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CN111213051B - 用于确定分析物的纳米传感器方法和装置 - Google Patents

用于确定分析物的纳米传感器方法和装置 Download PDF

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CN111213051B CN201880066841.9A CN201880066841A CN111213051B CN 111213051 B CN111213051 B CN 111213051B CN 201880066841 A CN201880066841 A CN 201880066841A CN 111213051 B CN111213051 B CN 111213051B
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Abstract

本发明一般而言涉及用于例如经由表面等离子共振、电共振、磁共振、颜色变化等确定分子和其它特征的纳米传感器。这些物品和方法可以例如被用于样品检测。在本发明的一些方面中描述的物品包括微孔阵列和纳米传感器阵列。纳米传感器阵列可以利用定位在纳米结构上的能够与被怀疑包含分析物的样品(诸如单个细胞)相互作用的纳米颗粒。纳米颗粒与样品之间的相互作用可以通过施加的能量的变化来检测，诸如由于入射可见光的表面等离子共振和/或其它类型的共振引起的更改的电磁辐射。电磁辐射可以被施加到微孔阵列和纳米传感器，并且当纳米传感器与被怀疑包含分析物的样品相互作用时，施加的电磁辐射可以被更改。

Description

用于确定分析物的纳米传感器方法和装置
相关申请
本申请要求Quan等人于2017年9月8日提交的名称为“Nanosensor Methods andApparatuses for Determination of Analytes”的美国临时专利申请序列No.62/556,186的权益，该美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
在一些方面，本发明一般而言涉及与用于例如经由表面等离子共振、颜色变化等确定分子和其它特征的纳米传感器有关的物品和方法。
背景技术
免疫测定(Immunoassay)已被广泛用于疾病诊断。由于大量测量得自荧光标记分子或酶促反应的荧光或比色信号，常规免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹法(western blot))具有通常在100pg/ml及以上的有限检测灵敏度。此外，当前的免疫测定只能在大量细胞上执行。现有的单细胞技术包括流式细胞术，其受到抗体的选择的限制，因为典型的流式细胞术方法仅与10％的可用抗体兼容。当前可用的技术都不能够以高度复用的形式在单细胞水平检测细胞内分子。
因此，需要针对疾病预后和药物开发改善检测极限。
发明内容
在一些方面，本发明一般而言涉及与用于例如经由表面等离子共振、电偶极共振或磁偶极共振、颜色变化等确定分子和其它特征的纳米传感器有关的物品和方法。在一些情况下，本发明的主题涉及相互关联的产品、针对特定问题的替代解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。
在一方面，本发明一般而言涉及一种物品。在一组实施例中，物品包括微孔阵列(microwell array)，该微孔阵列包括孔(well)，该孔包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与入射光相互作用。
根据另一组实施例，物品包括：微孔阵列，该微孔阵列包括孔；以及纳米传感器阵列，该纳米传感器阵列包括远侧定位在被包含在孔内的纳米结构的端部上的纳米颗粒，其中纳米颗粒的尺寸被调整为经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与入射可见光相互作用，以更改入射可见光。
在另一方面，本发明一般而言涉及一种方法。在另一组实施例中，描述了组装物品的方法。该方法包括相对于包括纳米结构阵列的第二基底固定包括微孔阵列的第一基底，该微孔阵列包括孔，使得纳米结构被定位在孔内，纳米结构中的至少一些包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒。
