CN111246846B - 用于递送核糖核蛋白的纳米胶囊 - Google Patents
用于递送核糖核蛋白的纳米胶囊 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供包含单一核糖核蛋白(RNP)复合物作为核心和包封所述核心的可生物降解的交联聚合物壳的纳米胶囊，其中所述RNP复合物包含Cas9多肽和引导RNA，并且所述可生物降解的交联聚合物壳包含如本文所定义的咪唑基丙烯酰基单体、双丙烯酰基二硫化物单体(可生物降解的交联剂)、任选的PEG丙烯酰基单体、以及阳离子丙烯酰基单体或阴离子丙烯酰基单体或者阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者(任选地与非离子丙烯酰基单体组合)的聚合单体。还提供制备所述纳米胶囊的方法，含有所述纳米胶囊的试剂盒以及将包封的RNP递送至细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月28日提交的美国临时专利申请第62/551202号的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府权利
本发明是在国家卫生研究院颁发的GM119644和K25CA166178的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本技术大体上涉及包封的核糖核蛋白递送系统领域。此类系统的组合物包括包封与引导RNA复合的Cas9多肽的聚合物壳。
背景技术
基因编辑有望改变引起人类疾病的突变并将新的遗传功能引入人体。对于体内和离体二者的体细胞基因编辑应用，将CRISPR核酸酶连同其单引导RNA(sgRNA)一起递送至细胞中是一个重大的挑战。CRISPR组分的病毒递送通常用于将核酸酶和sgRNA递送至细胞中，但病毒载体引起对临床应用的其它安全性顾虑。虽然可以使用质粒和mRNA的非病毒递送，但它们依赖于宿主细胞的转录和/或翻译机制。质粒还带有插入诱变到宿主基因组中的风险。相反，将预组装的CRISPR核酸酶蛋白(例如，Sp.Cas9，一个常用的实例)与sgRNA一起(统称为核糖核蛋白(RNP))递送不依赖于用于精确的酶促基因编辑活性的此类细胞机构，也不携带任何可以整合到基因组中的长核酸。重要的是，RNP递送策略表现出较低的脱靶诱变，这是因为与质粒或mRNA递送策略相比，CRISPR复合物在降解之前在细胞内的寿命较短。这些特征使得RNP递送对于临床应用具有吸引力。然而，迄今为止，使用非病毒生物材料将RNP特异性地递送至体内或离体培养的目标细胞类型仅取得有限的成功。
发明内容
本技术提供纳米包封的核糖核蛋白(RNP)复合物，其具有RNP在靶细胞内的改善递送，同时通过RNP保持高水平活性。因此，在一个方面，本技术提供一种纳米胶囊(又叫做，NC)，其包含RNP作为核心和包封所述核心的可生物降解的交联聚合物壳(本文称为“聚合物壳”)。RNP复合物包含Cas9多肽和引导RNA。聚合物壳由咪唑基丙烯酰基单体、双丙烯酰基二硫化物(可生物降解的交联剂)、任选的聚(乙二醇)(PEG)丙烯酰基单体、以及阳离子丙烯酰基单体或阴离子丙烯酰基单体或者阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者(任选与非离子单体组合)的聚合单体制成。图1A显示了使用各种丙烯酰基单体形成纳米胶囊的说明性实施例的示意图。当存在时，从纳米胶囊延伸的PEG链被认为有助于溶解纳米胶囊并为细胞靶向配体、细胞穿透肽(CPP)、显像剂等提供方便的附着点。本领域技术人员将理解，本技术的纳米胶囊由于包含可离子化基团而以盐的形式存在，所述可离子化基团包括例如但不限于羧酸、胺和磷酸盐。
虽然不希望受理论的束缚，但是据信聚合物壳保护RNP免于在细胞外环境中降解，并有助于将RNP递送到细胞中，如图1B的示意图所示。纳米胶囊的小尺寸(例如，具有约7至约25nm的流体动力学直径)以及存在的任何CPP和/或靶向配体允许纳米胶囊通过胞吞作用进入靶细胞。聚合物壳中咪唑基的存在有利于纳米胶囊的内体逃逸，因为具有约6.0的pKa值的咪唑基可在酸性内体中吸收质子。如前所述，质子的这种吸收导致内体-膜破裂(G.Chen,Y.Wang,R.Xie,S.Gong,《控制释放杂志(J.Control.Release)》2017,259,10)，从而能够将纳米胶囊释放到胞质溶胶中。在那里，由于胞质溶胶的富含谷胱甘肽(GSH)的环境(2-10mM)，可生物降解的交联剂的二硫键被还原，导致聚合物壳降解。RNP一旦从纳米胶囊中释放出来，就可以进入细胞核，任选地由在Cas9蛋白上的一个或多个核定位信号(NLS)促进，并执行其基因编辑功能。
附图说明
图1A、1B是本技术的说明性实施例的示意图。图1A显示了形成用于递送通过原位自由基聚合制备的RNP复合物的共价交联的、但在细胞内可生物降解的NC的示意性说明。图1B显示了提出的RNP NC的细胞摄取和亚细胞释放机制的示意性描述。
图2显示了描述使用表达mCherry的HEK 293细胞，通过各种NC体外基因编辑的细胞百分比的柱状图。用RNP NC的各种制剂处理HEK 293细胞六天，并通过流式细胞术测量mCherry的损失。RNP中的sgRNA靶向mCherry转基因，并且因此可以通过细胞内mCherry荧光的丧失来测定基因编辑。所研究的制剂如下所列。在实例中使用方法I制备NC。
图3显示了RNP NC的说明性实施例的TEM图像。使用方法I以337/225/38/70/10的a/b/c/d/e比制备NC。
图4A-D图示显示了在HEK 293细胞中摄取RNP纳米胶囊中Atto-550标记的gRNA的说明性实施例。图4A显示用Cas9 RNP、Lipo 2000和NC的各种组合处理后细胞活力的MTT测定结果。图4B和4C(分别)显示了通过未转染的HEK293或使用Lipo 2000或NC用RNP转染的细胞的流式细胞术测量的mCherry基因编辑的代表性直方图和定量。RNP中的sgRNA靶向mCherry转基因，并且因此可以通过细胞内mCherry荧光的丧失来测定基因编辑。在实例中使用方法I以337/225/38/70/10的a/b/c/d/e单体比制备图4A-4C的NC。在实例中使用方法II以927/927/244/231/33的a/b/c/d/e单体比制备图4D的NC。
图5A-5B(分别)显示了使用未转染的H9干细胞或使用Lipo 2000或NC-3用RNP转染的细胞的流式细胞术测量的mCherry基因编辑的代表性直方图和定量。RNP中的sgRNA靶向mCherry转基因，并且因此可以通过细胞内mCherry荧光的丧失来测定基因编辑。在实例中使用方法I以337/225/38/70/10的a/b/c/d/e单体比制备NC。
图6A-6B(分别)显示了使用未转染的Jurkats或使用Lipo 2000或NC-3用RNP转染的细胞的流式细胞术测量的mCherry基因编辑的代表性直方图和定量。RNP中的sgRNA靶向mCherry转基因，并且因此可以通过细胞内mCherry荧光的丧失来测定基因编辑。在实例中使用方法I以337/225/38/70/10的a/b/c/d/e单体比制备NC。
图7A-7D显示了来自Ai14小鼠的视网膜色素上皮的tdTomato荧光图像。在视网膜下注射PBS或NC-3后13天获取共聚焦显微图像。NC-3含有8μg RNP和靶向tdTomato等位基因之前的SV40多腺苷酸(polyA)的sgRNA。在实例中使用方法I以337/225/38/70/10的a/b/c/d/e单体比制备NC。
具体实施方式
以下术语在全文中如下定义地使用。如本领域技术人员所理解的，本文所用的所有其它术语和短语具有其普通含义。
如本文和所附权利要求中所用，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则描述元素的上下文中(尤其是以下权利要求的上下文中)的单数冠词如“一”和“一个”和“所述”以及类似指示物应被解释为涵盖单数和复数。
