CN111246941A - 用于产生体外淋巴结的微流体装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于体外淋巴结的微流体装置。在本发明中公开的微流体装置，具有具有半圆形内壁的主体和沿着半圆形内壁相邻定位的第一通道。所公开的微流体装置的第一通道对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域。该装置还具有位于第一通道附近的第二通道，其对应于网状网络。位于中心的下空腔和上空腔分别对应于淋巴结的副皮质和滤泡。装置的各个隔室由周向和水平定位的成排微柱隔开。本发明的微流体装置由聚硅氧烷，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。在本发明中还提供了一种芯片实验室装置，该装置在富含胶原的硅酮微流体装置内并入了多种免疫细胞类型。

Description

用于产生体外淋巴结的微流体装置

技术领域

本发明涉及一种仿生微流体装置，更具体地，本发明涉及一种在体外重建天然人淋巴结微环境的微流体装置。

背景技术

抗原是能够诱导免疫应答的物质。众所周知，免疫系统是由细胞、组织和器官组成的网络，它们共同抵抗细菌和病毒等外来入侵者，从而保护人体。免疫系统分为两个子系统：先天免疫系统和适应性免疫系统。天生的免疫系统构成第一道防线；它对抗原类型具有非特异性，包括：1)物理屏障，例如皮肤；2)化学防御，例如胃中的酸；以及3)吞噬性白细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞诱导的细胞攻击。另一方面，适应性免疫系统对抗原类型具有特异性，并且包括称为T细胞和B细胞的淋巴细胞。与抗原接触后立即激活的先天免疫系统不同，适应性免疫系统在新近遇到的情况下需要一定的时间才能对病原体做出反应。尽管先天性免疫系统和适应性免疫系统看起来可能不同或极为不同，但是它们紧密地联系在一起。某些类型的抗原呈递细胞，即巨噬细胞和树突状细胞(DC)介导两个子系统之间的相互作用。DC将抗原呈递给T细胞，从而激活它们。活跃的T细胞又触发B细胞，导致产生可以破坏病原体的抗原特异性抗体。DC与T细胞的接触及其随后的相互作用通常发生在淋巴结中，淋巴结是椭圆形的器官，分布在整个淋巴系统中，可以作为过滤器从体内清除异物和癌细胞。

淋巴结是分布在全身的柔软、浅棕褐色、椭圆形、块状外观的器官，并用作异物的过滤器。它们具有复杂的结构，使它们能够收集大量的抗原呈递细胞(APC)和淋巴细胞，并促进它们之间的相互作用。淋巴结的基本功能和解剖单位是淋巴小叶。淋巴结由多处淋巴小叶组成，周围被充满液体的鼻窦包围，并被囊包封。淋巴小叶有两个主要腔室：滤泡和副皮质。滤泡容纳B细胞，而副皮质容纳T细胞和DC。淋巴结内淋巴细胞和DC的定位和组织主要受趋化因子、粘附分子和细胞外基质(ECM)蛋白控制。淋巴结环境可最贴切地描述为几乎没有ECM的密集细胞环境。淋巴结的ECM排列成一个开放的网状纤维系统，称为网状网络。副皮质的网状网络比滤泡中的网状网络更密集。它为APC-淋巴细胞相互作用提供结构支持和指导。网状纤维主要由I型胶原和III型胶原组成，并通过β1整联蛋白支持一层称为成纤维网状细胞(FRC)的基质细胞的附着。FRC包裹着网状纤维，并通过紧密的结合复合物彼此结合，形成“活的基质”，T细胞和DC粘附在其上。FRC覆盖了大约90％的网状纤维，其组织产生了一个导管系统，该导管系统充当过滤器，小的可溶性抗原(<70kDa)可以在其中穿过。FRC不仅是结构支持，因为它们在促进淋巴细胞迁移和调节T细胞活化中起着至关重要的作用。由于在淋巴结内，细胞会爬行但无法游泳，因此需要一条行进的道路，因此，已知是淋巴细胞粘附受体配体的ECM蛋白在FRC的外表面表达。此外，网状纤维的间距和方向极大地影响淋巴细胞的迁移速率。

