CN111246874A - 合胞素用于将药物和基因靶向递送至再生肌肉组织的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将药物靶向递送(包括基因递送)至再生肌肉组织的药物组合物，其至少包含与合胞素蛋白结合的治疗性药物或基因，及其在预防和/或治疗肌肉损伤或疾病中的用途，特别是在使用用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒或慢病毒样颗粒基因治疗所述疾病中的用途。

Description

合胞素用于将药物和基因靶向递送至再生肌肉组织的用途

技术领域

本发明涉及靶向再生肌肉组织的药物组合物及其在预防和/或治疗肌肉损伤或疾病中的用途。更特别地，本发明涉及合胞素用于通过注射将药物靶向递送(包括基因递送)至再生肌肉组织的用途。

背景技术

基因治疗可能为多种不同类型的遗传源的肌病提供治愈，但证明该途径是一项艰巨的努力。基因转移到骨骼肌存在很多困难。在肌肉中测试的各种载体已被证明具有免疫原性，并且目前，仅非炎性重组腺相关载体(rAAV)仍在临床前和临床研究中使用，旨在进行肌肉中的基因转移。这些rAAV在靶细胞中保持游离，并且由于它们不整合，因此无法在复制细胞中传播。这种作用方式对于分化后的有丝分裂组织(例如成年骨骼肌纤维)中的基因转移有用，但可能不允许在具有高增殖潜能的肌肉祖细胞中或在经历高度再生过程的肌肉组织中的长期基因表达。rAAV的第二个局限性是它的载量小，目前限制为4.5Kb，这阻止了该载体系统用于大基因(例如肌营养不良蛋白)的用途。另外，尽管rAAV不是炎性载体，但它仍能够诱导对其病毒衣壳的强免疫应答，如临床前模型和临床试验所证实的。除非向患者施用免疫抑制治疗，否则目前不可能再施用相同血清型的rAAV，而且在基因治疗的获益/风险分析中并非总是可能的。因此，需要另外的、新颖的、更加生理的基因治疗载体，其具有高载量并且可以允许基因转移到再生肌肉或肌肉祖细胞中。

作为大小约为120nm的包膜RNA颗粒的慢病毒载体(LV)是有效的药物递送工具，并且更特别是用于稳定的长期转导的有效基因递送工具。LV通过赋予其假型的包膜蛋白结合并进入靶细胞。一旦LV进入细胞，它释放衣壳成分并经历慢病毒RNA的逆转录，然后将前病毒DNA永久整合到靶细胞的基因组中。因此，LV使基因稳定地转移到复制细胞中。非整合型慢病毒载体已通过修改载体整合机制的特性而产生，并且可用于瞬时基因表达。缺乏前病毒的病毒样颗粒也已产生，并且可用于递送蛋白质或信使RNA。例如，LV可以用于基因添加、RNA干扰、外显子跳跃或基因编辑。所有这些途径都可以经由LV的假型通过组织或细胞靶向来实现。

LV最常用的假型是水泡性口炎病毒的G糖蛋白(VSVg)。VSVg的广泛趋向性可以在体外将普遍存在的基因递送至许多不同类型的细胞。LV-VSVg通常在造血系统基因治疗的情况下离体使用或用于产生CAR T细胞。LV还用于体内的一些应用中，其中向脑或眼施用少量载体。通常不进行LV-VSVg的全身施用，因为已知这些载体在小鼠体内具有免疫原性。实际上，体内VSVg结合补体，并且当体内使用时，其将转基因靶向递送至肝脏和淋巴器官，从而触发抗转基因免疫应答(Ciréet al.Plos One 9,e101644,2014)。因此，需要能够提供稳定的体内基因递送而不损失表达转基因的细胞的LV的新假型。这对于将基因转移到肌肉，特别是再生肌肉组织和肌肉祖细胞中可能是有用的。实际上，LV具有大载量，并且最近已表明可将肌营养不良蛋白cDNA(11kb)装配到LV盒中(Counsell et al.Sci.Report,2017,7:46880.doi:10.1038)，提供了治疗所有杜兴氏肌营养不良症患者的可能策略。

合胞素是具有促融合特性的内源性逆转录病毒(ERV合胞素)包膜糖蛋白(Dupressoir et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2005,102,725-730；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)。专利申请EP2385058已经描述了由ERVW-1基因(ENSG00000242950；也称为合胞素-1或HERV-W)编码的人内源性逆转录病毒包膜糖蛋白的促融合特性。所述申请描述了其通过形成合胞体在癌症治疗中的用途。鼠合胞素包括鼠合胞素-A(即：家鼠(mus musculus)合胞素-A，synA)和鼠合胞素-B(即：家鼠合胞素-B，synB)。

最近表明，由于尚无法解释的原因，鼠合胞素在骨骼肌中表达，特别是合胞素B对雄性小鼠的肌纤维再生很重要，但对雌性小鼠不重要(Redelsperger et al.,PLOSGenetics,2016,12(9):e1006289.doi:10.1371)。

还报道合胞素不会产生功能性假型，这可能是由于不当掺入病毒颗粒所致(Bacquin et al.,J.Virol.,2017,91(18):e00832-17.doi:10.1128)。

发明概述

出乎意料并且与现有技术所期望的相反，发明人发现合胞素可用于假型LV，因此可用于将基因稳定递送靶向再生肌肉组织而不会扩散到其他器官，从而避免肝脏毒性风险。

实际上，鼠合胞素-A糖蛋白已用于假型化编码若干转基因序列的HIV-1衍生的慢病毒载体：荧光素酶LucII有助于通过生物发光，或肌营养不良蛋白外显子23跳跃的小反义序列(U7mex23)或人α肌糖蛋白基因检测转基因表达，以显示功能性作用。将假型化LV肌肉内注射到具有正常骨骼肌(C57B16)的小鼠、肌营养不良蛋白缺陷的mdx小鼠、具有高再生骨骼肌纤维的杜兴氏肌营养不良症模型和正在经历肌肉再生的α-肌糖蛋白缺陷小鼠。通过在这些不同模型中比较合胞素A假型LV(LV-SynA)的作用，表明用合胞素A假型LV优先转导正在再生的肌肉。相比之下，将LV-SynA直接注入肌肉不会导致正常小鼠骨骼肌组织的明显转导。使用通常用作成肌细胞向成肌管分化的模型的鼠成肌细胞(C2C12)，无法从体外数据预测LV-SynA对再生肌肉的转导。实际上，在再生肌肉细胞中长期(至少50天)可再现地获得稳定的转基因表达，而在肝脏中没有表达。相反，用其他包膜(例如VSVg)假型化的LV仅提供临时表达。此外，LV-SynA载体的免疫原性低于LV-VSVg，因为它们在肌内或全身施用后诱导的转基因特异性免疫应答较少。此外，在具有合胞素-A LV载体的mdx小鼠中获得了诱导肌营养不良蛋白外显子跳跃的证据。通过用LV-SynA Sgca载体进行基因转移，可以在体内纠正sgca缺陷型小鼠的基因缺陷，并且可以通过在同一肌肉中重复注射该载体来增强治疗性转基因的表达。用人合胞素蛋白(如合胞素2)假型化的LV可用于转导人骨骼肌，以稳定表达转基因。

这些结果提供了概念证明，即合胞素可以可靠地用于治疗药物(如治疗基因或编码治疗药物的基因)向再生肌肉组织的靶向递送，特别是使用用合胞素假型化的慢病毒载体颗粒用于肌病的基因疗法，例如但不限于杜兴氏肌营养不良症和肢带肌营养不良症。

相比之下，尽管rAAV是肌肉注射的，但其分布远超出肌肉，并且被发现在肝脏中处于高水平。此外，由于LV载体的整合性质和用合胞素假型化的LV的较低免疫原性，预期LV-合胞素的体内基因递送比游离型rAAV更稳定。此外，LV的载量比rAAV大，并且可以掺入较大的转基因，例如肌营养不良蛋白cDNA。考虑到所有这些优点，用合胞素假型化的LV代表了用于肌病基因治疗的rAAV的非常有希望的替代物。

因此，本发明涉及靶向再生肌肉组织的药物组合物用于预防和/或治疗肌肉损伤或疾病的用途，所述药物组合物至少包含与合胞素蛋白相关的药物。

发明详述

根据本发明的合胞素(也称为ERV合胞素)是指来自真哺乳亚纲哺乳动物的高度促融合的包膜糖蛋白，其属于内源性逆转录病毒(ERV)家族。这些蛋白质由在胎盘中显示优先表达并在引入培养细胞时诱导形成合胞体的基因编码(Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)。

根据本发明的合胞素可以选自人合胞素(例如：HERV-W和HERV-FRD)、鼠合胞素(例如：合胞素-A和合胞素-B)、合胞素-Ory1、合胞素-Car1、合胞素-Rum1或它们的功能性直系同源物(Dupressoir et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2005,102,725-730；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)以及至少包含受体结合结构域的其功能性片段(对应于合胞素-1的残基117-144)。

功能性直系同源物意指由直系同源基因编码的并且表现出促融合特性的直系同源蛋白。如Dupressoir等(PNAS 2005)所述，可以在融合测定中评估促融合特性。简言之，例如通过使用Lipofectamine(Invitrogen)转染细胞，约1-2μg DNA用于5×10⁵个细胞或磷酸钙沉淀(Invitrogen，5-20μg DNA用于5×10⁵个细胞)。通常在转染后24-48小时检查平板的细胞融合。通过使用May-Grünwald和Giemsa染色(Sigma)可以看到合胞体，并且融合指数计算为[(N-S)/T]×100，其中N是合胞体中的核数，S是合胞体数，T是计数的核总数。

人合胞素包括HERV-W和HERV-FRD。这些蛋白质的功能性直系同源物可以在人科中发现。HERV-W是指属于人内源性逆转录病毒(HERV)家族的高促融合膜糖蛋白。HERV-W是包膜糖蛋白；它也称为合胞素-1。它具有Ensembl数据库中所示的序列，对应于转录物ERVW-1-001、ENST00000493463。相应的cDNA具有SEQ ID NO：1所示的序列。HERV-FRD也指属于人内源性逆转录病毒(HERV)家族的高促融合膜糖蛋白。HERV-FRD是包膜糖蛋白，也称为合胞素-2。它具有Ensembl数据库中所示的序列，对应于转录物ERVFRD-1、ENSG00000244476。相应的cDNA具有SEQ ID NO：2所示的序列。

鼠合胞素包括鼠合胞素-A(即：家鼠合胞素-A，synA)和鼠合胞素-B(即：家鼠合胞素-B，synB)。这些蛋白质的功能性直系同源物可以在鼠科家族中找到。鼠合胞素-A由合胞素-A基因编码。合胞素-A具有如Ensembl数据库Syna ENSMUSG00000085957中所示的序列。相应的cDNA具有SEQ ID NO：3所示的序列。鼠合胞素-B由合胞素-B基因编码。合胞素-B具有Ensembl数据库Synb ENSMUSG00000047977中所示的序列。相应的cDNA具有SEQ ID NO：4所示的序列。

合胞素-Ory1由合胞素-Ory1基因编码。合胞素-Ory1的功能性直系同源物可以在兔科家族(典型地是兔子和野兔)中找到。

合胞素-Car1由合胞素-Car1基因编码。合胞素-Car1的功能性直系同源物可以在来自劳亚兽总目的食肉动物哺乳动物中找到(Cornelis et al.,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2013,110,E828–E837；Lavialle et al.,Phil.Trans.R.Soc.B.,2013,368:20120507)。

合胞素-Rum1由合胞素-Rum1基因编码。合胞素Rum-1的功能性直系同源物可以在反刍哺乳动物中找到。

在本发明的各种实施方案中，根据本发明的合胞素可以典型地选自下组：HERV-W(合胞素-1)、HERV-FRD(合胞素-2)、合胞素-A、合胞素-B、合胞素-Ory1、合胞素-Car1和合胞素-Rum1及它们的功能性直系同源物；优选地，ERV合胞素选自下组：HERV-W、HERV-FRD、鼠合胞素-A、鼠合胞素-B及它们的功能性直系同源物，更优选地，ERV合胞素选自下组：HERV-W、HERV-FRD、鼠合胞素-A和鼠合胞素-B。在一些优选实施方案中，合胞素为合胞素A、合胞素-1或合胞素-2；优选合胞素-A或合胞素-2。

在本发明的各种实施方案中，使用本领域已知的标准偶联方法，通过共价或非共价偶联或键合，将治疗药物直接或间接地与合胞素蛋白结合。

在一些实施方案中，将药物共价偶联至合胞素蛋白。例如，药物可以与合胞素缀合。可以通过在合胞素蛋白中掺入反应性基团，然后使用该基团将药物共价连接来实现药物与合胞素的共价偶联。或者，可以将作为蛋白质的药物与合胞素融合以形成融合蛋白，其中合胞素和药物氨基酸序列直接连接或通过肽间隔子或接头连接。

在一些其他实施方案中，将药物和合胞素蛋白掺入药物递送载体，例如基于聚合物或基于颗粒的递送载体，包括但不限于胶束、脂质体、外泌体、树状聚合物、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、病毒样颗粒等。

如本文所用，术语“病毒载体”是指工程化以用于将遗传物质递送到细胞中的非复制性、非致病性病毒。在病毒载体中，复制和毒力必不可少的病毒基因已被异源目标基因取代。

如本文所用，术语“重组病毒”是指通过重组DNA技术产生的病毒，特别是病毒载体。

如本文所用，术语“病毒颗粒”或“病毒性颗粒”旨在表示非病原性病毒的胞外形式，特别是病毒载体，其由从DNA或RNA制成的遗传物质组成，并被蛋白外壳(称为衣壳)包围，在某些情况下被源自宿主细胞膜的一部分并且包括病毒糖蛋白的包膜包围。

如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指自组装、非复制、非致病性、无基因组的颗粒，其大小和构型与完整的感染性病毒颗粒相似。

