鼠AIM包含3个SRCR结构域，但SRCR1结构域、SRCR2结构域和SRCR3结构域中所含的半胱氨酸与野生型人AIM不同，分别为8个、9个、8个。另外，不参与生物体内的野生型小鼠AIM的高级结构的形成的半胱氨酸仅可列举SEQ ID NO: 2的氨基酸编号168的半胱氨酸。野生型小鼠AIM中存在的该半胱氨酸无助于分子内二硫键，取而代之的是在重组小鼠AIM间形成分子间二硫键，重组小鼠AIM发生二聚体化。而且，上述SEQ ID NO:2的氨基酸编号168的半胱氨酸通过与IgM五聚体中的特定的半胱氨酸形成分子间二硫键，从而形成由野生型小鼠AIM和小鼠IgM五聚体构成的复合物，使野生型小鼠AIM失活。
如上所述，本发明的突变型小鼠AIM包含(1c)SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列。
本发明的突变型小鼠AIM通过将上述SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸取代成其他氨基酸，可妨碍重组小鼠AIM间的分子间二硫键的形成，可防止重组小鼠AIM的二聚体化。另外，通过将上述SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸取代成其他氨基酸，可妨碍重组小鼠AIM与IgM五聚体间的分子间二硫键的形成，可防止重组小鼠AIM的失活。作为用于取代上述的SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸的其他氨基酸，只要所得的突变型小鼠AIM可维持或提高与野生型小鼠AIM所具有的活性(这里，“活性”可以和野生型人AIM同样。)同样的活性即可，没有特别限定，可优选列举在物理化学性质上与半胱氨酸类似的氨基酸。作为半胱氨酸的类似氨基酸，可列举分类为极性中性氨基酸的氨基酸，具体而言，可列举：选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸。其中，从结构上最类似的角度考虑，优选丝氨酸。因此，上述本发明的突变型小鼠AIM可优选为包含(1d)SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)的突变型小鼠AIM。
另外，本发明的突变型小鼠AIM可包含下述(2c)或(3c)的氨基酸序列以代替上述(1c)的氨基酸序列。
(2c) 实质上与(1c)的氨基酸序列同源、并且残留有(1c)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的氨基酸的氨基酸序列；
(3c) 在(1c)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
另外，本发明的突变型小鼠AIM可包含下述(2d)或(3d)的氨基酸序列以代替上述(1d)的氨基酸序列。
(2d) 实质上与(1d)的氨基酸序列同源、并且残留有(1d)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的丝氨酸的氨基酸序列；
(3d) 在(1d)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的丝氨酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
作为实质上与上述(1c)(或上述(1d))的氨基酸序列同源、并且残留有上述((1c)(或上述(1d))的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)的氨基酸序列，具体而言，可列举：上述(1c)(或上述(1d))的氨基酸序列的氨基酸编号10、26、39、44、72、82、91、101、124、140、153、158、168、185、195、204、214、229、245、258、263、291、301、311和321的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)没有变化、并且在除该氨基酸以外的氨基酸序列部分与SEQ IDNO: 2所表示的氨基酸序列具有约85%以上、优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选约98%以上的同源性的氨基酸序列等。这里，“同源性”可与上述同样。
更优选，实质上与上述(1c)(或上述(1d))的氨基酸序列同源、并且残留有上述((1c)(或上述(1d))的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)的氨基酸序列是指，上述(1c)(或上述(1d))的氨基酸序列的氨基酸编号10、26、39、44、72、82、91、101、124、140、153、158、168、185、195、204、214、229、245、258、263、291、301、311和321的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)没有变化、并且在除该氨基酸以外的氨基酸序列部分与SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列具有约85%以上、优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选约98%以上的同源性的氨基酸序列。