在一组实施例中，该方法包括：向远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒施加电磁辐射，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与电磁辐射相互作用以更改电磁辐射；以及确定更改的电磁辐射。
根据另一组实施例，该方法包括将细胞定位在微孔阵列的孔内，其中孔还包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒和至少部分地涂覆在纳米颗粒上的反应实体。在另一组实施例中，该方法还包括：在孔内裂解细胞以释放被怀疑能够结合反应实体的分析物；以及向纳米颗粒施加电磁辐射，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与电磁辐射相互作用以更改电磁辐射；以及确定更改的电磁辐射以确定分析物。
又一组实施例涉及一种方法，该方法包括：获取基底上的纳米结构的阵列的第一光学图像，其中纳米结构具有小于700nm的与获取第一光学图像的方向正交的截面维度(dimension)，并且其中纳米结构被至少部分地涂覆有反应实体。在另一组实施例中，该方法还包括：引起反应实体和分析物之间的相互作用；获取纳米结构的阵列的第二光学彩色图像；以及确定第一光学图像和第二光学图像之间的颜色变化，其中颜色变化是由反应实体和分析物之间的相互作用引起的。
在一组实施例中，该方法包括：将样品定位在微孔阵列的孔中，其中孔还包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒；以及向纳米颗粒施加电磁辐射，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与电磁辐射相互作用以更改电磁辐射；以及确定更改的电磁辐射。
另一组实施例是一种方法，该方法包括将被怀疑包含分析物的样品添加到微孔阵列的孔，其中孔还包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒，纳米颗粒被至少部分地涂覆有反应实体。在另一组实施例中，该方法包括向纳米颗粒施加电磁辐射，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与入射光相互作用以更改电磁辐射；以及确定更改的电磁辐射以确定反应实体与分析物的相互作用。
在另一组实施例中，一种方法包括将被怀疑包含分析物的溶液暴露于远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒，其中纳米结构还包括能够与分析物相互作用的反应实体；向纳米颗粒施加电磁辐射，其中纳米颗粒经由表面等离子共振、电共振和/或磁共振与电磁辐射相互作用以更改电磁辐射；以及确定更改的电磁辐射。
根据另一组实施例，该方法包括：获取基底上的纳米结构的阵列的第一光学彩色图像和第二光学彩色图像，其中纳米结构具有400nm和700nm之间的截面维度；以及确定第一光学彩色图像和第二光学彩色图像之间的颜色变化。
当结合附图考虑时，本发明的其它优点和新颖特征将从以下对本发明的各种非限制性实施例的详细描述变得清楚。
附图说明
将参考附图通过示例的方式描述本发明的非限制性实施例，这些附图是示意性的并且不意图按比例绘制。在附图中，图示的每个相同或几乎相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚起见，并非在每个图中都标记了每个部件，也没有在不必图示来使本领域普通技术人员理解本发明的地方示出本发明的每个实施例的每个部件。在附图中：
图1示出了根据一些实施例的纳米传感器与分析物之间的相互作用的图示，该相互作用更改了入射电磁辐射。
图2A-图2B示出了根据一些实施例的由纳米传感器在结合分析物时产生的可见光的变化。
图3示出了根据一些实施例的具有半透膜的微孔阵列，该微孔阵列包括纳米传感器和各种浓度的分析物，它们产生可见光。
图4示出了根据一些实施例的微孔阵列的图示。
图5示出了以约70％的单细胞捕获效率捕获HEK293细胞的示例性表示。
图6示出了硅纳米棒纳米传感器的示例性表示。
图7A-图7B示出了在暗场图像下硅纳米棒的颜色的示例性表示。
图8A-图8D示出了根据一些实施例的多种形式的硅纳米传感器，包括纳米锥、纳米针、纳米线和纳米颗粒。
图9A-图9D示出了在BSA蛋白质的浓度增加时纳米传感器的颜色色调偏移的示例性表示。
图10A-图10C示出了在链霉亲和素的浓度增加时纳米传感器的颜色色调偏移的示例性表示。
图11A-图11C示出了在链霉亲和素的浓度增加时具有各种直径的纳米传感器的颜色色调偏移的示例性表示。
图12示出了根据一些实施例的具有～100nm直径和～400nm间距的纳米棒。