在一些优选的实施方案中，将药物和合胞素蛋白掺入颗粒中，例如脂质体、外泌体、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒和病毒样颗粒。颗粒有利地选自下组：脂质体、外泌体、病毒颗粒和病毒样颗粒。病毒颗粒和病毒样颗粒包括病毒衣壳和包膜病毒或病毒样颗粒。包膜病毒或病毒样颗粒包括假型化病毒或病毒样颗粒。病毒或病毒样颗粒优选来自逆转录病毒，更优选来自慢病毒。病毒颗粒有利地来自病毒载体，优选慢病毒载体。

逆转录病毒特别包括γ逆转录病毒、泡沫病毒和慢病毒。慢病毒特别包括人免疫缺陷病毒，例如1型HIV(HIV1)和2型HIV(HIV2)和马传染性贫血病毒(EIAV)。

例如，慢病毒样颗粒描述于Muratori et al.,Methods Mol.Biol.,2010,614,111-24；Burney et al.,Curr.HIV Res.,2006,4,475-484；Kaczmarczyk et al.,Proc.Natl.Aca.Sci；U.S.A.,2011,108,16998–17003；Aoki et al.,Gene Therapy,2011,18,936-941。慢病毒样颗粒的实例是通过在生产者细胞中共表达产生的VLP，即具有gag的融合蛋白的合胞素蛋白(与目标基因融合的Gag)。

药物和/或合胞素可以呈现在颗粒的表面上，或包封(包装)入颗粒中。合胞素蛋白有利地呈现在颗粒的表面上，例如与颗粒偶联或掺入病毒颗粒或病毒样颗粒的包膜中(包被)以形成假型化包膜病毒颗粒或病毒样颗粒。将药物与颗粒偶联或包装入颗粒中。例如，将药物与病毒衣壳偶联或包装入病毒衣壳中，其中所述病毒衣壳可进一步包含包膜，优选用合胞素假型化。在一些优选的实施方案中，将药物包装入用合胞素蛋白假型化的颗粒中。包装入颗粒的药物有利地是异源目标基因，其被包装入病毒载体颗粒中，优选逆转录病毒载体颗粒中，更优选慢病毒载体颗粒中。

在一些更优选的实施方案中，颗粒是包膜病毒颗粒或病毒样颗粒，优选用合胞素蛋白假型化的包膜病毒颗粒或病毒样颗粒，甚至更优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒或用合胞素蛋白假型化的慢病毒样颗粒。用合胞素蛋白假型化的包膜病毒颗粒，优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒有利地包装了(异源)目标基因。在一些优选的实施方案中，将慢病毒载体颗粒，优选包装(异源)目标基因的慢病毒载体颗粒，用合胞素-A、合胞素-1或合胞素-2；优选合胞素-A或合胞素-2假型化。

在本发明的各种实施方案中，肌肉损伤或肌肉疾病(肌病)包括作为疾病生理病理过程的一部分的再生阶段。药物是通过靶向递送至再生肌肉组织的细胞，特别是肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞，更优选肌管、成肌细胞和/或卫星细胞来治疗肌肉损伤或疾病的任何目标药物。此类药物包括能够刺激肌肉再生，特别是骨骼肌再生的任何药物，例如但不限于：生长因子和前列腺素抗炎药；免疫治疗药，包括免疫调节药、免疫抑制药；抗组胺药、抗过敏药或免疫刺激药；抗感染药，例如抗菌、抗病毒、抗真菌或抗寄生虫药；抗癌药；治疗性蛋白质，包括治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶、治疗性肽、治疗性RNA和用于肌肉疾病和损伤治疗的目标基因，包括治疗性基因和编码上述治疗性蛋白质、治疗性肽和/或治疗性RNA的基因。药物可以是天然、合成或重组的分子或试剂，例如核酸、肽核酸(PNA)、蛋白质(包括抗体和抗体片段)、肽、脂质(包括磷脂、脂蛋白和磷脂蛋白)、糖、小分子、其他分子或试剂，或其混合物。例如，免疫抑制药物包括白介素10(IL10)、CTLA4-Ig和其他免疫抑制蛋白或肽。例如，治疗性抗体包括抗肌生成抑制蛋白的抗体。治疗性核酸(例如治疗性RNA)包括能够外显子跳跃的反义RNA(例如修饰的小核RNA(snRNA))、向导RNA或用于基因编辑的模板，以及干扰RNA(例如shRNA和microRNA)。

“用于治疗的目标基因”、“治疗目标基因”、“目标基因”或“异源目标基因”是指治疗性基因或编码用于治疗肌肉损伤或疾病(包括作为疾病生理病理过程的一部分的再生阶段)的治疗性蛋白质、肽或RNA的基因。

治疗性基因可以是基因或其片段的功能版本。功能版本或变体包括所述基因的野生型版本，属于相同家族的变体基因或保留编码蛋白的功能的截短版本。基因的功能版本可用于替代或加性基因治疗，以替代患者的缺乏或无功能的基因。基因功能版本或变体的片段可用作与基因组编辑酶结合使用的重组模板。

或者，目标基因可以编码包括治疗性抗体或抗体片段、基因组编辑酶或治疗性RNA的治疗性蛋白质。目标基因是能够在再生肌肉组织的细胞，特别是肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞和更优选肌管、成肌细胞和/或卫星细胞中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能性基因。治疗性蛋白质可以是能够刺激如上所述的肌肉再生的任何药物。

治疗性RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补。例如，治疗性RNA是干扰RNA，例如shRNA、microRNA、与Cas酶或类似酶组合用于基因组编辑的向导RNA(gRNA)、或能够外显子跳跃的反义RNA，例如修饰的小核RNA(snRNA)。干扰RNA或microRNA可用于调节参与肌病的靶基因的表达。与Cas酶或类似酶组合用于基因组编辑的向导RNA可用于修饰靶基因序列，特别是用于校正突变/缺陷基因的序列，或修饰参与肌病的靶基因的表达。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框并恢复具有破坏的阅读框的缺陷基因的表达。

根据本发明的基因组编辑酶是在靶基因组位点处诱导遗传修饰的酶或酶复合物。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，其在靶基因组基因座中产生双链断裂(DSB)，例如但不限于，大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)、来自簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)-Cas系统的Cas酶和类似的酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶，通常但不必定与通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组修饰靶基因组基因座的同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)结合使用。特别地，HR模板可以将目标转基因引入靶基因组基因座中或修复靶基因组基因座中的突变，优选在引起肌病的异常或缺陷基因中。

有利地，将目标基因包装入用合胞素蛋白假型化的包膜病毒载体颗粒中，优选用合胞素蛋白假型化的慢病毒载体颗粒中。病毒载体包含为可在肌肉细胞中表达的形式的目标基因。特别地，目标基因与在肌肉细胞中起作用的普遍存在的、组织特异性的或可诱导的启动子，例如脾病灶形成病毒(SFFV)启动子或合成的肌肉特异性启动子C5-12可操作地连接(Wang et al.,Gene Therapy,2008,15,1489-1499)。

在本发明的一些优选实施方案中，包括用于治疗肌肉损伤或疾病的目标基因的目标药物对肌病是特异性的，因为它靶向在肌肉细胞(特别是骨骼肌细胞)中特异性表达的参与肌病的基因或基因产物(蛋白质/肽)。特别地，与其他细胞类型相比，靶基因或基因产物在肌肉细胞中高度表达。靶基因或基因产物还包括来自引起感染性肌炎的细菌、真菌、寄生虫和病毒制剂的基因和基因产物，例如但不限于金黄色葡萄球菌、念珠菌属、旋毛虫属、病毒(如甲型和乙型流感)以及肠病毒(如柯萨奇)。

本发明涵盖包含两种或多种与合胞素蛋白相关的药物的药物组合物，和/或其中至少两种不同的合胞素蛋白与一种或多种药物相关的组合物。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装包括目标基因的目标药物的慢病毒颗粒通过转导再生肌肉组织的细胞，例如特别是肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞和更优选肌管、成肌细胞和/或卫星细胞用于肌肉损伤或肌病(包括作为疾病生理病理过程的一部分的再生阶段)的任何靶向治疗。

肌肉细胞(肌细胞)是细长细胞，其长度为几毫米到约10厘米，宽度为10-100微米。分别取决于是否存在被称为肌丝的肌原纤维收缩蛋白的有组织的规律重复的排列，这些细胞在可以是横纹的或平滑的组织中连接在一起。横纹肌可进一步分为骨骼肌或心肌。

通过肌腱附着在骨骼上的骨骼肌由周围神经系统控制，并与机体的自发运动有关。骨骼肌是横纹肌。骨骼肌细胞被保护和支撑肌肉纤维束的结缔组织覆盖。血管和神经穿过结缔组织，为肌肉细胞提供氧和使肌肉收缩的神经冲动。

在心肌中，细胞之间通过插入的闰盘相互连接，从而使心跳同步。心肌是分支的横纹肌。心脏壁由三层组成：心外膜、心肌层和心内膜。心肌层是心脏的中间肌肉层。心肌肌肉纤维通过心脏传递电脉冲，为心脏传导提供动力。

内脏肌肉(平滑肌)存在于机体的各个部位，包括血管、膀胱、消化道以及许多其他中空器官。像心肌一样，大多数内脏肌肉受自主神经系统调节并处于非自愿控制之下。内脏肌肉无交叉条纹。内脏肌肉的收缩比骨骼肌慢，但收缩可以持续更长的时间。心血管系统、呼吸系统、消化系统和生殖系统的器官衬有平滑肌。

损伤后的肌肉再生与胚胎发生过程中的肌肉发育相似。骨骼肌修复是高度同步的过程，涉及各种细胞和分子反应的激活，其中炎症和再生之间的协调对于肌肉损伤后修复过程的有益结果至关重要。损伤后的肌肉组织修复可被认为是由两个相互依赖的阶段组成的过程：退化和再生，其中除了生长和分化因子的作用外，损伤程度以及肌肉与浸润性炎性细胞之间的相互作用似乎都在影响肌肉修复过程的成功结果。肌肉再生取决于促炎和抗炎因子之间的平衡，这些因子决定了是否通过肌肉纤维置换和功能性收缩装置的重建或疤痕形成来解决损伤。

肌纤维受损后，静止的卫星细胞被激活以进入细胞周期并增殖，从而允许肌源细胞群扩增。在这一阶段，卫星细胞被称为肌源前体细胞。增殖期之后是具有受损的肌纤维的成肌细胞(分化的卫星细胞)的分化和融合，以修复纤维，或相互修复，形成新的肌纤维。

表达Myf5和MyoD的肌源细胞称为成肌细胞。继发性肌源性调节因子(MRF)肌成蛋白和MRF4的上调诱导成肌细胞最终分化为肌细胞，这些细胞现在不仅表达肌成蛋白和MRF4，而且还表达肌肉细胞的重要基因，如肌球蛋白重链(MHC)和肌酸激酶(MCK)。最终，单核肌细胞融合形成多核合胞体(肌管)，其最终成熟为收缩肌纤维(肌细胞)。

由于卫星细胞的激活不仅限于受损部位，因此损伤激活所有沿着肌纤维的卫星细胞，从而导致卫星细胞增殖和迁移至再生部位。

卫星细胞(肌源细胞)位于单个肌纤维周围的基底层内，在肌纤维的质膜和基底膜之间。与成年肌纤维相比，它们具有独特的形态特征，包括丰富的细胞质、具有增加的异染色质含量和减少的细胞器含量的小核。这些特征反映了这样的事实，即卫星细胞有丝分裂地静止并且转录活性低于肌核。

骨骼肌在重复损伤后具有完全再生和修复的能力。这种能力表明卫星细胞池在每个再生过程后都会更新。但是，已提出卫星细胞的自我更新能力是受限的。因此，几轮再生后卫星细胞池的耗尽可能导致老年人或肌病患者的临床恶化。有关肌肉再生的详细综述，参见Karalaki M,Fili S,Philippou A,Koutsilieris M.Muscle regeneration:cellularand molecular events.In Vivo.2009Sep-Oct；23(5):779-96；Baghdadi and Tajbakhsh2018(Meryem B Baghdadi,Shahragim Tajbakhsh.Regulation and phylogeny ofskeletal muscle regeneration..Developmental Biology,Elsevier,20172018)。

本发明的组合物允许靶向递送至再生肌肉组织，特别是骨骼肌组织和/或心肌组织的细胞。典型地，该组合物允许靶向递送至再生肌肉组织的细胞，例如特别是肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞和更优选肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。

如本文所使用，术语“再生肌肉组织”是指经历再生(即肌发生和新的肌肉形成)的肌肉组织。

在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装目标药物或基因(优选目标基因)的慢病毒载体颗粒用于肌病的(靶向)基因治疗。

基因疗法可以通过以下进行：基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、顺式剪切，或细胞中任何编码或调控序列，包括在细胞核、线粒体中含有的那些或作为共生核酸(例如但不限于细胞中含有的病毒序列)的任何其他遗传修饰。

两种主要的基因疗法如下：

-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替代基因的疗法：这是替代或加性基因疗法；

-旨在基因或基因编辑的疗法：这种情况下，目的是为细胞提供必要工具以纠正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调控，从而表达功能性基因：这是基因编辑疗法。

在加性基因疗法中，目标基因可以是患者中缺陷或突变的基因的功能性版本，例如在遗传疾病中就是这种情况。在这种情况下，目标基因将恢复功能性基因的表达。更优选地，在这种实施方案中，本发明的组合物优选包含编码目标基因的病毒载体。甚至更优选地，病毒载体是整合病毒载体，例如逆转录病毒，特别是如前所述的慢病毒。

基因或基因组编辑使用一种或多种目标基因，例如：(i)编码如上定义的治疗性RNA的基因，例如干扰RNA(如shRNA或microRNA)；与Cas酶或类似酶组合使用的向导RNA(gRNA)；或能够外显子跳跃的反义RNA，例如修饰的小核RNA(snRNA)；(ii)编码如上定义的基因组编辑酶的基因，例如工程化核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物基核酸酶(TALEN)、Cas酶或类似的酶；或这些基因的组合，以及最终还有如上所定义的用作重组模板的基因的功能性版本的片段。可以使用非整合型病毒载体，例如非整合型慢病毒载体来进行基因编辑。

特别令人感兴趣的是表现出肌病的患者的缺陷或突变基因，一旦在再生肌肉组织细胞中进行纠正，则会改进患者的疾病或症状。来自再生肌肉组织，特别是骨骼和/或心肌组织的细胞优选是肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞，更优选是肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。

根据本发明的肌病包括但不限于以下所列疾病。

肌肉疾病也称为肌病，是指其中肌肉纤维无法正常起作用的疾病，其通常与肌肉损伤有关。根据本发明的肌病包括但不限于：

-包括先天性肌营养不良的营养不良(或肌营养不良)是肌病的亚群，其特征在于肌肉退化和再生。先天性肌营养不良症(CMD)的特点是通过免疫组织化学发现了明显的营养不良性变化：肌肉纤维坏死和再生、肌内膜结缔组织增加以及肌肉被脂肪组织替代。经典CMD在临床上仅限于肌肉骨骼系统，但其他CMD的特征在于明显的脑神经元迁移缺陷和眼部异常。营养不良包括：

-肌营养不良症，其包括由DMD基因的致病性变体引起的一系列X连锁性肌病，该疾病编码蛋白质肌营养不良蛋白。肌营养不良症包括杜兴氏肌营养不良症、贝克尔肌营养不良症(BMD)和DMD相关性扩张型心肌病。DMD是其中致病性变体引起肌营养不良的唯一基因。已在DMD或BMD患者中鉴定出5,000多种致病性变体。致病等位基因高度可变，包括整个基因的缺失、一个或多个外显子的缺失或重复、以及小的缺失、插入或单碱基改变(参见DarrasBT,Miller DT,Urion DK.Dystrophinopathies.2000Sep 5[Updated 2014Nov 26].In:Pagon RA,Adam MP,Ardinger HH,et al.,editors.