幼稚B和T细胞通过高内皮小静脉(HEV)或传入淋巴管渗入淋巴结。通常，一旦进入淋巴结，T细胞就会沿着副皮质的FRC随机爬行，而B细胞在FRC上爬行以到达滤泡。在滤泡内部，B细胞堆积在滤泡DC(FDC)中，形成密集的网络，B细胞在其中搜寻抗原。遇到抗原时，B细胞不会立即受到刺激。相反，它们会随着时间积累抗原，提示“多轮抗原获取”。DC是APC，其识别和处理来自组织的抗原，并将其呈递给淋巴结中的T细胞。与淋巴结相关的DC可以分为两大类：常驻DC和迁移DC。常驻细胞位于紧邻FRC导管的淋巴结的T细胞区(副皮质)。他们迅速从淋巴液中吸收可溶性抗原，并将其呈递给淋巴细胞。另一方面，迁徙DC通过携带高浓度加工抗原的传入淋巴管从组织到达淋巴结。然后将它们定位在HEV附近，以增加遇到幼稚淋巴细胞的可能性。

淋巴液是类似于血浆的流体，其包含淋巴细胞、迁移性DC、废物、细胞碎片、细菌和蛋白质，它们通过传入淋巴管进入淋巴结以被过滤。淋巴液随后从传入管穿过许多较小的窦：被膜下淋巴窦(SCS)，小梁窦，髓质淋巴窦，通过这些窦得到清洁，最后通过传出淋巴管将淋巴结留在肺门处。FRC位于SCS附近，它们可以在那里捕获抗原并将抗原从淋巴液转运到附近的APC。特别地，淋巴结通常具有一个传出管和多个传出管。这使淋巴结可以充当“沉淀池”，为淋巴细胞提供足够的时间来识别抗原并与APC相互作用。

在生物医学和药物领域中，不断地研究和开发新药物，以对抗病原体和致病因子。但是，对于新药候选而言，医药开发行业面临着高损耗率。一项涉及主要制药公司AstraZeneca,Eli Lilly,GlaxoSmithKline and Pfizer公司的企业内部研究的结论是，尽管改进的分析方法和实验方法提高了药物代谢和药代动力学特征，但由于功效和安全性而导致的失败仍维持损耗率。已通过并被认为具有商业利润的药物估计开发成本为17亿美元。在开发链中一个被忽视的关键方面是候选药物对我们免疫系统的影响。缺乏对此方面的深入研究，并且它可能会通过大量了解我们对药物的免疫生理学的机理来释放大量知识，以节省高成本并降低损耗率。

所有类型和所有类别的药物都扰乱免疫系统(Kidd等，2015)，但是这些扰动的机制和免疫结果尚不明确。对这些生物-药物相互作用缺乏了解会使药物开发遇到困惑，掩盖潜在的副作用并限制发现。另外，当前药物领域的最新革命也是药物工业中的最新支柱，是使用免疫细胞进行基于细胞的药物递送，这比许多其他递送系统优越，并且具有广泛的适用性。类似地，需要对这种修饰的免疫细胞进行进一步的评估，因为引入细胞载体以递送药物可能会破坏自然的生理状况或加剧已经患病的组织。

使用有助于促进从细胞微环境中添加和/或去除组分的实验设置，可以对细胞系统进行最佳的机械研究。微流体技术可以实现这种受控设置，而微流体技术已被广泛用于生物学研究，以降低试剂成本并最大化来自珍贵样品的信息，同时在其微环境中提供细胞的时空动态。

过去已经开发了各种微流体模型以重建肿瘤微环境以及血脑屏障和其他微环境。文献表明建立体外淋巴结的尝试是有限的，每种尝试都有其自己的方法。在其获得专利的“人工免疫系统”(US 8288159 B2)中。William Warren等人介绍了一个完整的人工免疫系统，该系统包括三个等效组织：a)等效皮肤b)等效淋巴组织和c)等效血管网络，所有这些均被封闭在具有受控环境的生物反应器中。通过磁性微珠和纳米珠控制细胞(主要是树突细胞)从一种等效组织到另一种等效组织的运动。但是，添加微/纳米珠可能会人为地引起不必要的免疫反应，并可能最小化该系统在机理研究中的有效性。对于等效的淋巴组织，提出了以下设计：(1)使用BioAssembly Tool的数字印刷淋巴结的模型图像，其中通过微球释放T和B细胞引诱剂来维持不同的T和B细胞区域，以及(2)封闭在多孔容器中的T和B细胞填充的微载体。尽管第一种设计的方法，即生物打印是很有前途的，但使用微球来引导T细胞和B细胞的组织可能会诱导不必要的免疫反应，从而影响系统的保真度。另一方面，第二种设计并未紧密模仿体内淋巴结的解剖结构，并且由于它们位于微载体上，似乎限制了不同细胞类型之间的相互作用。

