CN111269934B - 一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法。本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现LPR2基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦LPR2基因，从而实现基因组水平LPR2基因的沉默，提高小麦磷利用率，培育转基因小麦。

Description

一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法

技术领域

本发明涉及一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法，涉及基因编辑领域。

背景技术

磷是植物生长发育所必须的大量元素之一。它是植物的核酸、核蛋白、磷脂和三磷酸腺苷等的主要组成成分，在能量代谢、光合作用、呼吸作用、酶活性调节、氧化还原反应、信号传导和碳代谢等方面也扮演重要角色。磷素的缺乏会影响核蛋白形成,抑制细胞分裂与增殖,使蛋白质合成下降，糖的运输受阻，最终导致植物的分枝变少，茎、根纤细，植株矮小，花果容易脱落和减产等。植物的生长和产出能力显著依赖于无机磷(Pi)的有效性，然而大部分土壤中有效磷含量很低，仅有1～10μmol/L。虽然土壤中的有机磷可高达80％，却不能被植物吸收，有机磷必须转化为无机磷后才能被吸收利用(Schachtman et al.,1998；Holford,1997)。在农业生产上，常用追加磷肥的方法以确保作物的正常生长和发育，而全球的易开采磷矿石资源在本世纪却面临消失殆尽的危机(Gilbert,2009；Vance et al.,2003)。

小麦是我国重要的粮食作物，如何培育低肥高产环境友好型的小麦品种，这对小麦育种家也是一种很大的挑战。植物在长期的进化中，已经形成了应对农业自然生态系统中有效磷严重缺乏的机制。因此，在小麦中充分挖掘磷高效利用的基因对改良低磷高效和环境友好可持续增产的分子育种具有重要的指导意义。

低磷胁迫下，拟南芥的主根的生长会受到抑制，而在LPR1(Low Phosphate Root1)缺失功能的拟南芥突变体中，主根的生长正常。LPR1编码多铜氧化酶(multicopperoxidases)，通过调控SCR(Scarecrow)和SHR(Short-root)的表达水平，来控制主根的生长，在低磷胁迫下主根生长减慢而侧根数和侧根长度增强(Svistoonoff et al.,2007)。这些基因的同源基因能在水稻、玉米、小麦、刀豆和白羽扇豆中发现，说明植物中应对低磷胁迫的根构型改变可能具有相似的调控途径。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法。本发明的方法构建具有敲除LPR2基因功能的表达载体pBUE411-LPR2，通过基因转化过程降低LPR2基因的表达水平。

一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法，包括如下步骤：使小麦LPR2基因功能降低或者丧失，进而抑制小麦LPR2基因编码的蛋白的表达和/或活性，从而使小麦的磷利用率提高。

进一步的，上述方法中所述使小麦LPR2基因功能降低或者丧失的方法是构建具有敲除LPR2基因功能的pBUE411-LPR2双元载体。

上述具有敲除LPR2基因功能的pBUE411-LPR2双元载体，包括表达盒A和表达盒B；所述表达盒A自上游至下游具体依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述LPR2基因的sgRNA和终止子A；所述表达盒B自上游至下游依次具体包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B。

进一步的，所述LPR2基因的sgRNA序列如序列SEQ10所示；所述玉米Cas9编码序列如SEQ13所示；所述启动子A的序列如SEQ3所示；所述启动子B序列如SEQ4所示；所述终止子A序列如SEQ5所示；所述终止子B序列如SEQ6所示。

进一步的，所述表达盒A序列具体如SEQ7所示；所述表达盒B序列具体如SEQ8所示；所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

进一步的，所述pBUE411-LPR2双元载体还含有抗性标记基因，如bar基因；所述pBUE411-LPR2双元载体的核苷酸序列如SEQ9所示。

进一步的，上述pBUE411-LPR2双元载体的构建方法包括如下步骤：

S11设计靶向LPR2基因的sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的是LPR2-gR1-TaU3-F和LPR2-gR1-TaU3-R，即LPR2-gR1-TaU3-F序列如SEQ1所示，LPR2-gR1-TaU3-R序列如SEQ2所示；

S12将合成的sgRNA的2条oligo进行磷酸化和退火形成双链；

S13利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；

S14将回收的pBUE411载体片段和带有粘性末端的双链sgRNA进行通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-LPR2双元载体。

