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CN111297884B - 腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用 - Google Patents

腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用 Download PDF

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CN111297884B CN202010255841.2A CN202010255841A CN111297884B CN 111297884 B CN111297884 B CN 111297884B CN 202010255841 A CN202010255841 A CN 202010255841A CN 111297884 B CN111297884 B CN 111297884B
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Abstract

本发明涉及蜜蜂养殖技术领域，具体涉及腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用。本发明发现腺苷能够显著提高感染中蜂囊状病毒(CSBV)的中华蜜蜂幼虫的存活率，降低其死亡率。腺苷能够抑制蜜蜂体内CSBV的增殖，降低病毒的拷贝数；同时，还能够诱导内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力。腺苷可用于制备防治CSBV感染的药物或饲料，对于中蜂囊状幼虫病的防治具有重要意义，具有良好的市场应用价值。

Description

腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用
技术领域
本发明涉及蜜蜂养殖技术领域，具体涉及腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用。
背景技术
蜜蜂是自然界中重要的传粉昆虫，全球约有三分之一的农作物在一定程度上需要蜜蜂授粉，而某些水果、蔬菜等则完全依赖蜜蜂传粉。蜜蜂授粉可以显著提高农作物的产量和品质，因此在农业生产方面具有重要的经济价值。此外，蜜蜂还可以产出种类繁多的峰产品，如蜂蜜，蜂王浆，蜂胶，蜂花粉等。蜂产品的质量与蜜蜂的健康状态息息相关，感病蜜蜂产出的蜂产品存在安全隐患，而治疗蜂病的药物也会残留在蜂产品中进而导致蜂产品的安全问题。
中华蜜蜂(Apis cerana)作为具有抗螨能力强、耐低温、善于采集零星蜜粉源的优势蜂种，在养蜂业中具有重要地位，在维护自然生态体系平衡方面也发挥着极为重要的作用。然而，中华蜜蜂常受到多种病原物的危害，其中，中蜂囊状病毒(CSBV)对中华蜜蜂的危害最为严重。CSBV主要感染1～3日龄幼虫，造成蜂群内幼虫大量死亡,即便侥幸存活也无法化蛹，导致新出房的工蜂数量不足，进而导致中蜂群势减弱，蜂群抵抗能力下降，更易被其它病毒侵袭，从而表现出多病毒共同感染的现象。CSBV可通过食物互饲，排泄物污染，交配行为和生殖配子的方式在蜂群内进行传播。雄蜂可作为病毒载体将病毒通过生殖配子传递给子代。由于雄蜂的无群界性，可以直接决定蜂群的遗传多样性，因此可能会对蜂群的抗病害能力产生重要的影响。目前对于中华蜜蜂囊状幼虫病主要采取换王断子、严格消毒、加强管理，使用抗病毒药物配以抗生素预防继发感染等综合防治措施进行防控，但是防治效果不理想，常用的抗病毒药物很难有效的控制该病毒的危害及传播，还会导致蜂产品中药物残留。
内源性抗菌肽作为先天免疫的重要组成部分,在免疫调节和病原体防御中起关键作用。内源性抗菌肽具有免疫调节活性，参与调节先天性和适应性免疫应答，是机体防御外来物质入侵的重要介质，同时也是机体适应环境产生的免疫活性分子。
蜜蜂在受到微生物或其他外源物质的侵染时，血淋巴会产生一定量的抗菌肽，包括膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)，蜜蜂防卫素(Defensin)，蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)和蜂蛾抗菌肽(Abaecin)。这些肽类物质是由脂肪体合成后分泌到血淋巴中，是一种快速有效的防御机制，可用来迅速杀死或清除外源的微生物。这种防御机制不同于动物的免疫应答，昆虫没有严格意义上的免疫应答机制，昆虫血淋巴所产生的这些抗菌肽可以由一种或多种微生物入侵产生，没有特异性，诱导产物不是只对特定的入侵微生物产生的，通常对非入侵的微生物也有抵抗作用。