2011年引入了先前专利(US 8,003,387 B2)的扩展。发明人旨在通过成熟的滤泡体外生发中心(GC)研究对疫苗、过敏原和其他药物的体液免疫反应。他们的系统由至少一个3D生发中心(包含毛囊DC、B细胞和T细胞)嵌入或固定在工程组织构造中组成，该组织构造可以由胶原蛋白、明胶、透明质酸或其他ECM材料制成。他们的方法包括将载有抗原的滤泡DC置于含有幼稚淋巴细胞的工程组织结构中，以诱导免疫反应。但是，该系统具有许多缺点。首先，缺少淋巴结的重要成分，如被膜下淋巴窦、网状网络和副皮质、淋巴结滤泡。结果，US 8,003,387 B2仅限于体液免疫反应的研究，而不是细胞介导的免疫反应的研究。其次，将载有细胞的抗原手动放入等效淋巴样器官中，在本例中为GC，而在体内，抗原则通过淋巴液进入淋巴结，并且在淋巴结的整个过程中它们可能被淋巴细胞捕获，随后开始免疫反应。第三，在US 8,003,387 B2中公开的发明限于静态条件并且不支持流动。

题为“淋巴结替换构建体”的另一最新专利WO2016083784 A1讨论了一种淋巴结替换模型，该模型由三个部分组成：一个或多个入口，主体和一个或多个出口。主体进而包括内部结构，该内部结构限定从一个或多个入口延伸到一个或多个出口的一个或多个流体连通路径。该模型还包含小阀门，以确保流体的单向流动。然而，对于已经通过外科手术切除了淋巴结并且由于流体引流减少而最终导致水肿的患者，该模型已被提议作为其实际体内淋巴结的替代。因此，该模型具有维持淋巴液的生理流速的功能，并且不包含任何细胞成分。

另一方面，Annika Lubitz和Christoph Giese提出了一种基于生物反应器的淋巴结模型。他们的方法涉及在生物反应器中的3D基质上对淋巴细胞、DC和基质细胞进行共培养，然后对其进行灌注、充氧和喂养。生物反应器中有两个由双层膜隔开的连续灌流的细胞培养室。尽管其具有潜力，但是该模型并未紧密模仿天然淋巴结的解剖结构，因此破坏了细胞的免疫能力。

现有专利或可用设计中没有一个提供能够替代动物测试并且同时易于再现和用户友好的体内淋巴结全面模型。由于淋巴结是免疫细胞的汇合中心，借此人体通过激活免疫反应来防御异物，因此有必要开发一种淋巴结的体外模型，以密切模拟其微环境，从而促进细胞间相互作用和免疫反应的机理研究，从而为新开发药物的功效、效率和毒性提供更好的可预测性。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种体外淋巴结，其有助于对免疫细胞-细胞相互作用和下游免疫应答的研究，从而提供有关新开发药物的免疫毒性的信息。

本发明的又一个目的是提供一种装置，该装置尽可能地模仿人淋巴结环境的解剖结构和生理学。

本发明的另一个目的是提供一种在成功维持细胞活力的同时模仿淋巴结解剖结构的装置。

本发明的另一个目的是提供一种支持实时成像并允许实时监测该装置内的淋巴结活动的装置。

本发明的又一个目的是提供一种用户友好且易于制造的装置，其可以在各种生物医学和制药应用中实施，以研究在淋巴结环境内发生的各种抗原的活性和物理反应。

在本发明的一个方面，公开了一种用于产生体外淋巴结的微流体装置，该装置包括第一通道，与第一通道相邻的第二通道，在装置内位于中心的下空腔和上空腔，其中微流体装置模仿淋巴结的解剖和生理结构。

在一个实施例中，第一通道对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域，第二通道对应于淋巴结的网状网络，位于中心的下空腔对应于淋巴结的副皮质，并且位于上空腔的中心对应于淋巴结的滤泡

在一个实施例中，微流体装置还包括入口孔和出口孔。

在一个实施例中，入口孔和出口孔允许在微流体装置内并通过微流体装置注射流体、气体和固体材料中的至少一种。

在一个实施例中，微流体装置在第一通道、第二通道，上空腔和下空腔中直接填充有细胞成分。

在一个实施例中，微流体装置还包括用于将装置密封至支撑基座的外表面。在优选的实施方式中，所述支撑基座是玻璃支撑基座。

在另一个实施例中，密封的微流体装置具有开放的入口孔和出口孔，从而允许将流体、固体和气体材料中的至少一种注入到微流体装置内。

在一个实施例中，微流体装置的主体由选自玻璃、硅、聚硅氧烷、光学透明聚合物的材料制成。

在优选的实施例中，用于制造微流体装置的聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在另一个实施例中，微流体装置的第一通道的宽度小于第二通道的宽度。