含有所述pBUE411-LPR2双元载体的转化体也属于本发明的保护范围。

所述pBUE411-LPR2双元载体在提高小麦磷利用率的应用。

所述pBUE411-LPR2双元载体在培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦的磷利用率提高。

本发明还保护如下DNA片段Ⅰ：

所述DNA片段Ⅰ由LPR2基因的引导sgRNA组成，其序列具体可如序列SEQ10所示。

有益效果：

本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现LPR2基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦LPR2基因。LPR2基因在小麦中位于第四号染色体的4A，4B和4D上，分别命名为TaLPR2-4A、TaLPR2-4B和TaLPR2-4D。其基因组序列在4A、4B和4D上的全长分别为1972、1957和1940个碱基，这三个部分同源基因均由3个外显子和2个内含子组成。TaLPR2-4A、TaLPR2-4B和TaLPR2-4D分别含1761、1761和1746个碱基的开放阅读框，分别编码一段含587、587和582个氨基酸残基的多肽链。根据这些基因信息，我们利用同源克隆的方法，在Fielder中克隆到TaLPR2-4A基因，并提交到NCBI中，GenBank号为MK676068。这三个部分同源基因之间编码区的相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaLPR2基因提供了理论依据。

在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平LPR2基因的沉默，是利用基因工程技术提高小麦磷利用率的有力工具。

附图说明

图1LPR2基因的编码区。

图2pBUE411载体BsaI酶切电泳图。

图3靶向LPR2基因CRISPR/Cas9重组载体pBUE411-LPR2的测序结果。

图4Bar试纸条检测转基因小麦植株。

图5野生型小麦LPR2基因的推导氨基酸序列。

图6突变型小麦LPR2基因的推导氨基酸序列。

图7野生型和突变型的LPR2基因CDS序列比对图。

图8野生型和突变型的LPR2基因的推导氨基酸序列比对图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。

T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种Jw1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

质粒pBUE411(17430bp)由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向LPR2的sgRNA的设计

在小麦品种Fielder里扩增LPR2基因的序列，扩增序列见图1所示，下划线部分的序列为靶向LPR2基因的sgRNA序列，下划线部分后三位的序列标记为PAM序列，与NCBI数据库中的小麦的该基因序列100％相似。该基因全长1761个碱基，通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在LPR2基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为CGGAGCCGACGACGTGGAAG。

2.sgRNA的退火及双链的形成

LPR2基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是LPR2-gR1-TaU3-F和LPR2-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：LPR2-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,LPR2-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4 PNKbuffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH₂O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to 25℃at5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pBUE411载体的线性化

用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h如图2所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker，电泳后回收线性载体片段，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；。

4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应

连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase1μL，ddH₂O补足10μL，25℃30min进行连接反应。

5.转化验证

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。测序结果(如图3)检测到了sgRNA的靶序列，同时在靶序列上游都检测到了TaU3启动子序列，测序结果说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaLPR2的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1 T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^TM对转基因小麦T0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图4所示，样品1-8为T0代再生苗，9为阳性对照，10为阴性对照，其中样品1,3,4，5，6,7,8出现两条带，与阳性对照9结果一致，为阳性苗；1-8分别代表LPR2-01，-02，-03，-04，-05，06，-07，-08。

3.2 T0代转基因植株DA2基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对LPR2进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。目的基因小麦LPR2基因的野生型核苷酸序列如SEQ11所示，其推导的氨基酸序列如图5所示，突变体的目的基因核苷酸序列如SEQ12所示，其推导的氨基酸序列如图6所示，经比对，LPR2-2发生在+954处的核苷酸缺失了4个碱基CCAC(下划线和箭头所指第一部分)，在突变序列的+1087处出现TGA(下划线和箭头所指第二部分)，变成了终止密码子，造成蛋白质翻译的提前终止，核苷酸序列的比对结果如图7所示，标记为加粗下划线和箭头的部分为野生型和突变体有差异的部分，氨基酸序列比对结果如图8所示，标记为下划线和箭头的部分为野生型和突变体有差异的部分。

第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-LPR2基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。

