CN111295395A

CN111295395A - 抗体和使用方法

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Publication number: CN111295395A
Application number: CN201880070829.5A
Authority: CN
Inventors: A·比什特; R·杜塞克; H·黄; C·汉娜; J·阿克罗伊德; L·德班
Original assignee: Oxford Biotherapeutics Ltd
Current assignee: Oxford Biotherapeutics Ltd
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: JP2021501583A; CN111295395B; MX2020004431A; IL274376B2; US20240228649A9; AU2018361819B2; IL274376A; KR20200074127A; IL274376B1; WO2019086878A1; AU2018361819A1; US20200262927A1; JP7430137B2; ZA202002144B; US20240132614A1; CA3079313A1; BR112020008438A2; EP3704154A1; US11673963B2

Abstract

本文公开了针对CRTAM的抗体、对这种抗体进行编码的核酸、包括对所述抗体进行编码的这种核酸的宿主细胞、用于制备抗CRTAM抗体的方法以及用于治疗疾病的方法，所述疾病例如人类癌症，包含但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

Description

抗体和使用方法

技术领域

本发明涉及能够与CRTAM蛋白结合的抗体和其用途。

背景技术

引言

本发明的方面包含针对CRTAM的抗体和其它治疗性蛋白质、对这种抗体和治疗性蛋白质进行编码的核酸、用于制备抗体和其它治疗性蛋白质的方法，以及用于通过使用针对CRTAM的抗体和其它治疗性蛋白质来治疗如癌症等疾病的方法。

背景技术

靶抗原，CRTAM，是一种具有V和C1样Ig结构域的粘连蛋白家族(nectin family)的单通I型膜蛋白(Yeh等人,《细胞(Cell)》,2008年3月7日；132(5):846-5)。这种基因首次在小鼠和人活化的NKT细胞中得到鉴定(Kennedy等人,《白细胞生物学期刊(J LeukocBiol.)》),2000年5月；67(5):725-34)，随后的研究表明所述基因的表达受到活化的严密调节，并且被限制在活化的MHC-I类限制性细胞中，包含NKT和CD8 T细胞(

-Lopez等人,《神经免疫学期刊(J Neuroimmunol.)》,2006年2月；171(1-2):145-55)。

CRTAM的唯一已知配体是Necl2(Galibert等人,《生物化学期刊(J Biol Chem.)》,2005年6月10日；280(23):21955-64)，并且配体与受体之间的相互作用被认为优于任一分子的同源性相互作用(Zhang等人,《结构(Structure)》,2013年8月6日；21(8):1430-9)。假设CRTAM-Necl2的相互作用有助于建立成熟的免疫突触，并且有助于增强非专职性APC对T细胞的刺激。这个功能在NK细胞中也已被发现，其中针对CRTAM的抗体刺激了NK细胞的细胞毒性(Boles等人,《血液(Blood)》,2005年8月1日；106(3):779-86)。

WO2009/029883公开了CRTAM在特定的一组T细胞上上调，并且选择性地调节某些细胞因子，包含IFNγ、IL22和IL17。

WO2016/154341公开了激动性抗CRTAM抗体可用于通过增加如NK细胞等免疫效应细胞的ADCC能力来治疗癌症。

发明内容

本发明的方面包含针对CRTAM的特异性抗体、对本发明所述抗体进行编码的核酸、包括对本发明的抗体进行编码的这种核酸的宿主细胞、用于制备抗CRTAM抗体的方法以及用于治疗疾病的方法，例如人类癌症，包含但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌和胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

提供了一种与CRTAM结合的本文描述的抗体(SEQ ID NO:11)。优选地，所述抗体与CRTAM的细胞外结构域结合(SEQ ID NO:12)。本发明的方面包含抗体或其抗原结合片段，其与本文所描述的抗体识别的CRTAM蛋白上的表位结合，或与本文所描述的抗体交叉竞争结合，并且优选保留本文所描述的抗体对人CRTAM的结合亲和力的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在一些实施例中，抗体是一种分离抗体。

本发明的方面包含一种与CRTAM结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括：CDR-H1序列，所述CDR-H1序列包括SEQ ID NO:5的序列；CDR-H2序列，所述CDR-H2序列包括SEQ ID NO:6；以及CDR-H3序列，所述CDR-H3序列包括SEQID NO:7的序列。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段进一步包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由以下组成的组的至少一个CDR序列：CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:15的序列中的任一个；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9的序列；以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16的序列中的任一个。

在一些实施例中，与CRTAM结合的所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括如表1中所示出的重链和轻链CDR的4种组合之一。

表1

在一些优选的实施例中，与CRTAM结合的所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括：CDR-H1，所述CDR-H1包括SEQ ID NO:5；CDR-H2，所述CDR-H2包括SEQ ID NO:6；以及CDR-H3，所述CDR-H3包括SEQ ID NO:7；所述轻链可变区包括CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:8；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9；以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:10。

在另一个优选的实施例中，与CRTAM结合的所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括：CDR-H1，所述CDR-H1包括SEQ ID NO:5；CDR-H2，所述CDR-H2包括SEQ ID NO:6；以及CDR-H3，所述CDR-H3包括SEQ ID NO:7；所述轻链可变区包括CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:15；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9；以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16。

在进一步的方面，与本文所描述的亲本抗体相比，本发明的抗体或其抗原结合片段包括可变的CDR。因此，本发明提供了变体抗体或抗原结合片段，其包括亲本抗体的变体可变区，其中所述亲本抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括：CDR-H1序列，所述CDR-H1序列包括SEQ ID NO:5的序列；CDR-H2序列，所述CDR-H2序列包括SEQ ID NO:6的序列；以及CDR-H3序列，所述CDR-H3序列包括SEQ ID NO:7的序列；所述轻链可变区包括CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:15的序列；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9的序列；以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16的序列，并且其中在一个实施例中，所述变体抗体或其抗原结合片段在一组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的任何一个或多个中具有1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸取代、添加和/或缺失；或共同地在所述组CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个氨基酸取代、添加和/或缺失；其中1到5个或1到4个或1到3个特定用途的取代、添加或缺失，并且其中所述抗体或其抗原结合片段保留与CRTAM的特异性结合。优选地，所述变体是取代，优选地，所述取代是保守取代或使可变区中的氨基酸回复到人种系中的对应氨基酸的取代。在进一步的实施例中，本发明的变体抗体或其抗原结合片段包括：CDR-H1序列，所述CDR-H1序列包括SEQ ID NO:5的序列；CDR-H2序列，所述CDR-H2序列包括SEQ ID NO:6的序列；以及CDR-H3序列，所述CDR-H3序列包括SEQ ID NO:7的序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:15的序列；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9的序列；以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16的序列，其中所述CDR序列中的一个或多个被改变，使得所述序列与上文所叙述的对应CDR亲本序列具有约70、75、80、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％相同。

在一些实施例中，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13中描述的可变重链区，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％相同的序列和/或在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14中描述的可变轻链区，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14约80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％相同的序列。在进一步的实施例中，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或可变轻链区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13相比的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个氨基酸取代、添加和缺失，所述可变轻链区包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14相比的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个氨基酸取代、添加和缺失。优选地，取代，更优选地，保守取代。

还将显而易见的是，氨基酸取代、添加和/或缺失可以在框架区内和/或在CDR内。

在一个实施例中，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2的序列。

在一个实施例中，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:13的序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14的序列。

在一个实施例中，提供了一种全长抗体，其包括重链序列和轻链序列，所述重链序列包括SEQ ID NO:17，所述轻链序列包括SEQ ID NO:18。

在本发明的进一步的方面中，提供了一种特异性地与CRTAM结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13的3个重链CDR和SEQ ID NO:2或SEQID NO:14的3个轻链CDR，其中所述CDR由Kabat编号系统或Chothia编号系统定义。优选地，所述特异性地与CRTAM结合的抗体或其抗原结合片段包含由Kabat编号系统或Chothia编号系统定义的SEQ ID NO:13的3个重链CDR和SEQ ID NO:14的3个轻链。

SEQ ID NO:13-18是基于SEQ ID NO:1和2的序列的人源化抗体序列。技术人员将容易地理解的是，SEQ ID No:17-18是全长重链和轻链序列，其包含除了可变区之外的产生全长功能性抗体所需的区，即恒定区和Fc区。技术人员将理解的是，通过用来自人种系序列的氨基酸替换来自其中产生抗体的生物体的可变区的氨基酸来人源化序列，以试图在向人类受试者施用抗体时使所述抗体的免疫原性效应最小化。大多数氨基酸取代发生在框架区中，然而来自CDR的许多氨基酸(发生在非关键位置)可以被取代；此类取代优选地在性质上是保守的，或将特定位置处的氨基酸回复到对应的人种系中存在的氨基酸。在当前情况下，已经使用结构模型鉴定来自已经被取代的CDR的氨基酸，以区分CDR区中的面向互补位和非互补位残基。这使得抗体的人源化程度高于单纯的CDR移植。

在本发明中，当与SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:8)的CDR1相比时，SEQ ID NO:14在CDR1(SEQ ID NO:15)中包括3个氨基酸取代。具体地，在SEQ ID NO:8的位置1处存在V-S取代；在SEQ ID NO:8的位置4处存在E-V取代；以及在SEQ ID NO:8的位置10处存在V-A取代。当与SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:10)的CDR3相比时，SEQ ID NO:14在CDR3(SEQ ID NO:16)中进一步包括1个氨基酸取代。具体地，在SEQ ID NO:10的位置5处存在S-A取代。

技术人员将理解的是，当与亲本抗体相比时，这些人源化序列不代表不同的、可替代的抗体，而是涉及具有相同特征的相同抗体，所述相同抗体仅仅使用结构建模被改变以更接近地对应于人种系，以便使免疫原性最小化。

在一些实施例中，抗体或抗原结合片段具有5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或更小的结合亲和力(K_D)，在一个优选的实施例中，所述结合亲和力是0.75nM、0.5nM或更小。

在一些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段是与其配体necl2竞争结合到CRTAM的抗体或抗原结合片段。

在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是嵌合的、人源化的或人抗体。在一些实施例中，重链可变区包括框架序列。在一些实施例中，所述框架序列的至少一部分包括人共有框架序列。在一些实施例中，轻链可变区包括框架序列。在一些实施例中，所述框架序列的至少一部分包括人共有框架序列。

在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是被工程化以具有增加的与FcgRIIa结合的Fc变体。在一个优选的实施例中，所述Fc变体包括S267E和/或L328F氨基酸取代。在一个实施例中，所述Fc是IgG1 Fc区。在进一步的实施例中，所述Fc是IgG4 Fc区。在优选的实施例中，当所述Fc区是IgG4 Fc区时，所述Fc区将进一步包括S228P取代。在一个实施例中，所述重链包括包含SEQ ID NO:17的序列。

在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是Fc沉默的工程化IgG1抗体或抗原结合片段，所述Fc沉默的工程化IgG1抗体或抗原结合片段与一种或多种Fc受体结合降低或不与所述一种或多种Fc受体结合。在另一实施例中，所述抗体是IgG4抗体。

在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是一种介导T细胞细胞毒性和/或NK细胞细胞毒性的双特异性抗体或抗原结合片段。

在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段能够诱导和/或增强免疫细胞的活化。在一个实施例中，所述免疫细胞优选地是T细胞。在另一实施例中，所述免疫细胞优选地是NK细胞。技术人员将理解的是，术语诱导和/或增强可以指诱导和/或增强免疫细胞的细胞因子释放和/或诱导和/或增强所述免疫细胞的增殖和/或诱导和/或增强细胞杀伤活性。对于技术人员来说将显而易见的是，在本上下文中所使用的术语诱导或诱导(induce/inducing)意指引起免疫细胞的活化或将免疫细胞的活化增加到高于在不存在抗体或抗原结合片段的情况下所见的活化水平。在本上下文中所使用的术语增强是指增加已经活化的免疫细胞的活化水平。

在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是一种双特异性或多特异性抗体或抗原结合片段，其与CRTAM蛋白结合并且与一个或多个另外的结合靶结合，优选地所述另外的结合靶是一种或多种肿瘤抗原。在进一步的实施例中，所述一个或多个另外的结合靶是免疫调节分子。

在一些实施例中，抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、Fv、scFv、dAb和单结构域抗体。

在本发明的另一方面中，提供了对本发明的抗体的重链和/或本发明的抗体的轻链进行编码的一个或多个核酸。应当理解，本发明的抗体的重链和轻链可以一起编码在单个核酸分子上或由两个分开的核酸分子编码。