在一个实施例中，微流体装置的第一通道和第二通道由圆形分布的微柱隔开。

在另一个实施例中，微流体装置的下空腔和上空腔由水平成排的微柱隔开。

在一个实施例中，微柱的直径的直径为至少0.45mm。在另一个实施例中，微柱的高度为至少1.5mm。

在一个实施例中，水凝胶分别包含在微流体装置的第一通道、第二通道、下空腔和上空腔内。

在一个优选的实施例中，水凝胶是I型胶原水凝胶。

在优选的实施例中，微流体装置包括在上空腔中的B细胞和在下空腔中的T细胞。

在另一方面，本发明还公开了一种包括微流体装置的芯片实验室，其包括第一通道，与第一通道相邻的第二通道，位于装置内中心的下空腔，位于装置内中心的上空腔，其中微流体装置模仿淋巴结的解剖和生理结构。

在一个实施例中，包括微流体装置的芯片实验室包括对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域的第一通道，对应于淋巴结的网状网络的第二通道，位于中心的下空腔对应于淋巴结的副皮质，而位于中心的上空腔对应于淋巴结的滤泡。

在一个实施例中，包括微流体装置的芯片实验室包括入口孔和出口孔，其允许将流体、气体和固体材料中的至少一种注入到装置内并通过装置。

在一个机构中，将包含微流体装置的芯片实验室直接在第一通道、第二通道、上空腔和下空腔中填充细胞成分，然后用透明支撑基座密封。

在另一个实施例中，微流体装置的第一通道的宽度小于第二通道的宽度。

在一个实施例中，用选自玻璃、硅、聚硅氧烷、光学透明聚合物的材料来制造包括微流体装置的芯片实验室。

在优选的实施例中，聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在另一个实施例中，形成芯片实验室的微流体装置的第一通道和第二通道由圆形分布的微柱隔开。

在一个实施例中，形成芯片实验室的微流体装置的下空腔和上空腔由水平成排的微柱隔开。微柱的直径的直径至少为0.45mm。在另一个实施例中，微柱的高度为至少1.5mm。

在一个实施例中，形成芯片上实验室的微流体装置的上空腔包括B细胞，而形成芯片上实验室的微流体装置的下空腔则包括T细胞。

在一个实施例中，胶原水凝胶分别包含在形成芯片实验室的微流体装置的第一通道、第二通道、下空腔和上空腔内。

附图说明

在说明书的结尾处的权利要求中特别指出并明确要求保护被视为本发明的主题。以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合本文中提出的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本发明的发明。通过以下结合附图的详细描述，本发明的前述和其他方面、特征和优点将变得清楚，其中：

图1示出了显示多个淋巴小叶的淋巴结-每个淋巴小叶由滤泡和副皮质组成。

图2A示出了微流体装置的理论设计的3D AutoCAD模型。

图2B示出了由逆加工模具制造的基于硅酮的微流体装置。

图3示出了装置内T单元的平均速度(以像素/分钟为单位)的曲线图。

图4示出了装置内B单元的平均速度(以像素/分钟为单位)的曲线图。

图5描绘了使用ANSYS R17.2生产的装置中流速的CFD模拟。

图6示出了使用ANSYS R17.2生产的装置中的压力的CFD模拟。

图7示出了流量评估实验的设置。

具体实施方式

在下面的详细描述中，参考了附图，这些附图构成了本说明书的一部分，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实施本发明的特定实施例。在附图和说明书中，尽可能使用相同的附图标记指代相同或相似的部件。参考所描述的附图的方向，使用诸如“顶部”、“底部”、“正面”、“背面”、“前导”、“尾随”等方向性术语。因为本发明的实施例的组件可以以许多不同的方向定位，所以方向术语是用于说明的目的，绝不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施例，并且可以进行结构或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应被视为限制性的，并且本发明的范围由所附权利要求书限定。

本文描述的本发明的一些优选实施例通常涉及假体和矫正系统。尽管描述阐述了各种实施例特定的细节，但是应当理解，该描述仅是说明性的，并且不应以任何方式解释为限制本发明。此外，本领域技术人员可以想到的本发明的各种应用及其修改也被本文描述的一般概念所涵盖。

本发明旨在提供一种用于体外淋巴结的微流体装置，其中该微流体装置包括试剂的有效消耗、高通量分析、部件的小型化以及相对较低的制造成本。

本发明的目的还在于提供一种微流体装置，其模仿人淋巴结的解剖结构和生理学，维持细胞活力，实现实时成像，并且对用户友好。本发明的微流体装置是多室的，结合了选定的细胞类型，特别是在人淋巴结中发现的对免疫至关重要的B细胞和T细胞。如所公开的微流体装置允许在淋巴结模型内有足够量的气体交换以维持细胞活力。另外，所公开的微流体装置是耐用的、坚固的并且操作非常稳健。