这几种抗菌肽的分子量、化学结构以及抗菌机制作用均不同，不同抗菌肽能够抵御不同的细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等，其中，蜜蜂抗菌肽是蜜蜂主要的抗菌肽，而膜翅目抗菌肽是蜜蜂抗菌肽中最重要的补充肽，主要是对蜜蜂抗菌肽产生抗性的部分革兰氏阴性菌起抑制作用；蜂蛾抗菌肽则作为蜜蜂抗菌肽的后备肽，只有当蜜蜂抗菌肽和膜翅目抗菌肽的杀菌能力丧失时才会发挥作用。蜜蜂防卫素的表达量最少，它也是蜜蜂血淋巴内唯一抑制革兰氏阳性菌的抗菌肽。蜜蜂抗菌肽含量变化受不同因素的影响，包括细菌、真菌和微抱子虫、病毒、蜂螨以及药物等。抗菌肽在抵抗蜜蜂病毒方面发挥作用，研究人员发现：当蜜蜂接种急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)后，抗菌肽基因表达量显著增加；在蜜蜂中肠上皮组织中，蜜蜂残翅病毒(DWV)感染水平和蜜蜂抗菌肽基因的表达水平呈线性相关；在受到病毒侵染后，蜜蜂体内的蜜蜂抗菌肽、膜翅目抗菌肽、蜂蛾抗菌肽的表达量显著降低。蜂螨也可影响蜜蜂抗菌肽的表达。在药物方面，研究人员发现杀螨剂能够显著影响蜜蜂抗菌肽基因的表达，在蜜蜂接触氟氯苯菊醋后，膜翅目抗菌肽的表达量显著上调，而蝇毒磷则使膜翅目抗菌肽和蜂蛾抗菌肽基因的表达下调。综上，蜜蜂抗菌肽是蜜蜂体液免疫的关键部件，它们共同发挥协调作用，抵御各种病原微生物的入侵。
中国专利CN103524602A公开了通过给予外源性抗菌肽治疗中蜂囊状幼虫病，但是给予外源性抗菌肽仍面临抗菌肽药物可能存在的潜在安全风险、抗菌肽的大量生产受到限制、生产效率较低和生产成本较高等问题(林承德,彭鸿娟,王衍海.抗菌肽的应用及存在的问题.热带医学杂志.2007,1(7)：86-90.)。因此，开发高效的中蜂囊状幼虫病的防治方法对于蜜蜂养殖业具有重要的意义。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用。
本发明所述的腺苷为一种现有技术已知的化合物，是由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物，其磷酸酯为腺苷酸。腺苷是腺瞟呤核苷酸的代谢产物，在体内发挥着重要的生理生化效应，是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。腺苷的结构式如下：
Figure BDA0002437276650000031
本发明提供腺苷或其衍生物在制备用于治疗或预防蜜蜂病毒感染的药物中的应用。
本发明提供腺苷或其衍生物在制备用于治疗或预防蜜蜂病毒感染的饲料中的应用。
本发明提供腺苷或其衍生物在抑制蜜蜂病毒增殖中的应用。
本发明所述的腺苷或其衍生物在抑制蜜蜂病毒增殖中的应用，可为抑制表观健康的蜜蜂体内的病毒增殖，也可为抑制病毒病蜜蜂体内的病毒增殖。
本发明所述的病毒优选为中蜂囊状病毒。本发明通过实验证明给予腺苷能够显著提高感染中蜂囊状病毒的中华蜜蜂幼虫的存活率，一方面，腺苷可直接作用于病毒，降低病毒拷贝数，另一方面，腺苷还可诱导内源性抗菌肽的表达，增强机体先天性免疫防御力以抵御病毒，使染毒幼虫减少发病概率。
根据腺苷对于蜜蜂病毒感染的作用，含有腺苷结构、能够在体内代谢产生腺苷的物质(包括腺苷酸、腺苷酸盐等)或是其他腺苷衍生物应具有相同的作用。
本发明所述腺苷的衍生物包括腺苷酸、腺苷酸盐。
本发明通过实验证明，腺苷可诱导内源性抗菌肽基因的转录与翻译，提高内源性抗菌肽(如膜翅目抗菌肽、蜜蜂防卫素、蜜蜂抗菌肽和蜂蛾抗菌肽)的表达水平，进而提高机体的免疫力。
因此，本发明提供腺苷或其衍生物在制备用于提高蜜蜂免疫力的药物中的应用。本发明还提供腺苷或其衍生物在制备用于提高蜜蜂免疫力的饲料中的应用。
本发明所述提高蜜蜂免疫力具体通过提高蜜蜂的内源性抗菌肽的表达量实现。
本发明所述内源性抗菌肽可为选自膜翅目抗菌肽、蜜蜂防卫素、蜜蜂抗菌肽和蜂蛾抗菌肽中的任意一种或多种。
本发明所述药物或饲料的活性成分包括选自腺苷和其衍生物中的一种或多种。
本发明还提供一种用于治疗或预防蜜蜂病毒感染的产品，所述产品的活性成分包括选自腺苷和其衍生物中的一种或多种。所述产品为药物、饲料或饲料添加剂。
本发明所述药物的活性成分可仅包含腺苷或其衍生物；也可包含选自腺苷和其衍生物中的多种；还可包含除腺苷和其衍生物以外的其它活性成分(例如：其它能够提高蜜蜂免疫力或抗病毒能力的活性成分)。
本发明所述药物还可包含药学领域允许的辅料；所述药物的剂型可为药学领域允许的任意剂型。
本发明所述饲料可包含腺苷或其衍生物，也可包含选自腺苷和其衍生物中的多种；还可包含除腺苷和其衍生物以外的其它活性成分(例如：其它能够提高蜜蜂免疫力或抗病毒能力的活性成分)；除上述活性成分外，本发明所述饲料还可包含蜜蜂所需的营养物质，例如：花粉、蜂王浆、果糖、葡萄糖、蔗糖、大豆粉、酵母粉、脱脂奶粉、无机盐、维生素、水等。
本发明所述饲料可为固体饲料、半固体饲料或液体饲料。