在另一方面，提供了包括本发明的一个或多个核酸的载体。

在本发明的另一方面，提供了含有对本发明的抗体的重链和/或轻链或两者进行编码的一个或多个核酸的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞在其中所述一个或多个核酸被表达的条件下生长。在其它实施例中，提供了一种回收本发明的抗体的方法。

本发明的方面包含制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在其中抗体或抗原结合片段在宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，以及任选地分离抗体或抗原结合片段。

本发明的方面包含药物组合物，其包括本文所描述的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。

在一些实施例中，药物组合物或药物进一步包括有效量的第二治疗剂。

在本发明的进一步的方面中，提供了一种治疗病症的方法，所述方法包括向对其有需要的患者施用本发明的与CRTAM(SEQ ID NO:11)结合的抗体或抗原结合片段。在一个实施例中，所述病症是癌症。

在进一步的方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。

在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括：CDR-H1，所述CDR-H1包括SEQ ID NO:5；CDR-H2，所述CDR-H2包括SEQ IDNO:6，以及CDR-H3，所述CDR-H3包括SEQ ID NO:7，所述轻链可变区包括CDR-1，所述CDR-1包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:15；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9，以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16。优选地，所述轻链可变区包括CDR-1，所述CDR-1包括SEQ ID NO:15；CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9，以及CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16。

在一些实施例中，提供了一种治疗癌症的方法，其中向对其有需要的患者施用本发明的抗体或抗原结合片段，并且其中本发明的所述抗体或抗原结合片段诱导和/或增强免疫应答，例如细胞毒性T细胞应答和/或NK细胞应答。

在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastriccancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

根据本发明的进一步的方面，提供了一种用于在预防或治疗中使用的本发明的抗体或抗原结合片段。

优选地，所述抗体或抗原结合片段用于预防或治疗癌症。

根据本发明的进一步的方面，提供了根据本发明的抗体或抗原结合片段在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

在一些实施例中，根据前述方面的所述癌症选自由以下组成的组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

附图说明

图1a示出了亲本5A11抗体的重链的可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

图1b示出了亲本5A11抗体的轻链的可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

图2a示出了人源化抗体5A11的重链的可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。

图2b示出了人源化抗体5A11的轻链的可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。

图3示出了抗体5A11和可商购的抗CRTAM抗体CR24.1与活化的T细胞的特异性剂量相关结合。

图4示出了抗体5A11与食蟹猴CRTAM同源物交叉反应，而抗体CR24.1不交叉反应。

图5示出了抗体5A11在T细胞活化后与CR24.1相比，介导IFNγ产生的增强的能力。

图6a示出了5A11亲本抗体序列的重链可变区与人源化重链可变区5A11序列的序列比对。

图6b示出了5A11亲本抗体序列的轻链可变区与人源化轻链可变区5A11序列的序列比对。

图7示出了抗体5A11可以以剂量相关的方式体外活化T细胞以产生穿孔素。

图8示出了抗体5A11可以以剂量相关的方式体外活化T细胞以产生颗粒酶B。

图9示出了抗体5A11可以在MCF7肿瘤细胞中诱导体外T细胞介导的细胞毒性。

图10示出了抗体5A11可以诱导从原发性NSCLC肿瘤样品中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，以在离体测定中产生干扰素γ。此测定示出了在与可商购的抗体CR24.1相比时，抗体5A11具有增强的活性。

图11示出了抗体5A11可以诱导从原发性乳腺癌样品中分离的TIL，以在离体测定中产生干扰素γ。

图12示出了抗体5A11以剂量相关的方式诱导TIL，以产生干扰素γ。

图13示出了抗体5A11可以引起NK介导的K562细胞的裂解。

图14示出了与用同种型对照抗体治疗的动物相比，抗体5A11可以显著降低小鼠的肿瘤生长。

具体实施方式

本发明的方面包含针对CRTAM的抗体、对所述抗体进行编码的核酸、包括对本发明的抗体进行编码的这种核酸的宿主细胞、用于制备抗CRTAM抗体的方法以及用于治疗疾病的方法，如CRTAM介导的病症，例如人类癌症，包含但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastriccancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

应当指出，如本文以及在所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另外明确指示。应当进一步指出的是，可以将权利要求书撰写成排除任何可选要素。因此，此陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

如对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在阅读本公开时，本文所描述和展示的单独方面中的每一个都具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与任何其它若干方面的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其它顺序来执行任何所叙述的方法。

定义

出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包含复数形式，并且反之亦然。

除非另外指明，否则如本文所使用的术语“CRTAM”是指来自任何脊椎动物来源(包含哺乳动物，如灵长类动物(例如，人类、灵长类动物和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CRTAM蛋白。CRTAM蛋白也可以称为CRTAM样蛋白。人CRTAM的氨基酸序列在本文中提供于SEQ ID NO:11中。

术语“CRTAM”涵盖“全长”未经处理的CRTAM以及由细胞中处理产生的任何形式的CRTAM。术语还涵盖天然存在的CRTAM的变体，例如剪接变体、等位基因变体和同种型。术语具体地包含天然存在的截短或分泌的形式的CRTAM多肽(例如，细胞外结构域序列)。本文所描述的CRTAM多肽可以从多种来源(如从人组织类型或从另一种来源)中分离，或通过重组或合成方法制备。“天然序列CRTAM多肽”包括具有与源自自然的对应CRTAM多肽相同的氨基酸序列的多肽。这种天然序列CRTAM多肽可以从自然中分离或可以通过重组或合成方法产生。如本文所使用的术语“CRTAM表位”是指由包括本文所描述的CDR序列中的至少一个或多个的抗体结合的表位，和/或如通过实例中所展示的抗CRTAM抗体的结合谱所例证的。

术语“抗体”以最广义使用，并且具体地涵盖，例如，单一抗CRTAM单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位特异性的抗CRTAM抗体组合物、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要其展现出所期望的生物活性)，由至少两种完整抗体、单链抗CRTAM抗体和抗CRTAM抗体的抗原结合片段形成，包含Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、单结构域抗体(sdAb)，只要其展现出所期望的生物活性或免疫活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与术语“抗体”与互换使用。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。本领域普通技术人员将理解的是，在一些实施例中，抗体至少含有如本文所定义的一组6个CDR；所述抗体包含但不限于传统抗体(包含单克隆抗体和多克隆抗体两者)、人源化抗体、人抗体和/或嵌合抗体、抗体片段、工程化抗体(例如，具有如下所述的氨基酸修饰)、多特异性抗体(包含双特异性抗体)以及本领域中已知和本文所讨论的其它类似物。

应当理解的是，在其它实施例中，如本文所使用的术语抗体是指不包括6个CDR的结构；包含但不限于

和scFv片段。

术语“抗CRTAM抗体”、“CRTAM抗体”或“与CRTAM结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CRTAM的抗体，以使得所述抗体在靶向CRTAM中可用作诊断剂和/或治疗剂。在某些实施例中，抗CRTAM抗体与在来自不同物种的CRTAM中保守的CRTAM的表位结合。

“分离的抗体”是指已经从其环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其环境的污染性组分是将干扰抗体的治疗用途的材料，并且可以包含酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。

关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性地与……结合(specifically binds to)”或“对……具有特异性(is specific for)”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指可测量不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量，所述对照分子通常是未具有结合活性的类似结构的分子。

术语“拮抗剂”以最广义使用，并且包含部分或完全阻断、抑制或中和天然CRTAM多肽的生物活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体地包含拮抗剂抗体或天然CRTAM多肽的抗体片段、片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、小有机分子等。用于鉴定CRTAM多肽的拮抗剂的方法可以包括使CRTAM多肽与候选拮抗剂分子接触，并测量通常与CRTAM多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。

术语“激动剂”以最广义使用，并且包含增强天然CRTAM多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂分子具体地包含激动剂抗体或抗体片段、CRTAM配体多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、小有机分子等。用于鉴定CRTAM多肽的激动剂的方法可以包括使CRTAM多肽与候选激动剂分子接触，并测量通常与CRTAM多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。

如本文所使用的，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性的细胞和组织。

如本文所使用的术语“预测性”和“预后性”也是可互换的，在意指用于预测或预后的方法是允许实践所述方法的人员选择被认为(通常在治疗之前，但不一定)更可能对用抗癌剂(包含抗CRTAM抗体)的治疗有反应的患者的意义上。

CRTAM蛋白

根据SWISS-PROT，CRTAM是粘连蛋白家族的I型膜蛋白。所述蛋白质由一个Ig样V型(免疫球蛋白样)结构域、一个Ig样C型(免疫球蛋白样)结构域(Yeh等人,《细胞》2008年3月7日；132(5):846-5)、一个跨膜区和SEQ ID No:11的氨基酸18–287之间的细胞外尾巴(extracellular tail)组成。

这种基因首次在小鼠和人活化的NKT细胞中进行鉴定(Kennedy等人,《白细胞生物学期刊(J Leukoc Biol.)》),2000年5月；67(5):725-34)，随后的研究表明所述基因的表达受到活化的严密调节，并且被限制在活化的MHC-I类限制性细胞中，包含NKT和CD8 T细胞(

CRTAM的唯一已知配体是Necl2(Galibert等人,《生物化学期刊(J Biol Chem.)》,2005年6月10日；280(23):21955-64)，并且配体与受体之间的相互作用被认为优于任一分子的同源性相互作用(Zhang等人,《结构》,2013年8月6日；21(8):1430-9)。假设CRTAM-Necl2的相互作用有助于建立成熟的免疫突触，并且有助于增强非专职性APC对T细胞的刺激。这个功能在NK细胞中也已被发现，其中针对CRTAM的抗体刺激了NK细胞的细胞毒性(Boles等人,《血液(Blood)》,2005年8月1日；106(3):779-86)。

在一些实施例中，本发明的抗体与人CRTAM结合。如本文所使用的“人CRTAM”或“人CRTAM蛋白”是指如本文所定义的SEQ ID NO:11的蛋白质。

在某些情况下，根据本发明的实施例的抗体可以与来自除人类之外的物种的CRTAM蛋白交叉反应。例如，为了促进临床前和毒理学测试，本发明的抗体可以与鼠类或灵长类动物CRTAM蛋白交叉反应。可替代地，在某些实施例中，抗体可以对人CRTAM蛋白具有特异性，并且可以不展现出物种或其它类型的非人交叉反应性。

抗体

本发明的方面包含抗CRTAM抗体，通常是治疗抗体和/或诊断抗体，如本文所描述的。用于本发明的方法中的抗体可以采取如本文所描述的多种格式中的任何一种，包含如本文进一步所描述的传统抗体以及抗体衍生物、抗原结合片段和模拟物。在一些实施例中，抗体具有选自如本文所定义的一组6个CDR(包含如本文所描述的少量氨基酸变化)的一个或多个CDR。如上所述，如本文所使用的术语“抗体”是指多种结构。

在一些实施例中，本发明中使用了IgG同种型。在一个实施例中，使用Fc沉默的IgG1同种型抗体。在另一实施例中，使用IgG4同种型抗体。

抗体的每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区。在可变区中，重链和轻链的V结构域中的每个结构域聚集三个环，以形成抗原结合位点。所述环中的每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变的”是指可变区的某些区段在抗体之间在序列上广泛不同的事实。可变区内的可变性不均匀分布。相反，V区由称为15-30个氨基酸的框架区(FR)的相对不变的延伸段组成，所述框架区由称为“高变区”的极可变性的较短区域隔开，所述高变区各自长9-15个氨基酸或更长。

每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

高变区通常涵盖从轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(CDR-L1；“L”表示轻链)、50-56(CDR-L2)和89-97(CDR-L3)的氨基酸残基和在重链可变区中的约31-35B(CDR-H1；“H”表示重链)、50-65(CDR-H2)和95-102(CDR-H3)周围的氨基酸残基；Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,公共卫生署(Public Health Service),国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如，在轻链可变区中的残基26-32(CDR-L1)、50-52(CDR-L2)和91-96(CDR-L3)以及在重链可变区中的26-32(CDR-H1)、53-55(CDR-H2)和96-101(CDR-H3)，Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917。下文中描述了本发明的特异性CDR。

贯穿本说明书，在提及可变结构域中的残基(大致上，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，同上(1991))。

CDR促进了抗原结合或更具体地抗体的表位结合位的形成。单个抗原可以具有多于一个表位。

在免疫球蛋白的IgG亚类中，在重链中存在若干免疫球蛋白结构域。在本文中，“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区。本发明中关注的是重链结构域，包含恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的上下文中，IgG同种型各自具有三个CH区。