本发明提供了一种PDMS制造的微流体装置，其易于合成且具有可变的刚度，相对便宜，允许进行表面处理以调节其疏水性。

本发明提供的微流体装置用透明玻璃基底密封，以容纳所添加的流体或水凝胶，而不会损害显微成像的光学清晰度。另外，所公开的微流体装置是惰性的，因此它不干扰培养的细胞，并且提供了创建精确且精心控制的化学引诱剂梯度的能力，可以用于在短期内研究小分子微生物种群的运动性、趋化性和对抗生素产生抗药性的能力。

图1示出了显示多个淋巴小叶(102)的淋巴结(100)-每个淋巴小叶(102)由滤泡(104)、副皮质(106)、被膜下淋巴窦区域(108)和网状网络(110)组成。

图2A示出了如上文公开的微流体装置(200)的理论设计的3D AutoCAD模型，示出了如果装置(200)的不同区域，例如沿着半圆形内壁(202)相邻设置的第一通道(204)，与第一通道(204)相邻的第二通道(206)，其中第一通道(204)和第二通道(206)由圆形分布的微柱(208)隔开、下空腔(210)和上空腔(212)位于装置(200)中心，其中下空腔(210)和上空腔(212)被水平的成排微柱(214)隔开。微流体装置(200)的内壁(202)可以具有其他形状，例如圆形、半圆形、椭圆形。

图2B示出了微流体装置(200)的模具。微流体装置(200)包括具有半圆形内壁(202)的主体，沿半圆形内壁(202)相邻定位的第一通道(204)，与第一通道(204)相邻的第二通道(206)；其中第一通道(204)和第二通道(206)由圆形分布的微柱(208)隔开，下空腔(210)和上空腔(212)位于装置(200)的中心，其中下空腔(210)和上空腔(212)由水平的成排微柱(214)隔开。

此外，微流体装置(200)包括入口孔(216)和出口孔(218)。微流体装置(200)设计成能够模拟体外淋巴结，其中装置(200)中的每个通道和空腔对应于淋巴结(100)组件，例如第一通道(204)对应于淋巴结(100)的被膜下淋巴窦区域(108)，其中大的抗原(>70KDa)应在其中流动。装置(200)的第二通道(206)对应于淋巴结(100)的网状网络(110)。第二通道(206)充满特定的多孔细胞外基质，其能够捕获少量可溶性抗原，并促进迁移性DC从淋巴液向淋巴细胞迁移。细胞外基质包括水凝胶、蛋白质或蛋白质组合，例如胶原I、胶原III、胶原IV、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白-1、腱生蛋白、玻连蛋白和硫酸肝素。

第二通道(206)通过PDMS微柱(208)与第一通道(204)隔开。假定PDMS微柱(208)允许并入不同的细胞外基质组分，同时保持它们的分离。

位于中心的下空腔(210)对应于淋巴结(100)的副皮质(106)，而位于中心的上空腔(212)对应于淋巴结(100)的滤泡(104)。另外，下空腔(210)和上空腔(212)由PDMS微柱(214)隔开。上空腔(212)是B细胞驻留的地方，下空腔(210)是T细胞和DC驻留的地方。这两个空腔(210、212)中的每个空腔都将被特定的细胞外基质填充，并将包含B细胞和T细胞组织/组装所需的特定趋化因子(与B细胞组装相关联的化学引诱剂：CXCL13和与T细胞组装相关联的化学引诱剂：CXCL12，CCL21和CCL19)。

在本发明的一个实施例中，微流体装置(200)包含对应于淋巴结(100)的传入管的入口孔(216)和对应于淋巴结的传出管(100)的出口孔(218)。这些入口孔(216)和出口孔(218)允许流体流过微流体装置(200)。

此外，微流体装置(200)还包括外表面(220)，该外表面适于密封至使用无菌机械螺钉紧固的玻璃支撑基座，以形成完全的密封。

在一个实施例中，微流体装置(200)的主体(202)由选自硅或其他光学透明聚合物材料的材料制成。

第一通道(204)、第二通道(206)以及位于中心的下空腔(210)和上空腔(212)适于通过由装置(200)内的圆形分布的微柱(208)和水平的成排微柱(214)提供的分离分别容纳和/或引导具有不同组成和浓度的各种流体、固体或气体材料。通过PDMS微柱(208、214)实现不同区域之间的物理分离，以允许不同组分的结合和相互作用，同时保持它们的分离。