4低磷处理在基因编辑材料和对照材料中的表型鉴定

将未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6小麦种子置于培养皿中，加入适量的水，在发芽箱中催芽15～18h，待种子露白后置于自制的发苗网上生长6天，挑选整齐一致的幼苗转移至培养盒中开始营养液培养。小麦幼苗培养条件为温度(21±1)℃，湿度50％～60％，光强150～200μmol/(cm2·s)。每3天换一次营养液，连续培养18天后对苗期性状进行调查。水培采用Hoagland营养液配方，对照条件下的KH₂PO₄浓度为200μmol/L，低磷条件下KH₂PO₄浓度为5μmol/L。每个处理设6个重复，每个重复有20颗左右的小麦幼苗。

在对照试验CK中，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的平均苗长分别为41.32cm和41.54cm(表2)，在统计检验上没有显著差异；在低磷处理试验中，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的平均苗长分别为37.77cm和40.07cm(表2)，统计检验的P-value小于2.2e-16，达到了显著差异水平。

表2.低磷处理后，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的苗长。

在对照试验CK中，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的地上部鲜重平均值分别为695.63mg和696.33mg(表3)，在统计检验上没有显著差异；在低磷处理试验中，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的地上部鲜重平均值分别为561.03mg和690.77mg(表3)，统计检验的P-value小于2.2e-16，达到了显著差异水平。

表3.低磷处理后，未转基因Fielder材料和基因编辑材料TaLPR-6的地上部鲜重。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法

<130> 2019

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc tttcgttcgt 7500

atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc gcacacacca 7560

gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg taccatttgt 7620

tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt gaaatggaaa 7680

tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa ttaatattat 7740

ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata tgcaaacatt 7800

ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta atatgaggag 7860

taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat attttcagac 7920

ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt agacatttat 7980

gaactttcct ttatgtaatt ttccagaatc cttgtcagat tctaatcatt gctttataat 8040

tatagttata ctcatggatt tgtagttgag tatgaaaata ttttttaatg cattttatga 8100

cttgccaatt gattgacaac gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 8160

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 8220

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 8280

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 8340

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agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg 8460

taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga 8520

cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg 8580

ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg 8640

tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg 8700

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gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc 8820

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atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 8940

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 9000

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 9060

cttcgcaaga ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa 9120

tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctcgagtcta ccatgagccc agaacgacgc 9180

ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac 9240

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tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc 9540

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aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 9960

aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga 10020

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ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc 10260

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ggtatcttta aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat 10440

caccggaatt gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt 10500

ctcctgctaa ggtatataag ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg 10560

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tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac 10860

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tagaatgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 11280

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 11340

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tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 11460

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taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 11580

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gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 12720

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa cagacctttt cgaccttttt 12780

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ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 12960

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cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 13140

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ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 13260

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caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 13440

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agtgccattg cagggccggc agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc 13980

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tcagcttggt gtgatcctcc gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt 14220

ctgccaggct ggccaacgtt gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta 14280

gcgtgtttgt gcttttgctc attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt 14340

aatttcagcg gccagcgcct ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag 14400

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gataaccttc atgcgttccc cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca 15000

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cctcggtcaa tgcgtcctca cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt 15360

cctcgctgcg ctcaagtgcg cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg 15420

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ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta a 16231

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggagccgac gacgtggaag 20

<210> 11

<211> 1761

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgccggacg gaatgctcgg caaggcggcg ctcgccgtcc ttctcgtgct cgccggcctt 60

gcggccggga ccaggccgcc cccgccgccg gtgtcggagg acacgctgga gaaggtcgcc 120

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ctcgtgctcg ccgaccgcag cttctatgcc aacggctccc tctacatgaa ctccaccggc 780

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tacatcgtga tgtacgagta cgacgacggc gcgacgggcg gcccgacgca cctgtacatc 1320

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caggcggtgc gcgcccgggg gctggtcggg cttgacgagt tcaggcgctg catggccagg 1500

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ccggagcacg agaggacgtg gaagaacgtg gggaagatgg cgccggggca cgtgacgacg 1620

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgccggacg gaatgctcgg caaggcggcg ctcgccgtcc ttctcgtgct cgccggcctt 60

gcggccggga ccaggccgcc cccgccgccg gtgtcggagg acacgctgga gaaggtcgcc 120

ggctcgctgg aaatgtacgt cgacaggctc ccccagatgc ccaaggtacg cggctactcc 180

gtggaacgcg gccgcgccac gccggtgcac ctcgccgtcg ggatgtacca aaagaaatgg 240

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gagaaccacc tgccggagaa ccacatcctt ccgtgggacc ccaccgtgcc cgtcgccatc 420