如本文所用，“约”将被本领域普通技术人员理解，并且将在一定程度上根据其所使用的上下文而变化。如果术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，鉴于使用该术语的上下文，“约”将意指至多该特定术语的正负10％。
如本文所用，Cas9多肽是指具有核酸酶活性的Cas9蛋白及其变体，以及含有此类Cas9蛋白及其变体的融合蛋白。融合蛋白可以包括修饰表观基因组或控制转录活性的那些。变体可以包括缺失或添加，诸如，例如，添加一个、两个或更多个核定位序列(诸如来自SV40和本领域已知的其它序列)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个此类序列或前述值中的任意两个之间并包括前述值中的任意两个的范围。在一些实施例中，Cas9多肽是在II型CRISPR相关系统中发现的Cas9蛋白。可用于本技术的合适的Cas9多肽包括但不限于来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(Sp.Cas9)新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、专性嗜热菌(S.thermophiles)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)及其变体的Cas9蛋白。在一些实施例中，Cas9多肽是野生型Cas9、切口酶，或包含核酸酶灭活的(dCas9)蛋白。在一些实施例中，Cas9多肽是包含dCas9的融合蛋白。在一些实施例中，融合蛋白包含转录激活因子(例如VP64)、转录抑制子(例如KRAB、SID)、核酸酶结构域(例如FokI)、重组酶结构域(例如Hin、Gin或Tn3)、脱氨酶(例如胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)或表观遗传修饰因子结构域(例如TET1、p300)。在一些实施例中，Cas9多肽包括与野生型Cas9具有至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或甚至96％、97％、98％或99％序列同一性的变体。因此，多种Cas9多肽可用于本纳米胶囊中，因为包封不是序列依赖性的，只要Cas9多肽的表面具有足够的带正电荷和/或负电荷的残基以允许被本技术的阴离子和/或阳离子基于丙烯酰基的单体包被。其它合适的Cas9多肽可见于Karvelis,G.等人“利用Cas9的天然多样性和体外进化扩展基因组编辑工具箱(Harnessing the naturaldiversity and in vitro evolution of Cas9 to expand the genome editingtoolbox)”《微生物学新见(Current Opinion in Microbiology)》37:88–94(2017)；Komor,A.C.等人“用于真核基因组操作的基于CRISPR的技术(CRISPR-Based Technologies forthe Manipulation of Eukaryotic Genomes)”《细胞(Cell)》168:20–36(2017)；和Murovec,J.等人“CRISPR RNA引导的基因组编辑酶的新变体(New variants of CRISPRRNA-guided genome editing enzymes)”《植物生物技术杂志(Plant Biotechnol.J.)》15:917-26(2017)，其各自通过引用并入本文。
如本文使用的关于聚合物的“分子量”是指重均分子量(Mw)，并且可以通过本领域公知的技术包括凝胶渗透色谱法(GPC)确定。GPC分析可以在例如用聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)校准的D6000M柱上，使用三重检测器(包括折射率(RI)检测器、粘度计检测器和光散射检测器)，以及二甲基甲酰胺作为洗脱剂进行。关于小分子而非聚合物的“分子量”是实际分子量，而非平均分子量。
短语“靶向配体”是指与“靶向受体”结合的配体，所述靶向受体区分被靶向用于基因编辑的细胞。由于在靶细胞上表达或优先表达配体结合可及的配体受体，配体可能能够结合。此类配体的实例包括GE11肽、抗EGFR纳米抗体、cRGD(环(RGDfC))、KE108肽、奥曲肽、叶酸、前列腺特异性膜抗原(PSMA)适体、TRC105、人/鼠嵌合IgG1单克隆抗体、甘露糖和霍乱毒素B(CTB)。此类配体的其它实例包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、阿仑单抗、帕尼单抗、RGD、DARPin、RNA适体、DNA适体、叶酸和其它叶酸受体结合分子的类似物、凝集素、其它维生素、从库筛选中鉴定的肽配体、肿瘤特异性肽、肿瘤特异性适体、肿瘤特异性碳水化合物、肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体、抗体的Fab或scFv(即单链可变区)片段如导向EphA2的抗体的Fab片段或在转移性癌细胞上特异性表达或独特可及的其它蛋白质、源自组合文库的有机小分子、生长因子如EGF、FGF、胰岛素和胰岛素样生长因子以及同源多肽、生长抑素及其类似物、转铁蛋白、脂蛋白复合物、胆盐、分选、类固醇激素、含Arg-Gly-Asp的肽、微管相关序列(MTAS)、各种半乳凝素、δ阿片受体配体、胆囊收缩素A受体配体、对血管紧张素AT1或AT2受体具有特异性的配体、过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体、β-内酰胺类抗生素、小有机分子包括抗微生物药物以及其它与优先在靶细胞表面或传染性生物体表面上表达的受体特异性结合的分子、或这些分子中任何一个的片段。
短语“靶向受体”是指由细胞表达的能够结合靶向细胞的配体的受体。受体可以在细胞表面上表达。所述受体可以是跨膜受体。此类靶向受体的实例包括EGFR、αvβ3整联蛋白、生长抑素受体、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、CD105、甘露糖受体、雌激素受体和GM1神经节苷脂。
在一些实施例中，代替或除了靶向配体之外，细胞穿透肽还可以连接至一个或多个PEG末端基团。“细胞穿透肽”(CPP)，也称为“蛋白质转导结构域”(PTD)、“膜移位序列”和“特洛伊木马肽”，是指短肽(例如，4至约40个氨基酸)，其具有跨细胞膜移位以进入细胞内部，并将各种共价和非共价结合的货物(包括蛋白质、寡核苷酸和脂质体)带入细胞的能力。它们典型地是高度阳离子性的，并富含精氨酸和赖氨酸氨基酸。此类肽的实例包括TAT细胞穿透肽(GRKKRRQRRRPQ)；MAP(KLAL)KLALKLALKALKAALKLA、穿膜肽或黑腹果蝇触足肽(Antenapedia)PTD RQIKWFQNRRMKWKK；穿膜肽-Arg:RQIRIWFQNRRMRWRR；抗胰蛋白酶(358-374)：CSIPPEVKFNKPFVYLI；Temporin L:FVQWFSKFLGRIL-NH2；Maurocalcine:GDC(acm)LPHLKLC；pVEC(钙粘蛋白-5)：LLIILRRRIRKQAHAHSK；降钙素：LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP；神经秩蛋白：GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA；穿膜肽：RQIKIWFQNRRMKWKKGG；TAT-HA2融合肽：RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG；TAT(47-57)YGRKKRRQRRR；SynB1RGGRLSYSRRRFSTSTGR；SynB3 RRLSYSRRRF；PTD-4PIRRRKKLRRL；PTD-5RRQRRTSKLMKR；FHVCoat-(35-49)RRRRNRTRRNRRRVR；BMV Gag-(7-25)KMTRAQRRAAARRNRWTAR；HTLV-II