另外，具体而言，上述(1c)(或上述(1d))的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸(优选该所取代的其他氨基酸为丝氨酸)以外的位置，只要是上述(1c)(或上述(1d))的除氨基酸编号10、26、39、44、72、82、91、101、124、140、153、158、168、185、195、204、214、229、245、258、263、291、301、311和321的氨基酸以外的位置、且包含缺失、添加、插入或取代或其组合的突变型小鼠AIM可维持或提高野生型小鼠AIM所具有的活性的位置即可，没有特别限定。需要说明的是，关于野生型小鼠AIM所具有的活性、用于取代的氨基酸、缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸数等，可与本发明的突变型人AIM中的记载同样。
本发明的突变型人AIM和突变型小鼠AIM(以下，本发明的突变型人AIM和突变型小鼠AIM还统称为本发明的突变型AIM)可进一步添加有信号肽。野生型人AIM以在SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的N末端连接有SEQ ID NO: 7所表示的信号肽的未成熟野生型人AIM的形式在细胞内翻译、并分泌到细胞外时，上述信号肽被切割，转换为成熟型蛋白。同样地，野生型小鼠AIM以在SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的N末端连接有SEQ ID NO：8所表示的信号肽的未成熟野生型小鼠AIM的形式在细胞内翻译、并分泌到细胞外时，上述信号肽被切割，转换为成熟型蛋白。在通过添加信号肽使突变型AIM作为重组AIM在细胞内表达的情况下，突变型AIM被分泌到细胞外，从而使回收变得容易。
本发明的突变型AIM可按照已知的肽合成法进行制备。
肽合成法例如可以是固相合成法、液相合成法的任一种。在将可构成本发明的突变型AIM的部分肽或氨基酸与残余部分缩合、且产物具有保护基的情况下，通过脱离保护基，可制备目标突变型AIM。
这里，缩合或保护基的脱离按照自身已知的方法、例如以下的(1)和(2)所记载的方法进行。
(1) M. Bodanszky和M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, IntersciencePublishers, New York (1966年)；
(2) Schroeder和Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)。
如此操作而得到的本发明的突变型AIM可利用已知的纯化方法进行纯化分离。这里，作为纯化方法，例如可列举：溶剂提取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶、这些方法的组合等。
在通过上述方法得到的本发明的突变型AIM为游离体的情况下，可通过已知的方法或基于其的方法将该游离体转换成适当的盐，反之，在以盐的形式得到本发明的突变型AIM的情况下，可通过已知的方法或基于其的方法将该盐转换成游离体或其他的盐。
而且，本发明的突变型AIM还可通过培养含有表达载体的宿主细胞、并由所得培养物分离纯化突变型AIM来制备，所述表达载体包含编码本发明的突变型AIM的核酸。编码本发明的突变型AIM的核酸可以是DNA也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合体。优选列举DNA。另外，该核酸可以是双链也可以是单链。在双链的情况下，可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA的杂化物。在单链的情况下，可以是有义链(即编码链)，也可以是反义链(即非编码链)。
作为编码本发明的突变型AIM的DNA，可列举合成DNA等。例如可如下获取：使用已知的试剂盒、例如MutanTM-super Express Km (TAKARA BIO INC.)、MutanTM-K(TAKARA BIOINC.)等和用于导入突变的引物，按照ODA-LA PCR法、带缺口的双链体(Gapped duplex)法、Kunkel法等自身已知的方法或以它们为基准的方法转换使用由细胞或组织调制的总RNA或mRNA组分作为模板、通过逆转录酶-PCR(以下，简称为“RT-PCR法”)直接扩增的全长AIMcDNA(例如，在人的情况下可列举SEQ ID NO: 9所表示的核苷酸序列，在小鼠的情况下可列举SEQ ID NO: 10所表示的核苷酸序列。)而获取。或者，还可通过将利用集落或噬菌斑杂交法或PCR法等由cDNA文库克隆的cDNA按照上述方法进行转换而获取，所述cDNA文库是将上述的总RNA或mRNA的片段插入到适当的载体中而调制的。文库中使用的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等的任一种。
