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CN111249524B - 用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法 - Google Patents

用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法，以明胶为致孔剂，以复乳‑溶剂挥发法为基础，制备得到聚己内酯多孔微球；所述高孔隙率聚己内酯多孔微球的表面及内部的孔隙相互连通，微球的孔隙率为75.28‑90.73％，所述孔隙的孔径为43‑217μm。该聚己内酯多孔微球支架具有高孔隙率，使其可以提供更多的空间让骨组织生长，同时也减少了聚己内酯材料占据的空间，弥补了聚己内酯降解缓慢的缺点，并且该多孔微球有着较大的孔径，适合于细胞的长入及骨组织的再生。

Description

用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备 方法
技术领域
本发明涉及组织工程材料领域，具体而言涉及一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法。
背景技术
在骨组织工程中，支架处于关键的地位，理想的支架必须具备的特征有：在宏观结构上要能与缺损的形态相适应；生物相容性好，无毒性，细胞可以在其表面黏附生长；生物可降解，降解产物无毒副作用；多孔性，使细胞有更多空间进行黏附生长，有利于骨组织的长入。交互联通的多孔结构还有其他很多优点，比如：增加了比表面积，利于蛋白质吸附，并且有利于代谢废物的清除、营养物质的转运，生物因子的传递。
聚己内酯(PCL)是一种人工高分子合成材料，具有良好的生物相容性、降解性，对人体无毒副作用，已经被FDA批准用于临床。但是由于聚己内酯具有结晶性较强、在体内降解速率过慢等缺点，使得该材料在生物医学领域的应用范围受到限制。
目前的文献中，所制备的聚己内酯多孔微球孔隙率和孔径都较低，不能满足理想支架的需求。Qingchun Zhang(Qingchun Zhang.Materials Science and Engineering C,32(2012)2589-2595)等通过乳液/溶剂蒸发和粒子浸出法制备的多孔PCL微球，该微球的孔径为20-80μm，孔隙率为30-70％，其孔径和孔隙率都比较低。Seng Yeol Kim(Seng YeolKim.Journal of Colloid and Interface Science,465(2016)18-25)等以室温离子液体和莰烯分别为液态模具和致孔剂制备的多孔PCL微球，该微球的孔径最高只能达到100μm。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架及其制备方法，制备的聚己内酯多孔微球支架具有高孔隙率，使其可以提供更多的空间让骨组织生长，同时也减少了聚己内酯材料占据的空间，弥补了聚己内酯降解缓慢的缺点，并且该多孔微球有着较大的孔径，适合于细胞的长入及骨组织的再生。
本发明的另一目的为提供上述骨组织工程支架的制备方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架，所述高孔隙率聚己内酯多孔微球为表面及内部的孔隙相互连通的球型颗粒，所述多孔微球的孔隙率为75.28-90.73％，所述多孔微球的孔径为43-217μm；
其中，大于100μm的孔径分布高达94％。
进一步地，所述多孔微球的粒径为250-1000μm。
进一步地，所述聚己内酯的相对分子质量为6-10万。
一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶于不溶于水的有机溶剂中，配成油相，油相中聚己内酯的浓度为0.05g/mL；将明胶加入双蒸水溶解，分装并冷藏凝固，使用时，将分装冷藏的明胶进行水浴融化，作为内水相；
(2)取一定量的步骤(1)所得的内水相加入油相中，进行第一次乳化，使用匀浆仪搅拌，搅拌的转速为8000-12000r/min，乳化成初乳，再将初乳加入外水相，进行第二次乳化，使用搅拌机搅拌，搅拌的转速为600-800r/min，乳化形成复乳；
(3)将步骤(2)所得的复乳加入聚乙烯醇溶液中搅拌，得聚己内酯/明胶微球；
(4)将步骤(3)制得的微球加入双蒸水中搅拌，重复两次后，进行筛取，即得所需的聚己内酯多孔微球支架；