Rex-(4-16)TRRQRTRRARRNR；HIV-1Tat(48-60)或D-TatGRKKRRQRRRPPQ；R9-Tat GRRRRRRRRRPPQ；Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL嵌合体；MAP KLALKLALKLALALKLA；SBP或人P1MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV；FBP GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；MPG ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya(其中cya是半胱胺)；MPG(ΔNLS)ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya；Pep-1或Pep-1-半胱胺ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya；Pep-2 ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya；周期序列、聚精氨酸RxN(4<N<17)嵌合体；聚赖氨酸KxN(4<N<17)嵌合体；(RAca)6R；(RAbu)6R；(RG)6R；(RM)6R；(RT)6R；(RS)6R；R10；(RA)6R；和R7。
“染料”是指分子量(实际而非重均分子量)为2,000Da或更小的有机小分子或能够发光的蛋白质。染料的非限制性实例包括荧光团、化学发光或磷光实体。例如，可用于本技术的染料包括但不限于花青染料(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7及其磺化形式)、异硫氰酸荧光素(FITC)、ALEXA
染料(例如，ALEXA
488、546或633)、
染料(例如，
350、405、488、550、594、633、650、680、755或800)或荧光蛋白，例如GFP(绿色荧光蛋白)。
一方面，本技术提供具有单一核糖核蛋白(RNP)复合物作为核心和包封所述核心的可生物降解的交联聚合物壳的纳米胶囊，其中所述RNP复合物包括Cas9多肽和引导RNA，并且所述聚合物壳包括咪唑基丙烯酰基单体、PEG丙烯酰基单体、双丙烯酰基二硫化物单体、以及阳离子丙烯酰基单体或阴离子丙烯酰基单体或者阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者的聚合单体。靶向配体和/或细胞穿透肽(CPP)也可以例如经由PEG丙烯酰基单体连接至聚合物壳。
引导RNA指导Cas-9多肽在特定基因组位置切割DNA。任何合适的引导RNA可用于本纳米胶囊的RNP中。在一些实施例中，引导RNA是修饰的引导RNA，例如单个引导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，修饰的引导RNA包括crRNA，所述crRNA包含来自单链前间隔序列、Cas9多肽的前间隔序列邻近基序和Cas9多肽的结合区的第一互补链，以及tracrRNA，所述tracrRNA包含Cas9多肽的结合区的第二互补链，其中crRNA或tracrRNA任选地包含与生物素结合分子结合的适体，并且其中crRNA和tracrRNA通过Cas9多肽的结合区的第一和第二互补链杂交。在一些此类实施例中，crRNA和tracrRNA形成sgRNA，所述sgRNA从5'至3'包含单链前间隔序列、Cas9多肽的前间隔序列邻近基序、Cas9多肽的结合区的第一互补链、与生物素结合分子结合的任选适体和Cas9多肽的结合区的第二互补链。在其它实施例中，在修饰的sgRNA的二级结构中，Cas9多肽的结合区和与生物素结合分子结合的适体(当存在时)形成茎环结构。在一些实施例中，如AA所示对sgRNA进行化学修饰。Hendel等人《自然生物技术(Nature Biotech.)》(2015),33:985-89通过引用整体并入本文。其它合适的sgRNA可见于美国临时专利申请第62/519317号(“修饰的引导RNA，CRISPR-核糖核蛋白复合物和使用方法(Modified Guide RNAs,CRISPR-Ribonucleoprotein Complexes and Methods ofUse)”)，其通过引用整体并入本文。
在本纳米胶囊的一些实施例中，修饰的引导RNA具有以下序列：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGCAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:1)；NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:2)；或
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGUUUU(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，待编辑的基因是作为治疗靶标的基因，例如在疾病治疗中期望灭活或校正的基因。在一些实施例中，靶核酸序列是CEP90、CCR5、DMD、NRL、B2M、HBB、PD1、TRAC、BEST1、MERTK、PRDM16、PPARγ、VEGF-A、Oct-4、PI3K、早老素、α-抗胰蛋白酶、血管假性血友病因子或半胱天冬酶-9基因序列。
本技术的纳米胶囊包括包封RNP的薄的可生物降解的交联聚合物壳。使用与RNP的质量相似的本文所述类型的基于丙烯酰基的单体的质量制备聚合物壳。例如，聚合物壳和RNP之间的质量比可在0.4至10.0的范围内，尽管根据所用的RNP，更低和更高的比例也可以是合适的。在一些情况下，质量比范围为0.4至3.5，在其它情况下为0.4至1.2或甚至0.6或0.7至3.5、2.0或1.2。因此，合适的质量比可以包括0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0或在前述值中的任意两个之间并包括前述值中的任意两个的任何范围。
虽然聚合物壳可以包括聚合的阳离子丙烯酰基单体或聚合的阴离子丙烯酰基单体，但也可以包括聚合的阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者。任选地，聚合物壳可以包括聚合的非离子丙烯酰基单体。因此，在一些实施例中，聚合物壳包括阳离子和非离子丙烯酰基单体二者的聚合单体、阴离子和非离子丙烯酰基单体二者的聚合单体、或阳离子、阴离子和非离子单体的聚合单体。在一些实施例中，聚合的阳离子丙烯酰基单体与聚合的阴离子丙烯酰基单体和/或与聚合的非离子单体的摩尔比可在10:1至1:10的范围内。类似地，聚合的阴离子与非离子单体的比例可在10:1至1:10的范围内。此类聚合单体的合适摩尔比包括10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10，或值在前述的任意两个之间并包括前述的任意两个的范围，例如3:1至1:3。所有聚合单体(例如阴离子丙烯酰基和/或阳离子丙烯酰基和/或非离子丙烯酰基，和任选的PEG丙烯酰基单体，和咪唑基丙烯酰基单体和双丙烯酸基二硫化物单体)与RNP的摩尔比可在400:1至8000:1的范围内，尽管也可以使用更高的比例。所有带电丙烯酰基单体与RNP的合适摩尔比包括400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、1100:1、1200:1、1300:1、1400:1、1500:1、1600:1、1800:1、2000:1、2200:1、2500:1、3000:1、3500:1、4000:1、4500:1、5000:1、6000:1、6500:1、7000:1、7500:1或8000:1，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围。
本技术的丙烯酰基单体包括丙烯酸和甲基丙烯酸单体(及其盐)、此类单体的酯和此类单体的酰胺。酯和酰胺可以带有带正电荷的基团，例如胺、脒或胍，或带负电荷的基团，例如羧基、磺酸盐和磷酸盐。例如，本技术的阳离子丙烯酰基单体可具有式(I)的结构：