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acgacgcggc caggtgcaac gtgagccagc acgccgctgg ggacgcggtg ggcgtgccgg 1560

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggacaaga agtactcgat cggcctcgat attgggacta actctgttgg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gccctcaaag aagttcaagg tcctgggcaa caccgatcgg 120

cattccatca agaagaatct cattggcgct ctcctgttcg acagcggcga gacggctgag 180

gctacgcggc tcaagcgcac cgcccgcagg cggtacacgc gcaggaagaa tcgcatctgc 240

tacctgcagg agattttctc caacgagatg gcgaaggttg acgattcttt cttccacagg 300

ctggaggagt cattcctcgt ggaggaggat aagaagcacg agcggcatcc aatcttcggc 360

aacattgtcg acgaggttgc ctaccacgag aagtacccta cgatctacca tctgcggaag 420

aagctcgtgg actccacaga taaggcggac ctccgcctga tctacctcgc tctggcccac 480

atgattaagt tcaggggcca tttcctgatc gagggggatc tcaacccgga caatagcgat 540

gttgacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acgtacaacc agctcttcga ggagaacccc 600

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ctcctgtctg atattctcag ggtgaacacc gagattacga aggctccgct ctcagcctcc 960

atgatcaagc gctacgacga gcaccatcag gatctgaccc tcctgaaggc gctggtcagg 1020

cagcagctcc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgatc agtcgaagaa cggctacgct 1080

gggtacattg acggcggggc ctctcaggag gagttctaca agttcatcaa gccgattctg 1140

gagaagatgg acggcacgga ggagctgctg gtgaagctca atcgcgagga cctcctgagg 1200

aagcagcgga cattcgataa cggcagcatc ccacaccaga ttcatctcgg ggagctgcac 1260

gctatcctga ggaggcagga ggacttctac cctttcctca aggataaccg cgagaagatc 1320

gagaagattc tgactttcag gatcccgtac tacgtcggcc cactcgctag gggcaactcc 1380

cgcttcgctt ggatgacccg caagtcagag gagacgatca cgccgtggaa cttcgaggag 1440

gtggtcgaca agggcgctag cgctcagtcg ttcatcgaga ggatgacgaa tttcgacaag 1500

aacctgccaa atgagaaggt gctccctaag cactcgctcc tgtacgagta cttcacagtc 1560

tacaacgagc tgactaaggt gaagtatgtg accgagggca tgaggaagcc ggctttcctg 1620

tctggggagc agaagaaggc catcgtggac ctcctgttca agaccaaccg gaaggtcacg 1680

gttaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aagattgagt gcttcgattc ggtcgagatc 1740

tctggcgttg aggaccgctt caacgcctcc ctggggacct accacgatct cctgaagatc 1800

attaaggata aggacttcct ggacaacgag gagaatgagg atatcctcga ggacattgtg 1860

ctgacactca ctctgttcga ggaccgggag atgatcgagg agcgcctgaa gacttacgcc 1920

catctcttcg atgacaaggt catgaagcag ctcaagagga ggaggtacac cggctggggg 1980

aggctgagca ggaagctcat caacggcatt cgggacaagc agtccgggaa gacgatcctc 2040

gacttcctga agagcgatgg cttcgcgaac cgcaatttca tgcagctgat tcacgatgac 2100

agcctcacat tcaaggagga tatccagaag gctcaggtga gcggccaggg ggactcgctg 2160

cacgagcata tcgcgaacct cgctggctcg ccagctatca agaaggggat tctgcagacc 2220

gtgaaggttg tggacgagct ggtgaaggtc atgggcaggc acaagcctga gaacatcgtc 2280

attgagatgg cccgggagaa tcagaccacg cagaagggcc agaagaactc acgcgagagg 2340

atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctggggtccc agatcctcaa ggagcacccg 2400

gtggagaaca cgcagctgca gaatgagaag ctctacctgt actacctcca gaatggccgc 2460

gatatgtatg tggaccagga gctggatatt aacaggctca gcgattacga cgtcgatcat 2520

atcgttccac agtcattcct gaaggatgac tccattgaca acaaggtcct caccaggtcg 2580

gacaagaacc ggggcaagtc tgataatgtt ccttcagagg aggtcgttaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctcct gaatgccaag ctgatcacgc agcggaagtt cgataacctc 2700