关于尺寸，微柱(208、214)的直径优选地为大约0.45mm，并且微柱的高度为大约1.5mm。微型支柱(208、214)可以具有大约1.5mm的高度，并且从微型支柱到微型支柱的间隔是大约0.2mm。由半圆形内壁所限定的主体(202)的直径约为1.1cm。

在优选实施例中，装置(200)由光学透明材料组成，用于实现对装置(200)及其在第一通道(204)、第二通道(206)、下空腔(210)和上空腔(212)中的内容的成像和光学监控，使得可以实现活性的实时或记录成像，以便监测和研究体外淋巴结环境内特定生物学相互作用的活性，例如对APC-淋巴细胞相互作用的研究。可以将水凝胶放置在微流体装置(200)的各个隔室内，包括第一通道(204)、第二通道(206)以及位于中心的下空腔(210)和上空腔(212)。这可以通过在密封装置之前将水凝胶直接放置在所需的隔室中来实现。

在另一方面，本发明还公开了一种芯片实验室装置，其包括如上所述的微流体装置(200)。

在考虑了公开了其优选实施例的说明书和附图之后，本领域技术人员将清楚本发明的许多改变、修改、变化以及其他用途和应用。不脱离本发明的精神和范围的所有这些改变、修改、变化以及其他用途和应用被认为被本发明覆盖，本发明仅由所附权利要求书来限制。

示例

用于微流体装置的模具的制备

取决于淋巴结的位置和激活水平，体内淋巴结的大小在0.5厘米至2.0厘米之间变化。在异常情况下，例如炎症或癌症，随着免疫系统对问题的反应，某些LN可能会扩大。在本发明中，发明人假设淋巴结的大小固定，不包括装置壁在内大约为1.1cm。然而，使用者仍然可以改变流速以类似于期望的状况，这等同于体内淋巴结中改变的淋巴液流入。使用者可以增加装置中的流速以研究炎症期间的细胞反应。

一旦确定了微流体装置的不同部分的特定尺寸，就生成了该装置的AutoCAD 3D模型。如图2A所示的AutoCAD设计构成了生成模具的基础，然后将其用于制造基于PDMS的微流体装置。制造的第一步是将CAD设计转换为G代码，这是一种数控编程语言，主要用于计算机辅助制造中以控制自动化机床。G代码依次引导自动化机器将所需的设计(具有所需的隔室和通道)蚀刻到聚四氟乙烯(PTFE)零件上，生成PTFE模具，然后将其用于制造基于PDMS的微流体装置。图2B示出了基于PDMS的微流体装置，其描述了对应于体内淋巴结的各个隔室。使用CN-MAX 80-45机器(TEA Technology Engineering Automation SRL，比萨)完成PTFE模具的制造，该过程涉及四个主要步骤：1)将机器的铣刀(切割装置)放置在PTFE片的中心；2)使用专用铣刀对PTFE片的表面进行平滑处理(以防止将PDMS倒入模具后在PDMS中形成空隙或其他缺陷)；3)用0.45毫米钻头刺破孔产生立柱；4)使用合适的铣刀制作“D”形截面和设计的外壁，然后制造PTFE模型。

图2B示出了基于PDMS的微流装置的成功制造的模具，其示出体内淋巴结中的每个组件。

微流体装置的制造

如上所述的PDMS微流体装置的制造简单且相对便宜。该过程涉及创建具有所需通道或隔室的模具。将PDMS和交联剂的混合物(用于固化PDMS)倒入模具中，并在大约650℃的特定温度下加热。PDMS硬化后，将其从模具中取出。在PDMS块上获得了微通道的副本。然后用氧等离子体处理PDMS装置，以将其表面从疏水性转变为亲水性，并支持水凝胶的粘附。将嵌入选择的水凝胶中的期望细胞成分填充在装置的不同隔室中。然后，使用玻璃底座密封装置，并使用无菌机械螺钉将其拧紧，以形成完全的密封。

然后，准备使用微流体管将微流体装置连接至微流体储器和泵。

进行了各种评估，以证明最终的原型是人类淋巴结的工作和实用模型。更具体地，微流体装置通过提供不同隔室之间的分离来模仿体内淋巴结，维持细胞活力，并维持不同的流速。

细胞活力的评估

为了证明本发明的装置或将细胞放入其中的过程不会引起细胞死亡，我们隔夜测试了细胞活力。将B和T淋巴细胞分别注射到该装置的下空腔和上空腔中，而将第一通道和第二通道的隔室中分别注入介质以增湿环境并增强气体交换以维持细胞活力。然后将装置中的不同位置以5倍成像。