作为包含编码本发明的突变型AIM的核苷酸序列的核酸，只要是包含本发明的突变型AIM的氨基酸序列所对应的密码子的核酸即可，没有限定，例如在添加有信号肽的突变型人AIM的情况下，可列举：包含SEQ ID NO: 9所表示的核苷酸序列的碱基编号572的G取代成了C的SEQ ID NO: 11所表示的核苷酸序列、SEQ ID NO: 9所表示的核苷酸序列的碱基编号899的G取代成了C的SEQ ID NO: 12所表示的核苷酸序列、或者与具有这两种取代的SEQID NO: 13所表示的核苷酸序列同源或实质上同源的核苷酸序列的DNA等，在添加有信号肽的突变型小鼠AIM的情况下，可列举：包含与SEQ ID NO: 10所表示的核苷酸序列的碱基编号581的G取代成了C的SEQ ID NO: 14所表示的核苷酸序列同源或实质上同源的核苷酸序列的DNA等。
这里，“实质上同源的核苷酸序列”可列举具有不使由原始核苷酸序列编码的氨基酸序列发生变化的这样的突变(沉默突变)的核苷酸序列。
包含编码本发明的突变型AIM的核酸的表达载体可通过分离编码上述的突变型AIM的DNA片段、并将该DNA片段连接在适当的表达载体中的启动子的下游来制备。例如，将由SEQ ID NO: 11所表示的核苷酸序列构成的DNA插入表达载体pCAGGS中，将所得质粒转化到大肠杆菌中，从而可获取包含编码本发明的突变型人AIM的DNA的表达载体。
作为表达载体，使用动物细胞表达质粒(例如：pCAGGS、pSRα、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)。
作为启动子，只要是与基因表达中使用的宿主对应的适当的启动子即可，可以是任何的启动子。
例如，在宿主为动物细胞的情况下，使用β-肌动蛋白启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、trc启动子、trc修饰启动子等。
作为表达载体，除上述以外，还可使用根据期望而含有增强子、剪接信号、聚A添加信号、选择标志物、SV40复制起点(以下，有时简称为SV40 ori)等的表达载体。作为选择标志物，例如可列举：二氢叶酸还原酶基因(以下，有时简称为dhfr、甲氨蝶呤(MTX)抗性)、新霉素抗性基因(以下，有时简称为neor、G418抗性)等。特别是，在使用dhfr基因缺损中国仓鼠细胞、并使用dhfr基因作为选择标志物的情况下，还可通过不含胸苷的培养基选择目标基因。
向宿主细胞中基因导入包含编码上述的突变型AIM的核酸的表达载体，培养所得的宿主细胞，从而可制备该突变型AIM。
作为宿主细胞，在本发明的突变型AIM的情况下优选动物细胞。
作为动物细胞，例如使用COS-7、Vero、CHO、CHO(dhfr-)、CHO-K1、CHO-S、L、AtT-20、GH3、FL、HEK293、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、P388等细胞。
基因导入可按照已知的方法实施。
动物细胞例如可按照细胞工程学分册8 新细胞工程学试验指南, 263-267(1995)(秀润公司发行), Virology, 52卷, 456 (1973)中记载的方法导入基因。
已导入基因的宿主细胞的培养可按照已知的方法实施。
在宿主细胞为动物细胞的情况下，作为培养中使用的培养基，例如使用包含约5～约20%的胎牛血清的最小必需培养基(MEM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium，DMEM)、RPMI 1640培养基、199培养基等。培养基的pH优选为约6～约8。培养通常是在约30～约40℃下进行约15～约60小时。根据需要可进行通气或搅拌。
如上操作，可在宿主细胞的细胞内或细胞外制备本发明的突变型人AIM。
可按照自身已知的方法从培养上述的导入有基因的宿主细胞而得到的培养物中分离纯化本发明的突变型AIM。
例如，在由宿主细胞的细胞质提取本发明的突变型AIM的情况下，可适当采用下述方法等：将通过已知方法由培养物收集的宿主细胞悬浮在适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或冻融等破坏宿主细胞，之后通过离心分离或过滤得到可溶性蛋白的粗提取液的方法等。该缓冲液可包含尿素或盐酸胍等蛋白变性剂、或Triton X-100TM等表面活性剂。另外，在本发明的突变型AIM被分泌到细胞外的情况下，采用通过离心分离或过滤等由培养物分取培养上清等的方法。