重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。在本文中，“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。

本发明中特别关注的是Fc区。如本文所使用的，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包括抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区，并且在一些情况下包括铰链的一部分的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包含J链。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的下铰链区。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat中的EU索引。在一些实施例中，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FcγR受体结合或与FcRn受体结合。

在一些实施例中，所述抗体是全长的。在本文中，“全长抗体”意指构成抗体的天然生物形式的结构，包含可变区和恒定区，任选地包含如本文所概述的一种或多种修饰。

可替代地，所述抗体可以是多种结构，分别包含但不限于抗原结合片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)以及每种抗体的抗原结合片段。依赖于一组CDR的使用的结构被包含在“抗体”的定义内。

在一个实施例中，抗体是抗原结合片段。特异性抗原结合抗体片段包含但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等人,1989,《自然(Nature)》341:544-546，所述文献通过引用整体并入)，所述dAb片段由单个可变区组成，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab')2片段，一种包括两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许这两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-426，Huston等人,1988,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.)》85:5879-5883，所述文献通过引用整体并入)，(viii)双特异性单链Fv(WO 03/11161，所述文献特此通过引用并入)和(ix)“双抗体”或“三抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等人,2000,《酶学方法(Methods Enzymol)》326:461-479；WO94/13804；Holliger等人,1993,《美国国家科学院院刊》90:6444-6448，所有所述文献通过引用整体并入)。

嵌合抗体和人源化抗体

在一些实施例中，抗体可以是来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。也就是说，在本发明中，CDR组可以与除在本文中通过序列具体描述的那些框架区和恒定区之外的框架区和恒定区一起使用。

通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”两者是指组合来自多于一个物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包括来自小鼠(或大鼠，在一些情况下)的一个或多个可变区和来自人的一个或多个恒定区。“人源化抗体”通常是指已经将可变结构域框架区替换为在人抗体中发现的序列的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除了CDR之外，整个抗体是由人起源的多核苷酸编码的，或除了其CDR之外，与这种抗体相同。将CDR(所述CDR中的一些或全部是由源自非人生物体的核酸编码的)移植到人抗体可变区的β-片层框架中以产生抗体，所述抗体的特异性由移植的CDR确定。这种抗体的产生描述于例如WO92/11018,Jones,1986,《自然》321:522-525，Verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536，所有所述文献通过引用整体并入。在一个实施例中，本发明的抗体可以是多特异性抗体，并且值得注意的是双特异性抗体，有时也称为“双抗体”。这些抗体是与两种(或更多种)不同抗原或同一抗原上的不同表位结合的抗体。双抗体可以按本领域中已知的多种方式制造(Holliger and Winter,1993,《生物技术时论(Current Opinion Biotechnol.)》4:446-449，所述文献通过引用整体并入)，例如化学制备或从杂合杂交瘤制备。

在一个实施例中，所述抗体是微抗体。微抗体是包括与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体样蛋白。Hu等人,1996,《癌症研究(Cancer Res.)》56:3055-3061，所述文献通过引用整体并入。在一些情况下，scFv可以连接到Fc区，并且可以包含一些或整个铰链区。应该注意的是，微抗体被包含在“抗体”的定义内，尽管事实是其不具有完整的一组CDR。

本发明的抗体通常是分离的或重组的。

在一些实施例中，本发明的抗体是重组蛋白、分离的蛋白或基本上纯蛋白。“分离的”蛋白不伴随有至少一些在其天然状态下通常与其相关的材料，例如占给定样品中总蛋白质的按重量计至少约5％、或至少约50％。应该理解的是，分离的蛋白可以占总蛋白含量的按重量计5％到99.9％，这取决于具体情况。例如，可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以显著更高的浓度制备蛋白质，使得以增加的浓度水平制备蛋白质。在重组蛋白的情况下，所述定义包含在本领域已知的多种多样的生物体和/或宿主细胞中产生抗体，其中所述抗体不是天然产生的。一般而言，分离多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，特异性与CRTAM结合的分离抗体基本上不含特异性结合除CRTAM之外的抗原的抗体。

具有不同特异性的分离单克隆抗体可以组合在明确定义的组合物中。因此，例如，本发明的抗体可以任选地并单独地被包含或排除在调配物中，如下文进一步所讨论的。

特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过具有K_D为以下的抗原或表位的抗体来展现：至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、可替代地至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M或更大，其中K_D是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，相对于对照分子，特异性地结合抗原的抗体将具有比抗原或表位低20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的K_D。

而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过具有K_A或K_a为以下的抗原或表位的抗体来展现：相对于对照物，比表位大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中K_A或K_a是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率。

用于评估这些抗体对CRTAM的结合能力的标准测定可以在蛋白质或细胞水平上进行并且在本领域中是已知的，包含例如ELISA、蛋白质印迹、RIA、

测定以及流式细胞术分析。合适的测定在实例中对其进行详细描述。这些抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)也可以通过本领域中已知的标准测定来评估，如通过

或

系统分析。

CRTAM抗体

本发明提供了与CRTAM多肽或其部分结合的CRTAM抗体。在SEQ ID NO:11中提供了CRTAM氨基酸序列的实例。主题CRTAM抗体可以诱导或增强免疫细胞活化，例如T细胞活化和/或NK细胞活化，以增强肿瘤中的免疫应答。这些抗体在本文中被称为“抗CRTAM”抗体，或为了便于描述，“CRTAM抗体”。

在一些实施例中，主题CRTAM抗体可以在与T细胞，特别是在其表面上表达CRTAM的CD8+T细胞接触时诱导和/或增强细胞因子释放或增殖。在此上下文中，细胞因子释放或T细胞增殖可以按若干方式来测量。在一个实施例中，使用标准测定如ELISA，使本发明的CRTAM抗体与经过活化的T细胞接触。在进一步的实施例中，主题CRTAM抗体可以诱导和/或增强NK细胞活化和杀伤。

在一个实施例中，所述抗体是包括以下CDR的抗体：此外，如以下所讨论的，这些CDR序列还可以含有有限数量的如先前所描述的氨基酸变体：

CDR	SEQ ID NO:
		5A11_VH_CDR1	SEQ ID NO:5
5A11_VH_CDR2	SEQ ID NO:6
		5A11_VH_CDR3	SEQ ID NO:7
5A11_VL_CDR1	SEQ ID NO:15
		5A11_VL_CDR2	SEQ ID NO:9
5A11_VL_CDR3	SEQ ID NO:16

在一些实施例中，所述抗体包括SEQ ID NO:5、6、7、15、9和16中提供的CDR序列中的至少一个或多个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体包括与SEQ ID NO:5、6、7、15、9和16中提供的一个或多个CDR序列中的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

本文还公开了包括本发明的CDR组的可变重链和轻链，以及全长重链和轻链(例如，还包括恒定区)。如本领域技术人员将理解的，本发明的CDR组可以并入到鼠类、人源化或人恒定区(包含框架区)中。本发明的方面包含与本文所描述的重链可变区序列(SEQ IDNO:13)和轻链可变区序列(SEQ ID NO:14)至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链可变区和轻链可变区。

在一些实施例中，本发明提供了与本文所描述的本发明的CRTAM单克隆抗体的人CRTAM上的同一表位结合或与其交叉竞争的抗体(即，与本文所描述的本发明的单克隆抗体交叉竞争结合到CRTAM蛋白的能力的抗体)。在一些实施例中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是如本文所定义的5A11抗体。这种交叉竞争抗体可以基于其与5A11抗体交叉竞争的能力来鉴定。应当理解的是，对于被认为是交叉竞争的抗体，其不一定完全阻断参考抗体的结合。在一些实施例中，参考抗体的结合被降低至少约10、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、97、98或99％。在一些实施例中，本发明提供了与配体necl2竞争结合到CRTAM的抗体或其抗原结合片段。

抗体修饰

本发明进一步提供了变体抗体，有时称为“抗体衍生物”或“抗体类似物”。也就是说，可以对本发明的抗体进行多种修饰，包含但不限于，CDR中的氨基酸修饰(亲和力成熟)、Fc区中的氨基酸修饰、糖基化变体以及其它类型的共价修饰(例如，用于药物缀合物的附着等)。

“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽的多肽序列的多肽序列。在一些实施例中，亲本多肽是列于SEQ ID NO:1或2、13或14中的全长可变重链或轻链，或是公开于SEQ ID NO:5到10、15或16中的任一个中的一个或多个CDR序列。在一些实施例中，氨基酸修饰可以包含取代、插入和/或缺失，其中前者在许多情况下是优选的。在一些实施例中，取代可以是保守取代。

通常，变体可以包含任何数量的修饰，只要抗体的功能仍然存在，如本文所描述的。例如，抗体仍应该特异性地与人CRTAM结合。类似地，例如，如果在Fc区内产生氨基酸变体，则变体抗体应该维持抗体的特定应用或适应症所需的受体结合功能。如本文所描述的，可以使主题抗体的“变体”在一个或多个所列出的CDR序列中、在抗体的一个或多个框架区中、或在一个或多个恒定区(例如，在Fc区)中具有氨基酸变化。

在一些实施例中，与亲本序列相比，通常利用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰，因为目的通常是以最少数量的修饰来改变功能。在一些实施例中，存在1到5(1、2、3、4或5)个修饰(例如，单独的氨基酸取代、插入和/或缺失)，其中在许多实施例中还使用1-2、1-3和1-4个修饰。例如，在一些实施例中，本发明的抗体的一个或多个CDR序列可以单独地包括一个或多个，例如1、2、3、4或5个氨基酸修饰，优选地1-4、1-3、1或2个修饰。通常，在一组CDR内进行不超过4、5、6、7、8、9或10个改变。

应当注意的是，氨基酸修饰的数量可以在功能结构域内：例如，可能期望例如在野生型或工程化蛋白质的Fc区中具有1-5个修饰，以及在Fv区中具有1到5个修饰。变体多肽序列将优选地与亲本序列(例如，可变区序列、恒定区序列和/或重链和轻链序列和/或例如抗体5A11的CDR)具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％或99％一致性。

在本文中，“氨基酸取代”或“取代”意指用另一个氨基酸置换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸。如本文所使用的，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。

如本文所使用的，“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指随后被修饰以产生变体的未经过修饰的多肽。通常，如本文所使用的，亲本多肽可以指5A11多肽，例如5A11 V_H或VL链或CDR序列。因此，如本文所使用的，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的抗体。

在本文中，“野生型”或“WT”或“天然”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有尚未有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

在本文中，“变体Fc区”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于野生型Fc序列的Fc序列。Fc变体可以指Fc多肽本身、包括Fc变体多肽的组合物或氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明的抗CRTAM抗体由变体Fc结构域构成。如本领域已知的，抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，从而赋予一系列被称为效应子功能的重要功能能力。可以在一个或多个位置处进行合适的修饰，并且特别是对于降低或沉默与Fc受体结合的特定氨基酸取代。

除了上文所概述的修饰之外，可以进行其它修饰。例如，可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥键来稳定这些分子(Reiter等人,1996,《自然生物科技(NatureBiotech.)》14:1239-1245，所述文献通过引用整体并入)。

此外，半胱氨酸处的修饰在抗体-药物缀合物(ADC)应用中特别有用，下文进一步描述。在一些实施例中，抗体的恒定区可以被工程化为含有特别“硫醇反应性的”一个或多个半胱氨酸，以便允许药物部分的更加特异性和受控的放置。参见例如美国专利第7,521,541号，所述专利通过引用以其整体并入本文。此外，存在抗体的多种共价修饰，所述共价修饰可以如下文所概述地进行。

抗体的共价修饰包含在本发明的范围内，并且通常但非总是，在翻译后进行。例如，抗体的若干类型的共价修饰通过使抗体的特定氨基酸残基与有机衍生化试剂反应而被引入到分子中，所述有机衍生化试剂能够与所选侧链或N-或C-末端残基反应。

此外，如本领域技术人员将理解的，标记物(包含荧光的、酶的、磁性的、放射性的等)可以全部被添加到抗体(以及本发明的其它组合物)中。

双特异性分子

在另一方面，本发明包含双特异性和多特异性分子，其包括本发明的抗CRTAM抗体或其片段。本发明的抗体、或其抗原结合部分可以被衍生化或被连接到另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)，以产生与两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。在一些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到至少两种功能分子，例如其它肽或蛋白质(例如，其它抗体或受体的配体)，以产生与至少三种不同结合位点或靶分子结合的多特异性分子。为了产生本发明的双特异性或多特异性分子，本发明的抗体可以功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其它方式)到一个或多个其它结合分子，如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性或多特异性分子。