本发明提供的腺苷的上述应用中，优选给予蜜蜂的腺苷的剂量为≥15ng/只/次。更优选为0.1～10μg/只/次。每次腺苷给予的时间间隔优选为22～24h。
具体地，对于3日龄蜜蜂，15ng～1.5μg/只/次；4日龄蜜蜂22.5ng～2.25μg/只/次；5日龄蜜蜂37.5ng～3.75μg/只/次；6日龄蜜蜂60ng～6μg/只/次。
本发明的有益效果在于：本发明首次发现腺苷能够显著提高感染CSBV中华蜜蜂幼虫的存活率，降低死亡率。一方面，腺苷能够抑制CSBV的增殖，降低病毒的拷贝数；另一方面，腺苷还能够诱导内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力。本发明的实验结果表明，腺苷干预后感染CSBV的中华蜜蜂幼虫的死亡率大幅下降，存活率显著提高(最高可提高1.32倍)，且存活幼虫可化蛹并羽化为成蜂；腺苷干预后感染CSBV的华蜜蜂幼虫体内的病毒拷贝数大幅下降(感染CSBV的病毒拷贝数最高可达121000，给予腺苷后无CSBV检出，且呈现量效关系，同时，腺苷干预可以改善表观健康幼虫病毒感染程度，有助于幼虫的正常生长发育；腺苷干预后感染CSBV的中华蜜蜂幼虫体内膜翅目抗菌肽、蜜蜂防卫素和蜜蜂抗菌肽的表达量均显著上调。
本发明提供的腺苷对于蜜蜂病毒感染的新功能为蜜蜂免疫防御机制的研究提供基础。腺苷可应用于制备防治中蜂囊状幼虫病或提高蜜蜂免疫力的药物或饲喂料，为防治中蜂囊状幼虫病提供了新方法，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明实验例1中腺苷干预后6日龄幼虫的存活率统计结果；其中，CK代表对照组，0.75代表制剂组的低浓度组，7.5代表制剂组的中浓度组，75代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+0.75代表干预组的低浓度组，CSBV+7.5代表干预组的中浓度组，CSBV+75代表干预组的高浓度组。
图2为本发明实验例1中腺苷干预后4～6日龄幼虫的死亡率统计结果；其中，CK代表对照组，0.75代表制剂组的低浓度组，7.5代表制剂组的中浓度组，75代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+0.75代表干预组的低浓度组，CSBV+7.5代表干预组的中浓度组，CSBV+75代表干预组的高浓度组。
图3为本发明实验例2中腺苷干预后4～6日龄幼虫的病毒拷贝数检测结果；其中，CK代表对照组，0.75代表制剂组的低浓度组，7.5代表制剂组的中浓度组，75代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+0.75代表干预组的低浓度组，CSBV+7.5代表干预组的中浓度组，CSBV+75代表干预组的高浓度组。
图4为本发明实验例3中健康幼虫和染毒后腺苷干预幼虫的化蛹及羽化情况；其中，A为腺苷干预组(7.5μg/ml)；B为对照(CK)组。
图5为本发明实验例4中染毒及腺苷干预后蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)的表达量；其中，CK代表对照组，低代表制剂组的低浓度组，中代表制剂组的中浓度组，高代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+低代表干预组的低浓度组，CSBV+中代表干预组的中浓度组，CSBV+高代表干预组的高浓度组。
图6为本发明实验例4中染毒及腺苷干预后膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)的表达量；其中，CK代表对照组，低代表制剂组的低浓度组，中代表制剂组的中浓度组，高代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+低代表干预组的低浓度组，CSBV+中代表干预组的中浓度组，CSBV+高代表干预组的高浓度组。
图7为本发明实验例4中染毒及腺苷干预后蜂蛾抗菌肽(Abaecin)的表达量；其中，CK代表对照组，低代表制剂组的低浓度组，中代表制剂组的中浓度组，高代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+低代表干预组的低浓度组，CSBV+中代表干预组的中浓度组，CSBV+高代表干预组的高浓度组。
图8为本发明实验例4中染毒及腺苷干预后蜜蜂防卫素(Defensin)的表达量；其中，CK代表对照组，低代表制剂组的低浓度组，中代表制剂组的中浓度组，高代表制剂组的高浓度组，CSBV代表感染组，CSBV+低代表干预组的低浓度组，CSBV+中代表干预组的中浓度组，CSBV+高代表干预组的高浓度组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的数据统计分析均利用SPSS 22.0(美国芝加哥SPSS公司)完成。腺苷对中华蜜蜂幼虫的作用效果采用“Mean±SE”表示。采用方差分析和LSD多重方差分析方法，比较中华蜜蜂幼虫体内感染CSBV的病毒拷贝数变化。