图13A-图13C示出了在蛋白质吸附到超表面(meta-surface)上时具有各种浓度的BSA蛋白质的～100nm直径的纳米棒的颜色色调偏移的示例性表示。
图14示出了根据一些实施例的具有～180nm直径和～420nm间距的纳米棒。
图15A-图15C示出了在蛋白质吸附到超表面上时具有各种浓度的BSA蛋白质的～180nm直径的纳米棒的颜色色调偏移的示例性表示。
图16A-图16B示出了在蛋白质吸附到具有1.8nm直径的金纳米颗粒作为辅助标记(secondary label)来放大颜色偏移的超表面上时具有各种浓度的BSA蛋白的～180nm直径的纳米棒的颜色色调偏移的示例性表示。
图17示出了在每个孔中具有3x3单独纳米传感器阵列的微孔阵列的暗场图像的示例性表示。
图18A-图18C示出了施加到微孔阵列和纳米传感器阵列的传感器芯片上的20微升单细胞悬浮液的液滴。
图19A-图19C示出了蛋白质在纳米传感器上的结合诱导与蛋白质浓度相关的颜色偏移的示例性表示。
图20示出了根据一些实施例的具有10个微孔阵列的75mm x25mm的载玻片。
图21A-图21C示出了以与微孔相同的周期性间隔开的硅纳米尺寸或微米尺寸的针顶上的纳米传感器的示例性表示。
图22A-图22I示出了用于检测0.1至10pM的蛋白质浓度的纳米传感器阵列的示例性表示。
具体实施方式
在一些方面，本发明一般而言涉及与用于例如经由表面等离子共振、电共振、磁共振、颜色变化等来确定分子和其它特征的纳米传感器有关的物品和方法。这些物品和方法可以例如用于样品检测。在本发明的一些方面中描述的物品包括微孔阵列和纳米传感器阵列。在一些实施例中，纳米传感器阵列可以利用定位在纳米结构上的能够与被怀疑包含分析物的样品(诸如单个细胞)相互作用的纳米颗粒。纳米颗粒与样品之间的相互作用可以通过施加的能量的变化来检测，诸如由于入射可见光的表面等离子共振和/或其它类型的共振引起的更改的电磁辐射。电磁辐射可以被施加到微孔阵列和纳米传感器，并且当纳米传感器与被怀疑包含分析物的样品相互作用时，施加的电磁辐射可以被更改。另外，在一些实施例中，纳米传感器阵列可以利用纳米结构，以及分析物的结合可以基于光学或颜色变化来确定。
本发明的某些方面一般而言涉及用于检测例如源自细胞或其它源的诸如蛋白质或核酸之类的生物分子的系统和方法。在一些实施例中，生物分子是使用用作传感器的纳米针或其它纳米结构来定性地和/或定量地确定的。这些可以例如存在于阵列内，诸如存在于孔的阵列内。
在一组实施例中，纳米针的端部上的颗粒具有窄带谱。生物分子或其它分析物例如经由反应实体与颗粒的结合可以影响颗粒例如由于表面等离子共振、电共振和/或磁共振而与入射光共振的能力。反应实体的示例包括抗体、酶、核酸或诸如以下描述的其它实体。通过确定共振差异，例如通过向颗粒施加光并确定折射和/或吸光度，可以确定颗粒和生物分子的结合相互作用。
作为非限制性示例，图1示出系统10，其中分析物15可以与相对于纳米颗粒25固定的反应实体20相互作用。相互作用可以是例如特异性或非特异性的、共价或非共价的等。纳米颗粒25可以被定位在纳米针35或其它合适的纳米结构的端部30处。在一些情况下，纳米针可以被定位在孔40中(例如，孤立的孔或微阵列的孔等)，但是在其它情况下，纳米针可以被定位在基底上，可选地在合适的纳米结构上，并且不一定在孔内。来自源50的入射光45可以与纳米颗粒25相互作用，并且可以经由等离子共振效应与颗粒相互作用。另外，一些光55可以例如经由从颗粒的折射被引导到检测器60。通过确定到达检测器的光的差异，可以确定分析物15与反应实体20之间的各种相互作用。
在另一组实施例中，可以使用颜色(例如可见光)的变化来确定生物分子或其它分析物的结合。不希望受到任何理论的束缚，据信某些类型的纳米针或其它纳米结构能够仅以基本模式振动(例如，响应于可见光)。例如，由于反应实体，在生物分子与纳米针结合时，基本模式可以变化。因此，纳米针的可见性质的变化(例如，颜色和/或强度变化)可以被用于确定纳米针与生物分子之间的结合相互作用。
作为非限制性示例，图2A示出系统10，其中定位在孔25中的纳米针15和反应实体20产生可见光30的颜色。分析物35不与纳米针15或反应实体20相互作用，并且不产生可见光。在图2B中的系统40中，定位在孔25中的纳米针15和反应实体20结合分析物35。相互作用导致由可以与可见光30不同的可见光45产生的光学颜色或外观的变化。