因此，本发明包含双特异性分子，其包括对第一靶表位(即，CRTAM)的至少一种第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。第二靶表位可以存在于与由第一结合特异性结合的靶蛋白相同的靶蛋白上；或第二靶表位可以存在于与由第一结合特异性结合的靶蛋白不同的靶蛋白上。第二靶表位可以存在于与第一靶表位相同的细胞上(即，CRTAM)；或第二靶表位可以存在于未由显示第一靶表位的细胞显示的靶上。如本文所使用的，术语“结合特异性”是指包括至少一个抗体可变结构域的部分。

在本发明的另一个实施例中，第二靶表位存在于肿瘤细胞上。因此，本发明的方面包含能够与表达CRTAM的效应细胞(例如，表达CRTAM的细胞毒性T细胞)以及与表达第二靶表位的肿瘤细胞两者结合的双特异性分子。

在一个实施例中，本发明的双特异性抗体可以具有总共两个或三个抗体可变结构域，其中所述双特异性抗体的第一部分能够通过特异性地与位于人免疫效应细胞上的效应抗原结合来募集人免疫效应细胞的活性，其中所述效应抗原是CRTAM，所述第一部分由一个抗体可变结构域组成，并且所述双特异性抗体的第二部分能够特异性地与除所述效应抗原之外的靶抗原结合，所述靶抗原位于除所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上，并且所述第二部分包括一个或两个抗体可变结构域。

在其中结合蛋白是多特异性的本发明的一个实施例中，除了抗肿瘤结合特异性和抗CRTAM结合特异性之外，分子可以进一步包含第三结合特异性。在一个实施例中，第三结合特异性是一种抗增强因子(EF)部分，例如与涉及细胞毒性活性的表面蛋白结合并且由此增加针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是抗体、功能抗体片段、或与给定分子(例如抗原或受体)结合的配体，并且由此导致靶细胞抗原的结合决定簇的作用的增强。“抗增强因子部分”可以结合靶标细胞抗原。可替代地，抗增强因子部分可以与不同于第一结合特异性和第二结合特异性结合的实体的实体结合。例如，抗增强因子部分可以结合细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的免疫应答增加的其它免疫细胞)。

在一个实施例中，本发明的双特异性蛋白包括至少一种抗体或其抗原结合片段作为结合特异性，包含例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、Fd、dAb或单链Fv。所述抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或如在美国专利第4,946,778号中所描述的单链构建体，所述专利的内容通过引用明确地并入。

在一些实施例中，可以用于本发明的双特异性分子的抗体是鼠类、人、嵌合或人源化单克隆抗体。

双特异性分子与其特异性靶的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)、或蛋白质印迹(Western Blot)测定来确认。这些测定中的每种测定通常通过采用对目的复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。

糖基化

另一种类型的共价修饰是糖基化的改变。例如，可以制备非糖基化抗体(即，缺乏糖基化的抗体)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，从而导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除在所述位点处的糖基化。此类非糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在授权于Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中进一步详细描述了这种方法，并且所述方法可以通过在位置297处去除天冬酰胺来实现。

抗体的另一种类型的共价修饰包括将抗体与各种非蛋白质聚合物连接，包含但不限于各种多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以在例如来自内克塔治疗公司(Nektar Therapeutics)的2005-2006PEG目录(可在内克塔网站上获得)的美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所阐述的方式，所有所述专利通过引用整体并入。此外，如本领域已知的，可以在抗体内的不同位置处进行氨基酸取代，以促进聚合物(如PEG)的添加。参见例如美国公开号2005/0114037A1，所述专利通过引用整体并入。

在另外的实施例中，例如在本发明的抗体用于诊断或检测目的的用途中，所述抗体可以包括标记。在本文中，“标记的”意指化合物附接有至少一个部分、元素、同位素或化学化合物，以使得能够检测所述化合物，如Richard P.Haugland的《分子探针手册(Molecular Probes Handbook》的第6版中所描述的化合物，所述文献特此通过引用明确地并入本文。

用于产生本发明的抗体的方法

本发明进一步提供了用于产生所公开的抗CRTAM抗体的方法。这些方法涵盖培养含有对本发明的抗体进行编码的一种或多种分离核酸的宿主细胞。如本领域技术人员将理解的，这可以以多种方式进行，这取决于抗体的性质。在一些实施例中，在本发明的抗体是全长传统抗体的情况下，例如，宿主细胞含有对重链可变区进行编码的核酸，并且轻链可变区可以在使得抗体被产生并且可以被分离的条件下培养。

本文公开了本发明的抗体的可变重链和轻链(蛋白质和核酸序列两者)；如本领域将理解的，这些抗体可以容易地增加以产生全长重链和轻链。也就是说，已经提供了如本文所概述的对V_H和VL区段进行编码的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进行进一步操作，例如，以便将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因、或scFv基因。在这些操作中，对VL-或V_H进行编码的DNA片段操作性地连接到对另一种蛋白质进行编码的另一个DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。如在此上下文中所使用的，术语“操作性地连接”旨在意指将这两个DNA片段连接，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读码框内。

通过将对V_H进行编码的DNA操作性地连接到对重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)进行编码的另一个DNA分子，可以将对V_H区进行编码的分离DNA转化为全长重链基因。鼠类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat,E.A.等人(1991),《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版,美国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一个优选的实施例中，所述重链恒定区是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，对V_H进行编码的DNA可以操作性地连接到仅对重链C_H1恒定区进行编码的另一个DNA分子。

通过将对V_L进行编码的DNA操作性地连接到对轻链恒定区C_L进行编码的另一个DNA分子，可以将对VL区进行编码的分离DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。鼠类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat,E.A.等人,(1991),《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版,美国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。在一个优选的实施例中，所述轻链恒定区是κ或λ恒定区。

为了产生对scFv抗体片段进行编码的多核苷酸序列，将对V_H-和VL进行编码的DNA片段操作性地连接到对柔性接头(例如，对氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃进行编码)进行编码的另一个片段，使得V_H和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中VL区和V_H区由柔性接头连接(参见，例如Bird等人,(1988),《科学》242:423-426；Huston等人,(1988),《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；McCafferty等人,(1990),《自然》348:552-554)。

本发明的方面包含编码本发明的抗体的核酸。此类多核苷酸编码重链和轻链中的每个的可变区和恒定区两者，但是本发明还设想了根据本文所描述的组合物的其它组合。本发明的方面包含源自所公开的多核苷酸的寡核苷酸片段，以及与这些多核苷酸互补的核酸序列。

根据本发明的实施例的多核苷酸可以呈以下形式或可以包含以下：RNA、DNA、cDNA、基因组DNA、核酸类似物和合成DNA。在一些实施例中，DNA分子可以是双链或单链的，并且如果是单链的，可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可以与本文所提供的编码序列相同，或可以是不同的编码序列，所述序列由于遗传密码的冗余性或简并性而编码与本文所提供的DNA相同的多肽。

在一些实施例中，将对本发明的抗体进行编码的一种或多种核酸并入到表达载体中，所述表达载体可以是染色体外的或设计成整合到其被引入到其中的宿主细胞的基因组中。表达载体可以含有任何数量的适当的调控序列(包含但不限于转录和翻译控制序列、启动子、核糖体结合位点、增强子、复制起点等)或其它组分(选择基因等)，如本领域所熟知的，将所有所述序列可操作地连接。在一些情况下，使用两种核酸，并且将每种核酸置于不同的表达载体中(例如，在第一表达载体中的重链，在第二表达载体中的轻链)，或可替代地，可以将其置于同一表达载体中。本领域技术人员应当理解的是，一种或多种表达载体的设计(包含调控序列的选择)可以取决于如宿主细胞的选择、所期望的蛋白质的表达水平等因素。

通常，可以使用适合于所选的宿主细胞的任何方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)将核酸和/或表达引入到合适的宿主细胞中以产生重组宿主细胞，使得一种或多种核酸分子可操作性连接到一个或多个表达控制元件(例如，在载体中，在由细胞中的过程产生的构建体中，整合到宿主细胞基因组中)。所得重组宿主细胞可以维持处于适合于表达的条件下(例如，在诱导物存在的情况下，在合适的非人动物中，在合适的补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的培养基中)，由此产生一种或多种经过编码的多肽。在一些实施例中，在同一宿主细胞中产生重链和轻链。在一些实施例中，在一个宿主细胞中产生重链，并且在另一个宿主细胞中产生轻链。

作为用于表达的宿主的可获得的哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包含可从美国标准生物品收藏中心(ATCC)，马纳萨斯(Manassas)，维吉尼亚州(VA)获得的许多永生化细胞系，包含但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK 293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其它细胞系。非哺乳动物细胞(包含但不限于细菌、酵母、昆虫和植物)也可以用于表达重组抗体。在一些实施例中，所述抗体可以在转基因动物(如奶牛或鸡)中产生。

用于抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法是熟知的，例如，参见美国专利第4,816,567号、第4,816,397号、第6,331,415号和第7,923,221号，以及《抗体工程(Antibody Engineering)》,编辑：Kontermann和Dubel,海德堡的施普林格出版社(Springer，Heidelberg),2001和2010；Hayhurst和Georgiou,2001,《化学生物学时论》5:683-689；Maynard和Georgiou,2000,《生物医学工程年评(Annu Rev Biomed Eng)2:339-76；和Morrison,S.,(1985),《科学》229:1202。

药物组合物

本发明的方面包含一种组合物，例如药物组合物，所述组合物含有与药学上可接受的载剂一起调配的本发明的一种或多种(或其组合)CRTAM抗体、或一种或多种其抗原结合部分。此类组合物可以包含本发明的抗体或双特异性分子中的一种或其组合(例如，两种或更多种不同的)。例如，本发明的药物组合物可以包括与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体的组合。

本发明的药物组合物还可以在组合疗法中施用，即，与其它试剂组合施用。例如，组合疗法可以包含与至少一种其它抗肿瘤剂或抗炎剂或免疫抑制剂组合的本发明的抗体。可以用于组合疗法的治疗剂的实例在以下关于本发明的抗体的用途的部分中进行更详细地描述。

如本文所使用的，“药学上可接受的载剂”包含生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载剂适合于静脉内施用、肌内施用、皮下施用、肠胃外施用、脊髓施用或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即，抗体或抗体片段)可以包被在材料中，以保护所述化合物免受酸和可能使所述化合物失活的其它自然条件的作用。

本发明的药物化合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所期望的生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学效应的盐(参见，例如，Berge,S.M.等人,(1977),《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.)》66:1-19)。本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。可以在本发明的药物组合物中采用的适当的水性和非水性载剂的实例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及其适当的混合物、植物油，如橄榄油、和可注射的有机酯，如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料，如卵磷脂、在分散液的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。可以通过上述灭菌程序，以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两者来确保预防微生物的存在。可能还期望将等渗剂，如糖、氯化钠等包含于这些组合物中。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

药学上可接受的载剂包含无菌水溶液或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况之外，设想了其在本发明的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。

调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单个大丸剂，可以随时间推移施用若干分次剂量，或可以按治疗状况的紧急情况所指出的成比例地减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，以剂量单位形式调配肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用的剂量单位是指作为针对待治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药物载剂缔合的、经过计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。

对于抗体的施用，剂量范围可以是宿主体重的约0.0001到100mg/kg、约0.001到50mg/kg、约0.001到10mg/kg、约0.01到10mg/kg，并且更通常地0.01到5mg/kg。例如，剂量可以是0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、7.5mg/kg体重或10mg/kg体重或处于0.1-5mg/kg或1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每日施用、隔日施用、每周两次施用、每周一次施用、每两周一次施用、每三周一次施用、每四周一次施用、每月一次施用、每3个月一次施用或每三到6个月一次施用。本发明的抗CRTAM抗体的优选剂量方案包含通过静脉内施用的1mg/kg体重、3mg/kg、5mg/kg或10mg/kg体重，其中使用以下给药方案之一给予所述抗体：(i)每周六个剂量，然后每月；(ii)每周；(iii)每周一次3mg/kg体重，随后是1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量落在所指示的范围内。在一些实施例中，抗体是在多种场合下施用的。单一剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量针对患者体内的靶抗原的抗体的血液水平所指示的。在一些实施例中，调整剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25-300μg/ml。

在一些实施例中，抗体可以作为持续释放的调配物施用，在这种情况下要求较低频率地施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人抗体显示出最长半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量在长时间段内以相对不频繁的间隔施用。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止，并且优选地直到患者示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以施用患者预防方案。

