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CN111247246A - β-内酰胺酶变体 - Google Patents

β-内酰胺酶变体 Download PDF

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CN111247246A
CN111247246A CN201880068725.0A CN201880068725A CN111247246A CN 111247246 A CN111247246 A CN 111247246A CN 201880068725 A CN201880068725 A CN 201880068725A CN 111247246 A CN111247246 A CN 111247246A
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让·德冈兹伯格
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Bioaster
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Da Volterra SAS
Bioaster
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Abstract

本发明涉及具有β‑内酰胺酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的核酸序列。本发明的分离的多肽是具有改进的性能例如改进的蛋白酶稳定性、在肠道介质中的稳定性、改进的针对一种或多种抗生素的活性、改进的比活性和/或改进的在宿主细胞中的生产的VIM‑2变体。

Description

β-内酰胺酶变体
技术领域
本发明涉及具有β-内酰胺酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的核酸序列。本发明的分离的多肽是属于VIM型亚群的B1亚类金属β-内酰胺酶，其具有改进的性能例如改进的蛋白酶稳定性、改进的内在稳定性例如热稳定性、改进的针对一种或多种β-内酰胺化合物例如β-内酰胺抗生素的活性和/或改进的在宿主细胞中的生产。
背景技术
许多抗细菌产品、特别是抗生素，可用于治疗细菌感染。然而，抗生素不仅攻击感染部位处的病原体，而且影响可能存在于健康对象中、特别是肠道中的正常细菌菌群。抗生素对由来自于500多个物种的超过10万亿个细菌构成的结肠共生菌群(也被称为结肠微生物菌群)的改变可以导致不利的副作用，例如耐药细菌的选择和耐药细菌的潜在定殖、正常消化过程的破坏、肠道被机会性肠道病原体例如艰难梭菌(Clostridium difficile)定殖和感染、与抗生素相关的腹泻或与肠道生态失调相关的其他疾病例如免疫力的改变、代谢紊乱或过敏。这些副作用可以通过在肠道中、尤其是在回肠末段和结肠中施用能够降解残留的活性抗生素的酶来降低。这种方法被具体描述在WO2004/016248或US20050249716中。
然而，酶是脆弱的大分子，其完整性和催化活性对大量物理化学因素例如引起它们降解的蛋白酶的存在、温度、离子强度、金属辅因子的可利用性或螯合剂的存在敏感。此外，为了提高它们的效率和/或减少在需要的患者中获得残留的活性抗生素的高效降解所必需使用的量，具有改进的比活性的酶将是有利的。最后，获得这些降解抗生素的酶的改进的生产得率，将是有利的。
发明内容
本发明提供了VIM-2金属β-内酰胺酶的新变体。具体来说，本发明涉及一种具有β-内酰胺酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列(其是不含天然信号肽的野生型VIM-2的序列)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。本发明的多肽与野生型VIM-2酶相比具有一种或多种下述性能：(i)改进的蛋白酶抗性，特别是消化蛋白酶抗性；(ii)改进的稳定性，特别是热稳定性和/或在肠道介质中的稳定性；(iii)对β-内酰胺的改进的作用谱(即所述变体能够水解更大量的β-内酰胺化合物，特别是β-内酰胺抗生素)；(iv)对一种或多种β-内酰胺化合物(例如对一种或多种β-内酰胺抗生素)的改进的酶活性，特别是转变成抗生素失活时间的减少；和(v)改进的生产得率。更具体来说，本发明的多肽是相对于SEQ ID NO：1的VIM-2β-内酰胺酶的序列包含至少一个在第10位中的替换的VIM-2变体。在另一个实施方式中，本发明的多肽是在第10位中和选自第22、34和130位中的至少一个位置中包含替换的VIM-2变体，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的VIM-2β-内酰胺酶的氨基酸位置。
在本发明的特定实施方式中，所述多肽在第10和22位处，在第10和34位处，在第10和130位处，在第10、22和34位处，在第10、22和130位处，在第10、34和130位处，或在第10、22、34和130位处包含替换。
在本文中还公开了在选自第10、22、34和130位的至少一个位置中包含替换的VIM-2变体，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的VIM-2β-内酰胺酶的氨基酸位置。
在本发明的特定实施方式中，在第10位处的替换是V10A。在另一个实施方式中，在第22位处的替换是Q22H或Q22N。在另一个实施方式中，在第34位处的替换是Q34R。在另一个实施方式中，在第130位处的替换是E130D。
产生本发明的VIM-2变体的细菌在至少一种β-内酰胺抗生素例如但不限于氨苄青霉素、哌拉西林、替卡西林、替莫西林、头孢菌素、头孢西丁、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、头孢洛林、头孢替坦、亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最低抑制浓度(MIC)方面，与产生SEQ ID NO：1的野生型VIM-2的相同细菌的MIC相比可以表现出改进的性能，所述MIC可以使用标准的体外敏感性测试方法，例如微量肉汤稀释法(临床实验室标准研究所(Clinical Laboratory Standard Institute)文件M07-A10：用于需氧生长细菌的抗微生物剂敏感性测试的稀释方法，批准的标准(Methods for Dilution AntimicrobialSusceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard)第10版)来确定。在本发明的情形中，表述“在最低抑制浓度(MIC)方面改进的性能”是指产生VIM-2变体的细菌与产生野生型VIM-2的相同细菌相比MIC提高，例如MIC提高2倍或更多倍。
本发明的VIM-2变体与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2相比在对蛋白酶、特别是消化蛋白酶的抗性方面也可以表现出改进的性能，所述抗性可以通过在与纯化的蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等或与来自于仔猪、猪、其他哺乳动物(例如人肠道介质)或其他动物的肠道介质温育后监测酶活性(利用如下文中所述的体外酶测定法)和/或完整性(例如利用质谱分析)来确定。
本发明的VIM-2变体与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2相比在稳定性(特别是热稳定性)方面也可以表现出改进的性能，所述稳定性可以通过在将蛋白质样品(包括粗提液)在45至75℃范围内的温度下温育最长2小时、特别是在65℃下温育45min后监测酶的残留活性来确定。或者，所述温度诱导的变性可以使用圆二色性测量来跟踪。该实验产生实验性熔解温度(Tm)，其对于显示出改进的构象稳定性的酶来说更高。
本发明的VIM-2变体与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2相比在肠道介质特别是空肠、回肠和盲肠介质中的稳定性方面也可以表现出改进的性能，所述稳定性可以通过在将蛋白质样品(包括纯化的酶)在肠道介质例如回肠介质中温育不同时长后监测酶的残留活性来确定。
本发明的VIM-2变体与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2显示出的活性相比在对一种或多种β-内酰胺底物(例如特定的β-内酰胺抗生素)的催化活性方面也可以表现出改进的性能，所述活性可以通过体外酶测定法来确定，其中在含有野生型VIM-2或VIM-2变体的蛋白质样品存在下通过分光光度法监测β-内酰胺底物浓度的时间依赖性变化(水解速率)。