[Internet].Seattle(WA):University of Washington,Seattle；1993-2017.Available from:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1119/,以及OMIM Entries forDystrophinopathies 300376,300377,302045and 310200)。

-肢带肌营养不良症(LGMD)，其是一组与DMD临床相似的疾病，但由于常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传而在两性中均发生。肢带营养不良由编码肌糖蛋白和与肌肉细胞膜相关的其他蛋白的基因的突变引起，所述肌肉细胞膜与肌营养不良蛋白相互作用。术语LGMD1是指显示显性遗传(常染色体显性)的遗传类型，而LGMD2是指具有常染色体隐性遗传的类型。已报道超过50个基因座的致病性变体。

常染色体显性LGMD(LGMD1)包括：

-由MYOT突变引起的LGMD1A(肌松弛症)。

-由LMNA突变引起的LGMD1B。LMNA的致病性变体导致至少11种等位基因病症，包括LGMD1B、常染色体显性遗传和常染色体隐性隐性Emery-Dreifuss肌营养不良症、邓尼根型家族性部分脂肪营养不良症(FPLD)、下颌骨发育不良、Hutchinson-Gilford早衰综合征和Charcot-Marie-Tooth型2B1。

-由编码Caveolin-3的基因CAV3突变引起的LGMD1C(小血管病变)。

-LGMD1D，其由编码作为HSP/DNAJ家族的分子辅助伴侣的成员的蛋白质的DNAJB6突变引起，该辅助伴侣在蛋白质合成或细胞应激过程中参与保护蛋白质免受不可逆的聚集。

-LGMD1E，其由desmin基因(DES)突变引起。

-LGMD1F(TNPO3基因)、LGMD1G(HNRNPDL基因)和LGMD1H。

常染色体隐性LGMD包括：

-肌聚糖病，包括由SGCA突变引起的α-肌聚糖病(LGMD2D)；由SGCB基因突变引起的β-肌聚糖病(LGMD2E)；由SGCG基因突变引起的γ-肌聚糖病(LGMD2C)；由SGCD基因突变引起的δ-肌聚糖病(LGMD2F)。

-钙蛋白酶病(LGMD2A)，其由具有超过450种致病性变体的CAPN3基因突变引起。

-Dysferlin肌病(LGMD2B)。Dysferlin(DYSF基因)是一种肌膜蛋白，其包括被认为对钙介导的囊泡与肌膜融合和骨骼肌纤维膜修复很重要的C2结构域。

-涉及TCAP致病性变体的LGMD2G。

-涉及TRIM32中报道的致病性变体的LGMD2H，所述致病性变体包括两个错义变体、一个密码子缺失和两个移码变体。

-与O-联糖基化酶缺陷有关的营养不良(Dystroglycanopathies)。包括LGMD2I(由FKRP基因突变引起)、LGMD2K(由POMT1基因突变引起)、LGMD2M(由FKTN基因突变引起)、LGMD2O(由POMGNT1基因突变引起)、LGMD2N(由POMT2基因突变引起)。

-由ANO5的缺陷变体引起的LGMD2L，其编码actonamin(假定的钙激活的氯离子通道)，可能参与了肌营养不良症的膜修复机制。

-由TTN基因的缺陷变体引起的LGMD2J。

-由DAG1基因的缺陷变体引起的LGMD2P

-由PLEC的缺陷变体引起的LGMD2Q。

-由DES的缺陷变体引起的LGMD2R。

-由TRAPPC11的缺陷变体引起的LGMD2S。

-由GMPPB的缺陷变体引起的LGMP2T。

-由ISPD的缺陷变体引起的LGMD2U。

-由GAA的缺陷变体引起的LGMD2V。

-由LIMS2的缺陷变体引起的LGMD2W。

-由BVES的缺陷变体引起的LGMD2X。

-由TOR1AIP1的缺陷变体引起的LGMD2Y。

-由包括EMD基因(编码emerin的基因)、FHL1基因和LMNA基因(编码lamin A和C)的基因之一的缺陷引起的Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)。

-分别由SYNE1和SYNE2基因缺陷引起的Nesprin-1和Nesprin-2相关性肌营养不良；由TMEM43基因缺陷引起的LUMA相关性肌营养不良；由TOR1AIP1基因缺陷引起的LAP1B相关性肌营养不良。

-1型Facio-scapulo-humeral肌营养不良(FSHD1A)，例如与DUX4基因缺陷(染色体4q35的亚端粒区域中D4Z4大卫星重复序列收缩)或FRG1基因有关；由SMCHD1基因缺陷引起的2型(FSHD1B)。

-由PTRF基因缺陷引起的肌营养不良症，伴有普遍性脂肪营养不良。

-由DPM3基因缺陷引起的先天性糖基化Io型肌营养不良症。

-由VCP基因缺陷引起的肩腓骨肌营养不良和头颅下垂综合征。

-由SMN1和/或SMN2的致病性变体引起的脊髓性肌萎缩症。

-由编码聚腺苷酸结合核蛋白1的基因PABPN1的致病性变体引起的眼咽肌营养不良症(OPMD)。

-先天性肌营养不良症，包括先天性肌营养不良症伴黑素蛋白缺乏症(LAMA2基因)；Bethlem肌病(COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1基因)；由于COL12A1、COL6A2、SEPN1、FHL1、ITGA7、DMM2、TCAP和LMNA基因缺陷导致的Ullrich综合征(COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1基因)和其他先天性肌营养不良症；糖基化缺陷导致的先天性肌营养不良症(FKTN、POMPT1、POMPT2、FKRP、POMGNT1、POMGNT2、ISPD、B3GNT1、GMPPB、LARGE、DPM1、DMP2、ALG13、B3GALNT2、TMEM5、POMK基因)；其他先天性肌营养不良症(CHKB、ACTA1、TRAPPC11、GOLGA2、TRIP4基因)。

-先天性肌病的特征主要在于与肌肉的收缩能力下降有关的肌肉无力。先天性肌病包括但不限于：

-肾上腺肌病，其特征在于肌肉中存在“肾上腺棒”，并且已经鉴定了十个基因(NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40和KLHL41)的致病性变体。

–轴空肌病(中央轴空肌病和多微小轴空肌病)，其特征在于肌肉纤维破裂的多个小“轴空”或区域。轴空肌病是先天性肌病的最常见形式，并且最常与RYR1突变相关。还分别在多个微小轴空和轴空-杆肌病(core-rod myopathies)中观察到SEPN1基因(编码SELENON)或encodin原肌球蛋白基因和KBTKD13基因中的突变。MEGF10基因中的突变也已在具有微小轴空的先天性肌病中公开。

-伴纤维型失衡的先天性肌病(MYH7基因)；眼肌麻痹近侧肌病(MYH2基因)；孤立性包涵体肌病(HNRNPA1基因)；先天性骨骼肌病和致命性心肌病(MYBPC3基因)；先天性致死性肌病(CTCN1基因)；肾小管肌病(TRIM32基因)；与PTPLA相关的先天性肌病(PTPLA基因)；伴有与CACNA1S相关的伴眼肌麻痹的先天性肌病(CACNA1S基因)。

-与MTM1(编码肌管蛋白)、DNM2、BIN1、TNN、SPEG基因的变体相关的中心核肌病(或肌管肌病)。

-与DYSF、TTN、GNE、MYH7、MATR3、TIA1、MYOT、NEB、CAV3、LDB3、ANO5、DNM2、KLHL9、FLNC、VCP、ADSSL1基因缺陷相关的远端肌病。

-与CRYAB、DES、EPN1、LDB3、MYOT、FLNC、BAG3、TRIM54、TRIM63、KY基因缺陷相关的肌原纤维肌病。

-与LAMP2、VMA21、CLN3、PABPN1、TNN、PLEC、MSTN、ACVR1、CAV3、FHL1、VCP、ISCU、RYR1、PYRODX1基因缺陷相关的混杂肌病(Miscellaneous myopathies)。

-与DMPK、CNPB、CLCN1、CAV3、HSPG2、ATP2A1基因缺陷相关的肌强直综合征；肌强直包括先天性肌强直、先天性副肌强直和肌强直性营养不良。

-与氯离子通道(CLCN1)、钠离子通道(SCN4A、SCN5A)、钙离子通道(CACNA1S、CACNA1A)、钾离子通道(KCNE3、KCNA1、KCNJ18、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、KCNE2、KCNE1)基因缺陷相关的离子通道肌肉疾病。离子通道肌肉疾病的实例是周期性麻痹。

-与RYR1、CACNA1S基因和其他未知基因缺陷有关的恶性高热。

-代谢性肌病，其由主要影响肌肉的生化代谢缺陷引起的，包括：

-糖原贮积病，例如：

-与PGK1、PGAM2、LDHA、ENO3基因缺陷相关的糖酵解途径疾病。

-由于CPT2、SLC22A5、LC25A20、ETFA、ETFB、ETFDH、ACADVL、ACAD9、ABHD5、PNPLA2、LPIN1、PNPLA8基因缺陷导致的脂质代谢紊乱。

-与GMPPB、MYO9A、SLC5A7、COL13A1、LRP4、PREPL、ALG14、ALG2、PLEC、SCN4A、LAMB2、DPAGT1、GFPT1、AGRN、DOK7、MUSK基因缺陷相关的先天性肌无力综合征。

-线粒体肌病，其由于线粒体基因(例如CHKB、MRPL3、NDUAF1、AARS2、MRPL44、MTO1、TSFM、CHCHD10、SLC25A42、PUS1、ADCK3、MARS2、MTPAP、YARS2、TK2和SUCLA2)的缺陷引起。实例包括Kerans-Sayre综合征(KSS)、Leigh综合征和母系遗传的Leigh综合征(MILS)、线粒体DNA耗竭综合征、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)；伴破碎红纤维的肌阵挛性癫痫发作(MERFF)、神经病、共济失调和色素性视网膜炎(NARP)；皮尔逊综合症和进行性眼外肌麻痹。

-脂质贮积病，包括Niemann-Pick病(A、B、E、F型：SMPD1基因；C、D型：NPC1基因)、法布里病(编码α-半乳糖苷酶A的GLA基因)、克拉伯病(GALC基因)、戈谢病(GBA基因)、Tay-Sachs病(HEXA基因)、异染性脑白质营养不良(ARSA基因)、多种硫酸酯酶缺乏症(SUMF1基因)和Farber病(ASAH1基因)。

-与MYH6、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYL3、TTN、MYL2、ACTC1、CSRP3、TNNC1、VCL、MYLK2、CAV3、MYOZ2、JPH2、PLN、NEXN、ANKRD1、ACTN2、NDUAF1、TSFM、AARS2、MRPL3、COX15、MTO1、MRPL44、LMNA、LDB3、SCN5A、DES、EYA4、SGCD、TCAP、ABCC9、PLN、TMPO、PSEN2、CRYAB、FKTN、TAZ、DMD、LAMA4、ILK、MYPN、RBM20、SYNE1、MURC、DOLK、GATAD1、SDHA、GAA、DTNA、FLNA、TGFB3、RYR2、TMEM43、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CTNNA3、CASQ2、ANK2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNAC1、SCN4B、AKAP9、SNTA1、KCNJ5、KCNH2、KCNQ1、NPPA、KCNA5、GJA5、SCN1B、SCN2B、NUP155、GPD1L、CACNA1、CACNB2、KCNE3、SCN3B、HCN4基因缺陷有关的遗传性心肌病。

-由TOR1A、SGCE、IKBKAP、KIF21A、PHOX2A、TUBB3、TPM2、MYH3、TNNI2、TNNT3、SYNE1、MYH8、POLG、SLC25A4、C10orf2、POLG2、RRMB2、TK2、SUCLA2、SLC25A42、OPA1、STIM1、ORAI1、PUS1、CHCHD10、CASQ1、YARS2、FAM111B基因缺陷引起的神经肌肉疾病。

-神经源性肌病，包括各种类型的以肌肉萎缩为特征并且由包括DNM2、YARS、MP2、INF2、GNB4和MTMR2的各种基因突变引起的Charcot-Marie-Tooth病，特别是MTMR2基因缺陷引起的4B1型Charcot-Marie-Tooth病；以肌肉萎缩为特征并且由包括DCTN1、PRPH、SOD1和NEFH的各种基因突变引起的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

-炎性肌病，其由免疫系统攻击肌肉成分，导致肌肉发炎迹象的问题引起。炎性肌病包括自身免疫性肌病，例如多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎和重症肌无力。