如此操作而得到的可溶性组分、培养上清中所含的本发明的突变型AIM的分离纯化可按照自身已知的方法进行。作为这样的方法，可列举：盐析或溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析法、超滤法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等主要利用分子量之差的方法；离子交换色谱等利用荷电之差的方法；亲和色谱法等利用特异性亲和性的方法；反相高效液相色谱法等利用疏水性之差的方法；等电点电泳法等利用等电点之差的方法；使用了抗体的方法等。这些方法也可适当组合。
如此得到的本发明的突变型AIM的存在可通过使用了抗该突变型AIM抗体的酶免疫测定或蛋白质印迹法等进行确认。
另外，本发明提供包含本发明的突变型AIM的药物组合物(以下，也称为本发明的药物组合物)。迄今为止，发明人报道了AIM可用于肥胖、肝病、肾病的预防或治疗(WO2010/140531、WO2013/162021、WO2015/119253)。另外，由于本发明的突变型AIM还维持或提高与野生型AIM同样的活性，所以可用于肥胖、肝病、肾病的预防或治疗。
本发明的药物组合物的给药对象可列举人或其他恒温动物(例如，小鼠、大鼠、兔、羊(绵羊)、猪、牛、猫、狗、猴、鸟等)。
成为本发明的药物组合物的应用对象的肝病，例如可列举：脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝癌。另外，成为本发明的药物组合物的应用对象的肾病，例如可列举：急性肾功能不全、慢性肾炎、慢性肾功能不全、肾病综合征、糖尿病性肾病、肾硬化症、IgA肾病、高血压性肾病、伴随胶原病的肾病或IgM肾病，优选列举急性肾功能不全或慢性肾功能不全。作为伴随胶原病的肾病，代表性的可列举狼疮性肾炎。
本发明的药物组合物为低毒性，可直接作为液体制剂、或者作为适当剂型的药物组合物对人或其他恒温动物(例如，小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴、鸟等)进行口服或胃肠外(例如，血管内给药、皮下给药等)给药。
作为用于胃肠外给药的药物组合物，例如使用注射剂、栓剂等，注射剂可包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可按照已知的方法进行调制。作为注射剂的调制方法，例如可通过将上述本发明的突变型人AIM溶解、悬浮或乳化在通常注射剂所使用的无菌的水性液或油性液中来调制。作为注射用水性液，例如使用含有生理盐水、葡萄糖或其他辅助药的等渗溶液等，可与适当的助溶剂、例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加成物)]等并用。作为油性液，例如使用芝麻油、大豆油等，可并用苯甲酸苄酯、苄醇等作为助溶剂。调制的注射液优选填充在适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可通过将上述突变型AIM混合在通常栓剂用基质中来调制。
作为用于口服给药的药物组合物，可列举固体或液体的剂型，具体而言，可列举：片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的药物组合物可通过已知的方法来制备，可含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
本发明的药物组合物的给药量根据给药对象、对象疾病、症状、给药路径等而不同，例如在用于成人的情况下，适合将本发明的突变型AIM如下进行给药：通常以0.01～20mg/kg体重左右、优选0.1～10mg/kg体重左右、进一步优选0.1～5mg/kg体重左右作为1次量，按照1天1～5次左右、优选1天1～3次左右，通过静脉注射给药1天～21天左右、优选1天～14天左右。在其他的胃肠外给药和口服给药的情况下，也可给予基于此的量。在症状特别严重的情况下，可根据其症状而增量。
需要说明的是，本发明的药物组合物可含有其他活性成分，只要它们与本发明的突变型AIM的掺混不会产生不希望的相互作用即可。
实施例
以下，通过实施例和参考例来更具体地说明本发明，但该发明并不限于这些例子。
实施例1：野生型人重组AIM(rAIM)的多聚体的形成
野生型人rAIM的调制如下进行。即，将pCAGGS-人AIM表达载体导入HEK293中，将由此得到的人AIM稳定表达株用含有5%FBS、Glutamax、庆大霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM、Invitrogen)培养3天，之后回收培养上清。对于回收的培养上清，使用通过将小鼠抗人AIM单克隆抗体(克隆7、自家制作)固定在HiTrap NHS-活化的HP柱(GE Healthcare LifeSciences)上而得到的抗体柱来纯化人rAIM。用pH2.5的0.1M的甘氨酸-HCl洗脱与抗体柱结合的人rAIM，之后立即用pH8.5的1M Tris-HCl进行中和，得到了人rAIM洗脱液。使用Amicon超滤浓缩器(Millipore)将洗脱液中的缓冲液置换成Dulbecco’s磷酸缓冲盐(DPBS)，进行浓缩。通过二辛可宁酸(Bcinchoninic acid，BCA)测定(Pierce)对人rAIM浓缩液进行蛋白量的定量，使用DPBS将终浓度调整至2.0mg/mL。将如上纯化和浓缩的1μg野生型人rAIM蛋白在非还原条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)根据分子量的不同进行分离，之后进行考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue，CBB)染色，进行野生型人rAIM的检测。