本发明的VIM-2变体与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2显示出的活性相比在催化参数例如kcat和Km值方面也可以表现出改进的性能。
本发明的VIM-2变体在其在重组细菌或其他适合的宿主中的生产水平与SEQ IDNO：1的野生型VIM-2的生产水平相比的提高方面，也可以表现出改进的性能，所述生产水平可以通过体外酶测定法，例如使用从产生野生型VIM-2或其变体的细菌培养物获得的提取物如上所述进行的测定法来确定。在特定实施方式中，所述提取物作为细胞或细菌裂解后的粗提液或在细胞(原核或真核细胞)培养基中(在分泌酶的情况下)获得。所有这些方法也可以在纯化的酶上执行。
在特定实施方式中，本发明的多肽选自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：23。
VIM-2 V10A(SEQ ID NO：3)
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在特定实施方式中，本发明的多肽是SEQ ID NO：3至13中任一者的VIM-2β-内酰胺酶的功能性变体，其包含V1M替换。因此，本发明还涉及一种多肽，其包含SEQ ID NO：14-23中示出的氨基酸序列或由SEQ ID NO：14-23中示出的氨基酸序列构成。
VIM-2 V10A V1M Q34R Q22H(SEQ ID NO：14)
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VIM-2 V10A V1M Q34R E130D DCT236(SEQ ID NO：21)
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VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22N DCT236(SEQ ID NO：22)MDSSGEYPTASEIPVGEVRLYNIADGVWSHIATRSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPSTRRLAEVEGNEIPTHSLDGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVKAHTN
VIM-2 V10A V1M Q34R E130D Q22H DCT236(SEQ ID NO：23)MDSSGEYPTASEIPVGEVRLYHIADGVWSHIATRSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPSTRRLAEVEGNEIPTHSLDGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVKAHTN
本发明还涉及编码本发明的VIM-2多肽变体的核酸序列、包含所述核酸序列的核酸构建物、包含本发明的核酸序列或核酸构建物的重组病毒或宿主细胞(原核和真核细胞)及其生产方法。
本发明还涉及包含本发明的多肽变体的组合物。在特定实施方式中，所述组合物可口服给药，并且能够在需要的对象的肠道的所需部分中释放出所述多肽。优选地，所述所需部分是空肠、回肠、盲肠或结肠。
在另一个实施方式中，本发明涉及产生所述多肽的重组原核或真核宿主细胞或生物体，其可以被给药到对象并在所述需要的对象的肠道的所需部分中释放出所述多肽。优选地，所述多肽被释放到回肠、盲肠或结肠，优选盲肠或结肠中。
本发明的另一方面是一种试剂盒，其用于本发明的多肽和对所述试剂盒的所述多肽敏感的β-内酰胺化合物例如β-内酰胺抗生素的分开、顺序或同时给药。在特定实施方式中，所述多肽和抗生素两者可口服给药。在另一个实施方式中，所述多肽和抗生素通过不同途径给药，例如所述多肽可口服给药，并且所述抗生素可肠胃外给药，例如通过注射如静脉内、动脉内、肌肉内、皮下或腹膜内注射。在特定实施方式中，所述多肽在所述抗生素之前或之后，特别是之前给药。
本发明还涉及使用本发明的多肽的治疗方法。因此，本发明提供了用作药物的本发明的多肽，其是VIM-2变体。更具体来说，本发明提供了所述多肽或组合物或含有它们的试剂盒用于在需要的对象中使β-内酰胺抗生素失活的方法中的用途。本发明还涉及本发明的多肽、组合物或试剂盒用于由对β-内酰胺抗生素敏感的细菌引起的细菌感染的治疗方法中的用途。更具体来说，所述细菌感染通过使用本发明的多肽与对所述多肽敏感的β-内酰胺抗生素的组合来治疗，从而借助于所述β-内酰胺抗生素治疗所述感染，而任何不想要的残留的活性抗生素借助于本发明的多肽从肠道，并且在特定实施方式中特别是从空肠、回肠、盲肠和结肠消除。在这个特定实施方式中，所述多肽优选被配制在组合物中，所述组合物能够在需要这种细菌感染治疗的对象的肠道的所需部分中释放出所述多肽，其中所述肠道的所需部分优选为空肠、回肠、盲肠或结肠，最优选为回肠、盲肠或结肠。所述多肽可以由重组宿主细胞(原核或真核的)或生物体生产，所述重组宿主细胞(原核或真核的)或生物体可以口服给药到需要这种细菌感染治疗的对象，并在肠道的所需部分中，特别是在回肠、盲肠或结肠中释放出所述多肽。
发明详述
本发明提供了VIM-2金属β-内酰胺酶的新变体。因此，本发明的多肽的序列与SEQID NO：1中示出的VIM-2的序列不一致，其中它与SEQ ID NO：1的VIM-2相比相差至少一个氨基酸修饰。
SEQ ID NO：1中示出的序列是野生型VIM-2的氨基酸序列，其已经历N-端信号肽切割(即不含信号肽的野生型VIM-2的序列)。
SEQ ID NO：1：
VDSSGEYPTVSEIPVGEVRLYQIADGVWSHIATQSFDGAVYPSNGLIVRDGDELLLIDTAWGAKNTAALLAEIEKQIGLPVTRAVSTHFHDDRVGGVDVLRAAGVATYASPSTRRLAEVEGNEIPTHSLEGLSSSGDAVRFGPVELFYPGAAHSTDNLVVYVPSASVLYGGCAIYELSRTSAGNVADADLAEWPTSIERIQQHYPEAQFVIPGHGLPGGLDLLKHTTNVVKAHTNRSVVE
因此，这个序列始于其N-端末端处的缬氨酸残基。然而，在本发明的特定实施方式中，该第一个缬氨酸残基可以被甲硫氨酸残基代替。例如，在从表达盒生产不含N-端信号肽的VIM-2蛋白或其变体的情况下，可以将编码甲硫氨酸残基的起始密码子引入到VIM-2或VIM-2变体编码基因中，代替编码缬氨酸残基的密码子。因此，在本发明的特定实施方式中，本发明的多肽包含V1M替换。
本发明的多肽与SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列享有至少70％的序列同一性，所述多肽与野生型VIM-2酶相比具有一个或多个下述性能：(i)改进的蛋白酶(特别是消化蛋白酶)抗性；(ii)改进的稳定性(特别是热稳定性和/或在肠道介质中的稳定性)；(iii)对β-内酰胺化合物特别是β-内酰胺抗生素的改进的作用谱(即本发明的多肽与野生型VIM-2酶相比能够使更大数量的不同β-内酰胺化合物(例如抗生素)失活，或者它能够使对野生型VIM-2酶不敏感的β-内酰胺化合物失活)；(iv)改进的酶活性(特别是减少的抗生素失活时间)；和(v)改进的生产得率。
本发明的变体多肽在选自第10、22、34和130位的至少一个位置中包含替换，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1中示出的氨基酸位置。在特定实施方式中，本发明的变体多肽在第1位中包含替换。在另一个特定实施方式中，本发明的变体多肽在第10位中和选自第22、34和130位的至少一个位置中包含替换。在另一个实施方式中，本发明的变体多肽在第10、22、34和130位中包含修饰，其中所述位置对应于SEQ ID NO：1的VIM-2β-内酰胺酶的氨基酸位置。
在特定实施方式中，所述变体多肽包含下述替换：
V10A；和
Q22H、N；和
Q34R；和
E130D。
在本发明的情形中，在编号位置后的顿号指示在所述位置处的可选修饰。例如，“22H、N”意味着SEQ ID NO：1中第22位处的氨基酸可以被H或N代替。
在用于改进肠道稳定性和对大量β-内酰胺抗生素的比活性的特定实施方式中，本发明的多肽包含10A、22N和34R替换。
在用于改进肠道稳定性和对大量β-内酰胺抗生素的比活性的特定实施方式中，本发明的多肽包含10A、22H和34R替换。
在用于改进肠道稳定性和对大量β-内酰胺抗生素的比活性的特定实施方式中，本发明的多肽包含10A、34R和130D替换。
在用于改进肠道稳定性和对大量β-内酰胺抗生素的酶活性的特定实施方式中，本发明的多肽包含10A、22H、34R和130D替换。
在用于改进肠道稳定性和对大量β-内酰胺抗生素的比活性的特定实施方式中，本发明的多肽包含10A、22N、34R和130D替换。