-横纹肌溶解、间室综合征或肌红蛋白尿。横纹肌溶解是受损骨骼肌迅速分解的疾病。肌红蛋白尿是尿中存在肌红蛋白，通常与横纹肌溶解或肌肉破坏有关。创伤、血管问题、恶性高热和某些药物是可破坏或损坏肌肉，将肌红蛋白释放到循环中的情况的实例。肌红蛋白尿的其他原因还包括：McArdle病、磷酸果糖激酶缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症、恶性高热、多肌炎、乳酸脱氢酶缺乏症、热或电灼伤。

-肌肉坏死(特别由于代谢衰竭和/或膜损伤引起)、扭伤、扩张、痉挛、肌腱炎、挛缩(如Volkmann缺血性挛缩或Dupuytren挛缩)、肌肉感染、肌筋膜疼痛和肌肉抽搐。

根据本发明的肌肉疾病优选包括涉及肌肉再生周期的疾病，例如但不限于肌营养不良症、横纹肌溶解、肌肉萎缩、肌肉坏死和自身免疫性肌病，例如重症肌无力和与肌肉损伤有关的其他肌病。

肌肉受伤包括但不限于由以下引起的肌肉损伤：

-直接创伤；

-体育锻炼或过度使用；

-间室综合征；

-药物滥用(例如酒精性肌病)或药物(例如导致肌肉萎缩的糖皮质激素性肌病)或暴露于肌毒剂(包括放射线)；

-恶性高热；

-缺血；

-暴露于高温或低温或电灼伤。

如上所述的影响肌肉的遗传性疾病中的突变基因的实例包括：

–参与肌营养不良的基因，如DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、TNPO3、HNRNPDL、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、DAG1、DES、TRAPPC11、GMPPB、ISPD、GAA、LIMS2、BVES、TOR1AIP1、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SYNE1、SYNE2、TMEM43、DUX4、FRG1、SMCHD1、PTRF、DPM3、VCP、SMN1、SMN2、PABPN1、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL12A1、FHL1、ITGA7、DMM2、TCAP、LMNA、FKTN、POMPT1、POMPT2、FKRP、POMGNT1、POMGNT2、ISPD、B3GNT1、GMPPB、LARGE、DPM1、DMP2、ALG13、B3GALNT2、TMEM5、POMK、CHKB、ACTA1、TRAPPC11、GOLGA2和TRIP4；

–参与先天性肌病的基因，如NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、MEGF10,MYH7、MYH2、HNRNPA1、MYBPC3、CTCN1TRIM32PTPLA、CACNA1S、MTM1、DNM2、BIN1、TNN和SPEG；

–参与远端肌病的基因，如DYSF、TTN、GNE、MYH7、MATR3、TIA1、MYOT、NEB、CAV3、LDB3、ANO5、DNM2、KLHL9、FLNC、VCP和ADSSL1；

–参与肌原纤维肌病的基因，如CRYAB、DES、SEPN1、LDB3、MYOT、FLNC、BAG3、TRIM54、TRIM63和KY；

–参与混杂肌病的基因，如LAMP2、VMA21、CLN3、PABPN1、TNN、PLEC、MSTN、ACVR1、CAV3、FHL1、VCP、ISCU、RYR1和PYRODX1；

–参与强直性综合征的基因，如DMPK、CNPB、CLCN1、CAV3、HSPG2和ATP2A1；

–参与离子通道肌肉疾病的基因，如CLCN1、SCN4A、SCN5A,CACNA1S、CACNA1A、KCNE3、KCNA1、KCNJ18、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、KCNE2和KCNE1；

–参与恶性高热的基因，如RYR1和CACNA1S；

–参与代谢性肌病(如糖原贮积病)的基因，如GYS1、GAA、GBE1、AGL、PYGM、PKFM、PHKA1、PGM1、GYG1、ALDOA、ENO3、PRKAG2和RBCK1；糖酵解途径疾病：PGK1、PGAM2、LDHA和ENO3；脂质代谢异常，如CPT2、SLC22A5、LC25A20、ETFA、ETFB、ETFDH、ACADVL、ACAD9、ABHD5、PNPLA2、LPIN1和PNPLA8；

–参与线粒体肌病的基因，如CHKB、MRPL3、NDUAF1、AARS2、MRPL44、MTO1、TSFM、CHCHD10、SLC25A42、PUS1、ADCK3、MARS2、MTPAP、YARS2、TK2和SUCLA2；

–参与先天性肌无力综合征的基因，如GMPPB、MYO9A、SLC5A7、COL13A1、LRP4、PREPL、ALG14、ALG2、PLEC、SCN4A、LAMB2、DPAGT1、GFPT1、AGRN、DOK7和MUSK；

–参与遗传性心肌病的基因，如MYH6、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYL3、TTN、MYL2、ACTC1、CSRP3、TNNC1、VCL、MYLK2、CAV3、MYOZ2、JPH2、PLN、NEXN、ACTN2、NDUAF1、TSFM、AARS2、MRPL3、COX15、MTO1、MRPL44、LMNA、LDB3、DES、EYA4、SGCD、TCAP、ABCC9、PLN、TMPO、PSEN2、CRYAB、FKTN、TAZ、DMD、LAMA4、ILK、MYPN、RBM20、ANKRD1、SYNE1、MURC、DOLK、GATAD1、SDHA、GAA、DTNA、FLNA、TGFB3、RYR2、TMEM43、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CTNNA3、CASQ2、ANK2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNAC1、SCN4B、AKAP9、SNTA1、KCNJ5、KCNH2、KCNQ1、NPPA、KCNA5、GJA5、SCN1B、SCN2B、NUP155、SCN5A、GPD1L、CACNA1、CACNB2、KCNE3、SCN3B和HCN4；

–参与神经肌肉疾病的基因，如TOR1A、SGCE、IKBKAP、KIF21A、PHOX2A、TUBB3、TPM2、MYH3、TNNI2、TNNT3、SYNE1、MYH8、POLG、SLC25A4、C10orf2、POLG2、RRMB2、TK2、SUCLA2、SLC25A42、OPA1、STIM1、ORAI1、PUS1、CHCHD10、CASQ1、YARS2和FAM111B；以及

–参与神经源性肌病的基因，如MTMR2、DNM2、YARS、MP2、INF2、GNB4和MTMR2(Charcot-Marie-Tooth病)；DCTN1、PRPH、SOD1和NEFH(肌萎缩性侧索硬化(ALS))。

优选地，根据本发明的目标基因选自在肌肉中主要或特异性表达的基因，包括但不限于下组：DMD、MYOT、CAV3、DES、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、POMT1、POMGNT1、POMT2、ANO5、FKTN、FKRP、TTN、EMD、FHL1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KHL40、KHL41、RYR1、MTM1、SEPN1、DUX4、FRG1、MTMR2、肌肉糖原磷酸化酶(PYGM)和肌肉磷酸果糖激酶(PKFM)。

这种基因可以在替代基因疗法中靶向再生肌肉组织，其中目标基因是缺陷或突变基因的功能性版本。

或者，这些基因可用作基因编辑的靶标。基因编辑的一个具体实例将是治疗由α-糖聚糖基因(SGCA)突变引起的肢带肌营养不良症2D(LGMD2D)。SGCA外显子3中最常报告的突变229CGC>TGC(R77C)导致精氨酸被半胱氨酸取代。因此，通过在患病的患者中编辑该基因的正确版本的基因，这可能有助于针对该疾病的有效治疗。可以使用相同的原理通过基因编辑来治疗以上所列的其他遗传性肌病。

在基因疗法中，通过转导所述细胞，可能可以使用如前所述的本发明组合物，更具体地，将根据本发明的用合胞素假型化的稳定的慢病毒颗粒用于肌肉组织工程，优选内源性肌肉干细胞(包括卫星细胞)工程的治疗中(Nichols JE,Niles JA,Cortiella J.Designand development of tissue engineered muscle:Progress andchallenges.Organogenesis.2009,5,57-61)。

也可以插入有利于基因剪接、表达或调控或基因编辑的序列。工具(如CRISPR/Cas9)可用于此目的。在自身免疫或癌症的情况下，它可用于修饰再生肌肉组织的细胞中的基因表达，或扰乱病毒在此类细胞中的周期。在这种情况下，优选地，异源目标基因选自编码向导RNA(gRNA)、位点特异性核酸内切酶(TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas核酸酶)、DNA模板和RNAi成分(例如shRNA和microRNA)的那些。

为了治疗感染性肌病，目标基因也可以靶向肌肉病原体生命周期的必要成分。

可以将根据本发明的包含稳定的假型化慢病毒颗粒的药物组合物一起或顺次用于靶向相同的细胞。这在其中需要将基因编辑平台的多种成分添加到细胞中的策略(例如基因编辑)中可能是一个优势。

在本发明的一些其他实施方案中，包含与合胞素蛋白相关的药物的本发明药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物或目标基因(优选目标基因)的慢病毒颗粒用于免疫调节或调节肌肉移植耐受性，特别是在复合组织同种异体移植的情况下，最近已将这种复合组织引入作为复杂重建程序(包括外伤、癌症消融手术或继发于烧伤的大量组织丧失)的潜在临床治疗方法。复合组织同种异体移植物(CTA)由异质组织组成，该异质组织包括皮肤、脂肪、肌肉、神经、淋巴结、骨骼、软骨、韧带和具有不同抗原性的骨髓。因此，复合组织结构被认为比实体器官移植更具免疫原性。因此，将组合物施用于移植供体以预防肌肉移植排斥。对于这些用途，该药物特别是免疫抑制药物，例如IL-10、CTLA4-Ig或其他免疫抑制肽或改进淋巴管生成的VEGF突变体(Cui et al.J.Clin.Invest.2015,Nov 2；125(11):4255-68.)，并且目标基因是编码所述免疫抑制药物或VEGF突变体的基因。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的与合胞素蛋白相关的药物。

在本发明的上下文中，如本文所用，术语“治疗”是指逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的发展，或逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的一种或多种症状的发展。

同样，治疗有效量是指足以逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的发展，或逆转、缓解或抑制该术语所适用的疾病或病症的一种或多种症状的发展的剂量。

有效剂量的确定和调节取决于各种因素，例如所使用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及医学领域将认可的其他因素。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或介质。

“药学上可接受的载体”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时不产生有害、过敏或其他不良反应的介质。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。

优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言是药学上可接受的介质。这些可以特别是等渗无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的(尤其是冷冻干燥)的组合物，其在添加无菌水或生理盐水(取决于情况)时，允许构成可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体。溶液或悬浮液可以包含添加剂，该添加剂与包膜病毒相容且不阻止病毒进入靶细胞。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是以易于注射的程度流动的。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

本发明还提供了一种治疗肌肉疾病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。预期用合胞素假型化的LV的较低的免疫原性将通过重复施用药物组合物在来自再生肌肉组织的细胞中允许长期基因表达。

如本文所用，术语“患者”或“个体”表示哺乳动物。优选地，根据本发明的患者或个体是人。

通常根据已知方法，以有效诱导患者治疗效果的剂量和时间段施用本发明的药物组合物，特别是包含如前所定义的在其表面上呈现合胞素的颗粒的组合物，甚至更优选地用合胞素假型化的包装目标药物(包括目标基因)的慢病毒颗粒。

施用可以通过注射、口服或局部施用。注射剂可以是皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)或其他。优选地，通过注射进行施用。优选地，注射是肌内注射。

本发明还涉及如上所定义的用于靶向再生肌肉组织的药物组合物，其包含特异于与合胞素蛋白相关的肌病的目标药物，其中包括目标基因的目标药物靶向如上文所定义的在肌肉细胞中特异性表达或主要表达的参与一种或多种肌病的基因或基因产物(蛋白质/肽)。

在一些优选实施方案中，药物组合物包含用于肌病的基因治疗的目标基因。优选地，目标基因靶向负责影响肌肉组织的遗传性疾病的基因，例如，所述遗传性疾病特别选自下组：肌营养不良症，包括营养不良性疾病、肢带肌营养不良症(如肌聚糖病、钙蛋白病和神经营养障碍)、Emery-Dreifuss肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症、眼咽肌营养不良症、Nesprin-1、Nesprin-2和LUMA相关肌营养不良症、Facio-Scapulo-Humeral肌营养不良症(FSDH；1型和2型)、具有普遍性脂代谢障碍的肌营养不良症、具有先天性糖基化Io型疾病的肌营养不良症、肩腓骨肌营养不良和头颅下垂综合征和先天性肌营养不良症；远端肌病；肌原纤维肌病；混杂肌病；强直性综合征；离子通道肌肉疾病，例如家族性周期性麻痹；恶性高热；先天性肌病，包括肾上腺肌病、轴空肌病和中央轴空肌病；线粒体肌病；代谢性肌病，包括糖原贮积病，例如庞贝氏病、科里氏病、Mc Ardle病、Tarui病、红细胞醛缩酶缺乏症、GSDXIII型、GSD XV型以及脂质贮积病；先天性肌无力综合征；神经源性肌病，例如Charcot-Marie-Tooth病，例如4B1型Charcot-Marie-Tooth神经病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；脂质贮积病；遗传性心肌病；神经肌肉疾病。

负责肌肉遗传性疾病的靶基因可以选自下组：DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1和MTMR2、糖原合酶基因(GYS1)、酸性α-葡萄糖苷酶基因(GAA)、糖原脱支酶(AGL)、肌肉糖原磷酸化酶(PYGM)、肌肉磷酸果糖激酶PKFM、醛缩酶A基因(ALDOA)、β-烯醇酶基因(ENO3)、糖原蛋白-1(GYG1)基因，尤其是靶基因可以选自在肌肉中特异性或主要表达的基因，例如但不限于DMD、MYOT、CAV3、DES、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、POMT1、POMGNT1、POMT2、ANO5、FKTN、FKRP、TTN、EMD、FHL1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KHL40、KHL41、RYR1、MTM1、SEPN1、肌肉糖原磷酸化酶(PYGM)、肌肉磷酸果糖激酶PKFM。如上所述，目标基因适合于通过基因置换或基因编辑进行的所述遗传性疾病的基因治疗。