实施例1利用腺苷干预健康中华蜜蜂幼虫和染毒幼虫
1、供试样本
中华蜜蜂来源于中国农业科学院蜜蜂研究所实验蜂群。为了获得2日龄幼虫，蜂王被关在子脾上产卵96h后，从蜂群中取出含有2日龄幼虫的子脾放入24孔板中，放置在温度为32±1℃，相对湿度为75±5％RH的恒温恒湿培养箱中进行预培养。
采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测试验幼虫有无CSBV及其它病毒(包括黑蜂王台病毒BQCV、残次病毒DWV、以色列麻痹病毒IAPV、克什米尔病毒KBV、急性麻痹病毒ABPV、慢性麻痹病毒CBPV)感染，以无病毒感染的健康幼虫作为本实施例的样本。
上述各种病毒的检测引物参照文献提供的引物序列，具体如下：CSBV检测引物参照Grabensteiner,E.,W.Ritter,M.J.Carter,S.Davison,H.Pechhacker,J.Kolodziejek,O.Boecking,I.Derakshifar,R.Moosbeckhofer,E.Licek,and N.Nowotny.Sacbrood virusof the honeybee(Apis mellifera):rapid identification and phylogeneticanalysis using reverse transcription-PCR.Clin.Diagn.Lab.Immunol.2001,8:93-104.；BQCV检测引物参照M,Benjeddou,N,Leat,M,Allsopp,S,Davison.Detection ofacute bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees byreverse transcriptase pcr.Applied and environmental microbiology.2001,67(5):2384-2387.；DWV检测引物参照Tentcheva,D.,L.Gauthier,S.Jouve,L.Canabady-Rochelle,B.Dainat,F.Cousserans,M.E.Colin,B.V.Ball,andM.Bergoin.Polymerasechain reaction detection of deformed wing virus(DWV)inApis mellifera and Varroa destructor.Apidologie.2004,35:431-439.；IAPV检测引物参照Eyal,Maori,Shai,Lavi,Rita,Mozes-Koch,Yulia,Gantman,Yuv al,Peretz,Orit,Edelbaum,Edna,Tanne,Ilan,Sela.Isolation and characterization of Israeli acuteparalysis virus,a dicistrovirus affecting honeybees in Israel:evidence fordiversity due to intra-and inter-species recombination.The Journal of generalvirology,2007,88(Pt 12):3428-38.；KBV检测引物参照Stoltz,D.,X.R.Shen,C.Boggis,and G.Sisson.Molecular diagnosis of Kashmir bee virusinfection.J.Apic.Res.1995,34:153-165.；ABPV检测引物参照Bakonyi,T.,R.Farkas,A.Szendroi,M.Dobos-Kovacs,and M.Rusvai.Detection of acute bee paralysis virusby RT-PCR in honey bee and Varroa destructor field samples:screening ofrepresentative Hungarian apiaries.Apidologie.2002,33:63-74.；CBPV检测引物参照Ribie`re,M.,C.Triboulot,L.Mathieu,C.Aurie`res,J.P.Faucon,and M.Pe′pin.Molecular diagnostic of chronic bee paralysis virus infection.Apidologie,2002,33:339-351。