在本发明中，氨基酸使用公知的三字母编码或单字母编码来表示，正如在下表中概述的。
Figure BDA0002461261960000141
根据本发明，β-内酰胺酶是具有β-内酰胺酶活性的多肽，即催化在化合物例如β-内酰胺抗生素(例如青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、培南砜类)中存在的β-内酰胺环的酰胺键的不可逆水解以产生没有其抗细菌活性的水解分子的酶。
在本发明的情形中，所述VIM-2β-内酰胺酶是具有SEQ ID NO：1中示出的序列的多肽。这种酶已由Poirel等人在2000年描述(来自于法国的铜绿假单胞菌临床分离株的一种水解碳青霉烯的金属β-内酰胺酶VIM-2及其质粒和整合子携带的基因的表征(Characterization of VIM-2,a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamaseand its plasmid-and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosaclinical isolate in France)，Antimicrob.Agents Chemother.2000；44(4):891-7)，并由Docquier等人在2003年进一步表征(关于VIM型金属β-内酰胺酶的功能和结构非均质性(On functional and structural heterogeneity of VIM-type metallo-beta-lactamases)，J.Antimicrob.Chemother.2003；51:257-266)。
本发明VIM-2变体的活性可以通过大量测定法来测试。例如，可以进行体外酶测定法，其中在含有野生型VIM-2或VIM-2变体的蛋白质样品存在下通过分光光度法确定β-内酰胺化合物的水解速率。具体来说，可以在UV-可见光分光光度计或微孔板读板器中，在对应于底物和/或产物的最大吸收的波长处跟踪溶液中的β-内酰胺化合物和/或其水解产物的浓度(使用适合的缓冲液例如增补有50μM ZnSO4的50mM pH 7.5HEPES缓冲液)。因此，在β-内酰胺酶存在下，β-内酰胺底物和/或产物的浓度的时间依赖性变化将对应于反应速率。如果测量水解的初始速率([S]t≈[S]0)，则该反应速率(以μM/min或μM/s为单位表示)与测定样品中的酶浓度直接成正比。此外，在初始底物浓度下初始速率的变化通过Henri-Michaelis-Menten方程来表征，并允许计算所述酶水解特定β-内酰胺化合物的动力学参数(kcat和KM)。因此，在这些酶测定法中所确定的初始水解速率的测量允许表征含有VIM-2变体的样品的性质，例如它对特定底物的偏好性活性或它在样品中的相对丰度。
在特定实施方式中，本发明的多肽可以是分离的。在本发明的情形中，术语“分离的”在本文中用于指称通过SDS-PAGE所确定的至少20％纯、优选地至少40％纯、更优选地至少60％纯、甚至更优选地至少80％纯、最优选地至少90％纯、甚至更优选地至少95％纯的多肽。具体来说，优选地所述多肽处于“基本上纯的形式”，即所述多肽制备物基本上不含天然与其相伴的其他生化组分例如多核苷酸、多肽和多肽。这可以例如通过利用公知的重组方法制备所述多肽和通过经典的纯化方法来实现。
两个氨基酸序列之间的相关性通过参数“同一性”来描述。出于本发明的目的，两个氨基酸序列的比对通过使用来自于EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序来确定。所述Needle程序执行在Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453中描述的全局比对算法。使用的替代矩阵是BLOSUM62，缺口开启罚分是10，并且缺口延伸罚分是0.5。
本发明的氨基酸序列与权利要求书中指称的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)之间的同一性程度被计算为两个序列的比对中精确匹配的数目除以“本发明的序列”的长度或SEQID NO：1的长度之中的最短者。结果以百分比同一性表示。
当“本发明的序列”与SEQ ID NO：1在比对的相同位置中具有一致的氨基酸残基时，出现精确匹配。序列的长度是所述序列中氨基酸残基的数目(例如，SEQ ID NO：1的第1-240位氨基酸的长度为240)。
在本发明的特定实施方式中，那些特定肽与SEQ ID NO：1的同一性程度为至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在其他实施方式中，它们与SEQ ID NO：1的同一性程度为至少88.7％、89.1％、89.5％、89.8％、90.2％、90.6％、91％、91.4％、91.7％、92.1％、92.5％、92.9％、93.2％、93.6％、94％、94.4％、94.7％、95.1％、95.5％、95.9％、96.2％、96.6％、97％、97.4％、97.7％、98.1％、98.5％、98.9％、99.2％或至少99.6％。
当然，本发明的VIM-2变体相对于SEQ ID NO：1还可以在不同于上文具体指定的位置中包含大量修饰。其他修饰可以包括氨基酸替换、缺失或插入，以及任何数量的这些修饰的组合。在特定实施方式中，本发明的VIM-2变体的这些修饰除了上文具体鉴定的之外，还包括所述蛋白质的氨基端或羧基端末端中的氨基酸缺失。在说明性而非限制性的实施方式中，本发明的多肽与SEQ ID NO：1相比可以缺失位于所述蛋白质的羧基端末端处的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。在优选实施方式中，本发明的多肽存在从SEQ ID NO：1的第237位起的羧基端截短。在本发明的情形中，这意味着在得到的本发明的多肽中不存在SEQ ID NO：1的第237至240位氨基酸残基。在另一个实施方式中，本发明的多肽存在SEQ ID NO：1的第236-240位残基的羧基端截短。在另一个实施方式中，本发明的多肽存在SEQ ID NO：1的第235-240位残基的C-端截短。在另一个说明性而非限制性实施方式中，与SEQ ID NO：1相比，即与经历N-端信号肽切割的野生型VIM-2的序列(即不含信号肽的野生型VIM-2的序列)相比，本发明的多肽可以缺失位于所述蛋白质的氨基端末端处的一个或超过一个(例如1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸。在这个实施方式的特定变化形式中，与SEQ ID NO：1相比缺失位于氨基端末端处的一个或超过一个氨基酸(或换句话说，具有所述氨基酸的截短)的多肽还可以包含如下文所定义的插入或延长，例如标签或信号肽。
在本发明的情形中，术语“插入”打算也覆盖氨基端和/或羧基端延伸。在特定实施方式中，N-端延伸可以包括向本发明的多肽添加信号肽。这可以包括氨基酸序列为MFKLLSKLLVYLTASIMAIASPLAFS(SEQ ID NO：2)的野生型VIM-2的天然信号肽，或与野生型VIM-2的信号肽相比具有替换L9S、L9F、L9W、V10I、L12C、A14V、I16T、M17L、I19M、I19T、F25C或上述替换的任何组合的修饰的信号肽，或任何其他适合的信号肽，或两者。
代表性的N-端或C-端延伸可以包括添加非天然存在的氨基酸，例如由与野生型VIM-2或其任何变体融合克隆的DNA片段编码的“标签”肽，其允许促进本发明的多肽的鉴定和/或纯化。这些适合的标签可以包括例如组氨酸标签(6x His)或谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白，正如本领域中公知的。
与SEQ ID NO：1的野生型VIM-2对给定的β-内酰胺抗生素表现出的比活性相比，本发明的多肽可以对相同的抗生素表现出改进的比活性。在特定实施方式中，使用实施例部分中公开的相同程序测定，以每单位时间和每1mg含有本发明的多肽的蛋白质样品水解的底物的纳摩尔数为单位表示的比活性相对于SEQ ID NO：1的野生型VIM-2的比活性为至少105％。在另一个实施方式中，仍相对于SEQ ID NO：1的野生型VIM-2的比活性，本发明的多肽的相对比活性为至少110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350、400、500、600、700、800或甚至至少1600％。