通过使用由科学图像分析平台Image J开发的Fiji手动跟踪两种细胞类型，对获得的图像进行量化。标记了几个细胞，并在视频的每个切片上获取每个细胞的坐标。之后，使用以下公式计算连续切片之间每个细胞所经过的距离：

然后通过将距离除以时间获得速度，将时间设置为每个切片之间1分钟。然后分别绘制T细胞和B细胞的平均速度与时间的关系图，分别如图3和图4所示。两种细胞类型在整个成像过程中都保持着变化的速度，并且速度没有下降，表明这些细胞是有活力的，并且没有发生凋亡。此外，将细胞与培养基一起放置在装置内，孵育24小时，并通过流式细胞术分析定量其活力。结果表明，细胞在整个过程中保持活力，细胞死亡率不到9％。这证明了装置本身的材料以及水凝胶填充、流动注射和成像的整个过程对于细胞都是安全的。

在图3所示的曲线图中，以像素/分钟为单位显示了T细胞的平均速度，可以看出该速度没有下降到零，表明这些细胞是有活力的，并且处于连续运动状态。在图4中，通过以像素/分钟为单位的B细胞的平均速度图可以看出，该速度没有下降到零，表明该细胞是有活力的，并且处于连续运动中。

流量评估

在评估装置中的流之前，通过使用ANSYS R17.2(美国ANSYS，Inc公司)开发的计算流体动力学(CFD)模拟在装置中对流进行了模拟。在我们的装置中定量研究了两个变量：流速和压力。

图5示出了速度分析的CFD结果。最高的速度是在入口和出口处，这是可以预期的，因为它们是直径最小的路径。一旦流存在于入口并进入装置，由于凝胶所引起的阻力，其速度将急剧下降。请注意，在装置的大多数部分中，速度是低到中等的。实际上，该装置的几何形状设计为降低了上空腔和下腔(细胞区域)中流动的速度，如图所示，从而为细胞提供了更多与同该流一起加入的物质相互作用的时间。

图6示出了压力分析的CFD结果。最高压力在通道2的峰值末端处，这是可以预期的，因为这是流会聚以离开装置的地方。否则，大多数地区的压力相对适中。

图7示出了流量评估实验的设置。该装置被放置在显微镜下。装置的入口孔通过管子连接到注射器。将注射器放置在泵中以控制流速。装置的出口孔将流体排到装置外部。

通过评估流量证明了以下几点：

注入的流体移动通过不同浓度的凝胶：重要的是确保流体不采取最小阻力的路径，该路径是凝胶和玻璃之间的界面。这是通过使凝胶在装置内部聚合而实现的，从而与玻璃形成化学键。因此，流体被迫通过凝胶移动。该结果被实验证实了，除了观察到颗粒以3D形式在整个凝胶中移动以外，还观察到一些纳米颗粒被困在凝胶中。

流覆盖装置的所有区域：观察到纳米粒子在整个装置上流动。这对于装置的任何应用都是至关重要的。例如，如果注入的流体是介质，则重要的是它要到达装置不同隔室中的所有细胞。

所注入的流体会聚并存在于出口处：流体不应被截留在装置内部，而应顺畅地流向出口。监测流量显示纳米颗粒离开装置。

该装置维持各种流速而不会移位凝胶或泄漏。此外，该结果证明了该装置针对不同用户应用的多功能性。例如，该装置维持高流速，可能类似于淋巴结发炎。

总的来说，所构造的微流体装置消除了本领域中先前的缺点。设计的实施例模拟了人类淋巴结的解剖结构和生理，因为它是一种多隔室的微流体装置，能够整合关键的免疫细胞；例如B细胞、T细胞和DC。此外，根据进行的测试，该装置可以进行足够量的气体交换，并且可以轻松消毒以维持细胞活力并防止细胞死亡。此外，由于它可以安装在标准载玻片中，因此可以进行实时成像，并且其设置不会分散显微镜光，从而可以产生高质量的图像。最终，该装置耐用、坚固并且操作非常稳健，可重现，使用户友好。

产生人淋巴结体外模型的微流体装置的本发明将大大改善APC-淋巴细胞相互作用的机理研究。此外，它将为动物试验提供替代方法，以检查新合成药物的效率，并更好地预测药物在临床前和临床试验中成功的能力。因此，这既节省时间又节省成本。此外，它将为无数免疫学应用铺平道路，从而导致生物医学研究的不断发展。