可以改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗应答，而对患者无毒性的活性成分的量。所选剂量水平将根据多种药代动力学因素，包含所采用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所采用的具体化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所采用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况以及以前病史；以及医学领域中熟知的类似因素。

本发明的抗CRTAM抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、或由于疾病折磨造成的损伤或残疾的预防。例如，“治疗有效剂量”相对于未经过治疗的受试者，优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、更优选地至少约40％、至少约50％、甚至更优选地至少约60％、至少约70％、并且仍更优选地至少约80％、至少约90％或至少约95％。可以在预测人肿瘤的功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。可替代地，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制细胞生长的能力来评估，这种抑制作用可以通过熟练的从业者已知的测定在体外进行测量。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其它方式减轻受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者的症状的严重性、以及所选的具体组合物或施用途径等因素确定这种量。

本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种、通过一种或多种施用途径进行施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或施用模式将根据所期望的结果而变化。本发明的抗体的优选施用途径包含静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的，短语“肠胃外施用”意指除了肠内和局部施用之外的、通常通过注射进行的施用模式，并且包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。

可替代地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻施用、经口施用、经阴道施用、经直肠施用、经舌下施用或局部施用。

活性化合物可以用将保护化合物免于快速释放的载剂来制备，如控释调配物，包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类调配物的许多方法是已经授权的或本领域普通技术人员普遍已知的(参见，例如，《持续以及受控释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)》,(1978)J.R.Robinson编辑,马塞尔·德克尔有限公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约(N.Y))。

在某些实施例中，可以调配本发明的单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果期望的话)，可以将所述化合物调配在例如脂质体中。关于制造脂质体的方法，参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可以包括被选择性地运输到特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见，例如，V.V.Ranade,(1989),《临床微生物学期刊(J.Clin.Pharmacol.)》29:685)。示例性靶向部分包含叶酸或生物素(参见，例如，美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988),《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.))》153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人,(1995),《FEBS快报(FEBS Lett.)》357:140；M.Owais等人,(1995),《抗菌剂和化学疗法期刊(Antimicrob.Agents Chemother.)》39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人,(1995),《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》1233:134)；p120(Schreier等人,(1994),《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269:9090)，还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen,(1994),《FEBS快报》346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler,(1994),《免疫方法(Immunomethods)》4:273。

用途和方法

本发明的抗体、抗体组合物和方法具有涉及免疫介导的病症的诊断和治疗的许多体外和体内诊断和治疗用途。

在一些实施例中，可以向体外或离体培养中的细胞或人类受试者施用这些分子，例如在体内，以治疗、预防和/或诊断多种病症。如本文所使用的，术语“受试者”旨在包含人类和非人类动物。非人类动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类动物和非哺乳动物。优选的受试者包含人类患者。当针对CRTAM的抗体与另一种试剂一起施用时，这两者可以按顺序或同时施用。

鉴于本发明的抗体对CRTAM的特异性结合，本发明的抗体可以用于特异性地检测免疫细胞表面上的CRTAM表达，并且此外，可以用于通过免疫亲和纯化来纯化CRTAM。

此外，给定CRTAM在免疫细胞上的表达，本发明的抗体、抗体组合物和方法可以用于治疗患有致瘤性病症的受试者，例如，一种以肿瘤细胞的存在为表征的病症，例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

在一个实施例中，本发明的抗体可用于治疗癌症，例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastriccancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

在进一步的实施例中，本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药物，例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

在一个实施例中，本发明的抗体(例如，单克隆抗体、抗体片段、纳米抗体、多特异性和双特异性分子和组合物等)可以用于检测CRTAM的水平，或在其膜表面上含有CRTAM的免疫细胞的水平，所述水平然后可以与用于诊断的某些疾病症状有关联。

在另一实施例中，本发明的抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以最初针对与体外治疗或诊断用途相关的结合活性进行测试。例如，可以使用在以下实例中描述的流式细胞术测定来测试本发明的组合物。

在一些实施例中，本发明的抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在疾病的治疗和诊断中具有另外的效用。例如，单克隆抗体、多特异性或双特异性分子可以用于在体内或体外引发以下生物活性中的一种或多种：诱导和/或增强免疫细胞的活化；在表达CRTAM的人效应细胞的存在下介导细胞的吞噬作用或ADCC，或阻断CRTAM配体与CRTAM的结合。

在特定实施例中，这些抗体(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内用于治疗、预防或诊断多种疾病。相关疾病的实例除了别的之外，还包含代表以下的人类癌症组织：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)的合适途径是本领域熟知的，并且可以由本领域普通技术人员进行选择。例如，这些抗体组合物可以通过注射(例如，静脉内注射或皮下注射)进行施用。所使用的分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重，以及抗体组合物的浓度和/或调配物。

如前文所述，本发明的抗CRTAM抗体可以与一种或多种另外的治疗剂(例如，免疫刺激剂、细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共同施用。抗体可以与试剂(作为免疫复合物)连接或可以与试剂分开施用。在后一种情况下(单独施用)，所述抗体可以在试剂之前、之后或同时地施用，或可以与其它已知疗法(例如，抗癌疗法，例如，放射疗法)共同施用。此类治疗剂除了别的之外，还包含抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥以及环磷酰胺羟基脲，其本身仅在对患者有毒性或亚毒性的水平上有效。适合于与本发明的抗体共同施用的其它试剂包含用于治疗癌症的其它试剂，例如

5FU和吉西他滨。本发明的抗CRTAM抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共同施用提供了两种抗癌剂，这两种抗癌剂通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机制而起作用。这种共同施用可以解决由于对药物抗性的发展或肿瘤细胞抗原性的改变而引起的问题。

靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应细胞也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞或单核细胞。其它细胞包含嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和其它携带IgG-或IgA-受体的细胞。如果期望的话，可以从有待治疗的受试者中获得效应细胞。靶特异性效应细胞可以在生理学可接受的溶液中作为细胞的悬浮液施用。所施用的细胞的数量可以是大约10⁸-10⁹，但将根据治疗目的而变化。

使用靶特异性效应细胞的治疗可以与其它技术结合进行。例如，使用本发明的组合物(例如，单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)和/或携带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法结合使用。另外，结合免疫疗法可以用于引导两种不同的细胞毒性效应群体朝着肿瘤细胞排斥。

本发明的双特异性和多特异性分子也可以用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，如通过加帽(capping)并且在细胞表面上消除受体。抗Fc受体的混合物也可以用于此目的。

本发明的方面包含试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体组合物(例如，单克隆抗体、双特异性或多特异性分子)，以及其用于例如治疗癌症的用法说明。所述试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，如免疫抑制试剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或多种本发明的另外的抗体(例如，具有互补活性的抗体，所述抗体与不同于第一抗体的CRTAM抗原中的表位结合)。

因此，用本发明的抗体组合物治疗的患者可以另外地施用(在给予本发明的抗体之前、同时或之后)另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，这增强或增加了抗体的治疗效果。

在其它实施例中，可以用调节例如增强或抑制Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的试剂另外地治疗受试者，例如通过用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗期间施用的优选细胞因子包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

本发明的组合物(例如，抗体、多特异性和双特异性分子)还可以用于靶向表达FcγR或CRTAM的细胞，例如用于标记此类细胞。对于这样的用途，可以将结合剂连接到可以检测到的分子上。因此，本发明提供了用于离体或体外定位表达Fc受体(如FcγR、或CRTAM)的细胞的方法。可检测标记可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。

在特定实施例中，本发明提供了用于检测样品中CRTAM抗原的存在或测量CRTAM抗原的量的方法，包括使样品和对照样品与单克隆抗体或其抗原结合部分在允许抗体或其部分与CRTAM之间形成复合物的条件下接触，所述单克隆抗体或其抗原结合部分特异性地与CRTAM结合。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的差异指示样品中存在CRTAM抗原。

在其它实施例中，本发明提供了用于治疗受试者的免疫介导的病症的方法，例如，人类癌症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomachcancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

在本说明书中所引用的所有参考文献，包含但不限于所有论文、出版物、专利、专利申请、演示文稿、文本、报告、手稿、手册、书籍、互联网帖子、期刊文章、期刊、产品及服务简介等，特此通过引用以其整体并入本说明书中。在本文中，参考文献的讨论旨在仅概括其作者做出的主张，并且不承认任何参考文献构成现有技术，并且申请人保留对所引用的参考文献的准确性和持续性质疑的权利。

虽然已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式较为详细地描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导很容易明白的是，在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

通过以下实例进一步说明了本发明，但是这些实例不应被解释为进一步的限制。提供以下实例、序列和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中阐述。应当理解的是，在不偏离本发明的精神的情况下，可以对所阐述的过程进行修改。

实例：

实例1：抗体产生和筛选

杂交瘤产生

大鼠单克隆抗CRTAM抗体通过遗传免疫产生。使用CRTAM ECD(SEQ ID NO:12)来产生用于免疫的质粒pB8-CRTAM-hum.ECD(Aldevron，弗赖堡(Freiburg))。使用质粒pB8-CRTAM-hum.ECD来免疫三只大鼠。使用工业标准技术将来自免疫大鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，以产生杂交瘤。

大鼠免疫和滴度测试

用载体(pB8-CRTAM-hum.ECD)免疫动物。为了检测靶特异性抗体的存在(“抗体滴度”)，在免疫动物的血清中进行基于流式细胞术的测定(FACS测试)。

杂交瘤筛选

使用FACS测定来鉴定过量表达的杂交瘤细胞。从初步筛选中鉴定出一百零八个杂交瘤克隆为阳性。

次级筛选

将重组hCRTAM/Fc嵌合体(R&D系统，目录1695-CR)以100纳克/孔包被在稀释于1X达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(目录号SH30028-03，赛默科技公司(ThermoScientific))中的高结合测定板(目录号12-565-136，赛默科技公司)上。使用Tecan Hydro速度96孔板洗涤器，将这些板用洗涤缓冲液、1X DPBS和0.05％Tween 20(目录号BP337-500，飞世尔科技公司(Fisher Scientific))洗涤三次。

洗涤后，在室温(RT)下，用超级块(可从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))获得)溶液封闭抗原包被的板持续1小时。

将以1:5稀释于ELISA缓冲液(ELISA缓冲液、1X DPBS、0.05％Tween20，以及1％牛血清白蛋白，目录号SH30574.02，赛默科技公司)中的100μl杂交瘤上清液添加到每个孔中。在第一抗体温育后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次。将在ELISA缓冲液(H&L链特异性，杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)，目录号112-035-167)中以1:5000稀释的HRP标记的第二抗体(山羊抗大鼠IgG)添加到这些板中，在RT下持续一小时。将板在洗涤缓冲液中洗涤三次。将一步超TMB-ELISA(1-Step Ultra TMB-ELISA)(目录号34028，赛默科技公司)添加到每个孔中以发展可检测信号。在信号完全显影之后，将2N硫酸(目录号8140-16，丽卡化学公司(Ricca Chemical Company))添加到所有孔中以终止反应。使用VERSA max酶标仪在450nm波长下测定每个样品的光密度(OD)。

实例2：针对CRTAM的单克隆抗体的结构表征

使用标准PCR技术获得对单克隆抗体的重链和轻链可变区进行编码的cDNA序列，并且使用标准DNA测序技术进行测序。在图1中可以看到选自筛的5A11的重链和轻链可变区。

5A11的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:3和1中。

5A11的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:4和2中。

使用CDR区测定的Kabat系统对5A11 VH序列进一步分析，得到分别如SEQ ID NO:5、6和7所示出的重链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。图1a示出了具有加框的CDR1、CDR2和CDR3的5A11 VH序列。

使用CDR区测定的Kabat系统对5A11 VL序列进一步分析，得到分别如SEQ ID NO:8、9和10所示出的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的示意图。图1b示出了具有加框的CDR1、CDR2和CDR3的5A11 VL序列。

实例3：通过流式细胞分析测定的单克隆抗体对CRTAM的特异性

体外活化的T细胞的制备

如上所述，从人血沉棕黄层(human buffy coat)中分离外周血单核细胞(PBMC)。在100ng/ml抗CD3(OKT3)的存在下，将2E6细胞/毫升PBMC在T细胞培养基(具有5％FBS的AIMV培养基，目录号SH3008703，飞世尔，匹兹堡，宾夕法尼亚州)和300u IL2(目录#200-02，派普泰克，洛基希尔，新泽西州)中培养持续4天。在此之后，在FACS分析(数据未示出)之前，将细胞用抗CD3/抗CD28活化珠粒(目录#11132D，赛默飞世尔，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)培养持续24小时。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