在另一个特定实施方式中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：3至23中任一者的氨基酸序列或其具有β-内酰胺酶活性的片段(例如与SEQ ID NO：3至23中任一者的多肽相比缺少1、2、3、4、5、6或7个或超过7个C-端氨基酸的片段)，特别是如上所述缺少第237-240、236-240或235-240位氨基酸的片段，或者由所述氨基酸序列或片段构成。在这个实施方式的变化形式中，所述不含信号肽的多肽可以包含另外的氨基酸替换。在这个实施方式的变化形式中，所述多肽还在其N-端末端处包含信号肽(例如SEQ ID NO：2中示出的信号肽或其如上所定义的任何变体)。
在特定实施方式中，本发明的多肽包含：
(i)SEQ ID NO：1的第236-240位残基的C-端截短，和
(ii)在第10和22位中的每个位置处的替换；
在第10和34位中的每个位置处的替换；
在第10和130位中的每个位置处的替换；
在第10、22和34位中的每个位置处的替换；
在第10、22和130位中的每个位置处的替换；
在第10、34和130位中的每个位置处的替换；或
在第10、22、34和130位中的每个位置处的替换。
在另一个特定实施方式中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：1的第236-240位残基的C-端截短以及在第10、22、34和130位中的每个位置处的替换。
在特定实施方式中，本发明的多肽包含第236-240位残基的C-端截短和选自V10A、Q22H或Q22N、Q34R和E130D的至少一个修饰。
本发明还涉及一种核酸分子，其包含编码本发明的VIM-2多肽变体的核酸序列。
术语“分离的核酸序列”是指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖凝胶电泳或任何其他适合的方法确定的至少约20％纯、优选地至少约40％纯、更优选地至少约60％纯、甚至更优选地至少约80％纯、最优选地至少约90％纯的核酸序列。例如，分离的核酸序列可以通过在遗传工程中使用的标准克隆程序来获得，以将所述核酸序列从其天然位置迁移到它将在其中繁殖的不同位点。所述克隆程序可以包括切下并分离包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入到载体分子中，以及将所述重组载体并入到宿主细胞中，在那里将复制所述核酸序列的多个拷贝或克隆。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的或其任何组合。
本发明的核酸序列可以通过在编码SEQ ID NO：1的野生型VIM-2或其子序列的模板序列中引入至少一个突变来制备，其中所述突变的核酸序列编码变体VIM-2多肽。将突变引入到所述核酸序列中以将一个核苷酸交换成另一个核苷酸，可以通过本领域中已知的任何方法来实现，例如通过定点诱变、通过随机诱变或通过掺杂、掺入或定域随机诱变。
随机诱变作为定域或区域特异性随机诱变在所讨论的翻译成所示氨基酸序列的基因的至少三个部分中或在整个基因内适合地进行。当所述诱变使用寡核苷酸来进行时，在所述寡核苷酸合成期间，所述寡核苷酸可以在将要改变的位置处掺杂或掺入三个非亲代核苷酸。可以进行所述掺杂或掺入以便避免不想要的氨基酸的密码子。所述掺杂或掺入的寡核苷酸可以通过任何技术并入到编码所述多肽的DNA中，例如使用PCR、LCR或任何DNA聚合酶和连接酶或认为适当的其他DNA加工/修饰酶例如拓扑异构酶。
优选地，所述掺杂使用“恒定随机掺杂”来进行，其中在每个位置中野生型和突变的百分比是预定的。此外，所述掺杂可以被导向偏好性地引入某些核苷酸，并由此偏好性地引入一种或多种特定氨基酸残基。可以进行所述掺杂，以便例如允许在每个位置中引入90％的野生型和10％的突变。在掺杂计划的选择中另外的考虑因素是基于遗传以及蛋白质-结构约束。
所述随机诱变可以被有利地定位到亲代VIM-2序列的所讨论的部分。这在例如当所述酶的某些区域已被鉴定为对所述酶的给定性能特别重要时可能是有利的。
用于提供本发明的变体的可选方法包括如WO 95/22625或WO 96/00343中所描述的基因穿梭和EP 897985中所描述的共有序列衍生方法。
本发明还涉及一种核酸构建物，其包含可操作连接到一个或多个控制序列的本发明的核酸序列，所述控制序列在适合的宿主细胞中，在与所述控制序列相容的条件下指导所述编码序列的表达。术语“表达”应该被理解为包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当在本文中使用时，术语“核酸构建物”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因分离或被修饰成以自然界中原本不存在的方式包含核酸区段。当核酸构建物含有本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语核酸构建物与术语“表达盒”同义。在特定实施方式中，所述核酸构建物或表达盒被包含在质粒(例如表达质粒)内。
术语“控制序列”在本文中被定义为包括对编码本发明的多肽的多核苷酸的表达来说必需或有利的所有组分。每个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列来说可以是本源或外源的。这些控制序列包括但不限于前导序列、操作子(operator)、前肽序列、启动子、转录起始序列、翻译起始序列、信号肽序列、翻译终止序列、多腺苷化序列和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子和转录终止信号以及翻译起始和终止信号。所述控制序列可以被提供有连接物，用于引入特定限制性位点的目的，以促进所述控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。
术语“可操作连接”在本文中表示一种配置，其中控制序列被放置在相对于多核苷酸序列的编码序列适合的位置处，使得所述控制序列指导所述多肽的编码序列的表达。
当在本文中使用时，术语“编码区”(CDS)意味着直接指定蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。所述编码序列的边界通常由开放阅读框确定，所述开放阅读框通常始于ATG起始密码子或可选起始密码子例如GTG和TTG，并且通常止于终止密码子例如TAA、TGA或TAG。所述编码序列可以由DNA、cDNA构成；它可以是天然、半合成或合成的；它还可以含有非天然或修饰的核苷酸。
术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”在本文中被定义为直链或环状DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被可操作连接到提供它的表达的其他核苷酸。
编码本发明的多肽的核酸序列可以使用表达载体来表达，所述表达载体通常包括编码启动子、操作子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏蛋白基因或各种不同的激活子基因的控制序列。
带有编码本发明的多肽的DNA序列的重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA程序的任何载体，并且载体的选择通常取决于它将被引入到其中的宿主细胞。所述载体可以是当被引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组中并与它已被整合在其中的染色体一起复制的载体。它也可以作为自主复制的染色体外DNA分子例如质粒保留在所述细胞中。
本发明还涉及包含本发明的核酸序列或核酸构建物的宿主细胞。当在本文中使用时，“宿主细胞”包括对使用包含本发明的多核苷酸的核酸构建物的转化、转染、转导、感染等易感的任何原核或真核细胞类型。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，其被有利地用于所述多肽的重组生产。包含本发明的多核苷酸的载体被引入到宿主细胞中，使得所述载体作为染色体整合物或作为自我复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖了亲代细胞的由于在复制期间发生的突变而与所述亲代细胞不一致的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码所述多肽的基因及其来源。
所述宿主细胞可以由单细胞或多细胞生物体构成或源自于所述生物体，并且可以是原核或真核的。
有用的单细胞微生物包括细菌细胞例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)细胞例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，或链霉菌(Streptomyces)细胞例如变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)。