在一些其他的优选实施方案中，药物组合物包含靶向肌肉病原体的必需基因的目标基因。病原体可以选自下组：旋毛虫属、肠病毒，如柯萨奇病毒、甲型和乙型流感病毒、金黄色葡萄球菌、念珠菌等(对于各种肌肉病原体的综述，特别参见Crum-CianfloneNF.Bacterial,Fungal,Parasitic,and Viral Myositis.Clinical MicrobiologyReviews.2008；21(3):473-494)。

在各种实施方案中，药物组合物优选包含在其表面上呈现合胞素的颗粒，甚至更优选地，用合胞素假型化的包装目标基因的慢病毒颗粒通过特异性地靶向再生肌肉组织中表达的基因来基因治疗肌病。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规技术。文献中充分解释了这种技术。

在各种实施方案中，可以使用标准重组DNA技术产生病毒颗粒，特别是病毒载体颗粒和病毒样颗粒。

特别地，可以通过包括以下步骤的方法获得用于本发明的包括异源目标基因的稳定的假型化慢病毒颗粒：

a)在合适的细胞系中转染至少一种质粒，其中所述至少一种质粒包含所述异源目标基因、逆转录病毒rev、gag和pol基因和编码ERV合胞素的核酸；

b)孵育a)中获得的转染细胞，使得它们产生分别用ERV合胞素假型化且包装有所述异源目标基因的稳定的慢病毒颗粒；和

c)收获并浓缩b)中获得的稳定的慢病毒颗粒。

所述方法允许获得高物理滴度以及高感染性滴度的包含异源目标基因的稳定的假型化慢病毒颗粒。优选地，所述方法的步骤c)包括从上清液收获、浓缩和/或纯化步骤b)中产生的稳定的慢病毒颗粒。因此，优选地，步骤c)的浓缩包括离心和/或纯化步骤b)中获得的收获的稳定的慢病毒颗粒。所述收获可以根据本领域熟知的方法进行。优选地，在与转染细胞融合之前，更优选转染后20-72小时，优选24小时后收获慢病毒载体。优选地，收获步骤是优选在转染后20-72小时，优选转染后20-30小时，更优选24小时后进行的单次慢病毒收获。

在步骤a)中，用至少一种质粒转染合适的细胞系。优选地，所述转染是瞬时转染。优选地，用至少一个、两个、三个或四个质粒转染合适的细胞系。这些细胞类型包括支持慢病毒生命周期的任何真核动物细胞。优选地，合适的细胞系是稳定细胞系或对于合胞素的促融合作用的灾难性后果不起反应的细胞系，从而在产生颗粒的同时继续生长。所述合适的细胞系是哺乳动物细胞系，优选人细胞系。此类细胞的代表性实例包括人胚肾(HEK)293细胞及其衍生物、HEK293T细胞，以及根据其作为贴壁细胞生长或适于在无血清条件下悬浮生长的能力而选择的细胞子集。这种细胞是高度可转染的。

合适的细胞系可以已经表达了五个序列中的至少一个，并且至多四个，所述五个序列是异源目标基因、逆转录病毒rev、gag和pol基因，以及编码ERV合胞素(例如HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸，优选为诱导型。在这种情况下，步骤a)包括用至少一种质粒转染所述细胞系，所述质粒包含至少一个尚未在所述细胞系中表达的序列。选择质粒混合物或单个质粒(如果仅使用一种质粒)，使得当在步骤a)中转染到所述细胞系中时，所述细胞系表达上述所有五个序列。例如，如果合适的细胞系表达逆转录病毒rev、gag和pol基因，待转染的质粒或质粒混合物包含待表达的剩余序列，即异源目标基因和编码ERV合胞素(例如HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

当使用单个质粒时，它包含所有5个目标序列，即：

-异源目标基因，

-rev、gag和pol基因，和

-如之前所述的编码ERV合胞素(尤其是编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

当使用两种或三种质粒时(质粒混合物)，每一种包含之前段落中所列的一些目标序列，使得质粒混合物包含所有上述目标序列。

优选使用四种质粒，四转染包含以下：

-第一种质粒包含目标基因，

-第二种质粒包含rev基因，

-第三种质粒包含gag和pol基因，和

-第四种质粒包含如之前所述的编码ERV合胞素(尤其是编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A)的核酸。

优选用特定比例的四种质粒进行所述四转染。可以调节不同质粒之间的摩尔比以优化放大生产。本领域技术人员能够使该参数适应于其用于产生目标慢病毒的特定质粒。具体地，第一、第二、第三、第四质粒的重量比优选为(0.8-1.2):(0.1-0.4):(0.5-0.8):(0.8-1.2),更优选为约1:0.25:0.65:0.9。

rev、gag和pol基因是逆转录病毒的，优选慢病毒。优选地，它们是HIV基因，优选HIV-1基因，但也可以是EIAV(马传染性贫血病毒)、SIV(猴免疫缺陷病毒)、泡沫病毒或MLV(鼠白血病病毒)的病毒基因。

编码ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素，更优选编码HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素A的核酸是DNA或cDNA序列。优选地，它对应于SEQ ID NO：1、2或3中分别列出的cDNA序列，或对应于分别与所述SEQ ID NO：1、2或3具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％同一性的序列。优选地，步骤a)包括转染至少一种质粒，所述质粒包含SEQ ID NO：5或6所列的cDNA序列，优选由SEQ ID NO：5或6所列的序列组成。

术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共有的匹配位置数除以比较的位置数并乘以100。通常，当比对两个序列以给出最大同一性时进行比较。例如，可以使用GCG(遗传学计算机组，Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序或任何序列比较算法(例如BLAST、FASTA或CLUSTALW)通过比对来计算同一性。

可以使用的编码包膜糖蛋白的质粒是本领域技术人员已知的，例如可商购的pCDNA3、使用相似表达系统的骨架或任何其他质粒盒，例如使用CMV启动子，例如，如Merten等(Human gene therapy,2011,22,343-356)所述的pKG质粒。

根据步骤a)，可以使用本领域已知的各种技术将核酸分子引入细胞。这种技术包括使用化合物(例如磷酸钙)、阳离子脂质、阳离子聚合物的化学促进转染、脂质体介导的转染(例如阳离子脂质体，如Lipofectamine(Lipofectamine 2000或3000))、聚乙烯亚胺(PEI)、非化学方法(例如电穿孔、粒子轰击或微注射)。优选用磷酸钙进行步骤a)的转染。

典型地，可以在磷酸钙存在下，用4种质粒(四转染)瞬时转染293T细胞进行步骤a)。所述4种质粒优选：表达HIV-1gag和pol基因的PKL质粒、表达HIV-1rev基因的pK质粒、表达在细胞启动子(例如人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子)控制下的异源目标基因的PCCL质粒和从CMV启动子表达ERV合胞素(例如之前定义的ERV合胞素，更优选表达HERV-W(合胞素-1)、HERV-FRD(合胞素-2)或鼠合胞素-A(合胞素-A)或合胞素-B(合胞素-B)糖蛋白)的PCDNA3质粒。

然后，步骤a)之后，该方法包括孵育在a)中获得的转染细胞的步骤b)，使得其优选在上清液中产生包含异源目标基因的用ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素假型化，更优选用HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素-A假型化的慢病毒颗粒。实际上，一旦进行步骤a)，就进行所获得细胞的孵育。这导致在上清液中产生稳定的慢病毒颗粒，其用ERV合胞素，例如之前定义的ERV合胞素假型化，更优选用HERV-W、HERV-FRD或鼠合胞素-A假型化且其包含异源目标基因。

因此，转染后，允许转染细胞生长一段时间，其可以包含转染后20-72小时，特别是24小时后。

用于培养细胞的培养基可以是经典培养基，例如包含糖(如葡萄糖)的DMEM。优选地，培养基是无血清培养基。可以在适于悬浮培养细胞的很多培养装置，例如多层系统或生物反应器中进行培养。生物反应器可以是单次使用(一次性)或可重复使用的生物反应器。例如，生物反应器可以选自培养瓶或袋或罐式反应器。非限制性的代表性生物反应器包括玻璃生物反应器(例如

2L-10L,Sartorius)、使用运动搅拌的单次使用的生物反应器(如波式生物反应器(例如Cultibag

10L-25L,Sartorius))、单次使用的搅拌罐式生物反应器(Cultibag

50L,Sartorius)或不锈钢罐式生物反应器。

孵育后，收集并浓缩获得的稳定的慢病毒颗粒；这是步骤c)。优选地，在与转染细胞融合之前，更优选转染后24小时收获步骤b)中获得的稳定的慢病毒颗粒。优选的，将步骤b)中获得的上清液中存在的稳定的慢病毒颗粒离心和/或纯化。可使用本领域任何已知的方法进行所述离心步骤c)，例如通过离心、超滤/渗滤和/或色谱法。

于1-5℃下以40000-60000g的速度离心上清液1-3h，以获得稳定的假型化病毒颗粒的离心物。优选地，于2-5℃(优选约4℃)下以45000-55000g的速度进行离心1.5-2.5小时。在该步骤结束后，以离心物的形式浓缩颗粒，其可被使用。

步骤c)可以是色谱法，例如阴离子交换色谱或亲和色谱。可以在超滤步骤(特别是超滤/渗滤，包括切向流过滤)之前或之后进行阴离子交换色谱。例如，阴离子交换色谱法是弱阴离子交换色谱法(包括DEAE(D)-二乙基氨基乙基，PI-聚乙烯亚胺)。

现在将通过以下非限制性的实施例举例说明本发明。参照附图，其中：

附图说明

图1：肌内注射LV-SynA或AAV2/8后在营养不良小鼠(MDX)或对照小鼠(C57Bl/6)中进行生物发光转基因表达。

在每只小鼠中，向右胫骨前肌(TA)注射25μL PBS，向左TA注射25μL载体。在一些小鼠中，载体是rAAV8-Luc2(对应于AAV血清型2ITR和AAV血清型8衣壳的AAV2/8)的2.5.10¹¹载体基因组(vg)(在图右侧的C57BL/6小鼠)。在其他小鼠中，注射对应于LV-SA-Luc2的7.5.10⁵个感染性基因组(ig)的1.4.10¹¹个物理颗粒(pp)(LV-SynA；左图C57BL/6和中图mdx小鼠)。注射后4周使用IVIS Lumina仪器测量生物发光。显示了每组代表性小鼠的全身生物发光图像。手动定义目标区域(ROI)，并在每只小鼠中报告以使用实时图像3.2软件(Xenogen)计算信号强度，并表示为光子/秒。从在没有施用载体的对照小鼠上绘制的ROI定义背景光子通量。

对于每只代表性小鼠，指示在对应于PBS对照的右TA肌肉(TA-R通量)和对应于载体的左TA肌肉(TA-L通量)中以光子/秒表示的生物发光信号。

图2：注射LV-SynA载体的MDX小鼠肌肉中表达的转基因的免疫组织学检测

注射PBS(左图)或LV-SA-Luc2(LV-SynA-LucII；右图)的MDX小鼠肌肉的代表性切片。两个切片均用荧光素酶和层粘连蛋白抗体以及DAPI染色。层粘连蛋白染色显示肌纤维的轮廓，DAPI染色显示细胞核。在注射LV-SA-Luc2后，在肌纤维的细胞质中发现了荧光素酶的表达。

图3：在mdx和C57BL/6小鼠骨骼肌中获得的比较生物发光。

每组7-8只小鼠，分别向右胫骨前肌注射25μL PBS，向左TA注射25μL LV-SA-Luc2载体(1-1.4 10¹¹个物理颗粒/TA，其相当于0.75-1.10⁶个转导单位(TU)/TA)。注射时，Mdx小鼠为4.5-5.5周龄。注射时，C57BL/6(B6)小鼠为6-8周龄。注射后一个月，测量TA中的生物发光。

图4：与正常小鼠相比，MDX小鼠的肌肉中获得显著的转导水平，如通过PCR和使用qPCR定量注射的TA中载体拷贝数测定。

在每只小鼠中，向右胫骨前肌(TA)注射25μL PBS，向左TA注射25μL载体LVSynA(LVSynA-Luc)，相当于5.10⁵个感染基因组(ig)。载体注射后第4周和第6周，通过q-PCR(A、C)和PCR(B、D)分析DNA样品。通过使用qPCR扩增标准化为鼠肌联蛋白基因水平的Psi载体序列来定量每个二倍体核(VCN)的载体拷贝数水平。在A和C中，方框代表所有小鼠获得的平均VCN值，线显示获得的最小值和最大值。在B和D中，仅在注射LVSynA载体的MDX小鼠肌肉中检测到对应于整合载体的489bp条带。在注射PBS的对照肌肉中未检测到489bp条带。数据代表每种情况下的12只小鼠。PBS和LVSynA组之间的比较采用Mann和Whitney两尾分析进行。P值低于0.05被认为是统计学显著的。

图5：具有用合胞素A假型化的LV的sgca-/-小鼠肌肉中的基因转移。

向六周龄的sgca-/-小鼠(n＝2)的每个TA以25μL的体积注射10⁶个ig的LV-SynALuc2载体。向左TA注射荧光素酶编码载体并向右TA注射对照载体。载体注射后14天，测量生物发光。显示两只小鼠中的一只代表性小鼠的全身生物发光图像。手动定义目标区域(ROI)，并在每只小鼠中报告以使用实时图像3.2软件(Xenogen)计算信号强度，并表示为光子/秒。从在没有施用载体的对照小鼠上绘制的ROI定义背景光子通量。在注射PBS的左肌肉中检测到8.510³个光子/秒的信号，在注射LV-SA Luc2载体的右肌肉中检测到1.96 10⁶个光子/秒的信号。