其中
R1是H或甲基；
R11是H或甲基或乙基；
R12是H或甲基或乙基；
X是O或NH；以及
n是0、1、2、3、4、5或6。
在式(I)的单体的一些实施例中，R11和R12各自为H。在一些实施例中，阳离子丙烯酰基单体具有式(IA)的结构：
其中
R1是H或甲基；
X是O或NH；以及
n是0、1、2、3、4、5或6。
在式(I)或(IA)的单体的一些实施例中，R1为H。在某些实施例中，R1是甲基。在一些实施例中，X是NH。在一些实施例中，n是1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，n是2或3。在一些实施例中，当n是0时，X是NH。
类似地，本发明的阴离子丙烯酰基单体可具有式II的结构：
其中
R2是H或甲基；
Y是OH、-O-(CH2)m-COOH、-O-(CH2)m-SO3H、-O-(CH2)m-OPO3H2、-NH-(CH2)m-COOH、-NH-(CH2)m-SO3H或-NH-(CH2)m-OPO3H2；以及
m是1、2、3、4、5或6。
聚合物壳任选地包括非离子丙烯酰基单体的聚合单体。此类单体在水溶液中保持不带电，但不包括连接有非离子聚合物的丙烯酰基单体，例如PEG丙烯酰基单体。在一些实施例中，非离子丙烯酰基单体具有式III的结构：
其中
R7是H或甲基；
R15和R16各自独立地为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
在一些实施例中，R7为H。在某些实施例中，R15和R16都是H。
本技术的咪唑基丙烯酰基单体包括含有咪唑基的丙烯酸/甲基丙烯酸的酯和酰胺。例如，咪唑基丙烯酰基单体可具有式IV的结构：
其中
R3是H或甲基；
Z是O或NH；以及
t是1、2、3、4、5或6。
在其它实施例中，咪唑基丙烯酰基单体具有式IV-2的结构：
其中
R13是H或甲基；
Z2是O或NH；以及
p是1、2、3、4、5或6。
在其它实施例中，咪唑基丙烯酰基单体具有式IV-3的结构：
其中
R14是H或甲基；
q是0、1、2、3、4、5或6。
在式(IV)、(IV-2)和(IV-3)的咪唑基丙烯酰基单体的一些实施例中，R3或R13或R14为H。在某些实施例中，Z或Z2是NH。在一些实施例中，t是2或3或p是2或3。在一些实施例中，q是1、2或3。
与阴离子/阳离子丙烯酰基单体相比，使用更少咪唑基丙烯酰基单体来制备聚合物壳。例如，咪唑基丙烯酰基单体与RNP的摩尔比可以为20:1至800:1。合适的摩尔比包括20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、150:1、200:1、250:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围，例如20:1至400:1或20:1至60:1。
如上所述，聚合物壳包括双丙烯酰基二硫化物单体，其设计用于交联聚合物壳，但一旦纳米胶囊释放到靶细胞的胞质溶胶中就会降解。例如，双丙烯酰基二硫化物可具有式V的结构：
其中
A和D独立地选自O和NH；以及
R4和R5独立地选自H和甲基。
在式V的双丙烯酰基二硫化物的一些实施例中，A和D各自为NH。在式V的某些实施例中，R4和R5各自为H。在一些实施例中，双丙烯酰基二硫化物与RNP的摩尔比可以是50:1至1000:1。合适的摩尔比包括50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1、200:1、210:1、250:1、300:1、350:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围。
在本NC的一些实施例中，聚合的壳包括聚合的PEG丙烯酰基单体。PEG丙烯酰基单体可以是含有PEG的丙烯酸/甲基丙烯酸的酯或酰胺。在一些实施例中，PEG丙烯酰基单体具有式VI的结构：
其中
E是O或NH；以及
R6是H或甲基；以及
PEG是重均分子量为100Da至10000Da的聚乙二醇。在一些实施例中，PEG具有100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000或10000Da的重均分子量，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围。例如，PEG的分子量可以为500至5000。
每个PEG以选自靶向配体、OH、O-(C1-6)烷基、NH2、生物素、细胞穿透肽、染料或其它显像剂的各种基团之一封端。例如，显像剂可以是同位素的螯合剂(例如，三氮杂环壬烷-次膦酸(即，TRAP)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(即，DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-三乙酸(即，NOTA)、二乙烯三胺五乙酸(即，DTPA)或螯合肽)。因此，显像剂可以是用于PET或MRI的显像剂。在一些实施例中，PEG以OH或O-(C1-6)烷基封端，并且在另一些实施例中，PEG以OC1-3烷基封端。在一些实施例中，PEG以靶向配体封端。靶向配体可以选自由辅因子、碳水化合物、肽、抗体、纳米抗体或适体组成的组。在其它实施例中，靶向配体或CPP选自由叶酸、甘露糖、GE11、抗EGFR纳米抗体、cRGD、KE108、奥曲肽、TAT细胞穿透肽、PSMA适体、TRC105和CTB组成的组。靶向配体可以通过反应性接头如马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺与PEG连接。PEG丙烯酰基单体与RNP的摩尔比可在0:1或1:1至30:1，例如0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1的范围内，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围。
在另一方面，提供制备本技术的纳米胶囊的方法。可以通过如本文所述在缓冲水溶液中或根据已知方法组合Cas9和期望的引导RNA来制备RNP。因为RNP在蛋白质和sgRNA上表现出不均匀的表面电荷，所以阳离子和/或阴离子丙烯酰基单体通过静电相互作用在RNP周围形成包被。咪唑基丙烯酰基单体、双丙烯酰基二硫化物和PEG丙烯酰基(当存在时)也通过范德华相互作用被吸引到RNP复合物的表面。因此，本文所述的纳米胶囊可简单地通过将RNP在缓冲水溶液中与阳离子和/或阴离子丙烯酰基单体混合，然后与咪唑基丙烯酰基和可生物降解的交联剂以单体与RNP的摩尔比混合而制备，如本文所述。第一聚合(例如过硫酸铵/TMEDA引发)进行一段时间(例如30-90分钟)，之后将PEG丙烯酰基(当存在时)加入到混合物中，并进行第二聚合以将PEG基团引入到聚合物壳中。
在另一方面，本技术提供包括本文所述的任意纳米胶囊的试剂盒，以及包含本文公开的任意纳米胶囊和药学上可接受的载体的组合物。所述组合物可用于本文所述的方法中。一方面，本技术提供一种将RNP递送到细胞以修饰靶基因的方法，包括将细胞暴露于有效量的纳米胶囊。细胞可以在体外或在体内。“有效量”是指产生期望效果所需的纳米胶囊的量。有效量的一个实例包括在靶细胞中产生期望基因编辑的量或剂量。当细胞在体内时，将有效量递送给受试者，例如需要其的受试者。如本文所用，“受试者”是哺乳动物，例如猫、狗、啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施例中，所述受试者是人。
本文所述的组合物可以配制成用于各种施用途径，例如，通过肠胃外、玻璃体内、鞘内、脑室内、直肠、鼻腔、阴道施用、直接注射到靶器官中或经由植入型药盒。肠胃外或全身施用包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内和肌内注射。下列剂型通过实例的方式给出，并且不应解释为限制本技术。