载体在细菌宿主细胞中的引入可以例如通过原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115)，通过使用感受态细胞的DNA转化(参见例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56:209-221)、使用任何转化方法包括但不限于化学转化或电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)或接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169:5771-5278)来实现。
所述宿主细胞也可以来自于真核生物，例如动物、特别是哺乳动物、昆虫、植物或源自于它们的细胞系，或单细胞真核生物或真菌细胞。所述重组蛋白也可以在多细胞生物体例如动物特别是哺乳动物或植物中生产。
在特定实施方式中，所述宿主细胞可以是真菌细胞。在特定实施方式中，所述真菌宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。在特定实施方式中，所述宿主细胞是源自于中华仓鼠卵巢细胞的细胞系。
真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法，以本身已知的方式来转化。酵母可以使用下述文献中描述的程序来转化：Becker和Guarente，Abelson,J.N.和Simon,M.I.主编的《酵母遗传学和分子生物学指南》(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology)，Methods in Enzymology 194:182-187,AcademicPress,Inc.,New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153:163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。真菌细胞也可以通过电穿孔或用于将DNA分子引入到细胞中的任何其他适合的方法来转化。
本发明还涉及一种生产本发明的多肽的方法，所述方法包括：(a)将宿主细胞在有助于所述多肽的生产的条件下培养；和(b)回收所述多肽。
在本发明的生产方法中，使用本领域中公知的方法将所述细胞在适合于所述多肽的生产的营养培养基中培养。例如，所述细胞可以通过在适合的培养基中并在允许所述多肽被表达和/或分离的条件下进行的摇瓶培养和在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养。所述培养在包含碳源和氮源和无机盐的适合的营养培养基中，使用本领域中已知的程序进行。适合的培养基可以从商业化供应商获得，或者可以按照已发表的组成(例如在美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)的目录中)来制备。在某些情况下，用于宿主细胞生长和多肽生产的条件是不同的；在第一阶段中允许所述宿主细胞在适合的条件下繁殖，并且在第二阶段中可以改变条件以允许所述多肽的最佳生产。如果所述多肽被分泌到营养培养基中，则可以直接从所述培养基回收所述多肽。如果所述多肽不被分泌，则它可以从细胞裂解物回收。
所述得到的多肽可以使用本领域中已知的方法来回收。例如，可以通过常规程序从所述营养培养基回收所述多肽，所述常规程序包括但不限于离心、过滤、提取、吸附、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过本领域中已知的各种不同程序来纯化，包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和孔径排阻)、电泳程序(例如制备型等电聚焦、制备型凝胶电泳)、差异溶解性(例如硫酸铵沉淀)或提取(参见例如《蛋白质纯化》(ProteinPurification)，J.-C.Janson和Lars Ryden主编，VCH Publishers,New York,1989)或其组合。
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。适合的组合物包括如上所定义的多肽与可接受的载体的组合。所述组合物可以按照本领域中公知的方法来制备，并为液体或干燥组合物的形式。所述组合物还可以包括使本发明的多肽稳定的组分例如甘油。
在特定实施方式中，所述组合物是包含可药用载体的药物组合物。所述组合物可以是可口服给药并且能够在需要的对象的胃肠道的所需部分中释放出所述多肽的组合物的形式。优选地，所述所需部分是胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠或结肠。在优选实施方式中，所述肠道的所需部分是空肠、回肠、盲肠或结肠，更优选为回肠、盲肠或结肠。在后一种情况下，所述组合物可以包括一种或多种抗胃液化合物，其保护本发明的多肽免于胃液影响。这些组合物可以包括在WO93/13795、WO2004/016248或US20050249716等中描述的药物递送系统。
本发明还涉及如上所述生产本发明的多肽的宿主细胞或生物体，其可以被引入到肠道的所需部分中并且能够在需要的对象的肠道的所需部分中释放出所述多肽。在优选实施方式中，所述肠道的所需部分是回肠、盲肠或结肠，更优选为盲肠或结肠。因此，本发明还涉及如上所定义的宿主细胞或生物体，其用于本文中所公开的治疗方法中，其中将所述宿主细胞给药到需要的对象。
正如上文提到的，本发明的VIM-2多肽变体可用于大量治疗和非治疗性用途。
本发明公开了使用本发明的多肽的治疗方法，其中所述多肽或组合物或含有它们与抗生素的组合的试剂盒或表达所述多肽的宿主细胞或生物体被用于在需要的对象中使β-内酰胺化合物例如β-内酰胺抗生素失活的方法中。执行所述方法是为了治疗或预防抗生素的副作用，例如肠道生态失调、耐药细菌的选择、正常消化过程的破坏、被机会性肠道病原体例如艰难梭菌(Clostridium difficile)定殖、与抗生素相关的腹泻或与肠道生态失调相关的其他疾病例如免疫力的改变、代谢紊乱或过敏。
本发明还涉及本发明的多肽、组合物、宿主细胞或生物体或试剂盒用于由对β-内酰胺抗生素敏感的细菌引起的细菌感染的治疗方法中的用途。更具体来说，所述细菌感染通过使用本发明的多肽和对所述多肽敏感的β-内酰胺抗生素的组合来治疗，从而借助于所述β-内酰胺抗生素治疗所述感染，而任何不想要的残留量的活性抗生素借助于本发明的多肽来消除。在这个特定实施方式中，所述多肽优选被配制在组合物中，所述组合物能够在需要这种细菌感染治疗的对象的肠道的所需部分中释放出所述多肽，其中所述肠道的所需部分优选为空肠、回肠、盲肠或结肠，最优选为回肠、盲肠或结肠。所述多肽也可以由产生所述多肽的宿主细胞或生物体释放到肠道的所需部分中，其中所述肠道的所需部分是回肠、盲肠或结肠，优选为盲肠或结肠。在特定情况下，本发明的多肽、组合物、宿主细胞或生物体或试剂盒被用于在可以是动物、哺乳动物或人类的对象中治疗细菌感染，其中对所述多肽敏感的抗生素在所述多肽或其组合物给药之前、之后或同时给药到所述对象。
本发明的多肽的其他用途包括非治疗性用途，例如所述多肽用于矫正环境或环境背景中的抗生素的用途。这些用途和方法可以在例如WO 2012/007536中发现，其描述了漆酶、纤维素酶和脂肪酶用于矫正环境中的抗生素的用途，并且在本文中做出必要的变通以适用于使用本发明的多肽从环境中消除β-内酰胺抗生素。
附图说明
图1是表示野生型VIM-2、VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]DCT236和VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236变体在人类回肠提取物中0、60、120和240分钟后的比活性的图。
实施例
实施例1：VIM-2变体的生产和纯化
在大肠埃希氏杆菌中使用任一基于T7启动子的表达系统(使用pET-9表达质粒)来生产VIM-2变体。简单来说，使用NdeI和BamHI限制性位点将突变体blaVIM-2基因克隆在质粒载体pET-9中，并将得到的质粒引入到大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)细胞中。将得到的宿主细胞在增补有ZnSO4的丰富自诱导细胞培养基ZYP-5052(Studier,F.W.2005.在高密度振摇培养中通过自诱导生产蛋白质(Protein production by auto-induction in high densityshaking cultures)，Protein Expr.Purif.41:207–234)中生长24h。通过离心分离细菌细胞和培养上清液。然后将澄清的培养上清液使用物理(例如超滤)或化学(沉淀)方法进行浓缩。或者，所述蛋白质可以从细菌细胞提取，将所述细胞重悬浮在100至200ml的20mM Tris(pH 8.0)中，然后用物理(超声、弗氏压碎器)或化学试剂(溶菌酶、去污剂)处理以诱导细胞裂解。将细胞提取物通过离心进行澄清。然后将得到的澄清样品装在阴离子交换层析柱上。使用NaCl在20mM Tris缓冲液(pH 8.0)中的线性梯度将蛋白质洗脱，并将有活性的级分合并，并浓缩。然后将蛋白质样品装在第二个阴离子交换柱上，并使用NaCl在20mM三乙醇胺(pH 7.2)中的线性梯度进行洗脱。将得到的样品装在凝胶过滤柱上，并用增补有50μMZnSO4和150mM NaCl的50mM HEPES(pH 7.5)洗脱蛋白质。然后将纯化的蛋白质浓缩并储存。