根据标准方案以96孔板格式进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。如上所述，制备活化的T细胞。染色方案的所有后续步骤在冰上用冰冷的试剂进行，除了在RT下进行的离心步骤以外。在FACS缓冲液中制备抗体的三倍系列稀释物，以给出终浓度范围为133nM到1pM的12点滴定曲线。将对应的杂交瘤上清液、同种型对照以及阳性对照抗体稀释于冰冷的FACS缓冲液中，以在具有终浓度为30nM的单个点处进行测试。对于每个细胞系，将抗体稀释液各自分配(100微升/孔)到一个孔中。将一个孔在FACS缓冲液中保持未染色。在用第一抗体或对照温育30分钟之后，通过添加FACS缓冲液将细胞洗涤两次，随后以1200rpm离心持续5分钟。弃去上清液，并且保留细胞沉淀物。将第二抗体，山羊抗大鼠IgG(H+L)-RPE稀释到1μg/mL的工作浓度，并且施加到除未用第一抗体染色的孔中的一个孔之外的所有孔。将第二抗体与细胞一起温育持续30分钟。通过添加FACS缓冲液将细胞洗涤两次，随后以1200rpm离心持续5分钟。将最终的细胞沉淀物重悬于150μL FACS缓冲液+50μl 4％多聚甲醛中，并且固定直到准备好在流式细胞仪中获得。将板置于4℃下，直到获得。使用Guava EasycytePlus高通量流式细胞仪(96孔板)确定每个样品的几何平均荧光强度(GMFI或几何平均数(Geo Mean))，并且使用Guava Cytosoft Pro软件模块，版本2.2.2(密理博(Millipore)，比勒利卡，马萨诸塞州)分析原始数据。将几何平均数相对于抗体浓度绘图，并且使用GraphPad^TM Prism软件来进行非线性回归、S形剂量-反应分析，并且计算抗体在活化的T细胞上的结合的EC50。

图3示出了与可商购的抗CRTAM抗体CR24.1(百进生技(BioLegend))相比，5A11特异性剂量相关的与活化的T细胞的结合。可以看出，抗体5A11示出了与活化的T细胞的优越结合。

实例4：抗CRTAM抗体的交叉反应性

酶联免疫吸附测定(ELISA)

根据标准方案以96孔板格式进行酶联免疫吸附测定(ELISA)分析。将96孔ELISA板(目录号12-565-136，赛默科技公司)在4℃下用含100μl 1μg/mL cyno CRTAM HIgG1-Fc蛋白的1X达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(目录号SH30028-03，赛默科技公司)包被过夜。将板用洗涤缓冲液、1X DPBS和0.05％Tween 20(目录号BP337-500，飞世尔科技公司)洗涤三次，在RT下用250μl超级块缓冲液(目录号37515，赛默科技公司)封闭持续30分钟，然后用洗涤缓冲液再次洗涤三次。

在ELISA缓冲液、1X DPBS、0.05％Tween 20和1％牛血清白蛋白(目录号SH30574.02，赛默科技公司)中以1:3连续稀释抗CRTAM抗体，以获得终浓度范围为0.003到2μg/ml的8点滴定曲线，并且一式两份地施加到这些孔。将最后的孔作为空白留在ELISA缓冲液中。在用第一抗体温育60分钟之后，将板在洗涤缓冲液中洗涤三次。

在ELISA缓冲液中以1:5000稀释第二抗体—过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗大鼠IgG(H+L)，并且用CRTAM抗体和同种型对照将其施加到孔，持续60分钟。还在ELISA缓冲液中以1:5000稀释过氧化物酶标记的亲和纯化F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)，并且用CR24.1将其施加到这些孔，持续60分钟。

将板在洗涤缓冲液中洗涤三次。将一步超TMB-ELISA(1-Step Ultra TMB-ELISA)(目录号34028，赛默科技公司)添加到每个孔中以发展可检测信号。在信号完全显影之后，将2N硫酸(目录号8140-16，丽卡化学公司)添加到所有孔中以终止反应。使用VERSA max酶标仪在450nm波长下测定每个样品的光密度(OD)。从一式两份孔中平均每个样品的吸光度，相对于抗体浓度绘图，并且使用非线性回归和S形剂量-反应分析来计算EC50。

抗CRTAM抗体5A11证明以剂量相关的方式与食蟹猴CRTAM蛋白结合，而发现CR24.1不与食蟹猴CRTAM蛋白结合。图4示出了5A11的交叉反应性。

实例5：抗CRTAM抗体活化T细胞并刺激IFNγ产生的能力

通过抗CRTAM和抗CD3抗体制备体外活化的T细胞

将96孔非组织培养板用2μg/ml OKT3和不同浓度的抗CRTAM抗体/同种型(以1:2稀释11次从20μg/ml滴定)在4℃下包被过夜。将板用PBS洗涤两次，随后用AIMV加上5％FBS封闭持续30分钟。封闭之后，将如实例3中所述产生的10万个OKT3激活的T细胞(OKT3-primedT cell)(第4天)重悬于新鲜的AIMV培养基中，并且添加到板上。在37℃下温育一天之后，收集上清液并稀释以用于IFNγELISA测定。

用于IFNγ测定的酶联免疫吸附测定(ELISA)

用对应的Ready-SET-Go！ELISA试剂盒测量来自eBiosciences的(目录#50-173-24，飞世尔科技公司)IFNγ。根据制造商的指示，将高结合板(康宁3690)用捕获抗体(以1:250稀释于包被缓冲液中)在4℃下包被过夜，然后用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween-20)洗涤三次。在振动器上用测定稀释剂封闭板持续1小时。将细胞培养上清液以适当的稀释度(IFNγ为1:400)添加到这些板中，并且在振荡器上温育持续2小时，随后洗涤3次。添加在测定稀释剂中以1:250稀释的经过生物素化的检测抗体(试剂盒中提供的)，并且在板振荡器上温育持续1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤，并且添加在测定稀释剂中以1:1000稀释的HRP标记的链霉亲和素(试剂盒中提供的)。在板振荡器上温育30分钟后，将板洗涤，并且添加TMB底物溶液(试剂盒中提供的)。在添加2N H2SO4溶液约5到10分钟之后终止显色反应，并且在读板仪上在450nm(OD450)下读取吸收。

结果

当与抗体CR24.1相比时，5A11抗体在OKT3预活化的T细胞中示出增强的活性，这反映了增加的IFNγ产生(图5)。这示出了针对CRTAM的抗体将在具有抑制免疫系统的患者中具有治疗作用。

实例6：抗体5A11的人源化

使用CDR移植技术进行大鼠5A11单克隆抗体的人源化。为了指导人源化过程并帮助决定保存亲本大鼠残基或用其人种系对应物取代其，建立了5A11大鼠单克隆抗体的Fv的同源性分子模型。

CDR的定义基于Kabat命名法。通过使用IgBLAST(在NCBI开发以促进免疫球蛋白V区序列的分析)搜索IMGT大鼠和人V基因数据库(其中5A11大鼠可变区序列作为输入)来实现对其中移植了5A11大鼠CDR区的人框架受体区的选择。所应用的策略是使用人种系序列，所述人种系序列是不含有在单独的人抗体序列中发现的特异性体细胞突变的天然人序列。

5A11大鼠抗体的同源性分子模型

同源性模型建立的方法

根据已建立的方案构建抗体BUH-5A11-F2(‘5A11’)的模型(拉莫斯OHP.抗体可变结构域的计算机辅助建模(Ramos OHP.Computer-assisted modeling of antibodyvariable domains.),《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》,2012；907:39-55)。根据IMGT惯例对可变重链(VH)和轻链(VL)序列进行单独编号/注释，以便分离框架和CDR序列。

使用VL框架残基通过蛋白质BLAST来搜索解决的抗体结构的序列。顶部命中由4AIZ结构的VL提供(1.75A分辨率)(108个相同残基中的65个)。所述顶部命中被选作模板，然而，采用由结构3G6D的VL提供的稍低等级的命中(3.20A分辨率)(107个相同残基中的64个)来固定4AIZ缺失的N末端丝氨酸的构象。VL CDR2序列与4AIZ的序列一致性匹配；因此，不需要搜索CDR2模板。使用VL CDR1和CDR3的序列(在每一末端上添加两个残基)通过蛋白质BLAST来搜索解决的抗体结构的序列。VL CDR3的顶部命中是结构1NFD(2.80A分辨率)(15个相同残基中的11个)。没有鼠类或大鼠抗体结构匹配CDR1的序列，其中在每一末端上添加两个残基；搜索具有VL构架的鼠类或大鼠抗体结构也未产生良好的近似命中。跨人结构搜索的CDR1的最佳匹配返回用作VL模板的4AIZ(10个相同残基中的5个)中的人V-λ。使用PyMol(PyMOL分子图形系统(PyMOL Molecular Graphics System)，版本1.3r1，薛定谔公司(Schrodinger,LLC.)来将CDR3模板适配到框架模板，使用末端上的两个残基突出端来将CDR模板片段锚定到VL框架模板。人工对经过组装的VL部分模型进行诱变(在PyMol中)，其中选择最佳的旋转异构体，以便匹配5A11VL序列。

使用VH框架残基通过蛋白质BLAST来搜索解决的抗体结构的序列。顶部命中由大鼠抗体结构5AUM的VH(2.05A分辨率)(116个相同残基的85个)提供；此抗体具有与5A11相同的IGHV10-5种系，并且因此被选作模板。使用VH CDR1、CDR2和CDR3的序列(在每一末端上添加两个残基)通过蛋白质BLAST来搜索解决的抗体结构的序列。VH CDR1的顶部命中是由4HPY(1.50A分辨率)(11个相同残基中的9个)的结构提供的。VH CDR2的顶部命中是由5AUM(14个相同残基中的11个)的结构提供的。VH CDR3的顶部命中，1Q72，由于在比对中存在4个缺口而没有被选作模板；相反，选择较低等级的命中结构4BZ1(1.50A分辨率)(14个相同残基中的7个)；这是因为1Q72和4BZ1 CDR3片段的重叠示出了N和C末端区段与框架模板彼此良好匹配，而4BZ1提供了1Q72中发现的序列插入的令人满意的闭合。使用末端上的两个残基突出端将CDR模板适配到框架模板(在PyMol中)，以将每个CDR模板片段锚定到框架模板。最后，人工对经过组装的VH部分模型进行诱变(在PyMol中)，其中选择最佳的旋转异构体，以便匹配5A11 VH序列。随后，选择VH和VL部分模型的最佳三级排列，以便组装最终模型。将VH和VL模板序列提交给PAPS(填充角预测服务器--阿比南当(Abhinandan KR)、马丁(Martin ACR)，抗体中vh/vl包装的分析和预测，蛋白质工程、设计与选择2010；23:689-697)，以便找到预测的最佳拟合的三级排列。PAPS服务器预测到，具有-44.5度的相对填充角的解决的抗体结构1D5B将提供VH和VL的最佳三级排列。因此，通过将VH和VL部分模型的保守锚定区段(残基41-44和101-104)的主链坐标拟合到1D5B(在PyMol中)来组装最终模型。最后，采用具有GROMOS96(Scott WRP、Hunenberger PH、Tironi IG、Mark AE、BilleterSR、Fennen J、Torda AE、Huber T、Kruger P、van Gunsteren WF.,通用分子动力学软件包生物分子模拟程序包(The gromos biomolecular simulation program package),《物理化学杂志，A辑(J Phys Chem A)》,1999；103:3596-3607)力场的GROMACS(Van Der SpoelD、Lindahl E、Hess B、Groenhof G、Mark AE、Berendsen HJC.,分子动力学软件：快速、柔性和自由,《计算化学杂志(计算化学杂志)》,2005；26:1701-1718)使此最终模型的坐标经历一轮能量最小化。