其中，所述油相、内水相、外水相和聚乙烯醇溶液的体积比为10mL：4-5mL:50mL:400mL。
进一步地，步骤(1)中所述的油相为聚己内酯的二氯甲烷溶液。
进一步地，步骤(1)中所述的双蒸水的温度为50℃，冷藏温度为4℃，内水相为8wt％的明胶水溶液，水浴温度为37℃。
进一步地，步骤(2)中所述内水相的量为4-5mL，所述外水相为1wt％的聚乙烯醇水溶液，温度为4℃，所述第一次乳化搅拌的时间为40s，所述第二次乳化搅拌的时间为60s。
进一步地，步骤(3)中所述的聚乙烯醇溶液的浓度为0.1wt％，温度为4℃。
进一步地，步骤(3)中所述的复乳加入聚乙烯醇溶液后的搅拌时间为8h，转速为250r/min。
进一步地，步骤(4)中所述的双蒸水的温度为50℃，搅拌转速为250r/min；所述筛取使用的标准筛孔径为250及1000μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过复乳-溶剂挥发法，在特定的浓度、转速和比例的协同作用下制备的聚己内酯多孔微球在具有高的孔隙率同时还具有较大的孔径尺寸，并且该微球的孔隙相互连通，以利于细胞和组织的生长、氧气和营养的传输、代谢产物的排出。
本发明的聚己内酯多孔微球所为颗粒样，可以满足临床上不规则形态骨腔的充填需求。
本发明的聚己内酯多孔微球中的多孔结构，使微球具有较大的比表面积，同时孔隙之间相互连通，有利用细胞向微球内部生长。
本发明的聚己内酯多孔微球具有较高的孔隙率，孔隙率可高达91％，高的孔隙率意味着可以提供更多的空间让骨组织长入，另一方面，高的孔隙率也意味着聚己内酯原料使用量少，在于一定程度上弥补了聚己内酯降解缓慢的问题。
本发明的聚己内酯多孔微球的孔径可达40-220μm，且大于100μm的孔径分布高达94％，为细胞及骨组织生长的提供有利的条件，有利于细胞及骨组织的长入。
附图说明
图1是本发明的聚己内酯多孔微球场发射扫描电镜图片。
图2是本发明的聚己内酯多孔微球接种骨髓间充质干细胞一周后，荧光染色后显微镜下图片。
图3本发明的聚己内酯多孔微球接种骨髓间充质干细胞一周后，场发射扫描电镜图片。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
以下实施例中使用的聚己内酯购于济南岱罡生物工程有限公司，相对分子质量为6-10万。
【制备】
以下实施例的制备方法均采用同一方法制备，即：
(1)将聚己内酯溶于二氯甲烷中，配成浓度为0.05g/mL的聚己内酯溶液，取10mL作为油相；将4g明胶溶于50mL 50℃双蒸水，分装并于4℃冷藏凝固，使用时，将分装冷藏的明胶放入37℃水浴融化，取一定量作为内水相；
(2)把步骤(1)所得的内水相加入油相中，用匀浆机以一定的转速进行第一次乳化搅拌，搅拌时间持续40s，乳化成初乳，将初乳加入50mL 4℃ 1wt％的聚乙烯醇溶液中，使用搅拌机以一定的转速第二次乳化搅拌，搅拌时间持续60s，乳化形成复乳；
(3)将步骤(2)所得的复乳加入400mL 4℃ 0.1wt％的聚乙烯醇溶液中，搅拌8h，转速为250r/min，静置后弃上清液，留微球沉淀，即得聚己内酯/明胶微球；
(4)将步骤(3)制得的微球加入50℃双蒸水，以250r/min转速搅拌至水温降至室温，重复两次后，以孔径为1000μm、250μm的筛子进行筛取，冷冻干燥得到所需的聚己内酯多孔微球支架。
实施例1-实施例10在制备过程中的变量如表1所示：
表1
Figure GDA0002750772600000041
【表征】
如图1是制备的聚己内酯多孔微球的场发射扫描电镜照片，可以发现微球含有疏松的多孔结构，并且孔隙相互连通。
使用压泵仪测实施例1-实施例10制备得到的聚己内酯多孔微球的孔隙率，使用显微镜拍照检测聚己内酯多孔微球的孔径，其结果如表2所示：
表2
Figure GDA0002750772600000042
Figure GDA0002750772600000051
从表2可以看出，通过特定的浓度、转速和比例的协同作用下制备的聚己内酯多孔微球在具有高的孔隙率同时还具有较大的孔径尺寸，孔隙率最高可达90.73％，孔径尺寸可高达217μm，且大于100μm的孔径分布高达94％，为细胞及骨组织生长的提供有利的条件。
【应用测试】
1、细胞粘附生长测试