图6：用LV-SynA载体显著转导另一种营养不良模型sgca缺陷型小鼠，如通过q-PCR定量测量注射TA中载体拷贝数并使用qPCR检测注射TA中载体拷贝数所示。

在每只6周龄的sgca-/-小鼠中，向右胫骨前肌(TA)注射25μL PBS，向左TA注射25μL载体LVSynA(LVSynA-Luc)相当于5.10⁵个感染基因组(ig)。载体注射后第4周，通过q-PCR(A)和PCR(B)分析DNA样品。通过q-PCR测量TA中VCN的水平，并标准化为肌联蛋白水平。在(A)中，方框和线代表获得的每只小鼠的VCN值，以及均值、最小值和最大值。在(B)中，在注射LVSynA载体的sgca缺陷小鼠肌肉中检测到对应于整合载体的489bp条带。在注射PBS的对照肌肉中未检测到489bp条带。数据代表每种情况至少11只小鼠。采用Mann和Whitney两尾分析进行PBS和LVSynA组之间的比较。P值低于0.05被认为是统计学显著的。

图7：检测外显子23跳跃的肌营养不良蛋白mRNA。

向Mdx小鼠肌肉内(IM)注射用合胞素A假型化并编码从U7启动子表达的mex23反义序列的慢病毒载体(LV-SA U7mex23)或编码U7驱动的反义mex23序列的AAV1载体(rAAVU7mex23)。在载体注射后2周，通过巢式RT-PCR用外显子20和26中的引物分析RNA样品。在所有肌肉中检测到对应于全长肌营养不良蛋白mRNA的901bp条带，并且仅在注射AAV载体(泳道4、5和6)或Lv-SynA载体(泳道1、2和3)的肌肉中检测到对应于外显子23跳跃的mRNA的688bp片段。在注射PBS或编码Luc2的载体的对照肌肉中未检测到688bp条带。

图8：如通过生物发光信号动力学所测定，与LVVsvg相反，用LV SynA获得了MDX小鼠的稳定转导。

向MDX和C57BL/6小鼠的右胫骨前肌(R-TA)注射25μL PBS，并向左TA(L-TA)注射25μL LVSynA(LV-SYNA LUC2)或表达萤光素酶(Luc2)转基因的LVVsvg(LV-VSVg LUC2)相当于每只小鼠注射5.10⁵个感染性基因组(IG)。在指定的时间点在R-TA和L-TA中测量生物发光。使用Living.Image 3.3软件用Ivis Lumina进行定量。虚线是定量极限区域(不是检测极限)。数据代表C57Bl/6小鼠中的3个独立实验和MDX小鼠中的5个独立实验，对于LVSynA条件，每组包括至少3只小鼠，并且对于LVVsvg条件，每组包括至少4只小鼠。

图9：如生物发光动力学所示，在肌营养不良的动物模型中，LV-SynA肌肉内递送后转基因表达的稳定性。

向Sgca缺陷和MDX小鼠的右侧胫骨前肌(R-TA，黑线)注射25μL PBS，并向左TA(L-TA，灰线)注射25μL编码Luc2的LVSynA(LVSynALuc2)，相当于2-7.5.10⁵个传染性基因组的剂量(ig)。在指定的时间点在R-TA和L-TA中测量生物发光。使用Living Image3.3软件用Ivis Lumina进行定量。数据代表Sgca缺陷小鼠中的三个独立实验和MDX小鼠中的五个独立实验，每个实验包括每组至少3只小鼠。

图10：如通过Elispot抗IFNg、PCR、q-PCR和免疫组化方法测定，与LVVsvg相比，肌内(IM)注射LVSynA后肌肉营养不良的动物模型中的免疫应答降低。

GFP-HY转基因是用于检测抗转基因CD4和CD8T细胞免疫应答的模型。GFP-HY转基因编码由HY雄性多肽标记的荧光蛋白GFP组成的融合蛋白。基因转移后，转基因产物的抗原呈递可以通过分别向CD4和CD8T细胞呈递的Dby和Uty肽来特异性检测。

将PBS、LVSynA_GFP-HY或LVVsvg_GFP-HY载体的5.10⁹个物理颗粒IM注入四周龄的MDX小鼠的TA中。

(A)十四天后，收获脾细胞以在肽体外刺激后通过γIFN-ELISPOT测量Dby特异性CD4+T细胞和Uty特异性CD8+T细胞应答。数据代表一个实验，包括每组3只小鼠。

(B)和(C)在载体注射后2周通过PCR(B)和q-PCR(C)分析肌肉DNA样品。在(B)中，在注射有两种载体之一的MDX小鼠肌肉中检测到对应于整合载体的489bp条带，但是与LVVsvg相比，在注射LVSynA的肌肉中似乎更强。在(C)中，通过q-PCR测量TA中VCN的水平，并标准化为肌联蛋白水平。与LVVsvg相比，注射LVSynA的肌肉中的水平更高。

(D)在用Dapi染色核之前，在注射有指定载体的MDX肌肉的冷冻切片上进行CD3表达的免疫组织学分析。然后，使用image j软件基于dapi染色强度(空心灰色圆圈)对每个核进行分割和计数。定量每个核中的CD3信号强度以测定肌肉切片(实心黑色圆圈)上CD3阳性核的分布和百分比。图像代表每组3个肌肉切片，每组分析3只小鼠。

图11：如使用Elispot抗IFNg和CBA所测量的，与LVVsvg相比，使用LVSynA全身递送后针对转基因的免疫应答降低。

将PBS、7.5.10⁵个Ig/小鼠的LVSynA_GFP-HY或LVVsvg_GFP-HY载体IV注入六周龄C57BL/6小鼠的尾静脉。

(A)21天后，收获脾细胞以测量体外肽刺激后通过γIFN-ELISPOT的Dby特异性CD4+T细胞和Uty特异性CD8+T细胞的应答。数据代表一个实验，每组包括3只小鼠。用于滴定由T细胞分泌的细胞因子。

(B)免疫三周后，用Dby、Uty肽或伴刀豆球蛋白A(conA)作为阳性对照，体外再刺激总脾细胞。培养36小时后，去除上清液并滴定指示的细胞因子(3只小鼠/组/实验)。每个点代表一个单独的测量，其中每只小鼠测量至少2次。

图12：通过用Lv-SynA Sgca载体进行基因转移可以在体内纠正sgca缺陷型小鼠的基因缺陷，并且可以通过在同一肌肉中重复注射该载体来增强治疗性转基因的表达。

在每只Sgca缺陷型小鼠中，向右胫骨前肌(TA)注射25μL PBS，并向左TA注射25μL的载体LVSynA(LVSynA-PGK-halpha-肌糖)一次或两次，相当于于每个TA 2.5.10⁵个感染性基因组(ig)。载体注射后第16天，分析DNA和RNA样品。

(A)在用LVSynA载体注射一次和两次的sgca缺陷小鼠肌肉中检测到对应于整合载体的489bp条带。在注射PBS的对照肌肉中未检测到489bp条带。

(B)通过qRT-PCR测量α-肌糖蛋白mRNA的表达水平，并标准化为P0水平。

(C)在两种情况下(HIV和AAV)，通过q-PCR测量TA中的载体基因组拷贝并标准化为肌联蛋白。

图13：无法通过体外数据预测再生肌肉的转导，如用Lv-Syn载体在不同阶段体外转导C2C12细胞所示。

(A)在生长培养基(DMEM+10％FCS+1％谷氨酰胺+1％PS)中培养C2C12鼠成肌细胞细胞系，并在Vectofusin-1(12μg/mL)存在下用指定的LV合胞素(1x E+05IG/mL)或LV VSVg(1^E+06IG/mL)转导。所使用的载体是LVSynA-ΔNGFR、LVSynB-ΔNGFR、LVSyn1-ΔNGFR、LVSyn2-ΔNGFR、LVVsvg-ΔNGFR。在第7天，通过流式细胞仪使用LSRII设备测量表达转基因的细胞的百分比，并使用Diva软件分析，并对3个实验的数据进行平均。在(B)中，通过改变培养基并将其在分化培养基(DMEM+2％马血清+1％谷氨酰胺+1PS)中培养来诱导C2C12细胞分化。在不同的时间，在培养基更换后，立即(d0)或第1或第3天(d1或d3)用增加体积的指定载体转导细胞。3天后，使用流式细胞仪在LSRII设备上用Diva软件分析测量转基因表达。数据代表2个不同的实验。

图14：不同细胞系上mLy6e mRNA表达水平和转导水平的比较。

(A)从不同细胞系(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)提取mRNA并转化为cDNA以使用PO作为管家基因在mLy6e上进行qRT-PCR。通过公式丰度＝2^-ΔCt计算相对水平。通过测试来自C57BL/6小鼠的肺、脾或骨髓中的总细胞来验证qRT-PCR，其证实了mLy6e表达水平在肺细胞中最高，如Bacquin等人J.Virol.,2017,doi:10.1128/JVI.00832-17所发表。

(B)以10⁵IG/mL的剂量用编码ΔNGFR的LV-合胞素A载体转导与图14(A)相同的细胞系。在转导后7天，通过流式细胞仪分析转导水平。

图15：用人合胞素2LV载体体外转导人骨骼肌成肌细胞。

在存在vectofusin的情况下，用5.10⁵ig/mL的LV合胞素载体转导从出生后的人肌肉获得并购自Creative Bioarray公司的原代CSC-C3196人骨骼肌成肌细胞，所述LV合胞素载体包括：LVSyn2-GFP和LVSynB-GFP。培养5天后，分别通过使用EVOS FL装置(LifeTechnologies)的显微镜(A)和通过q-PCR(B)观察转导细胞(GFP阳性细胞)的数目和HIV载体拷贝数。每个视野代表两个培养孔。数据代表2个不同的实验。放大倍数10倍。

具体实施方式

实施例1：生产稳定且感染性的LV-SynA颗粒

材料和方法

细胞系

将人胚胎肾脏293T细胞在37℃、5％CO2下于补充有10％的热灭活胎牛血清(FCS)(Life Technologies)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM+glutamax)(LifeTechnologies,St-Aubin,France)中培养。

合胞素A的克隆和LV-Syn A的生产

a.表达鼠合胞素-A的质粒的产生。

使用标准技术将鼠合胞素-A cDNA克隆到pCDNA3质粒中。

b.Syn-A假型化的慢病毒载体的生产

使用磷酸钙将HEK293T细胞与以下4个质粒共转染(每烧瓶定量)：表达HIV-1gagpol基因的pKLgagpol(14.6μg)、表达HIV-1rev序列的pKRev(5.6μg)、pcDNA3.1SynA(20μg)和基因转移质粒(22.5μg)。采用在脾病灶形成病毒(SFFV)启动子的控制下表达荧光素酶2转基因的基因转移质粒PRRL-SFFV LucII产生LV-SA-Luc2。采用在之前描述的构建体(Goyenvalle et al.Science,2004,3；306(5702):1796-9)获得的U7启动子控制下编码mex23反义序列的基因转移载体产生LV-SA U7mex23。24小时后，洗涤细胞并添加新鲜培养基。第二天，收获培养基，通过1500rpm离心5分钟来澄清并过滤0.45μm，然后在12℃下以50000g超离心2小时来浓缩，并在-80℃下储存直至使用。

c.合胞素-A-假型化LV的滴定

通过p24ELISA(

HIV-1Elisa试剂盒,Perkin-Elmer,Villebon/Yvette,France)测定物理滴度，然后计算作为物理颗粒(pp)的滴度，假设1fg p24对应于12pp LV(Farson et al,Hum Gene Ther.2001,20,981-97)，如之前报道的其他类型的LV(Charrier et al,Gene therapy,2011,18,479-487)。使用鼠淋巴瘤细胞系A20将感染性滴度测定为感染性基因组滴度(IG/mL)。在

(12μg/μL)存在下，将载体的系列稀释液添加到A20细胞中6小时。更新培养基，并将细胞孵育7天，并在带引物的iCycler7900HT(Applied Biosystems)上使用双重qPCR获得基因组DNA以测量每个细胞的载体拷贝数：PSI正向5’CAGGACTCGGCTTGCTGAAG3’(SEQ ID NO:7),PSI反向5’TCCCCCGCTTAATACTGACG3’(SEQ ID NO:8)，以及用FAM(6-羧基荧光素)标记的PSI探针5’CGCACGGCAAGAGGCGAGG3’(SEQ ID NO:9),肌联蛋白正向5’AAAACGAGCAGTGACGTGAGC3’(SEQID NO:10),肌联蛋白反向5’TTCAGTCATGCTGCTAGCGC3’(SEQ ID NO:11)以及用VIC标记的肌联蛋白探针5’TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC3’(SEQ ID NO:12)。

结果

研究鼠合胞素作为体内应用HIV-1衍生LV的可能的新假型。合胞素A是非同源的，但功能上类似于人合胞素-1和-2的鼠对应物(Dupressoir et al,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2005,102,725-730)。

将鼠SynA克隆到表达质粒中并用于在293T细胞中产生慢病毒载体颗粒。发现合胞素A可以成功地将rHIV衍生的LV假型化。优化用于转染步骤的合胞素A质粒的量提高培养基中基于p24水平的LV颗粒的产生。在规定的条件下(20μg DNA/板，仅一次收获；参见材料和方法)，可以产生用鼠合胞素假型化的稳定且感染性的颗粒。使用与用于VSVg假型化颗粒相同的条件，通过超速离心可以成功浓缩用这种包膜假型化的慢病毒颗粒(Charrier et al,Gene therapy,2011,18,479-487)。将浓缩的储液在-80℃下冷冻保存，并稳定数月。在存在Vectofusin-1(VF1)的情况下，LV-Syn A在转导鼠A20B淋巴瘤细胞系方面非常有效。A20细胞系用于产生合胞素-A假型化LV的感染性滴度。

实施例2：使用LV-SynA颗粒体内基因递送至再生骨骼肌

材料和方法

动物

使用购自Charles River的6-8周龄的雄性C57/B16小鼠进行实验。从Genethon繁殖集群获得4-5.5周龄的雄性mdx小鼠。从Genethon繁殖集群获得了六周龄的α-肌糖蛋白缺陷的sgca-/-小鼠。用25μL的体积注入小鼠的胫骨前肌肌肉(TA)中。通过生物发光在不同时间点分析注射有荧光素酶载体的小鼠并将其处死。处死注射有小核RNA mex23表达载体的小鼠用于分析。处死后，去除左右胫骨前肌(TA)肌肉。对部分冷冻TA肌肉进行qPCR和RT-PCR。为了进行切片机切片和免疫组织染色，将TA肌肉的另一部分固定并包埋在石蜡中。