重链设计

与大多数同源的大鼠种系IGHV10-5*01的氨基酸差异

分离自大鼠5A11杂交瘤的VH的氨基酸序列(根据Kabat编号方案的CDR区以粗体表示)。

5A11大鼠重链可变(VH)区与大鼠种系免疫球蛋白VH 10-5*01(IGHV10-5*01)之间的91％一致性(总共100个氨基酸中的91个相同残基)。

人框架受体VH区的选择

通过使用IgBLAST搜索IMGT人VH基因数据库(其中大鼠VH区氨基酸序列作为输入)来实现对其中移植了5A11大鼠CDR区的人框架受体VH区的选择。基于亲本抗体与人种系的序列比对，鉴定最接近的匹配条目。将最佳人种系鉴定为受体是基于以下经过排序的标准：如由Kabat所定义的跨框架的序列一致性，以及链间界面残基和支持环与亲本CDR的标准构象的一致性和/或相容性。根据此分析，人种系IGHV3-73*01似乎是具有75％的总体一致性百分比(总共100个中的75个残基)的作为人框架受体区的最佳选择。因此，此人种系用于设计人源化形式。大鼠种系J2基因(IGHJ2*01)被鉴定为与对应的大鼠5A11 VH J基因最同源的区段基因。在FR4中，5A11 VH的序列与大鼠IGHJ2*01种系基因的序列相同。在CDR3和FR4上将大鼠J2区段基因与人J区段基因进行比较，并且选择人J区段IGHJ4(IGHJ4*01)。

使用IGHV3-73*01人种系作为框架受体区的设计

人源化形式A

将由Kabat命名法所定义的大鼠CDR(粗体)移植到IGHV3-73*01中，以获得下文详述的序列。加下划线的残基是框架大鼠残基(CDR残基外)，即来自亲本大鼠5A11 VH序列的保守残基；其已经是保守的，因为其可能在结构上对于维持抗体的全部活性是非常重要的。

形式A

人源化形式A与IGHV3-73*01人种系的85％一致性(85/100)

在框架2(FR2)中，Kabat残基H49 Ala被称为“微调(Vernier)”残基；其与VH-CDR2相邻，并且可以影响CDR构象和抗原识别的微调。在框架3(FR3)中，Kabat残基H69 Val和H78Val被称为“微调残基”。这些残基与CDR相邻，并且可以影响CDR构象和抗原识别的微调。

轻链设计

与大多数同源的大鼠种系IGLV4-S1*01的氨基酸差异

大鼠5A11 VL的氨基酸序列(突出显示的CDR区)

5A11大鼠VL与大鼠种系免疫球蛋白λ变量IGLV4-S1*01之间的97.9％(94/96)一致性(总共96个氨基酸中的94个相同残基)。

人框架受体VL区的选择

通过使用IgBLAST搜索IMGT人VL基因数据库(其中大鼠VL区氨基酸序列作为输入)来实现对其中移植了5A11 VL大鼠CDR区的人框架受体VL区的选择。基于亲本抗体与人种系的序列比对，鉴定最接近的匹配条目。将最佳人种系鉴定为受体是基于以下经过排序的标准：如由Kabat所定义的跨框架的序列一致性，以及链间界面残基和支持环与亲本CDR的标准构象的一致性和/或相容性。根据此分析，人种系IGLV3-27*01似乎是具有64.6％的总体一致性百分比(总共96个中的62个氨基酸残基)的人框架受体区的最佳选择。因此，此人种系用于设计人源化形式。

大鼠种系J1基因(IGKJ1*01)被鉴定为与对应的大鼠5A11 VL J基因最同源的基因区段。在CDR3和FR4上将大鼠J1基因区段与人J区段基因进行比较，并且发现人J区段IGKJ2(IGKJ2*01)具有最高的整体同源性。

使用IGLV3-27*01人种系作为框架受体区的设计

人源化形式

将由Kabat编号所定义的大鼠CDR移植到IGLV3-27*01中，以获得下文详述的序列。已经保留了在结构上对于维持抗体的全部活性重要的许多大鼠框架残基。这得到了与IGLV3-27*01人种系具有87.5％一致性(96个中的84个氨基酸残基)的人源化形式。

实例7穿孔素/颗粒酶分析

通过在刺激之后测量CD8⁺细胞毒性淋巴细胞的穿孔素和颗粒酶B产生来评估由抗CRTAM抗体所诱导的细胞毒性潜力。使用可商购的试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体PBMC中阴性分离人CD8 T细胞。用板结合的CD3(OKT3，0.1μg/ml)和不同剂量的5A11刺激分离的CD8细胞，持续4天。在板上刺激之后，将CD8细胞用PMA(25ng/ml)、伊屋诺霉素(10μg/ml)以及布雷菲德菌素(10μg/ml)处理持续4小时。然后将细胞洗涤，用4％PFA固定持续10分钟，并且用穿孔素和颗粒酶B抗体染色，以用于在含有0.5％皂苷的PBS中稀释持续15分钟的流式细胞术。染色之后，将细胞在含有0.5％皂苷的PBS中洗涤2次，并且在FACS缓冲液(含有2％FCS和2mM EDTA的PBS)中洗涤1次。将洗涤的细胞重悬于FACS缓冲液中，并且使用AttuneNxT(飞世尔科技公司)流式细胞仪进行分析。如图7和图8所示，用增加剂量的5A11刺激以剂量相关的方式增加CD8 T细胞的细胞毒性潜力。

实例8 T细胞细胞毒性测定

使用Her2/CD3双特异性抗体作为T细胞和MCF-7细胞的锚来评估使用抗CRTAM抗体针对MCF-7乳腺癌细胞的T细胞毒性。当将抗CRTAM抗体添加到含有肿瘤细胞、PBMC和Her2/CD3双特异性抗体的测定孔中时，观察到另外的细胞毒性。与未用抗CRTAM抗体处理的细胞相比，与抗CRTAM抗体的作用相关的细胞毒性的百分比计算为杀伤百分比。

通过以1000xg离心持续5分钟来收获新鲜分离的PBMC，并且在DMEM完全培养基中稀释到1.5E⁶细胞/毫升。将PBMC等分，并且将测试抗体(5A11抗体)添加到20μg/ml。将细胞在冰上温育10到20分钟。收集MCF-7细胞，并且稀释到1.5E⁶细胞/毫升的密度。

将50ul所得PBMC和MCF-7两者的细胞悬浮液添加到每个孔，使得每个孔含有75000个PBMC和MCF-7细胞。将Her2/CD3双特异性抗体连续稀释于完全DMEM培养基中，并且将10ul的这种稀释液添加到每个孔中，以在每个测定孔中产生5μg/ml的最终稀释液。

具有50微升/孔培养基的未经过处理的孔代表阴性对照。将测定板在37℃下与5％CO₂一起温育持续96小时。温育之后，将测定板平衡到RT，持续30分钟。将PBMC移除并弃去，在测定孔中留下MCF-7细胞。将这些板在RT下用PBS洗涤三次，并且将100ul RT PBS添加到每个孔中。将Cell Titer-

试剂(目录号G7572，普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康辛州)按照制造商的指示进行制备，并且分配100微升/孔。将试剂吸移进并吸移出测定孔若干次，以混合并诱导细胞裂解。将测定板在黑暗中温育持续15分钟。根据制造商的建议，使用

光度计(普洛麦格)记录发光。

活细胞计数与发光单元成比例，并且针对测定的孔中的每个浓度计算平均值。使用没有测试抗体的孔作为对照计算活力百分比，并且相对于抗体浓度绘图。

从图9可以看出，与没有5A11抗体的对照相比，添加抗体5A11显著增加了细胞毒性的水平。

实例9具有肿瘤浸润淋巴细胞的ELISPOT

将来自NSCLC(图10)或乳腺癌(图11)肿瘤的原发性肿瘤来源的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)用稀释到指定浓度的CR24.1、5A11或派姆单抗(pembrolizumab)和在完全RPMI培养基中稀释到1μg/ml的OKT3进行刺激，持续96小时。刺激之后，收获TIL，计数并以100 000细胞/孔铺板在IFNγELISPOT板(马布泰克(Mabtech))上。将板在37℃下温育持续24小时，并且随后根据制造商的指示进行显影。使用

系列5ELISPOT分析仪读取斑点数量，使用GraphPad Prism软件分析数据。

图10示出了抗体5A11活化了比商业抗体CR24.1或派姆珠单抗更大数量的NSCLC来源的TIL，反映了显著更高的IFNγ产生。

图11示出了抗体5A11和派姆单抗活化类似数量的乳腺癌来源的TIL，以产生IFNγ。

实例10具有肿瘤浸润淋巴细胞的剂量反应ELISPOT

将来自NSCLC肿瘤的原发性肿瘤来源的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)用5A11以0.1μg/ml、1.0μg/ml或10μg/ml、派姆单抗(10μg/ml)或以1μg/ml稀释于完全RPMI培养基中的OKT3进行刺激持续96小时。刺激之后，收获TIL，计数并以100 000细胞/孔铺板在IFNγELISPOT板(马布泰克)上。将板在37℃下温育持续24小时，并且随后根据制造商的指示进行显影。使用

系列5ELISPOT分析仪读取斑点数量；使用GraphPad Prism软件分析数据。

图12示出了所有剂量的5A11活化TIL，以产生相对于派姆单抗所产生的更高的量的IFNγ。

实例11用

试剂盒的PBMC介导的细胞毒性

如在

(普洛麦格)试剂盒中所描述的，对K562细胞进行染色。将作为靶的经过染色的K562细胞与健康供体PBMC(用IL-2预培养持续72小时)以1:20的靶与效应子比率在稀释到10μg/ml的5A11、CR24.1或派姆单抗的存在下混合。将50IU/ml的IL-2用作此测定的阳性对照。一式三份重复所有条件。将共培养在37℃下温育持续3小时。3小时之后，收集20μl的共培养上清液，并且根据制造商的指示(

普洛麦格)进行测定。使用SpectraMax M5酶标仪在320nm激发、615发射、100微秒延迟、100微秒积分下读取结果，以用于时间分辨荧光(TRF)。由制造商建议的使得能够计算特异性裂解的所有对照被包含在所述测定中，并且如试剂盒说明书中详细描述的执行计算。

图13示出了抗体5A11引起比商业抗体CR24.1或派姆单抗显著更多的细胞裂解。

实施例12 5A11抗体在HCC827人NSCLC Mixeno NCG小鼠模型中的抗肿瘤功效的体内评价

同种型对照(10mg/kg；BIW×3)和5A11抗体(10mg/kg；BIW×3)在体内模型中进行测试；每个群组含有10只小鼠。将每群组分成两半，由此5只小鼠接受从两个健康人供体之一分离和制备的PBMC的腹膜内注射。三天后，用HCC827肿瘤细胞皮下接种小鼠。一天后，按照上述给药方案，开始用测试抗体进行处理。监测体重(BW)，并且每周三次测量肿瘤。经常检查小鼠的健康和不良副作用。根据移植物抗宿主疾病的证据，将小鼠安乐死。处理结果通过肿瘤生长抑制(TGI)来确定，所以肿瘤生长抑制是治疗组中的平均肿瘤体积相对于对照组的平均肿瘤体积的差异的量度，如在指定的研究日测量的。

图14证明了，15天之后，用5A11抗体处理的小鼠中的肿瘤显著小于用同种型对照抗体处理的动物中的肿瘤。

实施例13人源化5A11抗体的结合亲和力

采用抗hIgG捕获生物传感器(CAT#18-5060)，通过(ForteBio)测定人源化5A11抗体的结合亲和力。

将抗人IgG-Fc捕获(AHC)ForteBio生物传感器以1μg/mL的浓度在300秒内负载有测试抗体。

将负载的生物传感器与5个浓度的人重组hCRTAM/Fc嵌合体一起温育，起始于200nM，将其以1:3连续稀释；参比孔仅含有动力学缓冲液(以校正漂移)。

使用每个样品的全局1:1曲线拟合，拟合来自所有浓度的数据。在可能的情况下，测定动力学缔合和解离速率以及K_D值。

此分析示出了人源化抗体5A11具有以下表2中所示的特征。

表2

样品

KD(nM)

kon(1/Ms)

Koff(1/s)

Rmax(nm)

全部X2

全部R2

5A11

0.439

2.49×105

1.10×10-4

0.27

0.06

1.00

序列表

序列表

<110> 牛津生物治疗公司

<120> 抗体和使用方法

<130> P1123PC00

<150> US62/580667

<151> 2017-11-02

<150> US62/697145

<151> 2017-07-12

<160> 18

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 1

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Ala His Tyr Val Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Val Pro Gln Gly Thr Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Val Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 2

Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Ala Ser Val Thr Leu Gly Asn

1 5 10 15

Thr Val Ser Leu Thr Cys Val Gly Asp Glu Leu Ser Lys Arg Tyr Val

20 25 30

Gln Trp Ser Gln Gln Lys Pro Asp Lys Thr Ile Val Ser Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile His Gly Thr Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Thr Tyr Ser Asp Asp Asn Leu