检测方法具体如下：采用RNeasy迷你试剂盒(艾德莱)提取RNA，RNA提取按照产品说明书进行(该方法包括去除DNA的步骤，从而确保最终提取物只存在RNA)。总RNA在30μL洗脱缓冲液中洗脱，直接用于RT-PCR。利用Quantitec逆转录试剂盒(Takara)立即使用提取的RNA生成第一链cDNA(按照产品说明书进行)，将cDNA在-20℃下储存。PCR扩增反应为50μL体系；PCR反应条件包括94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸15秒，35个循环；72℃，延伸5分钟。检测结果显示，未检测到CSBV及其它病毒。
2、糖浆的制备
糖浆的制备与饲喂，参照2016年饲喂意大利蜜蜂的标准并在此基础上进行调整(Karl Crailsheim,Robert Brodschneider,Pierrick Aupinel,Dieter Behrens,ElkeGenersch,Jutta Vollmann&Ulrike Riessberger-Gallé.Standard methods forartificial rearing of Apis mellifera larvae.Journal of Apicultural Research,2013,52(1):1-15.)。不同日龄幼虫饲喂的糖浆配方、比例及饲喂剂量如表1所示。
表1糖浆配方、比例及饲喂剂量
Figure BDA0002437276650000101
3、病毒液的制备
从中国农业科学院蜜蜂研究所另一中华蜜蜂饲养场内选取具有典型的囊状幼虫病形态的中蜂囊状病虫，通过RT-PCR证实了中华蜜蜂体内CSBV的存在。为了获得CSBV，取感染CSBV的幼虫210只，将其放置无菌磨碎器中，并添加2100μL无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)，进行研磨。研磨后在4℃，8000rpm，离心30min，重复2遍，收集上清液，以其提取RNA后反转录的cDNA为模板，进行RT-PCR检测，未检测到其他病毒，将此上清液命名为原始毒液，-80℃储存备用。
使用绝对定量PCR方法检测病毒(K.M.Hong,H.Najjar,M.Hawley,R.D.Press.Quantitative real-time PCR with automated sample preparation fordiagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection in bone marrowtransplant patients.Clinical Chemistry.2004,50(5):846-856；HU Zhi Gang,CHEN KePing,YAO Qin,GAO Gui Tian,XU Jia-Ping,CHEN Hui-Qing.Cloning andCharacterization of Bombyx mori PP-BP,a Gene Induced by Viral Infection.ActaEntomol.Sin.2005,48:871-875)。
PCR反应在BIOER LineGene9600实时PCR系统中进行，上下游引物分别为：5′-ccttggagtttgctatttacg-3′和5′-cctacatccttgggtcag-3′。实时荧光定量PCR反应体系为15μL，包括正、反向引物各0.3μL、SYBR反应液7.5μL、模板1μL，补水至15μL。qPCR反应条件采用两步法：第一步包括恒温段(95℃变性3min)和循环段(95℃变性5s；60℃退火30s，40个循环)；第二步为熔解段(95℃变性15s；60℃退火5s；95℃变性15s。)。qPCR检测该原始毒液的浓度为6.74×104copies/μL，将该原始毒液用于后续的接种实验。
含毒糖浆的制备：根据预实验病毒感染的IC50检测结果，选取饲喂毒液的配比为原始毒液：糖浆(糖浆组成参照表1)＝1：3，制成5μL病毒原液和15μL糖浆的混合物，即CSBV为1.685×104copies/μL的含毒糖浆。将含毒糖浆饲喂于3日龄的试验幼虫中。
4、腺苷制剂的配制
购买腺苷标准品(源叶)，用高纯水配制成1mg/mL的母液，过滤除菌后备用。试验时按需要采用表1中各日龄的糖浆进行倍比稀释，得到腺苷制剂，分别设置低浓度组(0.75μg/mL)、中浓度组(7.5μg/mL)和高浓度组(75μg/mL)。
含毒制剂的制备：将原始毒液与腺苷制剂(糖浆组成参照表1)按1：3进行配制(例如：配制20μL含毒制剂即为将5μL病毒原液与15μL腺苷制剂混合)，即CSBV为1.685×104copies/μL的含毒制剂。将含毒制剂饲喂于3日龄的试验幼虫中。
5、腺苷干预试验