可注射剂型通常包括溶液或水性悬浮液，其可以使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备，只要此类试剂不干扰本文所述的纳米颗粒的形成即可。可注射形式可以用可接受的溶剂或溶媒制备，包括但不限于无菌水、磷酸盐缓冲液、林格氏溶液、5％葡萄糖或等渗盐水溶液。
除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和载体通常是本领域技术人员已知的，并且因此包括在本技术中。此类赋形剂和载体描述于例如“《雷氏药学大全(Remingtons Pharmaceutical Sciences)》”马克出版有限公司(Mack Pub.Co.),新泽西州(1991)，其通过引用并入本文。示例性的载体和赋形剂可以包括但不限于USP无菌水、盐水、缓冲液(例如磷酸盐、碳酸氢盐等)、张度剂(例如甘油)，
具体剂量可以根据疾病状况、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、剂量间隔、施用途径、排泄速率和药物缀合物的组合来调整。含有有效量的任何上述剂型都恰好在常规实验的界限之内，并且因此也恰好在本技术的范围之内。仅作为示例，此类剂量可用于向患者施用有效量的本纳米胶囊，并且可包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15mg/kg，或在前述值的任意两个之间并包括前述值的任意两个的范围，包括0.1至15mg/kg。此类量可以如本文所述肠胃外施用，并且可以发生在一段时间内，包括但不限于5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、15小时、20小时、24小时或在任一前述值之间并包括任一前述值的范围。施用频率可以变化，例如每天一次、每2天一次、每3天一次、每周一次、每10天一次、每2周一次，或在任一前述频率之间并包括任一前述频率的范围。可替代地，可以在2、3、4、5、6或7个连续日每天一次施用组合物。因此，完整的方案可能仅在几天内或在1、2、3、4或更多个星期的过程内完成。
在另一方面，本技术提供试剂盒，其包括制备本文所述的任意组合物所需的组分。例如，试剂盒可包括含有如本文所述的纳米胶囊和试剂盒的使用说明的包装。在另一个实施例中，试剂盒包括Cas9多肽和制备本技术的纳米胶囊所需的丙烯酸单体和其它试剂以及制备纳米胶囊的说明。使用者可以提供期望的gRNA，或者可以随试剂盒一起供应。本试剂盒允许使用者通过首先制备RNP然后根据本技术将其包封来制备本文所述的递送组合物，和/或采用纳米胶囊来编辑靶细胞内的遗传基因座。
提供本文的实例以说明本技术的优点，并进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用本技术的纳米颗粒组合物。就组合物包括可电离的组分而言，也可以使用盐如此类组分的药学上可接受的盐。为了更充分地说明本技术的优选方面，还给出了本文的实例。如所附权利要求所定义的，所述实例绝不应解释为限制本技术的范围。所述实例可以包括或并入上述本技术的任意变型或方面。上述变型或方面还可以进一步各自包括或并入本技术的任意或所有其它变型或方面的变型。
实例
概述
材料。N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACA)、1-乙烯基咪唑(VI)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA)、N,N'-亚甲基二丙烯酰胺(BAA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和过硫酸铵(APS)购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(菲奇堡，威斯康星州，美国)。丙烯酸(AA)，丙烯酰化PEG(APEG；480Da)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APMA)购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州，美国)。丙烯酰化PEG-马来酰亚胺(APEG-Mal；2KDa)和丙烯酰化PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(APEG-NHS；2KDa)购自CreativePEGWorks(教堂山，北卡罗来纳州，美国)。细胞穿透肽(CPP)和TAT-Cys(CYGRKKRRQRRR)由金斯瑞(Genscript)(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)合成。
细胞培养。将人胚胎肾(HEK)、正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)和M21黑色素瘤细胞系在明胶A包被的平板上的补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和50U/mL青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中维持在第10-50代。将Jurkats维持在含有10％FBS和50U/mL青霉素/链霉素的RPMI 1640中的悬浮培养物中。将WA09 WA09人胚胎干细胞(hESC)(WiCell，麦迪逊，威斯康辛州)维持在基质胶(WiCell)包被的组织培养聚苯乙烯平板(BD Falcon)上的mTESR培养基中。使用Versene溶液(生命科技公司(LifeTechnologies))以1:6的比例每3-4天传代hESC一次。
如先前所报道的(T.Harkness,J.D.Mcnulty,R.Prestil,S.K.Seymour,T.Klann,M.Murrell,R.S.Ashton,K.Saha,《生物技术杂志(Biotechnol.J.)》2015,10,1555；Steyer,B.,Carlson-Stevermer,J.,Angenent-Mari,N.,Khalil,A.,Harkness,T.和Saha,K.(2016)《生物学报(Acta Biomater)》34,143–158)使用gRNA AAVS1-T2(Addgene#41818)通过CRISPR介导的修饰AAV-CAGGS-EGFP质粒(Addgene#22212)在AAVS1安全港基因座的插入产生了H2B-mCherry转基因品系。将所有细胞维持在37℃和5％CO2下。通过在BD FACS Aria上进行嘌呤霉素选择或荧光辅助细胞分选(FACS)，使细胞系保持mCherry阳性。
实例1：RNP的制备
sgRNAs体外转录。根据制造商的方案，使用Q5高保真聚合酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))通过重叠PCR形成截短的T7启动子和期望sgRNA序列的DNA双链模板，并将其置于热循环仪中进行35个于98℃持续5秒，52℃持续10秒和72℃持续15秒的循环，并且最终延伸时段为在72℃持续10分钟。然后根据制造商的方案，将PCR产物在HiScribe T7体外转录反应(新英格兰生物实验室)中于37℃孵育过夜。使用MEGAclear转录清洁试剂盒(赛默飞世尔)纯化所得的RNA。使用Qubit荧光计(赛默飞世尔)定量sgRNA浓度。靶向mCherry的sgRNA序列(带有PAM位点)如下：GGAGCCGTACATGAACTGAG GGG。