具体来说，这个生产流程被成功地用于生产下述变体VIM-2酶：VIM-2[,Q22H,Q34R,E130D]，VIM-2[,Q22H,Q34R,E130D]DCT236和VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236。借助于类似方法可以生产的另一种变体是VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]。
实施例2：VIM-2的变体在肠道介质中提高的稳定性的确定
为了测量VIM-2变体的稳定性，使用了下述程序：在人类回肠提取物中温育后，确定了纯化的蛋白质样品的亚胺培南水解活性。在温育期间的不同时间点(0、60、120和240min)测量变体的比活性(Sp.Act.)。将t时的比活性与t＝0时的比活性进行比较，以评估肠提取物中变体活性的损失。随时间的变化被表示为初始活性(t＝0时)与在较晚时间测量到的活性之间的比率((Sp.Act.变体)t/(Sp.Act.变体)t＝0)。低于1的值指示当在肠提取物中温育时活性损失。将不同时间点的残留活性进行比较，以评估某些变体与野生型酶相比在肠提取物中更高的稳定性。
当在回肠提取物中温育时，野生型VIM-2酶、VIM-2变体VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]DCT236和VIM-2变体VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236的比活性随时间的变化呈现在图1中。
活性损失随时间的变化也概述在下表中：
Figure BDA0002461261960000291
如表或图1中所示，在回肠提取物中240分钟温育后，野生型酶损失其活性的94.4％。在相同条件下，VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]DCT236和VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236变体分别仅损失其活性的72.5％和51.2％。
替换Q22H、Q34R、E130D的组合产生从工业角度来说具有急剧改进的性能的变体。替换V10A的添加甚至进一步改进了所述酶在人类回肠提取物中的稳定性。
实施例3：给定的VIM-2变体对各种不同β-内酰胺的比酶活性或催化活性的确定
对于如实施例1中所述生产的变体酶来说，可以测量对特定β-内酰胺化合物例如β-内酰胺抗生素的比活性和催化性质。
当考虑亚胺培南作为底物时，变体VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236在缓冲液中表现出改进的催化性质：
Figure BDA0002461261960000292
上述结果说明VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236对碳青霉烯抗生素表现出极大改进的活性，这是出人意料的并具有强烈的工业利益。
实施例4：在肠道介质中温育4小时后给定的VIM-2变体对各种不同β-内酰胺的酶活性的确定
如下所述进行酶活性评估：在将VIM-2变体在人类回肠提取物中温育4小时后，在适合的波长处通过分光光度法监测β-内酰胺的水解。酶活性可以以样品中的每毫克总蛋白每分钟水解的β-内酰胺底物的nmol为单位表示。
在下文中，所有酶活性将相对于在相同条件下测量的野生型酶的酶活性来表示。
对于VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]DCT236和VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236变体来说，测量到的酶活性是：
Figure BDA0002461261960000301
Figure BDA0002461261960000302
Figure BDA0002461261960000311
Figure BDA0002461261960000312
上述结果说明，在人类肠道介质中温育4小时后，VIM-2[V10A,Q22H,Q34R,E130D]DCT236与VIM-2[Q22H,Q34R,E130D]DCT236突变体相比对几种感兴趣的β-内酰胺表现出极大改进的活性，而后者与野生型酶相比对相同β-内酰胺的活性大大改进。
因此，替换V10A、Q22H、Q34R、E130D的组合产生从工业的观点来看具有极大改进的性能的变体。
序列表
<110> 达·沃尔泰拉公司（DA VOLTERRA）等
<120> β-内酰胺酶变体
<130> B2616PC00
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 野生型VIM-2
<400> 1
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20 25 30
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<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2信号肽
<400> 2
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1 5 10 15
Met Ala Ile Ala Ser Pro Leu Ala Phe Ser
20 25
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 3
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<211> 240
<212> PRT
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<220>
<223> VIM-2变体
<400> 4
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<211> 240
<212> PRT
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<220>
<223> VIM-2变体
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<220>
<223> VIM-2变体
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<211> 240
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<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
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<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 10
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 11
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 11
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
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Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
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210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 12
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