其结果，由人AIM稳定表达株纯化人rAIM，在调制成高浓度溶液的情况下，人rAIM形成了多聚体(图1)。特别是，担心分子量大的一部分多聚体(多个rAIM聚合的复合物：相当于图1的泳道A中的分子量大的谱带的多聚体rAIM、以及残留在狭槽中的多聚体rAIM)会沉淀。这暗示了：在纯化人rAIM、并将其作为治疗药对生物体给药时，沉淀的多聚体可能会堵塞微细血管而导致重大事故的危险性。因此，鉴于将来的人rAIM的临床应用的可能性，希望研制至少不会形成分子量大的多聚体的突变型人AIM。
实施例2：野生型小鼠重组AIM(rAIM)的多聚体的形成
野生型小鼠rAIM的调制如下进行。即，将pCAGGS-小鼠AIM表达载体导入HEK293中，将由此得到的小鼠AIM稳定表达株用含有5%FBS、Glutamax、庆大霉素的DMEM培养3天，之后回收培养上清。对于回收的培养上清，使用通过将大鼠抗小鼠AIM单克隆抗体(克隆36、自家制作)固定在HiTrap NHS-活化的HP柱上而得到的抗体柱来纯化小鼠rAIM。使用pH2.3的0.1M的甘氨酸-HCl洗脱与抗体柱结合的小鼠rAIM，之后立即用pH8.5的1M Tris-HCl进行中和，得到了小鼠rAIM洗脱液。使用Amicon超滤浓缩器将洗脱液中的缓冲液置换成DPBS，进行浓缩。通过BCA测定对小鼠rAIM浓缩液进行蛋白量的定量，使用DPBS将终浓度调整至2.0mg/mL。将如上纯化和浓缩的1μg野生型小鼠rAIM蛋白在非还原条件下通过SDS-PAGE根据分子量的不同进行分离，之后进行CBB染色，进行野生型小鼠rAIM的检测。
其结果，小鼠rAIM未形成像人rAIM这样的多聚体，仅存在单体和二聚体(图2)。
实施例3：野生型人和小鼠AIM的立体结构的预测
野生型人AIM在3个SRCR结构域(SRCR1、SRCR2、SRCR3)中分别具有8、9、9个半胱氨酸(图3)。另外，未成熟的AIM在N末端连接有信号肽，分泌到细胞外时该信号肽被切割，转换为成熟蛋白。发明人为了验证人AIM中存在的上述半胱氨酸所形成的二硫键参与多聚体化的可能性，预测了人AIM的立体结构。人AIM的立体结构的预测通过由3个SRCR结构域表示的部分结构和包含3个SRCR结构域和铰链(图3的下划线部分)的整体结构的两阶段建模来进行。在每个SRCR结构域的同源建模(Homology Modeling)中使用Swiss-Model服务器(http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL)。对人AIM的3个SRCR结构域分别通过Blast和HHBlits进行序列同源性检索，其结果，同样属于人AIM所属的SRCR超级家族组B的人CD6(5a2e.1.A; PDB ID: 5A2E)对所有的SRCR结构域均显示出30%以上的良好的序列同源性。于是，以人CD6为模板，利用Promod-II6分别构建了3个SRCR结构域的立体结构。接下来，使用Prime 4.2版(Schrodinger, LLC, New York, NY, 2015)，通过导入除SRCR结构域以外的序列(铰链)，构建了人AIM的整体结构。人AIM整体的立体结构是采用以OPLS_2005为力场的Desmond的分子动力学计算(310 K, 20 ns)，在被水分子(SPC)填满的周期性箱型模型内使人AIM的整体结构达到平衡而得到的。另外，人AIM的各SRCR结构域内的4个二硫键以人CD6的SRCR结构域为模板而重现。野生型人AIM的立体结构预测的结果见图4。可知：野生型人AIM的3个SRCR结构域内分别存在的8、9、9个半胱氨酸中，分别有8个半胱氨酸在各SRCR结构域内被用于二硫键。然而，本发明人发现了：在野生型人AIM中，在SRCR2结构域和SRCR3结构域各存在1个孤立的半胱氨酸(孤立的Cys)、即SEQ ID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸和氨基酸编号277的半胱氨酸。
另外，利用同样的方法，发明人预测了小鼠AIM的立体结构。野生型小鼠AIM的立体结构预测的结果见图5。在野生型小鼠AIM的各SRCR结构域内分别存在8、9、8个半胱氨酸(图6)。可知：该半胱氨酸中分别有8个半胱氨酸在各SRCR结构域内被用于二硫键。然而，发明人发现了：野生型小鼠AIM在SRCR2结构域存在孤立的半胱氨酸(孤立的Cys)、即SEQ ID NO: 2所表示的野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸。