纳米胶囊(NC)的制备，方法I。将sNLS-Cas9-sNLS蛋白(Aldevron，麦迪逊，威斯康辛州)与期望的sgRNA以1:1的比例混合，并使其在温和混合下复合5分钟。将Cas9 RNP复合物在5mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.5)中稀释至250ng/mL。在搅拌下，以5分钟的间隔将单体以AA、AEMA和甲基丙烯酸2-(1H-咪唑-2-羧酰胺基)乙酯(ICEMA)的顺序加入到上述溶液中。另外5分钟后，加入交联剂BACA，然后加入过硫酸铵(2μL；10mg/mL，在碳酸氢钠缓冲液中)。将混合物脱气10分钟，并通过加入TMEDA(3μL；10mg/mL，在脱气的DI水中)立即引发聚合反应。聚合50分钟后，加入APEG。使反应继续进行另外10分钟。最后，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)进行透析，以除去未反应的单体和引发剂。所使用的AA/AEMA/ICEMA/BACA/APEG(a/b/c/d/e)的摩尔比总结在图2中。特别地，NC-3的a/b/c/d/e比为337/225/38/70/10。非双丙烯酰基二硫化物BAA用于制备不可生物降解的NC。
为了制备与CPP缀合的NC(NC-CPP)，首先通过使APEG-马来酰亚胺(APEG-Mal)和CPP(即TAT-Cys)在pH为7.4的水溶液中通过SH-Mal反应进行反应，制备丙烯酰化PEG-CPP(APEG-CPP)。简而言之，将APEG-Mal(1.0mg)、CPP(3.1mg)和TCEP(1.0mg)溶于PBS(3mL；pH7.4)。将所得溶液在室温搅拌24小时。用DI水透析48小时以除去杂质后，通过冻干获得聚合物APEG-CPP。然后，按照与上述相似的方案制备NC-CPP，其中AEMA/AA/ICEMA/BACA/APEG/APEG-CPP摩尔比为337/225/38/70/4/6。
制备纳米胶囊的可替代方法，方法II。新鲜制备碳酸氢钠缓冲液(10mM，pH＝9.0)，并使用冷冻-泵-解冻方法脱气3个循环。将sNLS-Cas9-sNLS蛋白(Aldevron，麦迪逊，威斯康辛州)与sgRNA(根据制造商的方案合成，新英格兰生物实验室，马萨诸塞州)以1:1的摩尔比混合，并使其在温和混合下复合5分钟。准确称量AA、APMA、VI和APEG并溶解在脱气的碳酸氢钠缓冲液(2mg/ml)中。准确称量VI、APS和TMEDA并溶解在脱气的碳酸氢钠缓冲液(1mg/ml)中。在氮气气氛下，在碳酸氢钠缓冲液中将Cas9 RNP复合物稀释至0.12mg/mL。在5分钟的间隔下，在搅拌下将单体溶液以AA、APMA和VI的顺序加入到上述溶液中。在每5分钟间隔中，将溶液通过真空泵脱气3分钟，并用氮气回流。另外5分钟后，加入交联剂BACA，然后加入过硫酸铵。将混合物脱气5分钟，并通过加入TMEDA立即引发聚合反应。在氮气气氛下聚合65分钟后，加入APEG。使反应继续进行另外30分钟。最后，使用20mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)进行透析，以除去未反应的单体和引发剂。用于最佳制剂的AA/APMA/VI/BACA/APEG(a/b/c/d/e)的摩尔比为927/927/244/231/33。
实例2：RNP NC的表征
通过动态光散射(DLS,ZetaSizer Nano ZS90,马尔文仪器公司(MalvernInstruments)，美国)和透射电子显微镜(TEM,FEI Tecnai G2 F30 TWIN 300KV,费希尔仪器公司(E.A.Fischione Instruments,Inc.)美国)研究了RNP NC的大小和形态。Zeta电势通过ZetaSizer Nano ZS90(马尔文仪器公司，美国)测量。纯化后，干燥的NC-3的透射电子显微镜(TEM)显示尺寸均匀的NC，平均尺寸为约10nm(图3)。通过DLS测量的平均流体动力学直径为12.7nm，并且对于NC-3获得了-0.9mV的电动电位(表1)，表明NC掩盖了RNP的净负电荷。
表1：Cas9、RNP和RNP NC(通过方法I制备)的平均流体动力学直径和电动电位。
| Cas9蛋白 | RNP | RNP NC-3 | |
| 尺寸(nm) | 6.3±0.6 | 7.6±1.1 | 12.7±2.8 |
| 电动电位(mV) | 7.9±3.13 | -18.5±4.1 | -0.9±1.3 |
实例3：测定RNP递送和功效
转染前一天，于100μL培养基中将细胞接种到96孔板(表2)中。转染当天，形成具有期望引导序列的RNP，将NC-RNP或脂质体2000-RNP(0.75μL脂质体2000/孔)复合物加入到细胞中以转染RNP。在第6天，收集细胞用于流式细胞术(BD FACSCanto II)，并测定mCherry荧光。使用FlowJo软件进行流量分析。
表2.纳米胶囊(NC)体外功能测试的条件。
基因组分析。采用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理并离心后，使用DNA QuickExtract(Epicentre，麦迪逊，威斯康辛州)从细胞中分离DNA。将QuickExtract溶液在65℃孵育15分钟，在68℃孵育15分钟，最后在98℃孵育10分钟。按照制造商的说明，使用Q5高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)和500ng基因组DNA进行基因组PCR。然后使用AMPure XP磁珠纯化试剂盒(贝克曼库尔特(Beckman Coulter))纯化产物，并使用Nanodrop2000进行定量。对于深度测序，将样品合并，并在依诺米娜HiSeq2500高通量(Illumina HiSeq2500 HighThroughput)上以2x125bp的运行长度或在Illumina Miseq 2x150bp上运行。
深度测序数据分析。开发了自定义的python脚本来执行序列分析。管道从预处理开始，该预处理由滤除低质量序列并找到读段的已定义末端组成。对于每个样本，从数据中过滤出频率小于100的序列。其中读段与引物和反向互补子序列匹配的序列被分类为“靶序列”。使用全局成对序列对齐将靶序列与相应的野生型序列进行对齐。在预期切割位点周围未对齐的序列被归类为编辑事件。匹配、插入、缺失和错配的频率、长度和位置都在得到的对齐序列中进行了追踪。
摄取测定。转染前一天，将细胞(HEK或NHDF)以约40,000个细胞/孔的密度接种到2个孔培养室(Ibidi)中。NC由与crRNA组合的Atto-550荧光标记的TRACr gRNA(集成DNA技术)形成，并以1ug/孔加入到细胞中进行转染。使用Eclipse TI落射荧光显微镜(尼康(Nikon))和AR1共聚焦显微镜(尼康)在各个时间点对细胞成像。使用CellProfiler进行图像分析。
结果。使用称为H2B-mCherry报告系统的人胚胎肾(HEK)细胞系，测试了具有不同制剂的NC的基因敲除效率。在这些细胞中的每一个中，使mCherry转基因与组蛋白2B融合，使得细胞核在红色通道中发荧光。通过使用靶向mCherry转基因的合适sgRNA，成功的基因编辑会导致细胞核中mCherry荧光的丢失，这容易通过流式细胞术检测。
在图2中总结了用于不同NC(通过方法I制造)的基因编辑效率。由于RNP的表面电荷分布是不均匀的，因此具有阳离子和阴离子单体的NC均提供更高的效率。纯阳离子或阴离子单体制剂比同时含有阳离子和阴离子单体的制剂表现出较低的基因编辑效率。含有阳离子/阴离子比例为3:2的阳离子和阴离子单体混合物的制剂(NC-3)表现出最高的基因敲除功效。
在NC中掺入至少一些咪唑基丙烯酰基单体有助于高效基因编辑。如图2所示，编辑效率随每个NC的咪唑基丙烯酰基单体量的增加而增加。交联剂的量也影响基因编辑效率。在低交联剂量下，几乎没有观察到基因编辑，这可能是由于在RNP周围未成功形成NC所致。利用足够量的交联剂检测到相似的基因编辑能力。此外，由非双丙烯酰基二硫化物形成的NC导致编辑效率仅高于基线，表明需要生物降解能力以促进RNP在胞质溶胶中的释放。在胞质溶胶中存在GSH时，可降解交联剂中存在的二硫键容易裂解，从而允许有效释放RNP。
最后，NC和RNP之间的质量比也影响基因编辑效率。需要足够量的丙烯酰基单体以形成NC聚合物包被，以完全封装RNP。具有低NC:RNP质量比的NC(例如NC-11)没有表现出任何基因编辑(图2)，这可能是由于RNP包被不足导致的NC形成不成功。一旦达到临界NC:RNP质量比，对于具有不同NC:RNP比的NC，观察到相似的基因编辑效率。由于交联剂量不足可能会发生NC形成不成功，为消除低NC:RNP质量比和交联剂量的影响，测试了另外两种NC制剂，其中改变了NC:RNP质量比，同时保持交联剂量不变。基因编辑效率的差异证实，低总量的含丙烯酰基反应物也可能导致不成功的NC形成。选择通过方法I(即a/b/c/d/e:337/225/38/70/10)制备的NC-3制剂进行进一步研究。