从培养箱中取出预培养1d后的幼虫(3日龄)，将健康状况良好的幼虫分别放入48孔板中，随机分为对照组，感染组，制剂组和干预组，每组24只样本，重复三次。分组及饲喂情况如表2所示，表2中糖浆的组成如表1所示(对照各日龄)。
表2腺苷干预试验分组
Figure BDA0002437276650000121
蜜蜂幼虫感染CSBV的最佳时间是2～3日龄幼虫，因此，在幼虫3日龄时，进行CSBV感染和腺苷干预处理，以分析腺苷对蜜蜂CSBV感染的预防和治疗作用。感染组饲喂含毒糖浆(制备方法如上述3中所述)，干预组饲喂含毒制剂(含毒制剂的制备方法如上述4中所述)；在幼虫4～6日龄，按组别分别饲喂糖浆或腺苷制剂，仅以糖浆喂养的幼虫作为CK对照(饲喂量参照表1)。将上述饲喂的食物放在培养板底部一侧，避免接触幼虫。每24h饲喂一次，观察并记录幼虫的摄食情况和死亡率。
使用75％乙醇(用DEPC处理过的水配制)消毒5min并用DEPC处理过的水冲洗三次的镊子，每天取出不同处理的存活幼虫各5只，立即用液氮冷冻处理，然后将其保存在-80℃冰箱中，用于后续病毒拷贝数检测。
实验例1 腺苷干预健康幼虫和染毒幼虫后的存活率和死亡率分析
1、存活率
对实施例1中的各组蜜蜂幼虫进行存活率统计，结果如图1所示，结果显示，常规饲喂的CK组和制剂组的幼虫存活率都能达到86％以上，说明腺苷干预不会造成健康幼虫的异常死亡，不影响健康幼虫的生长发育。
感染组的幼虫大量死亡，存活率只有43％，干预组的幼虫存活率大幅提高到76％以上，其中低浓度组(0.75μg/mL)干预染毒幼虫6日龄全部存活，结果表明，采用腺苷干预能够使约50％的染毒幼虫免于病死，使染毒蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。
2、死亡率
对实施例1中的各组蜜蜂幼虫进行死亡率统计，幼虫死亡率的测定方法如下：预培养(2日龄)及接毒当日(3日龄)的幼虫死亡数不计入分析，以排除实验过程中幼虫机械致死的影响，从接毒次日(4日龄)开始每天定时对幼虫的死亡数进行统计，并移除死亡幼虫，重复上述步骤至6日龄结束。
每日幼虫死亡率＝每天幼虫的死亡数量/每天幼虫存活的数量×100％；
全过程幼虫死亡率＝幼虫死亡数量/样本总数×100％。
各组死亡率的统计结果如图2所示，结果显示，常规饲喂的CK组4～6日龄幼虫每天的死亡率低于3％，各浓度腺苷干预后4～6日龄幼虫每天死亡率未见大幅升高，说明腺苷干预不影响健康幼虫的生长发育，可以用于幼虫的辅助饲喂。
而CSBV是一个典型的诱导源，3日龄幼虫染毒后次日幼虫(4日龄)死亡率大幅上升，高达25％，5日龄和6日龄死亡率有所下降，但日死亡率均超过20％，到6日龄时实验幼虫仅有43％存活(图1)。梁勤等(梁勤,陈大福.蜜蜂保护学[M].中国农业出版社,2009.2-3.)研究发现CSBV最易感染2-3日龄的幼虫，感染后的幼虫不能化蛹，且在幼虫期后期大量死亡，这与本发明的实验结果一致。
与感染组相比，腺苷干预组各日龄幼虫死亡率大幅下降，4日龄幼虫死亡率15％左右，随后逐日下降，到6日龄时各浓度组幼虫存活率均达到86％以上，其中，低浓度组(0.75μg/mL)干预染毒幼虫6日龄全部存活(图1)，结果表明，采用腺苷干预能够大幅减少染毒幼虫的病死率，使染毒蜂群免于崩溃，对蜂群的恢复和繁衍起到了重要作用。
实验例2 腺苷干预健康幼虫和染毒幼虫后的病毒拷贝数检测
对实施例1中表观健康的4～6日龄中蜂幼虫(CK组)进行CSBV检测，发现每个日龄幼虫的病毒拷贝数在66～70，说明表观健康幼虫也有病毒感染，只是没有表现出明显症状，表明CSBV在蜂群中普遍存在隐形感染的现象，在一定浓度内幼虫可以带毒生存，这与刘珊(Shan,L.,Liuhao,W.,Jun,G.,Yujie,T.,Yanping,C.,Jie,W.,Jilian,L.,ChineseSacbrood Virus Infection in Asian Honey Bees(Apis cerana cerana)and HostImmune Responses to the Virus Infection,Journal of InvertebratePathology.2017,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2017.09.006)的研究结果相吻合。腺苷干预后表观健康的4～6日龄中蜂幼虫体内(制剂组)的病毒拷贝数下降到6以下，说明腺苷干预可以改善表观健康幼虫病毒感染程度，有助于幼虫的正常生长发育。
感染组的幼虫体内病毒拷贝数呈爆发式增长，4日龄幼虫体内病毒拷贝数高达12.1×104，是CK组的1700多倍，如此大量的病毒增殖导致染毒幼虫病死，死亡率高达25％，随着生长发育，5日龄和6日龄体内病毒拷贝数有所下降，但仍维持在2.4×104以上，表现为单日幼虫死亡率仍在20％以上(图3)。各浓度腺苷干预组4～6日龄幼虫体内单日病毒拷贝数下降到10以下，可视为无CSBV检出，说明饲喂腺苷后染毒幼虫体内产生了强烈的拮抗病毒反应，明显降低了病毒对幼虫的感染程度，从而降低了染毒幼虫的病死率。