acaaaggctg agaggggcgg gctctctgag ctggacaagg cgggcttcat caagaggcag 2760

ctggtcgaga cacggcagat cactaagcac gttgcgcaga ttctcgactc acggatgaac 2820

actaagtacg atgagaatga caagctgatc cgcgaggtga aggtcatcac cctgaagtca 2880

aagctcgtct ccgacttcag gaaggatttc cagttctaca aggttcggga gatcaacaat 2940

taccaccatg cccatgacgc gtacctgaac gcggtggtcg gcacagctct gatcaagaag 3000

tacccaaagc tcgagagcga gttcgtgtac ggggactaca aggtttacga tgtgaggaag 3060

atgatcgcca agtcggagca ggagattggc aaggctaccg ccaagtactt cttctactct 3120

aacattatga atttcttcaa gacagagatc actctggcca atggcgagat ccggaagcgc 3180

cccctcatcg agacgaacgg cgagacgggg gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240

gcgaccgtca ggaaggttct ctccatgcca caagtgaata tcgtcaagaa gacagaggtc 3300

cagactggcg ggttctctaa ggagtcaatt ctgcctaagc ggaacagcga caagctcatc 3360

gcccgcaaga aggactggga tccgaagaag tacggcgggt tcgacagccc cactgtggcc 3420

tactcggtcc tggttgtggc gaaggttgag aagggcaagt ccaagaagct caagagcgtg 3480

aaggagctgc tggggatcac gattatggag cgctccagct tcgagaagaa cccgatcgat 3540

ttcctggagg cgaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa gctccccaag 3600

tactcactct tcgagctgga gaacggcagg aagcggatgc tggcttccgc tggcgagctg 3660

cagaagggga acgagctggc tctgccgtcc aagtatgtga acttcctcta cctggcctcc 3720

cactacgaga agctcaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtcgag 3780

cagcacaagc attacctcga cgagatcatt gagcagattt ccgagttctc caagcgcgtg 3840

atcctggccg acgcgaatct ggataaggtc ctctccgcgt acaacaagca ccgcgacaag 3900

ccaatcaggg agcaggctga gaatatcatt catctcttca ccctgacgaa cctcggcgcc 3960

cctgctgctt tcaagtactt cgacacaact atcgatcgca agaggtacac aagcactaag 4020

gaggtcctgg acgcgaccct catccaccag tcgattaccg gcctctacga gacgcgcatc 4080

gacctgtctc agctcggggg cgactga 4107

Claims (7)

1.一种具有敲除小麦LPR2基因功能的pBUE411-LPR2双元载体，其特征在于，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A自上游至下游具体依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述LPR2基因的sgRNA和终止子A；所述启动子A的序列如SEQ ID NO：3所示；所述LPR2基因的sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO：10所示；

所述表达盒B自上游至下游依次具体包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B，所述启动子B序列如SEQ ID NO：4所示；所述玉米Cas9编码序列如SEQID NO：13所示；所述终止子A序列如SEQ ID NO：5所示；所述终止子B序列如SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的pBUE411-LPR2双元载体，其特征在于，所述表达盒A序列具体如SEQ ID NO：7所示；

所述表达盒B序列具体如SEQ ID NO：8所示；

所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

3.如权利要求2所述的pBUE411-LPR2双元载体，其特征在于，还含有抗性标记基因；所述pBUE411-LPR2双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

4.如权利要求1所述的pBUE411-LPR2双元载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S11设计靶向LPR2基因的sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的引物是如SEQ ID NO：1所示LPR2-gR1-TaU3-F和如SEQ ID NO：2所示LPR2-gR1-TaU3-R；

S12将合成的sgRNA的2条oligo进行磷酸化和退火形成双链；

S13利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；

S14将回收的pBUE411载体片段和带有粘性末端的双链sgRNA进行通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-LPR2双元载体。

5.如权利要求1-4任一项所述的pBUE411-LPR2双元载体在提高小麦磷利用率的应用。

6.如权利要求1-4所述的pBUE411-LPR2双元载体在培育转基因小麦中的应用。

7.一种利用基因编辑提高小麦磷利用率的方法，其特征在于，包括如下步骤：使小麦LPR2基因功能降低或者丧失，进而抑制小麦LPR2基因编码的蛋白的表达和/或活性，从而使小麦的磷利用率提高；

所述使小麦LPR2基因功能降低或者丧失的方法是构建如权利要求1-5任一项所述的pBUE411-LPR2双元载体。

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