在体外转染入人细胞后不久，检查了NC的细胞摄取和货物的细胞定位。荧光标记的gRNA用于监测新生人皮肤成纤维细胞(NHDF)和HEK细胞中NC-3的摄取。两种细胞系在向培养基中加入NC的5分钟内均表现出对NC的快速摄取，然后大概在从NC中释放后的一小时内定位到细胞核。另外五小时后，标记的RNP的摄取和核定位大大增加，这表明颗粒的快速摄取和NC的分解使RNP在此时间表内释放到胞质溶胶中。为了增加NC的细胞摄取，将CPP(即TAT)缀合到NC上。与CPP缀合的NC(即NC-CPP)比没有缀合的NC展示出更高的细胞摄取水平。
为了评估用NC转染后对细胞健康的影响，进行了比色MTT测定。在该测定中，四唑鎓盐(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑鎓溴化物，MTT)通过仅在活细胞中有活性的酶转化为有色的甲瓒产物。在涉及HEK细胞的该测定中，NC-3不会引起显著的细胞毒性(<10％细胞死亡)。与其它研究一致，脂质体2000在相同剂量下表现出显著的细胞毒性(即约27％的细胞死亡)，如图4A所示。
在人类基因编辑测定中，将NC-3与脂质体2000(用于Cas9 RNP递送的最先进的市售转染试剂)进行了比较。如图4B和4C所示，HEK细胞内基因编辑产生的mCherry敲除效率至少与脂质体2000相当，如果不是更高的话。然后用H9人胚胎干细胞和Jurkat永生化T细胞系对NC-3进行了测试，这是两种著名的细胞类型，其中已报道脂质体2000具有低至没有的递送RNP的能力(X.Liang,J.Potter,S.Kumar,Y.Zou,R.Quintanilla,M.Sridharan,J.Carte,W.Chen,N.Roark,S.Ranganathan,N.Ravinder,J.D.Chesnut,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》2015,208,44)NC-3能够显著编辑H2B-mCherry转基因(图5A-5B，6A-6B)，而脂质体2000则具有低至没有的产生基因编辑的能力。使用NC-3以10％的效率编辑胚胎干细胞，而使用NC-3以约5％的效率编辑Jurkat细胞(通过减去未转染的对照计算)。
实例4：NC-RNP的编辑功效的体内评估
小鼠注射。对于小鼠研究，使用Ai14小鼠(从杰克逊实验室(Jackson Labs)获得)来测定视网膜色素上皮(RPE)中的基因编辑效率。将它们维持在200lux光照环境中的严格控制的温度(23±5℃)、湿度(40-50％)和明/暗(12/12h)循环条件下。在注射期间，将小鼠置于温度调节的加热垫上，并且出于恢复目的维持热稳定性。在注射之前，用0.5％盐酸丙美卡因滴剂将角膜麻醉，并用1％阿托品扩张瞳孔。通过将Cas9蛋白与靶向切除SV40 polyA块(AAGTAAAACCTCTACAAATG)的sgRNA以1:1的摩尔比混合来形成RNP(8μg)。(B.T.Staahl,M.Benekareddy,C.Coulon-Bainier,A.A.Banfal,S.N.Floor,J.K.Sabo,C.Urnes,G.A.Munares,A.Ghosh,J.A.Doudna,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》2017,35,431.)将含有RNP的NC-3(8μg)混合到2.5μL的注射体积进入视网膜下间隙中。预期用NC-3处理的小鼠在视网膜色素上皮细胞中显示tdTomato表达，这是成功进行基因编辑以切除sv40 polyA块的标志。
所有手术操作均在手术显微镜下进行。用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(16mg/kg)麻醉小鼠。使用装有NanoFil注射器的UMP3超微型泵和RPE-KIT(均来自世界精密仪器(World Precision Instruments)，萨拉索塔，佛罗里达州)注射入视网膜下间隙或玻璃体并进行手动注射。将针头对准视网膜的鼻下区域，并将剂量为8μg RNP的NC-3溶液(2.5μL)注入视网膜下间隙。由气泡形成证实成功施用。形成气泡后，将针尖在气泡中保留10秒，轻轻拔出。也将PBS溶媒的溶液(2.5μL)注射到对眼的视网膜下间隙中以用作对照。
成像。为了评估由成功的基因编辑产生的tdTomato表达，用PBS冲洗被处死小鼠的去核眼睛两次，用28号针头在锯齿缘进行穿刺，并沿角膜切口张开眼睛。然后小心地取出晶状体。眼杯是扁平的，形成向中心放射的切口，呈现出最终的“海星”外观。然后将视网膜与RPE层轻轻分离。将分离的RPE和视网膜平整安装在盖玻片上，并使用Nikon C2共聚焦显微镜(尼康仪器有限公司(Nikon Instruments Inc.)，梅威尔(Mellville)，纽约)用NIS-Elements成像。561nm二极管激光器用于红色激发，并通过低噪声PMT C2检测器在Plan ApoVC 20X/0.75,1mm WD透镜中捕获图像。在注射NC-3的小鼠中观察到RPE中的tdTomato表达，而在对照中则未观察到(图7)
等同物
尽管已经说明和描述了某些实施例，但是本领域普通技术人员在阅读上述说明书后，可以对本文所列的本技术的缀合物和纳米颗粒或其衍生物、前药或药物组合物进行改变、等同物的替代和其它类型的改变。上述每个方面和实施例也可以已经包括或并入其中，例如关于任何其它方面或所有其它方面和实施例所公开的变化或方面。
就旨在作为本技术的各个方面的单个说明的本文所述的特定方面而言，本技术也不受限制。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本技术进行多种修改和变化，这对本领域技术人员而言将是显而易见的。根据前面的描述，除了本文列举的那些之外，在本技术范围内的功能上等效的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。应该理解，本技术不限于特定的方法、缀合物、试剂、化合物、组合物、标记的化合物或生物系统，它们当然可以变化。除非本文另外指出或与上下文另外明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在进行限制。因此，旨在仅在仅由所附权利要求、其中的定义及其任何等同物指示的本技术的广度、范围和精神的情况下，将说明书视为示例性的。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素为必不可少的。
本文示例性地描述的实施例可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且不旨在使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到在要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。另外，短语“基本上由……组成”将被理解为包括具体叙述的那些要素和不会实质性地影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的那些附加要素。短语“由...组成”不包括未指定的任何元素。
另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任意单个成员或成员的子组描述本公开。落入一般公开内的每个较窄的种类和亚类分组也构成该技术的一部分。这包括对技术的一般性描述，但附带条件或否定限制可从属中除去任何主题，无论本文中是否具体叙述了切除的材料。