将实施例3制备的聚己内酯多孔微球浸泡于75％乙醇过夜，次日以无菌PBS充分清洗。将无菌的聚己内酯多孔微球移至24孔细胞培养板中，每孔接种骨髓间充质干细胞2×104个。培养1周后，以4％多聚甲醛固定30min，0.25％Triton X-100室温孵育15min，避光条件下以鬼笔环肽37℃染色30min，DAPI染色30s，PBS冲洗后于倒置的荧光显微镜下拍照观察。
如图2是骨髓间充质干细胞接种于聚己内酯多孔微球一周后的荧光染色图片，发现细胞可以在聚己内酯多孔微球表面黏附生长，说明该聚己内酯多孔微球有着良好的细胞学特性。
2、细胞长入孔内测试
将实施例3制备的聚己内酯多孔微球浸泡于75％乙醇过夜，次日以无菌PBS充分清洗。将无菌的聚己内酯多孔微球移至24孔细胞培养板中，每孔接种骨髓间充质干细胞2×104个。培养1周后，以2.5％戊二醛固定30min，以30％、50％、70％、90％的乙醇梯度脱水，再以无水乙醇脱水三遍，干燥，喷金，场发射扫描电镜下拍照观察。
如图3是骨髓间充质干细胞接种于聚己内酯多孔微球一周后的场发射扫描电镜图片，发现细胞可以长入微球的孔隙之中(白色箭头所指)，说明该聚己内酯多孔微球的孔隙可以容纳细胞的生长。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (10)

1.一种用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架，其特征在于：所述高孔隙率聚己内酯多孔微球为表面及内部的孔隙相互连通的球型颗粒，所述多孔微球的孔隙率为75.28-90.73％，所述多孔微球的孔径为43-217μm；
其中，大于100μm的孔径分布高达94％。
2.根据权利要求1所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架，其特征在于：所述多孔微球的粒径为250-1000μm。
3.根据权利要求1所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架，其特征在于：所述聚己内酯的相对分子质量为6-10万。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶于不溶于水的有机溶剂中，配成油相，油相中聚己内酯的浓度为0.05g/mL；将明胶加入双蒸水溶解，分装并冷藏凝固，使用时，将分装冷藏的明胶进行水浴融化，作为内水相；
(2)取一定量的步骤(1)所得的内水相加入油相中，进行第一次乳化，使用匀浆仪搅拌，搅拌的转速为8000-12000r/min，乳化成初乳，再将初乳加入外水相，进行第二次乳化，使用搅拌机搅拌，搅拌的转速为600-800r/min，乳化形成复乳；
(3)将步骤(2)所得的复乳加入聚乙烯醇溶液中搅拌，得聚己内酯/明胶微球；
(4)将步骤(3)制得的微球加入双蒸水中搅拌，重复两次后，进行筛取，即得所需的聚己内酯多孔微球支架；
其中，所述油相、内水相、外水相和聚乙烯醇溶液的体积比为10mL：4-5mL:50mL:400mL。
5.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的油相为聚己内酯的二氯甲烷溶液。
6.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的双蒸水的温度为50℃，冷藏温度为4℃，内水相为8wt％的明胶水溶液，水浴温度为37℃。
7.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述内水相的量为4-5mL，所述外水相为1wt％的聚乙烯醇水溶液，温度为4℃，所述第一次乳化搅拌的时间为40s，所述第二次乳化搅拌的时间为60s。
8.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的聚乙烯醇溶液的浓度为0.1wt％，温度为4℃。
9.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的复乳加入聚乙烯醇溶液后的搅拌时间为8h，转速为250r/min。
10.根据权利要求4所述的用于骨组织再生的高孔隙率聚己内酯多孔微球支架的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的双蒸水的温度为50℃，搅拌转速为250r/min；所述筛取使用的标准筛孔径为250及1000μm。
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