实施例4：突变型人rAIM的多聚体的形成
发明人为了验证SEQ ID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸和氨基酸编号277的半胱氨酸与野生型人rAIM的多聚体化有关的可能性，调制了将上述的半胱氨酸取代成了其他氨基酸的突变型人rAIM。首先，为了维持野生型人rAIM的功能，研究了用于取代的氨基酸。由于半胱氨酸为亲水性(可形成氢键)、零电荷、非芳族，所以选择了丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺这4种作为类似氨基酸。由分子形状和大小的比较可知：上述4种氨基酸中，丝氨酸具有最接近于半胱氨酸的结构和性质，因此选择丝氨酸作为用于取代的氨基酸。突变型人rAIM的调制如下进行。即，分别制作了分别表达下述突变型人AIM的pCAGGS-人AIM-2CS、pCAGGS-人AIM-3CS和pCAGGS-人AIM-2/3CS表达载体：通过将编码SEQID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸的密码子TGC取代成TCC而得到的突变型人AIM(以下，在实施例4、6、7中还称为“2CS”)(SEQ ID NO: 3)、通过将编码SEQID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号277的半胱氨酸的密码子TGC取代成TCC而得到的突变型人AIM(以下，还称为“3CS”)(SEQ ID NO: 4)和具有上述两种取代的突变型人AIM(以下，还称为“2/3CS”)(SEQ ID NO: 5)。接下来，利用电穿孔法将该表达载体导入HEK293T细胞中并培养3天，从而由培养上清回收一过性表达的各突变型人rAIM。之后，按照与实施例1同样的方法，使用抗体柱进行各突变型人rAIM的纯化和浓缩。将已纯化和浓缩的各100ng的野生型、2CS、3CS、2/3CS的人rAIM蛋白在非还原条件下通过SDS-PAGE根据分子量的不同进行分离，之后进行Oriole染色，进行各人rAIM蛋白的检测。
其结果，通过将SRCR2结构域和SRCR3结构域中分别存在的1个孤立的半胱氨酸分别取代成丝氨酸而得到的2CS和3CS未形成多聚体，与野生型小鼠AIM一样仅形成了单体和二聚体(图7)。另外，通过将上述孤立的半胱氨酸一同取代成丝氨酸而得到的2/3CS仅形成了单体(图7)。因此可知：野生型人rAIM的多聚体化的原因在于SEQ ID NO: 1所表示的野生型人AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸和氨基酸编号277的半胱氨酸。需要说明的是，由培养上清最终纯化后rAIM(野生型人rAIM中的沉淀部分除外)的回收率按照野生型、2CS、3CS、2/3CS的顺序依次为32、52、53、61%(3次一过性表达和纯化后的回收率的平均值)，在突变型中回收率上升。
实施例5：突变型小鼠rAIM的二聚体的形成
发明人为了验证SEQ ID NO: 2所表示的野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸与野生型小鼠rAIM的二聚体化有关的可能性，与实施例4同样，调制了将上述的半胱氨酸被取代成了丝氨酸的突变型小鼠rAIM。突变型小鼠rAIM的调制如下进行。即，制作了pCAGGS-小鼠AIM-2CS表达载体，其表达通过将编码SEQ ID NO: 2所表示的野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸的密码子TGT取代成TCT而得到的突变型小鼠AIM(以下，在本实施例5、7中还称为“2CS”)(SEQ ID NO: 6)。接下来，利用电穿孔法将该表达载体导入HEK293T细胞中并培养3天，从而由培养上清回收一过性表达的突变型小鼠rAIM。之后，按照与实施例2同样的方法，使用抗体柱进行突变型小鼠rAIM的纯化和浓缩。将已纯化和浓缩的各100ng的野生型、2CS的小鼠rAIM蛋白在非还原条件下通过SDS-PAGE按照分子量的不同进行分离，之后进行Oriole染色，进行各小鼠rAIM蛋白的检测。
其结果，通过将SRCR2结构域中存在的1个孤立的半胱氨酸取代成丝氨酸而得到的2CS，仅形成单体，未形成二聚体(图8)。因此，明确了野生型小鼠rAIM的二聚体化的原因在于SEQ ID NO: 2所表示的野生型小鼠AIM的氨基酸编号168的半胱氨酸。
实施例6：突变型人rAIM的功能
AIM被摄入到以巨噬细胞为代表的肝细胞、脂肪细胞等各种细胞中，对各自的细胞发挥各种作用。发明人使用巨噬细胞验证了各突变型人rAIM(2CS、3CS和2/3C)是否因突变而丧失了摄入到上述细胞中的功能。对于野生型和各突变型(2CS、3CS和2/3C)的人rAIM，使用荧光素-4-异硫氰酸酯(同仁化学研究所)进行FITC标记。各人rAIM的标记率为同等程度。之后，将各人rAIM在以20μg/mL的浓度含有5% FBS的DMEM中与由AIM缺损小鼠腹腔分离的F4/80阳性巨噬细胞进行30分钟的共培养，进行了细胞对人rAIM的摄入反应。回收细胞，洗涤后使用流式细胞仪(BD FACSCelesta)测定F4/80阳性巨噬细胞中的FITC平均荧光强度，从而分析各rAIM的细胞内摄入。