实验例3 腺苷干预健康幼虫和染毒幼虫后的形态分析
在实施例1实验的第18天(从卵期算起的第22天)，利用体式显微镜观察实施例1中各组幼虫的状态，并进行拍照记录。
形态学观察结果如图4所示，感染组的幼虫即便没有死亡也无法化蛹，但CK组和低浓度组(0.75μg/mL)干预组的幼虫生命活动很活跃，均可化蛹并已羽化为成蜂。CSBV感染的特点是感染1～3日龄幼虫，造成蜂群内幼虫大量死亡并且无法化蛹，健康幼虫化蛹并羽化为成蜂是蜂蜜正常发育过程，而感染CSBV幼虫可以化蛹并羽化为成蜂说明脯氨酸干预起到了拮抗病毒的作用，使染毒幼虫可以正常发育。
实验例4 CSBV感染及腺苷干预对幼虫免疫相关基因表达量的影响
为分析CSBV感染以及腺苷干预对于蜜蜂幼虫免疫系统的影响，采用实时荧光定量PCR对实施例1中各组蜜蜂幼虫中抗菌肽基因的表达水平进行检测，以β-actin作为内参基因(Shan,L.,Liuhao,W.,Jun,G.,Yujie,T.,Yanping,C.,Jie,W.,Jilian,L.,ChineseSacbrood Virus Infection in Asian Honey Bees(Apis cerana cerana)and HostImmune Responses to the Virus Infection,Journal of InvertebratePathology.2017,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2017.09.006)。检测结果具体如下：
1、蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)基因的表达检测
蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)是蜜蜂主要的抗菌肽，其检测结果如图5所示，对照(CK)组幼虫蜜蜂抗菌肽的相对表达量仅为1.24～1.55，在感染CSBV 24小时后，蜜蜂抗菌肽的相对表达量在幼虫体内有所升高，4-6日龄幼虫的蜜蜂抗菌肽的相对表达量维持在20左右。
对健康幼虫给予腺苷干预(制剂组)会引起蜜蜂抗菌肽表达量大幅上调，以6日龄为最高，其中低浓度组(0.75μg/ml)的相对表达量最高上调到1000左右；对染毒幼虫给予腺苷干预(干预组)也会大幅上调蜜蜂抗菌肽的表达量，以6日龄为最高，相对表达量达到650左右，为感染组表达量的32倍。
结果表明，通过腺苷干预强烈诱导了染毒幼虫蜜蜂抗菌肽表达的能力，增强了幼虫先天性免疫防御力以抵御CSBV侵害，减少病死率。说明腺苷具有强烈诱导健康幼虫和CSBV染毒幼虫蜜蜂抗菌肽表达的能力。
2、膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)
膜翅目抗菌肽是蜜蜂抗菌肽中最重要的补充肽，其检测结果如图6所示，对照(CK)组幼虫的膜翅目抗菌肽的相对表达量仅为1.31～1.56，在感染CSBV 24小时后，幼虫体内膜翅目抗菌肽的表达量升高，4～6日龄幼虫的相对表达量无明显变化，维持在20左右。
对健康幼虫给予腺苷干预(制剂组)会引起膜翅目抗菌肽表达量显著上调，相对表达量最高上调到97.24；对染毒幼虫给予腺苷干预(干预组)则大幅上调膜翅目抗菌肽的表达量，单日最高相对表达量可高达342.14，为感染组表达量的17倍。
结果表明，通过腺苷干预强烈诱导了膜翅目抗菌肽表达的能力，增强了幼虫先天性免疫防御力以抵御CSBV侵害，减少病死率。说明腺苷具有强烈诱导健康幼虫及CSBV染毒幼虫膜翅目抗菌肽表达的能力。
3、蜂蛾抗菌肽(Abaecin)
蜂蛾抗菌肽作为蜜蜂抗菌肽的后备肽，只有当蜜蜂抗菌肽和膜翅目抗菌肽的杀菌能力丧失时才会发挥作用。蜂蛾抗菌肽的检测结果如图7所示，对照(CK)组幼虫蜂蛾抗菌肽的相对表达量仅为1.52～3.68，在感染CSBV 24小时后，蜂蛾抗菌肽的表达量在幼虫体内显著的升高，提高到73.25，但5-6日龄表达量回落至25.4-26.97。
对健康幼虫给予腺苷干预(制剂组)会引起蜂蛾抗菌肽表达量上调到35左右，低浓度组(0.75μg/ml)单日蜂蛾抗菌肽表达量提高到100左右；对染毒幼虫给予腺苷干预(干预组)可大幅上调6日龄幼虫蜂蛾抗菌肽的表达量，最高可达50.81，较感染组上调88.4％，充分发挥了蜂蛾抗菌肽作为蜜蜂抗菌肽的后备肽的作用。
结果表明，通过腺苷干预强烈诱导了蜂蛾抗菌肽表达的能力，增强了幼虫先天性免疫防御力以抵御CSBV侵害，减少病死率。说明腺苷具有强烈诱导健康幼虫及CSBV染毒幼虫蜂蛾抗菌肽表达的能力。
4、蜜蜂防卫素(Defensin)