如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地识别为充分描述，并且可以将相同范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域的技术人员还将理解的那样，所有语言如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括叙述的数字并指范围，该范围随后可分解为子范围，如上所讨论的。最终，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员，并且每个单独的值都被并入说明书中，就好像其在本文中被单独叙述一样。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、已授权的专利和其它文件(例如期刊、文章和/或教科书)均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请、已授权的专利或其它文件都被具体地和单独地指示通过引用整体并入。在与本公开中的定义相抵触的程度上，排除通过引用并入的文本中含有的定义。
在以下权利要求中阐述了其它实施例，以及此类权利要求所赋予的等同物的全部范围。
Claims (14)
1.一种纳米胶囊，其包含单一核糖核蛋白(RNP)复合物作为核心和包封所述核心的可生物降解的交联聚合物壳，其中
所述RNP复合物包含Cas9多肽和引导RNA，以及
所述可生物降解的交联聚合物壳包含
(a)咪唑基丙烯酰基单体，
(b)双丙烯酰基二硫化物，
(c)阳离子丙烯酰基单体、阴离子丙烯酰基单体或者阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者，
(d)任选的PEG丙烯酰基单体，以及
(e)任选的非离子丙烯酰基单体的聚合单体，
其中：
所述咪唑基丙烯酰基单体具有式IV、式IV-2或式IV-3的结构：
其中
R3是H或甲基；
Z是O或NH；
t是1、2、3、4、5或6；
R13是H或甲基；
Z2是O或NH；
p是1、2、3、4、5或6；
R14是H或甲基；并且
q是0、1、2、3、4、5或6；
所述双丙烯酰基二硫化物单体具有式V的结构：
其中
A和D独立地选自O和NH；并且
R4和R5独立地选自H和甲基；
所述PEG丙烯酰基单体存在并且具有式VI的结构：
其中
E是O或NH；
R6是H或甲基；
PEG是重均分子量为500Da至5,000Da的聚乙二醇；并且所述PEG被选自靶向配体、OH、O-(C1-6)烷基、NH2、生物素、细胞穿透肽、染料或其它显像剂的基团封端；并且
(i)所述阳离子丙烯酰基单体具有式(I)的结构：
(ii)所述阴离子丙烯酰基单体具有式(II)的结构；和
(iii)所述非离子丙烯酰基单体具有式(III)的结构：
其中
R1是H或甲基；
R11是H或甲基或乙基；
R12是H或甲基或乙基，任选地其中R11和R12各自为H；
X是O或NH；
n是0、1、2、3、4、5或6；
R2是H或甲基；
Y是OH、-O-(CH2)m-COOH、-O-(CH2)m-SO3H、-O-(CH2)m-OPO3H2、-NH-(CH2)m-COOH、-NH-(CH2)m-SO3H或-NH-(CH2)m-OPO3H2；
m是1、2、3、4、5或6；
R7是H或甲基；并且
R15和R16各自独立地为H、甲基、乙基、丙基或异丙基。
2.根据权利要求1所述的纳米胶囊，其中所述引导RNA是修饰的引导RNA，其包含
crRNA，所述crRNA包含单链前间隔序列、Cas9多肽的前间隔序列邻近基序和所述Cas9多肽的结合区的第一互补链，以及
tracrRNA，所述tracrRNA包含所述Cas9多肽的所述结合区的第二互补链，
其中所述crRNA或所述tracrRNA任选地包含与生物素结合分子结合的适体，
其中所述crRNA和所述tracrRNA通过所述Cas9多肽的所述结合区的所述第一和第二互补链杂交；
任选其中：
所述crRNA和所述tracrRNA形成sgRNA，所述sgRNA从5'至3'包含
所述单链前间隔序列、
Cas9多肽的所述前间隔序列邻近基序、
所述Cas9多肽的结合区的所述第一互补链、
任选的与生物素结合分子结合的所述适体，以及
所述Cas9多肽的所述结合区的所述第二互补链。
3.根据权利要求2所述的纳米胶囊，其中在修饰的sgRNA的二级结构中，所述Cas9多肽的所述结合区和任选的与所述生物素结合分子结合的所述适体形成茎环结构。
4.根据权利要求3所述的纳米胶囊，其中所述修饰的引导RNA具有以下序列
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGCAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU；(SEQ ID NO:1)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:2)；或
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCCGAAUACGAGAUGCGGCCGCCGACCAGAAUCAUGCAAGUGCGUAAGAUAGUCGCGGGUCGGCGGCUCGUAUUCGUUUU(SEQ ID NO:3)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米胶囊，其中所述聚合物壳与所述RNP之间的质量比范围为大于0.4至10.0；
任选地其中：
所述聚合物壳与所述RNP之间的质量比范围为0.4至3.5。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含阳离子和阴离子丙烯酰基单体二者的聚合单体；任选其中：
所述阳离子丙烯酸酯单体与所述阴离子丙烯酸酯单体的摩尔比范围为10:1至1:10；或者
所述阳离子丙烯酸酯单体与所述阴离子丙烯酸酯单体的摩尔比范围为3:1至1:3。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米胶囊，其中所述聚合物壳包含阳离子和非离子丙烯酰基单体二者的聚合单体；任选其中：
所述阳离子丙烯酰基单体与所述非离子丙烯酰基单体的摩尔比范围为10:1至1:10；或者
所述阳离子丙烯酰基单体与所述非离子丙烯酸酯单体的摩尔比范围为3:1至1:3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米胶囊，其中所有单体与RNP的摩尔比为约400:1至8000:1；
任选其中：
咪唑基丙烯酰基单体与RNP的摩尔比为20:1至800:1；
咪唑基丙烯酰基单体与RNP的摩尔比为20:1至400:1；
双丙烯酰基二硫化物单体与RNP的摩尔比为50:1至1000:1；
PEG丙烯酰基单体与RNP的摩尔比为0:1至30:1；或者
其两个或更多个的组合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的纳米胶囊，其中
R11和R12各自为H；
X是NH；
n是0、2或3；并且
R15和R16各自独立地为H。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的纳米胶囊，其中
R3是H；
Z是NH；
t是2或3；
R13是H；
Z2是NH；
p是2或3；
R14是H；并且
q是1、2或3。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的纳米胶囊，其中
A和D是NH；并且
R4和R5是H。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的纳米胶囊，其中至少PEG丙烯酰基单体包含连接至PEG部分的靶向配体、染料或细胞穿透肽。
13.有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的纳米胶囊在制备用于将RNP递送至细胞以修饰靶基因的试剂盒中的用途。
14.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的纳米胶囊。
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