其结果，与野生型人rAIM相比，各突变型人rAIM向巨噬细胞内的摄入没有减弱。因此，认为各突变型人rAIM在功能上没有减弱。不仅如此，更有意思的是，与野生型AIM相比2CS反倒被巨噬细胞更好地摄入(图9)。
实施例7：野生型或突变型rAIM与IgM五聚体的复合物的形成
将强制表达IgM和J链的HEK293T细胞和强制表达野生型或突变型(2CS)的rAIM的HEK293T细胞进行24小时的共培养，将其培养上清中所含的蛋白在非还原条件下通过SDS-PAGE进行分离。然后，转录分离到薄膜滤器中的蛋白，使用抗AIM(a-AIM)抗体或抗IgM(a-IgM)抗体验证rAIM与IgM五聚体是否形成了复合物(小鼠(图10A)、人(图10B))。其结果，小鼠、人的野生型rAIM均与IgM结合，但2CS未与IgM结合。
产业实用性
本发明的突变AIM具有以下特征：维持与野生型AIM同等的功能，或者具有已提高的该功能，并且在以重组AIM的形式表达的情况下未发生多聚体化。由于未发生多聚体化，所以重组AIM不溶化而未沉淀，作为结果，与提高重组AIM的回收率和避免体内给药时的危险性有关。本发明的突变AIM在对生物体给药的情况下，由于未与IgM五聚体形成复合物，所以未被失活，可防止效价降低。认为该效果在人AIM的临床应用中极其有用。本申请以在日本申请的日本特愿2017-220733(申请日：2017年11月16日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。
<110> 宫崎彻
<120> 突变型AIM
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<150> JP 2017-220733
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cagaagggcc agtggggcac cgtctgcgac gacggctggg acatcaagga cgtggctgtc 180
ctctgccgcg agctgggatg cggtgctgcc agcggcacgc ccagcggcat cctgtacgag 240
cctcccgcag agaaggagca gaaggtcctg atccagagcg tcagctgcac aggcaccgag 300
gacacactgg ctcagtgtga gcaggaggaa gtctacgact gtagccacga cgaggacgct 360
ggcgcatcct gcgagaaccc cgagagctcc ttcagccccg tgcccgaggg cgtcagactg 420
gctgacggcc ctggccactg caagggcaga gtcgaggtga agcaccagaa ccagtggtac 480
accgtgtgcc agaccggctg gagcctcaga gccgcaaagg tcgtctgccg gcagctgggc 540
tgtggcaggg ctgtactgac tcagaagcgc tgcaacaagc acgcctacgg ccgcaagccc 600
atctggctca gccagatgag ctgcagcggc cgcgaggcaa ccctgcagga ctgccccagc 660
ggcccttggg gcaagaacac ctgcaaccat gacgaggaca cgtgggtcga gtgtgaagat 720
cccttcgact tgcgcctcgt cggaggagac aacctctgca gcggccgcct cgaggtgctg 780
cacaagggcg tctggggcag cgtctgcgac gacaactggg gcgagaagga ggaccaggtg 840
gtatgcaagc aactgggctg tggcaagtcc ctcagcccca gcttccgcga ccgcaagtgc 900
tacggtcccg gcgtcggcag aatctggctg gacaacgtcc gctgcagcgg cgaggagcag 960
agcctcgagc agtgccagca ccgcttctgg ggcttccacg actgcaccca ccaggaggac 1020
gtcgctgtca tctgcagcgg ctag 1044
<210> 10
<211> 1059
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 10
atggctccat tgttcaactt gatgctggcc atcttgagca tttttgttgg atcgtgtttt 60