蜜蜂防卫素的检测结果如图8所示，对照(CK)组幼虫蜜蜂防卫素的相对表达量仅为1.32～1.62，在感染CSBV 24小时后，幼虫体内蜜蜂防卫素的表达量有所升高，达到46.26，5日龄表达量最高为52.59，6日龄回落至22.28。
对健康幼虫给予腺苷干预(制剂组)会引起蜜蜂防卫素表达量大幅上调，以5日龄表达量最高，低浓度组(0.75μg/ml)上调到160以上；对染毒幼虫给予腺苷干预(干预组)则大幅上调蜜蜂防卫素的表达量，以5日龄表达量最高，最高相对表达量可达到210以上，是感染组表达量的4倍。
蜜蜂防卫素是蜜蜂血淋巴内唯一抑制革兰氏阳性菌的抗菌肽，但表达量最少。本发明通过腺苷干预这种外源途径强烈诱导了内源性蜜蜂防卫素表达的能力，增强了幼虫先天性免疫防御力以抵御CSBV侵害，减少病死率。说明腺苷具有强烈诱导健康幼虫和染毒幼虫内源性蜜蜂防卫素表达的能力。
本发明通过分析感染CSBV的中华蜜蜂4～6日龄幼虫体内免疫相关基因表达的动态变化可知，染毒幼虫体内的抗菌肽基因表达量整体高于健康幼虫，说明感染CSBV能够促进蜜蜂幼虫体内免疫相关基因的表达，此结果与刘珊(Shan,L.,Liuhao,W.,Jun,G.,Yujie,T.,Yanping,C.,Jie,W.,Jilian,L.,Chinese Sacbrood Virus Infection in AsianHoney Bees(Apis cerana cerana)and Host Immune Responses to the VirusInfection,Journal of Invertebrate Pathology.2017,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2017.09.006)的研究结果吻合。
本发明以感染CSBV的中华蜜蜂和健康的中华蜜蜂为研究对象，利用荧光定量PCR的方法，不但对4种抗菌肽基因在感病和健康蜂幼虫发育阶段的表达情况进行定量检测和比较，明确了感染CSBV后中蜂免疫应答的情况；而且定量检测和比较了对感病和健康蜂幼虫给予腺苷后4种抗菌肽基因的表达情况：
无论是健康幼虫还是染毒幼虫，给予腺苷干预可整体上调4～6日龄幼虫膜翅目抗菌肽Hymenoptaecin的表达；大幅度上调5日龄幼虫蜜蜂防卫素Defensin的表达量；大幅上调6日龄幼虫蜜蜂抗菌肽Apidaecin和蜂蛾抗菌肽Abaecin的表达量。总而言之，采用腺苷干预强烈诱导了染毒幼虫内源性抗菌肽——膜翅目抗菌肽(Hymenoptaecin)、蜜蜂防卫素(Defensin)、蜜蜂抗菌肽Apidaecin和蜜蜂抗菌肽(Apidaecin)表达的能力。这四种抗菌肽单日或多日的高表达成功抵御了CSBV对幼虫的侵害，减少了幼虫的病死率，促进幼虫化蛹并羽化为成蜂，是增强中蜂幼虫免疫力，抵抗CSBV感染的有效方法；同时腺苷干预也可以上调健康中蜂幼虫抗菌肽的表达水平，形成一种快速有效的防御机制，用来迅速杀死或清除外源的病原微生物，保护幼虫的生长发育。
综上所述，腺苷能够抑制CSBV的增殖，降低蜜蜂幼虫体内CSBV的拷贝数；还能够诱导蜜蜂幼虫内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力，抵抗CSBV对幼虫的侵害并防止CSBV以及其他病原微生物的进一步感染，因此可用于预防和治疗蜜蜂中蜂囊状幼虫病。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 腺苷在蜜蜂病毒感染防治中的应用
<130> KHP201110404.3
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttggagtt tgctatttac g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctacatcct tgggtcag 18

Claims (7)

1.腺苷在制备用于治疗或预防蜜蜂感染中蜂囊状病毒的药物中的应用。
2.腺苷在制备用于治疗或预防蜜蜂感染中蜂囊状病毒的饲料中的应用。
3.腺苷在制备用于抑制蜜蜂感染中蜂囊状病毒增殖的药物或饲料中的应用。
4.腺苷在制备用于提高蜜蜂感染中蜂囊状病毒后内源性抗菌肽的表达量的药物中的应用，所述内源性抗菌肽为选自膜翅目抗菌肽、蜜蜂防卫素、蜜蜂抗菌肽和蜂蛾抗菌肽中的任意一种或多种。
5.腺苷在制备用于提高蜜蜂感染中蜂囊状病毒后内源性抗菌肽的表达量的饲料中的应用，所述内源性抗菌肽为选自膜翅目抗菌肽、蜜蜂防卫素、蜜蜂抗菌肽和蜂蛾抗菌肽中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1、3或4所述的应用，其特征在于，所述药物的活性成分包括腺苷。
7.根据权利要求2、3或5所述的应用，其特征在于，所述饲料的活性成分包括腺苷。
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