体内荧光素酶成像

将C57BL/6小鼠用氯胺酮(120mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉，并腹膜内施用100μL(150μg/mL)D-荧光素(Interchim,ref.FP-M1224D)，并于10min后用CCD相机ISO14N4191(IVIS Lumina,Xenogen,MA,USA)成像。使用10cm视野、分档(分辨率)因子4、1/f挡光和开放式滤光片获得3分钟的生物发光图像。手动定义目标区域(ROI)(在每种情况下使用标准面积)，使用实时图像3.2软件(Xenogen)计算信号强度，并表示为光子/秒。从在没有施用载体的右胫骨前肌(TA-R)上绘制的ROI定义背景光子通量。

qPCR

使用

基因组DNA纯化试剂盒(Promega,ref.A1125)从细胞提取基因组DNA。用肌联蛋白Mex5作为标准化基因，在PSI前病毒序列或WPRE前病毒序列上进行多重qPCR。以0.1μM的浓度使用如下引物和探针：

PSI F	5’CAGGACTCGGCTTGCTGAAG 3’(SEQ ID NO:7)
		PSI R	5’TCCCCCGCTTAATACTGACG 5’(SEQ ID NO:8)
PSI探针(FAM)	5’CGCACGGCAAGAGGCGAGG 3’(SEQ ID NO:9)

WPRE F	5’GGCACTGACAATTCCGTGGT 3’(SEQ ID NO:13)
		WPRE R	5’AGGGACGTAGCAGAAGGACG 3’(SEQ ID NO:14)
WPRE探针(FAM)	5’ACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGC 3’(SEQ ID NO:15)

使用的qPCR混合物是ABsolute qPCR ROX混合物(Thermo Scientific,ref.CM-205/A)。用SDS 2.4软件在iCycler 7900HT(Applied Biosystems)上进行分析。

PCR

使用以下浓度为0.1μM的引物在整合的慢病毒载体上进行PCR：Psi-F:AGCCTCAATAAAGCTTGCC(SEQ ID NO:20)和RRE-R:TCTGATCCTGTCGTAAGGG(SEQ ID NO:21)。

肌肉切片上的免疫组织染色

在将小鼠肌肉包埋在石蜡中之前，在至少2小时内用10％甲醛(VWR)将其固定在甲醛溶液中。然后，用以1/100稀释作为一抗的多克隆抗体抗萤光素酶(Promega,ref.G7451)和以1/1000稀释作为二抗的驴抗山羊AlexaFluor 594(Invitrogen,ref.A11058)染色肌肉切片机切片(4μm)。将一抗在湿度箱中于4℃孵育过夜并将二抗在湿度箱中孵育2h。

肌营养不良蛋白外显子跳跃的检测

使用TRIzol试剂(Life Technologies)从合并的中间肌肉切片分离总RNA。为了检测肌营养不良蛋白mRNA，使用access RT-PCR系统(Promega)对200ng总RNA进行巢式RT-PCR。用Ex20ext(5’-CAGAATTCTGCCAATTGATGAG-3’,SEQ ID NO:16)和Ex26ext(5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3’,SEQ ID NO:17)引物将第一反应进行30个循环(94℃/30s；55℃/1min；72℃2min)。然后，用Ex20int(5’-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3’,SEQ ID NO:18)和Ex26int(5’CCTGGCTTTAAGGCTTCCTT-3’,SEQ ID NO:19)将2μL的第一反应扩增23个循环。在2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。

统计分析(荧光素酶和qPCR实验)

在整个研究中，使用Mann和Whitney两尾分析对2个实验组进行比较。P值低于0.05被认为是统计学显著的。

结果

目的是测试用合胞素A假型化的LV是否可以进入再生肌肉的肌纤维，但不进入稳态的正常肌肉。因此，使用肌营养不良蛋白缺陷的年轻mdx(或MDX)小鼠(小于12周)(一种杜兴氏肌营养不良症的模型)，已知它们的肌营养不良蛋白缺陷的肌肉处于恒定的再生阶段。还使用了经历肌肉再生的肌糖蛋白缺陷的小鼠。鼠合胞素A糖蛋白用于假型化编码几种转基因序列的HIV-1衍生的慢病毒载体：荧光素酶LucII(或Luc2)以促进通过生物发光检测转基因表达，或用于肌营养不良蛋白外显子23跳跃的小反义序列(U7mex23)以显示功能效果。

将编码LucII的LV-SynA载体肌肉内注入雄性mdx小鼠或C57BL/6albinos对照的胫骨前肌(TA)中。作为阳性对照，使用相同的途径注射相同体积的编码LucII的rAAV2/8(包装在AAV8衣壳中的AAV2基因组)。进行两种方案以检查IM注射后随时间在小鼠中获得的生物发光。

显示代表性照片，并在每张照片下方显示左、右TA肌肉的生物发光(图1)。结果表明，与rAAV2/8相反，LV-SynA使得转基因在MDX小鼠的肌肉中局部表达，但不在C57Bl/6对照中表达，也不在小鼠肝脏中表达。肌肉内注射LV-SynA的MDX小鼠中的信号(本文中在注射后4周表示)表明基因转移是稳定的，并且很好地被小鼠耐受。从注射后第6天开始可见信号。相反，在肌肉内注射LV-SynA的正常小鼠中，在任何时间点均未观察到生物发光信号的证据。用LV-SA-Luc2所获得的信号低于用rAAV2/8-Luc2，但即使是肌肉内注射，rAAV2/8载体广泛散布到肌肉以外，并且发现在肝脏中的含量很高，与rAAV2/8对小鼠肝脏的已知趋向性一致(表I)。

表I.LV-SA Luc2或rAAV2/8注射后，正常或营养不良小鼠的TA肌肉或肝脏中获得的生物发光的比较。

TA和肝脏的平均生物发光(光子/秒)+/-SD(n)

信号	C57BL/6	MDX
			肌肉
TA-R(注射PBS)	0.15x10<sup>5</sup>±0.25(n＝8)	0.04x10<sup>5</sup>±0.02(n＝7)
			TA-L(注射LV-SA)	0.69x10<sup>5</sup>±1.35(n＝8)	12.41x10<sup>5</sup>±13.25(n＝7)
肝脏
			LV-SA	0.89x10<sup>5</sup>±0.12(n＝8)	0.39x10<sup>5</sup>±0.07(n＝7)
rAAV2/8	1174x10<sup>5</sup>±193(n＝4)	4030x10<sup>5</sup>±1371(n＝2)

在肝脏以及左右胫骨前肌中定量生物发光转基因荧光素酶的表达。在2种不同方案中的平均值、SD和测试的小鼠数(n)。注射载体4周后测量生物发光。通过绘制掩膜以基于最高信号检测到的最大面积来定义器官面积来进行定量。将相同的掩膜应用于来自相同方案的所有小鼠。(*)C57BL/6小鼠和MDX小鼠的LV-SynA注射的肌肉之间的统计学显著性差异(p＝0.03)。

为了确保生物发光信号归因于荧光素酶而不是炎症，并且为了确认肌肉中转基因的存在，进行免疫组织化学以定位荧光素酶。图2显示在用载体注射的mdx小鼠肌肉的肌纤维内部发现了荧光素酶。

其中量化TA的生物发光信号的两个实验的总结表明，与正常C57B16小鼠相比，在注射LV-SA载体的mdx小鼠中发现了明显更高的信号水平(图3)。统计分析(Mann-Whitney)显示，用LV-SA-Luc2获得的信号显著高于PBS(p＝0.0009)，并且在mdx小鼠中获得的信号高于在C57BL/6小鼠中获得的信号(p＝0.03)。

还通过qPCR测量在MDX和正常小鼠的注射TA中的载体拷贝数(图4A和4C)，并且通过更敏感的经典PCR证实整合载体的存在(图4B和4D)。结果证实，向小鼠中直接注射合胞素-A假型化LV(LV-SynA)不会导致正常小鼠中骨骼肌组织的显著转导(C57Bl/6；图4A和4B)，但在构成了杜兴氏肌营养不良症的模型的MDX小鼠中能够进行显著转导(图4C和4D)。

为了证实这些发现也可以应用于另一种营养不良的小鼠模型，在α-肌糖蛋白缺陷型小鼠(sgca-/-小鼠)中测试了荧光素酶基因转移。向七只sgca-/-小鼠(6周龄)的左TA中注射LV-SA luc2载体，在右TA中注射了另一种载体。将第八只小鼠用作阴性对照。结果显示在注射荧光素酶载体的肌肉中有清晰的生物发光信号(图5和表II)。

表II：LV-SA Luc2后，在sgca-/-营养不良小鼠的TA肌肉中获得的生物发光。

在左右胫骨前肌中定量生物发光转基因荧光素酶的表达。在2种不同方案中获得平均值、SD和测试的小鼠数(n)。注射载体2周后测量生物发光。通过绘制掩膜以根据最高信号检测到的最大面积来定义器官面积来进行定量。将相同的掩膜应用于来自相同方案的所有小鼠。Mann-Whitney p值TAR vs TAL：p＝0.0006。

图6显示LV-SynA可用于将可检测水平的转基因盒整合到α-肌糖蛋白缺陷型小鼠(sgca-/-小鼠)的骨骼肌中。与MDX小鼠相比，sgca-/-小鼠的骨骼肌组织具有较高的再生率。这些数据证实LV-SynA载体优先转导再生肌肉组织的观点。数据还表明，LV-SynA载体可用于治疗多种营养不良性疾病，可能是所有其中发生高水平骨骼肌再生的营养不良性疾病。

为了确定基因转移是否具有潜在的治疗意义，使用Goyenvalle et al.(Science,2004,306(5702):1796-9)已经报道的构造，将mdx小鼠用于进行肌营养不良蛋白外显子跳跃。小核RNA mex23的表达是反义序列，它将诱导在mdx小鼠中突变的肌营养不良蛋白基因外显子23的跳跃，并允许产生略微截短的肌营养不良蛋白。生成一种用合胞素A假型化并编码从U7启动子表达的mex23反义序列的慢病毒载体(LV-SA U7mex23)。作为对照，我们使用已经描述的编码U7驱动的反义mex23序列的AAV1载体(Goyenvalle et al.Science2004)。将载体注入mdx小鼠的左TA中。作为对照，右TA注射PBS或编码Luc2的载体。图7显示在向mdx小鼠注射LV-SA U7mex23后2周，可以在注射的肌肉中而不是对照肌肉中检测对应于外显子23-跳跃的肌营养不良蛋白RNA的688bp序列的存在。LV-SA载体的效率似乎不如rAAV，但还需要其他实验来优化载体剂量和检测时机。

实施例3：与LV-VSVg相反，用LV-SynA颗粒获得稳定的转导和降低的免疫原性

材料和方法：

用ELISPOT测量基因转移诱导的转基因特异性T细胞免疫应答

为了测量转基因特异性免疫应答，我们使用了编码较早描述的GFP-HY转基因的慢病毒载体(Ciréet al.Plos One 2014PLoS One.2014Jul 24；9(7):e101644.doi:10.1371/journal.pone.0101644.eCollection 2014)。处死小鼠后，获得红细胞耗尽的脾细胞的细胞悬液。通过在存在或不存在1μMDby或Uty肽的情况下，在IFN-γ酶联免疫斑点板(MAHAS45,Millipore,Molsheim,France)中每孔培养10⁶个脾细胞，进行IFN-γ酶联免疫斑点测定(ELISPOT)。作为阳性对照，用伴刀豆球蛋白A(Sigma,Lyon,France)(5μg/ml)刺激细胞。在+37℃下培养24小时后，洗涤板，并用生物素化的抗IFNγ抗体(eBiosciences)、链霉亲和素碱性磷酸酶(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)和BCIP/NBT(Mabtech,LesUlis,France)显示。使用AID读取器(Cepheid Benelux,Louven,Belgium)和AID ELISpotReader v6.0软件对点进行计数。减去非脉冲脾细胞获得的背景值后，代表斑点形成单位(SFU)。

用细胞计数微珠阵列(CBA)滴定基因转移后由转基因特异性免疫应答诱导的细胞因子

铺板刺激培养基[培养基、UTY(2μg/mL)、DBY(2μg/mL)或伴刀豆球蛋白A(5μg/mL)]，并添加10⁶个脾细胞/孔。在+37℃下培养36小时后，将上清液在-80℃下冷冻直至滴定。用BD Biosciences flex试剂盒(IL-6、IFN-γ、TNFα和RANTES)进行细胞计数珠阵列。简言之，将具有不同荧光强度并且包被有细胞因子特异性捕获抗体的捕获珠群体混合在一起。接下来，分配25μL的珠混合物，并添加25μL的每种样品(上清液)。在室温下孵育1小时后，将细胞因子特异性PE抗体混合在一起，并添加25μL这种混合物。在室温下孵育1小时后，用1mL洗涤缓冲液洗涤珠，并使用LSRII流式细胞仪采集数据。

结果

用LV-VSVg进行的比较测定证实LV-SynA颗粒的稳定转导和降低的免疫原性。

结果表明，LV-SynA在MDX肌肉中提供持久且稳定的基因转移，而用其他包膜(例如VSVg)假型化的LV仅提供临时表达，并且信号随时间下降(图8)。此外，图8证实LV-SynA不能在任何时间点转导正常的骨骼肌组织。图8表明在MDX小鼠中可能转导了长期的肌肉祖细胞，例如卫星细胞。在sgca-/-小鼠和MDX小鼠中肌肉内递送LV-SynA载体后也观察到稳定的转基因表达(图9)。MDX小鼠中的数据证实了已在图8中显示的数据。LV-SynA载体的免疫原性低于LV-VSVg载体，因为当它们被肌肉内注入MDX小鼠时，它们诱导的转基因特异性免疫应答较少(图10)。如通过ELISPOT-IFNg(图10A和10B)和通过组织中CD3+T细胞的浸润水平(图10D)所测量，LV-VSVg载体诱导强烈的转基因特异性CD4和CD8T细胞应答。用LV-SynA载体获得的降低的免疫应答转化为组织中更高水平的整合载体(图10B和图10C)。