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gaggtggaac acaatggcca gtgggggact gtgtgtgatg atggctggga ccggcgtgat 180
gtggctgtgg tgtgccgaga gctcaattgt ggagcagtca tccaaacccc gcgtggcgca 240
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<212> DNA
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atggctctgc tcttcagcct catcctcgcc atctgcacca gacccggctt cctcgccagc 60
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cacaagggcg tctggggcag cgtctgcgac gacaactggg gcgagaagga ggaccaggtg 840
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cagtggagca ctgtgtgtaa agcaggctgg aacttacagg tctcaaaggt ggtgtgcagg 540
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gaacagtctc tggagttctg ccggcacagg ttgtgggggt accacgactg tacccacaag 1020
gaagatgtgg aggtgatctg cacagacttt gatgtgtga 1059

Claims (11)

1.突变型人AIM，其包含以下(1)～(5)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型人AIM的活性：
(1) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(2) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(3) SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸、并且SEQ ID NO: 1所表示的氨基酸序列的氨基酸编号277的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(4) 实质上与(1)～(3)中的任一条氨基酸序列同源、并且残留有(1)～(3)中的任一条氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸的氨基酸序列；
(5) 在(1)～(3)中的任一条氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的突变型人AIM，其中，该其他氨基酸为选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸。
3.权利要求1所述的突变型人AIM，其中，该其他氨基酸为丝氨酸。
4.突变型小鼠AIM，其包含以下(1)～(3)中的任一条氨基酸序列，且具有野生型小鼠AIM的活性：
(1) SEQ ID NO: 2所表示的氨基酸序列的氨基酸编号168的半胱氨酸被取代成了其他氨基酸的氨基酸序列；
(2) 实质上与(1)的氨基酸序列同源、并且残留有(1)的氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该所取代的氨基酸的氨基酸序列；
(3) 在(1)的氨基酸序列中存在的除半胱氨酸和该所取代的其他氨基酸以外的位置进一步包含1～多个氨基酸的缺失、添加、插入或取代或其组合的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的突变型小鼠AIM，其中，该其他氨基酸为选自天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸。
6.权利要求4所述的突变型小鼠AIM，其中，该其他氨基酸为丝氨酸。
7.核酸，其包含下述(1)或(2)的核苷酸序列：
(1) 编码权利要求1～3中任一项所述的突变型人AIM的核苷酸序列；
(2) 编码权利要求4～6中任一项所述的突变型小鼠AIM的核苷酸序列。
8.表达载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求8所述的表达载体。
10.突变型人AIM或突变型小鼠AIM的制备方法，该制备方法包括：培养权利要求9所述的宿主细胞。
11.药物组合物，其包含下述(1)或(2)的突变型AIM：
(1) 权利要求1～3中任一项所述的突变型人AIM；
(2) 权利要求4～6中任一项所述的突变型小鼠AIM。
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