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210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 13
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 13
Val Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235
<210> 14
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 14
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
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Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
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195 200 205
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210 215 220
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<210> 15
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 15
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1 5 10 15
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<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 16
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Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
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Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
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Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
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Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
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Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
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210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 17
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 17
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Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
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65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
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His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
<210> 18
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 18
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
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Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
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His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn Arg Ser Val Val Glu
225 230 235 240
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<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 19
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
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Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 20
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 20
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
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Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
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65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
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Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
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Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
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Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
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Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
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Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
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Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 21
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 21
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Gln Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
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Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
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Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
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65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
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Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
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Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
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Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
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Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
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195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 22
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 22
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr Asn Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235
<210> 23
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VIM-2变体
<400> 23
Met Asp Ser Ser Gly Glu Tyr Pro Thr Ala Ser Glu Ile Pro Val Gly
1 5 10 15
Glu Val Arg Leu Tyr His Ile Ala Asp Gly Val Trp Ser His Ile Ala
20 25 30
Thr Arg Ser Phe Asp Gly Ala Val Tyr Pro Ser Asn Gly Leu Ile Val
35 40 45
Arg Asp Gly Asp Glu Leu Leu Leu Ile Asp Thr Ala Trp Gly Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Gln Ile Gly Leu Pro
65 70 75 80
Val Thr Arg Ala Val Ser Thr His Phe His Asp Asp Arg Val Gly Gly
85 90 95
Val Asp Val Leu Arg Ala Ala Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ser Pro Ser
100 105 110
Thr Arg Arg Leu Ala Glu Val Glu Gly Asn Glu Ile Pro Thr His Ser
115 120 125
Leu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Gly Pro Val
130 135 140
Glu Leu Phe Tyr Pro Gly Ala Ala His Ser Thr Asp Asn Leu Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Pro Ser Ala Ser Val Leu Tyr Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Glu
165 170 175
Leu Ser Arg Thr Ser Ala Gly Asn Val Ala Asp Ala Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Trp Pro Thr Ser Ile Glu Arg Ile Gln Gln His Tyr Pro Glu Ala Gln
195 200 205
Phe Val Ile Pro Gly His Gly Leu Pro Gly Gly Leu Asp Leu Leu Lys
210 215 220
His Thr Thr Asn Val Val Lys Ala His Thr Asn
225 230 235

Claims (16)

1.一种具有β-内酰胺酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽：
-在第10和22位中的每个位置处包含替换；
-在第10和34位中的每个位置处包含替换；
-在第10和130位中的每个位置处包含替换；
-在第10、22和34位中的每个位置处包含替换；
-在第10、22和130位中的每个位置处包含替换；
-在第10、34和130位中的每个位置处包含替换；或
-在第10、22、34和130位中的每个位置处包含替换，
其中所述位置对应于在SEQ ID NO：1所表示的序列中的位置，并且其中所述多肽与SEQID NO：1的野生型VIM-2相比在稳定性方面具有改进的性能。
2.根据权利要求1所述的多肽，其包含选自下述的至少一种修饰：
V10A；
Q22H或Q22N；
Q34R；和
E130D。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中对应于SEQ ID NO：1的第一位残基的残基被甲硫氨酸残基代替。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其还包含在N-端末端处的信号肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其与SEQ ID NO：1中示出的序列相比在N-端或C-端末端处包含截短。
6.根据权利要求5所述的多肽，其包含：
-SEQ ID NO：1的第237-240位残基的C-端截短；
-SEQ ID NO：1的第236-240位残基的C-端截短；或
-SEQ ID NO：1的第235-240位残基的C-端截短。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：4至23中任一者的氨基酸序列或其具有β-内酰胺酶活性的片段，或由SEQ ID NO：4至23中任一者的氨基酸序列或其具有β-内酰胺酶活性的片段构成。
8.一种分离的核酸序列，其包含编码根据权利要求1至7中任一项所述的多肽的核酸序列。
9.一种核酸构建物，其包含根据权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列被可操作连接到指导所述多肽在适合的表达宿主中表达的一个或多个控制序列。
10.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的核酸构建物。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物，其可口服给药，并且能够在肠的所需部分中，特别是在空肠、回肠、盲肠或结肠中释放出所述多肽。
13.一种试剂盒，其包含：
(a)根据权利要求1至7中任一项所述的多肽或根据权利要求11至12中任一项所述的组合物；和
(b)对(a)的所述多肽或包含在(a)的组合物中的所述多肽敏感的β-内酰胺抗生素；
用于分开、顺序或同时给药。
14.根据权利要求1至7所述的多肽，其用作药物。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求11至12中任一项所述的组合物、根据权利要求13所述的试剂盒或根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其用于在需要的对象中使β-内酰胺抗生素失活的方法中。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽、根据权利要求11至12中任一项所述的组合物、根据权利要求13所述的试剂盒或根据权利要求10所述的宿主细胞，其用于治疗细菌感染的方法中，其中所述多肽或所述组合物或所述宿主细胞与对所述多肽敏感的β-内酰胺抗生素相组合使用。
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