85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 3

<211> 411

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 3

atgttggtgc tgcagtgggt tttggtgact gctctttttc aaggtgttca ttgtgcggta 60

cagcttgttg agtctggtgg aggattggtg cagcctaagg agtcattgaa aatctcatgt 120

gcagcctctg gattcacgtt cagtgatgct gccatgtact gggtccgcca ggctccagga 180

aagggtctgg agtgggttgc gcgcatacga actaaaacta ataattatgc agcgcattat 240

gttgagtcag tgaaaggcag attcaccgtc tccagagatg attcaaaaag catggtctac 300

ctacaaatgg ataacttgaa aactgatgac acagccatgt attactgtac gtcagtcccc 360

caaggaacgc aggattactg gggccaagga gtcatggtca cagtctcctc a 411

<210> 4

<211> 381

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 4

atggcctggg tctctcttgt tctacctctg ctctctctgt atgcaggtta tgtgaccagc 60

tatgagttga tccaaccacc ttcggcatca gtcactctgg gaaatactgt ctcactcact 120

tgtgtcggag atgaattatc aaaaagatat gttcagtggt ctcaacaaaa gccagacaag 180

accattgtgt ccgtgatata caaagatagc gagcggccct caggcatctc tgaccgattc 240

tctggttcca gctccgggac aacagccact ctgacaatcc atggcaccct ggctgaggat 300

gaggctgatt attactgttt gtcaacatat agtgatgata atctccctgt gttcggtggt 360

ggaaccaagc tcactgtcct a 381

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

Asp Ala Ala Met Tyr

1 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 6

Arg Ile Arg Thr Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Ala His Tyr Val Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 7

Val Pro Gln Gly Thr Gln Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 8

Val Gly Asp Glu Leu Ser Lys Arg Tyr Val Gln

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 9

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 10

Leu Ser Thr Tyr Ser Asp Asp Asn Leu Pro Val

1 5 10

<210> 11

<211> 393

<212> PRT

<213> 人

<400> 11

Met Trp Trp Arg Val Leu Ser Leu Leu Ala Trp Phe Pro Leu Gln Glu

1 5 10 15

Ala Ser Leu Thr Asn His Thr Glu Thr Ile Thr Val Glu Glu Gly Gln

20 25 30

Thr Leu Thr Leu Lys Cys Val Thr Ser Leu Arg Lys Asn Ser Ser Leu

35 40 45

Gln Trp Leu Thr Pro Ser Gly Phe Thr Ile Phe Leu Asn Glu Tyr Pro

50 55 60

Ala Leu Lys Asn Ser Lys Tyr Gln Leu Leu His His Ser Ala Asn Gln

65 70 75 80

Leu Ser Ile Thr Val Pro Asn Val Thr Leu Gln Asp Glu Gly Val Tyr

85 90 95

Lys Cys Leu His Tyr Ser Asp Ser Val Ser Thr Lys Glu Val Lys Val

100 105 110

Ile Val Leu Ala Thr Pro Phe Lys Pro Ile Leu Glu Ala Ser Val Ile

115 120 125

Arg Lys Gln Asn Gly Glu Glu His Val Val Leu Met Cys Ser Thr Met

130 135 140

Arg Ser Lys Pro Pro Pro Gln Ile Thr Trp Leu Leu Gly Asn Ser Met

145 150 155 160

Glu Val Ser Gly Gly Thr Leu His Glu Phe Glu Thr Asp Gly Lys Lys

165 170 175

Cys Asn Thr Thr Ser Thr Leu Ile Ile His Thr Tyr Gly Lys Asn Ser

180 185 190

Thr Val Asp Cys Ile Ile Arg His Arg Gly Leu Gln Gly Arg Lys Leu

195 200 205

Val Ala Pro Phe Arg Phe Glu Asp Leu Val Thr Asp Glu Glu Thr Ala

210 215 220

Ser Asp Ala Leu Glu Arg Asn Ser Leu Ser Ser Gln Asp Pro Gln Gln

225 230 235 240

Pro Thr Ser Thr Val Ser Val Thr Glu Asp Ser Ser Thr Ser Glu Ile

245 250 255

Asp Lys Glu Glu Lys Glu Gln Thr Thr Gln Asp Pro Asp Leu Thr Thr

260 265 270

Glu Ala Asn Pro Gln Tyr Leu Gly Leu Ala Arg Lys Lys Ser Gly Ile

275 280 285

Leu Leu Leu Thr Leu Val Ser Phe Leu Ile Phe Ile Leu Phe Ile Ile

290 295 300

Val Gln Leu Phe Ile Met Lys Leu Arg Lys Ala His Val Ile Trp Lys

305 310 315 320

Lys Glu Asn Glu Val Ser Glu His Thr Leu Glu Ser Tyr Arg Ser Arg

325 330 335

Ser Asn Asn Glu Glu Thr Ser Ser Glu Glu Lys Asn Gly Gln Ser Ser

340 345 350

His Pro Met Arg Cys Met Asn Tyr Ile Thr Lys Leu Tyr Ser Glu Ala

355 360 365

Lys Thr Lys Arg Lys Glu Asn Val Gln His Ser Lys Leu Glu Glu Lys

370 375 380

His Ile Gln Val Pro Glu Ser Ile Val

385 390

<210> 12

<211> 270

<212> PRT

<213> 人

<400> 12

Ser Leu Thr Asn His Thr Glu Thr Ile Thr Val Glu Glu Gly Gln Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Lys Cys Val Thr Ser Leu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Gln

20 25 30

Trp Leu Thr Pro Ser Gly Phe Thr Ile Phe Leu Asn Glu Tyr Pro Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Ser Lys Tyr Gln Leu Leu His His Ser Ala Asn Gln Leu

50 55 60

Ser Ile Thr Val Pro Asn Val Thr Leu Gln Asp Glu Gly Val Tyr Lys

65 70 75 80

Cys Leu His Tyr Ser Asp Ser Val Ser Thr Lys Glu Val Lys Val Ile

85 90 95

Val Leu Ala Thr Pro Phe Lys Pro Ile Leu Glu Ala Ser Val Ile Arg

100 105 110

Lys Gln Asn Gly Glu Glu His Val Val Leu Met Cys Ser Thr Met Arg

115 120 125

Ser Lys Pro Pro Pro Gln Ile Thr Trp Leu Leu Gly Asn Ser Met Glu

130 135 140

Val Ser Gly Gly Thr Leu His Glu Phe Glu Thr Asp Gly Lys Lys Cys

145 150 155 160

Asn Thr Thr Ser Thr Leu Ile Ile His Thr Tyr Gly Lys Asn Ser Thr

165 170 175

Val Asp Cys Ile Ile Arg His Arg Gly Leu Gln Gly Arg Lys Leu Val

180 185 190

Ala Pro Phe Arg Phe Glu Asp Leu Val Thr Asp Glu Glu Thr Ala Ser

195 200 205

Asp Ala Leu Glu Arg Asn Ser Leu Ser Ser Gln Asp Pro Gln Gln Pro

210 215 220

Thr Ser Thr Val Ser Val Thr Glu Asp Ser Ser Thr Ser Glu Ile Asp

225 230 235 240

Lys Glu Glu Lys Glu Gln Thr Thr Gln Asp Pro Asp Leu Thr Thr Glu

245 250 255

Ala Asn Pro Gln Tyr Leu Gly Leu Ala Arg Lys Lys Ser Gly

260 265 270

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Ala His Tyr Val Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Val Pro Gln Gly Thr Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<400> 14

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ser Lys Arg Tyr Ala

20 25 30

Gln Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Ile Val Ser Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Asn Leu

85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化CDR序列

<400> 15

Ser Gly Asp Val Leu Ser Lys Arg Tyr Ala Gln

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化CDR序列

<400> 16

Leu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Asn Leu Pro Val

1 5 10

<210> 17

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Thr Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Ala His Tyr Val Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Val Pro Gln Gly Thr Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体序列

<400> 18

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Ser Lys Arg Tyr Ala

20 25 30

Gln Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Ile Val Ser Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Asn Leu

85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

Claims

1.一种与CRTAM结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括：

CDR-H1序列，所述CDR-H1序列包括SEQ ID NO:5；

CDR-H2序列，所述CDR-H2序列包括SEQ ID NO:6；以及

CDR-H3序列，所述CDR-H3序列包括SEQ ID NO:7。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由以下组成的组的至少一个CDR序列：

CDR-L1序列，所述CDR-L1序列包括选自由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15组成的组的序列；

CDR-L2序列，所述CDR-L2序列包括SEQ ID NO:9；以及

CDR-L3序列，所述CDR-L3序列包括选自由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:16组成的组的序列。

3.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包括：

CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:8的序列；

CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9的序列；以及

CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:10的序列。

4.根据权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链可变区包括：

CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:15的序列；

CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9的序列；以及

CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16的序列。

5.一种与CRTAM结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：

重链可变区，所述重链可变区包括：

CDR-H1，所述CDR-H1包括SEQ ID NO:5；

CDR-H2，所述CDR-H2包括SEQ ID NO:6；以及

CDR-H3，所述CDR-H3包括SEQ ID NO:7；以及

轻链可变区，所述轻链可变区包括：

CDR-L1，所述CDR-L1包括SEQ ID NO:15；

CDR-L2，所述CDR-L2包括SEQ ID NO:9；以及

CDR-L3，所述CDR-L3包括SEQ ID NO:16；

或其变体，其中所述变体具有i)独立地在所述CDR-H1、所述CDR-H2、所述CDR-H3、所述CDR-L1、所述CDR-L2和所述CDR-L3中的任何一个或多个中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸取代、添加和/或缺失；或ii)共同地在包括所述CDR-H1、所述CDR-H2、所述CDR-H3、所述CDR-L1、所述CDR-L2和所述CDR-L3中的一组CDR中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代、添加和/或缺失。

6.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：

i)SEQ ID NO:1的3条重链CDR和SEQ ID NO:2的3条轻链CDR，或

ii)SEQ ID NO:13的3条重链CDR和SEQ ID NO:14的3条轻链CDR；

其中所述CDR由Kabat编号系统或由Chothia编号系统定义。

7.一种抗体或其抗原结合片段，其包括：

重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:13至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，以及

轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:14至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包括

重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:13，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:14。

9.一种抗体或其抗原结合片段，其与由根据权利要求1到8中任一项所述的抗体或抗原结合片段识别的CRTAM蛋白上的表位结合，或与根据权利要求1到8中任一项所述的抗体交叉竞争结合。

10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其保留根据权利要求1到8中任一项所述的抗体或抗原结合片段对人CRTAM的结合亲和力的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。

12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合的、人源化的、双特异性的或人抗体或抗原结合片段。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是Fc沉默的工程化IgG1抗体或抗原结合片段，所述Fc沉默的工程化IgG1抗体或抗原结合片段与一种或多种Fc受体结合降低或不与所述一种或多种Fc受体结合。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够诱导和/或增强T细胞的细胞毒性。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、Fv、scFv和单结构域抗体。

16.一种多核苷酸，其对以下进行编码：

i)根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段的重链可变区；和/或

ii)根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

17.一种表达载体，其包括至少一种根据权利要求16所述的多核苷酸。

18.一种宿主细胞，其包括：

i.表达载体，所述表达载体包括根据权利要求16所述的多核苷酸；或

ii.第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包括根据权利要求16所述的对抗体或其抗原结合部分的重链可变区进行编码的多核苷酸，所述第二表达载体包括根据权利要求16所述的对抗体或其抗原结合部分的轻链可变区进行编码的多核苷酸。

19.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在其中所述抗体或所述抗原结合片段在根据权利要求18所述的宿主细胞中表达的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或抗原结合片段。

20.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。

21.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到15或20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。

22.一种根据权利要求1到15或20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物的用途，其用于制造用于治疗癌症的药物。

23.根据权利要求1到15或20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其用于治疗癌症。

24.根据权利要求21到23中任一项所述的方法或用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌(包含鳞癌和腺癌)、皮肤癌(包含黑素瘤)、乳腺癌(包含TNBC)、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肝癌(包含肝细胞癌)、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌和其它尿路上皮癌、胃癌(stomachcancer)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、睾丸癌、甲状腺癌、骨癌、胆囊癌和胆管癌、子宫癌、肾上腺癌、肉瘤、GIST、神经内分泌肿瘤和血液系统恶性肿瘤。

25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法或用途，其中所述药物组合物或药物进一步包括有效量的第二治疗剂。

26.根据权利要求1到15或20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其用于疗法或用作药物。