全身施用后，与LV-VSVg载体相比，还观察到LV-SynA载体的免疫原性降低(图11)。与LV-VSVg相比，将LV-SynA载体静脉注入正常小鼠后，观察到较低水平的转基因特异性CD4和CD8T细胞应答(图11A)和较低水平的细胞因子(图11B)。

实施例4：使用LV-SynA颗粒在体内将治疗性基因基因递送至再生骨骼肌

材料和方法

qPCR

根据实施例2中所述的方案，使用以下引物和探针测定AAV上的qPCR AAV：

AAV-正向:CCAGGCGAGGAGAAACCA(SEQ ID NO:22)

AAV-反向:CTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCT(SEQ ID NO:23)

AAV-探针:CTCGCCGTAAAACATGGAAGGAACACTTC(SEQ ID NO:24)。

小鼠中基因转移后，人α-肌糖蛋白mRNA的定量

将组织冷冻并切片后，从测试小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉提取总RNA，并用Trizol(Invitrogen)从冷冻组织切片提取RNA。将RNA在25μl无RNase的水中洗脱，并用Free DNA试剂盒(Ambion)处理以去除残留的DNA。使用Nanodrop分光光度计(ND8000Labtech,Wilmington Delaware)定量每个样品提取的总RNA。

为了定量α-肌糖蛋白的表达，使用SuperScript II第一链合成试剂盒(Invitrogen)以及随机寡核苷酸和oligo-dT的混合物逆转录1μg RNA。根据协议AbsoluteQPCR Rox Mix(ABgene)使用LightCycler480(Roche)进行实时PCR，每种引物为0.2μM，探针为0.1μM。用于人α-肌糖蛋白扩增的引物对和Taqman探针为：920hasarco。F:5’-TGCTGGCCTATGTCATGTGC-3’(SEQ ID NO:25),991hasarco.R:5’-TCTGGATGTCGGAGGTAGCC-3’(SEQ ID NO:26),和946hasarco.P:5’-CGGGAGGGAAGGCTGAAGAGAGACC-3’(SEQ ID NO:27)。使用普遍使用的酸性核糖体磷蛋白(P0)来标准化样品中的数据。用于P0扩增的引物对和Taqman探针为：m181P0.F(5'-CTCCAAGCAGATGCAGCAGA-3'；(SEQ ID NO:28)),m267P0.R(5'-ACCATGATGCGCAAGGCCAT-3'；(SEQ ID NO:29))和m225P0.P(5'-CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA-3'；(SEQ ID NO:30))。使用以下公式以倍数变化表示结果：相对丰度＝2^^-ΔΔCt其中ΔCt＝Ct hasarco–Ct P0和ΔΔCt＝ΔCt样品-ΔCt校准器。

结果

在作为肢带肌营养不良的模型的sgca-/-小鼠中，用人α肌糖蛋白证实了使用LV-syn2载体实现治疗基因的基因转移的可能性(图12)。

结果还表明重复施用载体可以增加整合载体的水平(图12A和12C)并增加转基因表达水平(图12B)。LV-SynA施用后，所获得的针对转基因的免疫应答较低，因此可以再注射以增加剂量。

图12表明与rAAV载体相比，LV-SynA载体在肌肉组织中实现了较低水平的拷贝和较低水平的转基因表达。但是，LV和rAAV具有不同的特性并使用不同的分子机制。LV-SynA载体在持久性方面可能更具优势，因为它们稳定整合到靶细胞的基因组中，相反，rAAV仍然是游离的。LV-SynA载体可用于治疗不能接受rAAV的患者，因为它们对该载体呈血清阳性。LV-SynA还可以包装更大尺寸的转基因，因为LV的载量为约10-13Kb，大于rAAV的4.5Kb。

实施例5：无法从体外数据预测再生肌肉的转导

材料和方法

转导鼠和人成肌细胞并通过流式细胞仪分析

在分化过程中，在补充有10％胎牛血清或2％马血清的DMEM培养基(LifeTechnologies)中培养C2C12鼠成肌细胞的细胞系。在存在Vectofusin(12μg/ml)的情况下，使用LV-Syn A或LV-VSVg载体以每毫升10⁵或5.10⁵个感染基因组进行细胞转导6小时。

3或5天后，分别通过7-氨基放线菌素D标记和使用流式细胞仪(FACS LSRII,BDBiosciences)测量NGFR或GFP表达来评估细胞死亡率和转导效率。

不同的人和鼠细胞系以及鼠原代细胞上Ly6e mRNA的表达。

使用来自Qiagen的

mini试剂盒提取来自不同鼠细胞系(A20IIA、C2C12、NIH/3T3)和来自C57BL/6小鼠肺、脾和骨髓总细胞的mRNA。使用来自Thermofischer的Verso cDNA合成试剂盒进行mRNA的逆转录。使用以下引物对cDNA进行qPCR：mLy6e正向引物5’CGGGCTTTGGGAATGTCAAC 3’(SEQ ID NO:31),mLy6e反向引物5’GTGGGATACTGGCACGAAGT3’(SEQ ID NO:32),PO反向引物5’CTCCAAGCAGATGCAGCAGA 3’(SEQ ID NO:33)和PO正向引物5’ACCATGATGCGCAAGGCCAT 3’(SEQ ID NO:34)。PO用作仓库基因。用公式丰度＝2-ΔCt计算丰度。

结果

用LV-SynA和LV-VSVg载体转导作为鼠成肌细胞的C2C12细胞，该鼠成肌细胞通常用作成肌细胞向肌管分化的模型。当将培养为复制性成肌细胞的细胞暴露于载体时，只有LV-VSVg阳性对照实现转导(图13A)。在图13B中，在诱导分化为肌管后，将细胞在不同时间点暴露于不同剂量的载体。在每个测试的时间点，只有LV-VSVg阳性对照实现转导(图13B)。图13表明不能从体外数据预测再生肌肉的转导。图13进一步证实图4中所示的，即不是所有类型的肌肉细胞都可以用LV-Syn载体转导。在C2C12细胞和对照细胞(A20)上比较了报告为鼠合胞素A受体的mLy6e的表达水平和编码ΔNGFR的LV合胞素A载体的转导水平。结果表明，mLy6e在肌肉细胞上的表达不能预测通过用SynA假型化的LV转导肌肉细胞的能力(图14)。C2C12细胞表达相对丰富的Ly6e水平，但不被转导。图13和图14进一步证实图4中所示的，即不是所有类型的肌肉细胞都可以用LV-Syn载体转导。

实施例6：用人合胞素2LV载体体外转导人骨骼肌成肌细胞

材料和方法

转导人成肌细胞并通过流式细胞仪分析

将CSC-C3196人骨骼肌成肌细胞(Creative Bioarray,Shirley,NY,USA)在胶原蛋白包被的24孔板和补充有成纤维细胞生长因子-2(20ng/mL)的超级培养骨骼肌细胞培养基中培养。在存在Vectofusin(12μg/ml)的情况下，用LV-Syn A或LV-VSVg载体以每毫升10⁵或5.10⁵个感染基因组进行细胞转导6小时。

3或5天后，分别通过7-氨基放线菌素D标记和使用流式细胞仪(FACS LSRII,BDBiosciences)测量NGFR或GFP表达来评估细胞死亡率和转导效率。

结果

人合胞素2可用于转导人原代成肌细胞(图14)。在用LV-Syn2载体感染后5天，通过显微镜在约5-10％的细胞中检测到转基因表达(此处为GFP)(图14A)。通过qPCR分析证实转导并显示获得显著的VCN(图14B)。LV-SYnB载体提供一些转导，但效率低得多。这些结果表明，用人合胞素(例如合胞素2)假型化的LV可潜在地被用于转导人骨骼肌，以稳定地表达转基因。

这些结果首次显示，合胞素假型化LV可用于优先在再生骨骼肌中递送基因。这是新颖的，因为LV效率低下或具有免疫原性，通常不用于基因转移至肌肉。这些发现对于杜兴氏肌营养不良症具有治疗潜力，并且还可能对涉及再生性肌肉期的所有肌病，例如像α-肌糖蛋白缺乏症的肢带肌营养不良等具有治疗潜力。

这些结果还表明LV-SA载体的性能与rAAV(用于肌肉中基因递送的金标准载体)非常不同。尽管LV-合胞素载体可产生低于rAAV的载体拷贝和转基因水平，但LV-合胞素载体有3个潜在的优势要考虑。首先，LV-SA在肌肉中的使用仍然是局部的，并且似乎不会扩散到其他器官，从而限制了潜在的毒性。如图1所示，rAAV不是这种情况，即使施用入肌肉，rAAV8也能非常有效地进入肝脏。其次，由于LV载体的整合性质和用合胞素假型化的LV的免疫原性较低，预期LV-合胞素的体内基因递送比游离rAAV更稳定。由于使用了来自内源性逆转录病毒的包膜蛋白，用比rAAV更具生理性的合体素假型化的LV载体的免疫原性可能低于rAAV。由于与rAAV相比，对肝脏毒性较小、免疫原性较低且更稳定，用合胞素假型化的LV可以有利地重复施用以实现稳定的体内基因递送而不损失转基因表达细胞。第三，LV的载量大于rAAV，并且可以掺入大的转基因，例如肌营养不良蛋白cDNA。鉴于这些优点，用合胞素假型化的LV代表用于肌病基因治疗的rAAV的非常有希望的替代品。

Claims (17)

1.靶向再生肌肉组织的药物组合物用于预防和/或治疗肌肉损伤或疾病的用途，所述药物组合物至少包含与合胞素蛋白结合的治疗药物，所述肌肉损伤或疾病包括作为疾病生理病理过程的一部分的再生阶段。

2.根据权利要求1所述的药物组合物的用途，其中所述合胞素蛋白是人或鼠合胞素，优选地，所述合胞素选自下组：人合胞素-1、人合胞素-2、鼠合胞素-A和鼠合胞素-B。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物的用途，其中将所述药物和所述合胞素蛋白掺入颗粒中，优选地，所述颗粒选自下组：脂质体、外泌体、病毒颗粒和病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的药物组合物的用途，其中所述合胞素蛋白呈现在所述颗粒的表面上。

5.根据权利要求4所述的药物组合物的用途，其中所述颗粒是用合胞素蛋白假型化的慢病毒或慢病毒样颗粒。

6.根据权利要求1-5任一项所述的药物组合物的用途，其中所述药物选自下组：用于治疗肌肉损伤或疾病的目标基因，包括治疗基因和编码治疗性蛋白质或肽的基因，例如编码治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶的基因，治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA；能够刺激肌肉细胞再生的药物。

7.根据权利要求3-6任一项所述的药物组合物的用途，其中所述药物是包装入病毒载体颗粒中的目标基因。

8.根据权利要求7所述的药物组合物的用途，其中将所述目标基因包装入用合胞素蛋白，优选鼠合胞素-A或人合胞素-2假型化的慢病毒载体颗粒中。

9.根据权利要求1-8任一项所述的药物组合物的用途，其中所述肌肉损伤或疾病选自下组：肌营养不良症，如营养不良性疾病、远端肌病、肌原纤维肌病、混杂肌病、肌强直综合征、先天性肌病、线粒体肌病、代谢性肌病、离子通道肌肉疾病，如家族性周期性麻痹、先天性肌无力综合征、神经性肌病、自身免疫性肌病、脂质贮积病、遗传性心肌病、神经肌肉疾病、炎症性肌病、横纹肌溶解症、间室综合征或肌红蛋白尿、恶性高热、肌肉感染、肌筋膜痛和肌肉抽搐症以及直接创伤、药物滥用、药物、有毒试剂、局部缺血，高温或低温和/或体育锻炼或过度使用造成的肌肉损伤。

10.根据权利要求1-8任一项所述的药物组合物的用途，其中所述肌肉疾病选自下组：肌营养不良症，如营养不良性疾病、远端肌病、肌原纤维肌病、混杂肌病、肌强直综合征、先天性肌病、线粒体肌病、代谢性肌病、离子通道肌肉疾病，如家族性周期性麻痹、先天性肌无力综合征、神经性肌病、脂质贮积病、遗传性心肌病、神经肌肉疾病、肌红蛋白尿和恶性高热。

11.根据权利要求1-10任一项所述的药物组合物的用途，其用于肌肉疾病的基因治疗。

12.根据权利要求6-11任一项所述的药物组合物的用途，其中所述目标基因选自下组：DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、MTMR2、DUX4、FRG1、GYS1、GAA、GBE1、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3、GYG1及其功能性变体。

13.根据权利要求1-12任一项所述的药物组合物的用途，其用于通过注射施用。

14.用于靶向再生肌肉组织的药物组合物，包含用合胞素蛋白假型化的病毒颗粒，所述病毒颗粒包装选自下组的目标基因：基因DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1、MTMR2、GYS1、GAA、AGL、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3、GYG1及其功能性变体，以及编码治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的基因；其中所述治疗性RNA靶向上述基因。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述病毒颗粒是慢病毒载体颗粒。

16.靶向再生肌肉组织的药物组合物，包含用合胞素蛋白假型化的病毒样颗粒，优选慢病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包装治疗性RNA，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA，所述治疗性RNA靶向选自下组的目标基因：DMD、MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、CAPN3、DYSF、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、FKTN、POMGNT1、POMT2、ANO5、TTN、PLEC、EMD、FHL1、LMNA、SMN1、SMN2、PABPN1、NEB、ACTA1、TPM2、TPM3、TNNT1、CFL2、LMOD3、KBTBD13、KLHL40、KLHL41、RYR1、SEPN1、KBTKD13、MTM1、DUX4、FRG1、MTMR2、GYS1、GAA、AGL、PYGM、PKFM、ALDOA、ENO3和GYG1。

17.根据权利要求14-16任一项所述的药物组合物，其中所述合胞素蛋白是鼠合胞素-A或人合胞素-2。

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