为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的特定实施例的前述描述。它们并不旨在穷举或将本发明限制为所公开的精确形式，并且显然可以进行许多修改。鉴于以上教导，各种变化都是可能的。选择和描述实施例是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够最好地利用本发明并且具有各种修改的各种实施例适合于预期的特定用途。应当理解，因为情况所需或权宜之计可以考虑各种省略和等同替换，但是这种省略和替换旨在覆盖本申请或实施方式，而不背离本发明的精神或范围。

Claims (36)

1.一种用于产生体外淋巴结的微流体装置，包括：

第一通道；以及

第二通道，与所述第一通道相邻；

位于所述装置内中心的下空腔；

位于所述装置内中心的上空腔；

其中所述微流体装置模仿淋巴结的解剖和生理结构。

2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中：

所述第一通道对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域，

所述第二通道对应于淋巴结的网状网络，

位于中心的所述下空腔对应于淋巴结的副皮质，以及

位于中心的所述上空腔对应于淋巴结的滤泡。

3.根据权利要求1所述的微流体装置，还包括入口孔和出口孔。

4.根据权利要求3所述的微流体装置，其中所述入口孔和所述出口孔允许将流体、气体和固体材料中的至少一种注入到所述装置内并通过所述装置。

5.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述装置在所述第一通道、所述第二通道、所述上空腔和所述下空腔中直接填充有细胞成分。

6.根据权利要求1所述的微流体装置，还包括用于将所述装置密封至支撑基座的外表面。

7.根据权利要求6所述的微流体装置，其中所述支撑基座是玻璃支撑基座。

8.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述装置由选自由玻璃、硅、聚硅氧烷、光学透明的聚合物组成的组中的材料制成。

9.根据权利要求10所述的微流体装置，其中所述聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

10.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述第一通道的宽度小于所述第二通道的宽度。

11.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述第一通道和第二通道由圆形分布的微柱隔开。

12.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述下空腔和所述上空腔由水平的成排微柱隔开。

13.根据权利要求11所述的微流体装置，其中所述微柱的直径至少为0.45毫米。

14.根据权利要求11所述的微流体装置，其中所述微柱的高度为1.5毫米。

15.根据权利要求12所述的微流体装置，其中所述微柱的直径至少为0.45毫米。

16.根据权利要求12所述的微流体装置，其中所述微柱的高度为1.5毫米。

17.根据权利要求1所述的微流体装置，其中水凝胶分别包含在所述装置的所述第一通道、所述第二通道、所述下空腔和所述上空腔内。

18.根据权利要求17所述的微流体装置，其中所述水凝胶是I型胶原水凝胶。

19.根据权利要求1所述的微流体装置，其在所述上空腔中具有B细胞，并且在所述下空腔中具有T细胞。

20.一种包括所述微流体装置的芯片实验室，其中所述微流体装置包括：

第一通道；

第二通道，与所述第一通道相邻；

位于所述装置内中心的下空腔，

位于所述装置内中心的上空腔；

其中所述微流体装置模仿人淋巴结的解剖和生理结构。

21.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中

所述第一通道对应于淋巴结的被膜下淋巴窦区域；

所述第二通道对应于淋巴结的网状网络；

位于中心的所述下空腔对应于淋巴结的副皮质；以及

位于中心的所述上空腔对应于淋巴结的滤泡。

22.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述装置还包括入口孔和出口孔。

23.根据权利要求22所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述入口孔和所述出口孔允许将流体、气体和固体材料中的至少一种注入到所述装置内并通过所述装置。

24.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，还包括用于将所述装置密封至玻璃支撑基座的外表面。

25.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述装置由选自玻璃、硅、聚硅氧烷和光学透明聚合物的材料制成。

26.根据权利要求25所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

27.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述第一通道的宽度小于所述第二通道的宽度。

28.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述第一通道和第二通道由圆形分布的微柱隔开。

29.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述下空腔和所述上空腔被水平的成排微柱隔开。

30.根据权利要求28所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述微柱的直径为至少0.45毫米。

31.根据权利要求28所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述微柱的高度为1.5毫米。

32.根据权利要求29所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述微柱的直径为至少0.45毫米。

33.根据权利要求29所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述微柱的高度为1.5毫米。

34.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中水凝胶分别包含在所述装置的所述第一通道、所述第二通道、所述下空腔和所述上空腔内。

35.根据权利要求34所述的包括微流体装置的芯片实验室，其中所述水凝胶是I型胶原水凝胶。

36.根据权利要求20所述的包括微流体装置的芯片实验室，其在所述上空腔中具有B细胞，并且在所述下空腔中具有T细胞。

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