在一些情况下，生物分子(或其它分析物)源自细胞。例如，可以将细胞裂解在微孔板的孔内，并且使用如本文所讨论的用作传感器的纳米针或其它纳米结构来定性地和/或定量地确定细胞。在一些情况下，也可以存在颗粒。可以使用例如如本文所述的等离子共振效应、颜色变化等来确定生物分子。在一些情况下，可以将细胞引入到颗粒中并例如使用膜来将细胞密封在其中。细胞可以被单独地裂解在分开的孔内，例如，以防止来自细胞裂解物的一个孔与另一个孔的污染。在一些情况下，半透膜被用于使裂解试剂(例如，裂解缓冲物)进入孔，但防止裂解物离开孔。因此，根据某些实施例可以单独确定各个细胞的裂解物。
图3示出了系统10的非限制性示例，系统10包括孔25和30。细胞15和细胞20分别被定位在孔25和30内。例如，在将裂解缓冲物添加到孔25和30时，细胞15和20可以被裂解。半透膜55被定位在微孔阵列35上，以防止孔25和孔30的内含物的污染。可以在例如将细胞引入到孔中之后以及在细胞裂解之前或之后添加半透膜。
纳米颗粒45与来自细胞15的分析物的相互作用可以导致可见光60，而纳米颗粒45与来自细胞20的分析物(比细胞15更浓缩)的相互作用可以导致可见光65。例如，可以施加入射光，以及光中的一些可以被纳米针吸收。分析物的差异(例如，浓度、类型等)可以导致不同的可见光或者不同孔或纳米针的外观。作为另一个示例，孔可以包括纳米传感器，该纳米传感器包括纳米针40和定位在纳米针35的端部50上的纳米颗粒45。入射光可以通过等离子共振效应与这样的系统相互作用，这可以基于分析物和纳米颗粒之间的不同相互作用(例如，经由反应实体)而导致不同的折射光或外观。通过确定这样的光，可以确定分析物。
以上表示本发明的某些实施例的各种非限制性示例。但是，其它实施例也是可能的。因此，更一般地，现在关于用于例如经由表面等离子共振、颜色变化等确定分子和其它特征的纳米传感器描述本发明的各个方面。
本发明的一些物品和方法涉及一种传感器，该传感器包括定位在纳米结构上，例如，远侧定位在纳米结构的端部上的颗粒(例如，纳米颗粒)。在一些情况下，颗粒可以与分析物相互作用，例如，如下文所讨论的，使得可以通过确定光如何与颗粒相互作用来(例如，定性地和/或定量地)确定分析物与纳米结构和/或颗粒之间的相互作用。例如，光可以经由表面等离子共振效应与颗粒相互作用，并且光的变化可以被用于确定分析物。在一些情况下，可以发生其它共振，诸如电共振和/或磁共振。
在本发明的各种实施例中可以确定各种样品。例如，在某些方面，样品可以包括细胞。纳米传感器可以被用于光学地询问或研究样品，例如细胞。在一些情况下，细胞或其它样品的特性，诸如分析物或样品的存在或浓度，可以与纳米传感器和/或纳米传感器上的反应实体相互作用，这可以被光学地确定。可以使用的光学询问技术的示例包括但不限于荧光、磷光、表面等离子体共振、表面等离子共振、局部表面等离子体共振、拉曼光谱、表面增强拉曼光谱等。
在某些实施例中，纳米颗粒包括金属，例如金、银、铜等。根据一些实施例，纳米颗粒包括金。在另一组实施例中，纳米颗粒包括银、量子点或半导体纳米颗粒。
在一些实施例中，颗粒的尺寸被调整为经由表面等离子共振效应与入射可见光相互作用，例如，以更改入射可见光。例如，入射光中的一些在与颗粒相互作用时可以被吸收、反射、折射等。这可以产生光的变化，该光的变化可以以某种方式来确定。另外，在一些情况下，颗粒的尺寸被调整为经由电和/或磁共振效应与入射可见光相互作用。
在一些情况下，颗粒可以是纳米颗粒。例如，颗粒可以具有小于约1微米的特征直径。颗粒可以是球形或非球形的。特征直径可以被认为是具有与非球形颗粒相同的体积的理想球体的直径。根据某些实施例，纳米颗粒的直径为至少0.5nm、至少1.0nm、至少1.5nm、至少2.0nm、至少2.5nm、至少3nm、至少4nm、至少5nm、至少7nm、至少10nm、至少30nm、至少100nm、至少300nm等。在一些实施例中，纳米颗粒的直径为小于1000nm、小于500nm、小于300nm、小于100nm、小于50nm、小于30nm、小于10nm、小于7nm、小于5nm、小于4nm、小于3.0nm、小于2.5nm、小于2.0nm、小于1.5nm或小于1.0nm。另外，这些中的任何一个的组合也是可能的；例如，特征直径可以在0.5nm至3.0nm的范围内。
在一些实施例中，颗粒和/或纳米结构被至少部分地涂覆有反应实体。术语“反应实体”是指可以以引起例如成员(member)的性质的可检测的变化的方式与分析物相互作用的任何实体，该性质诸如化学性质、光学性质、机械性质、振动性质等。反应实体与分析物之间的相互作用可以是特异性或非特异性结合，并且可以包括各种相互作用。如本文所讨论的，反应实体与分析物的相互作用可以例如由于光的变化而是可确定的。
在一些实施例中，反应实体可以包括结合伴侣(binding partner)，分析物结合到该结合伴侣。反应实体可以包括分析物的特异性或非特异性结合伴侣。例如，反应实体可以是化学物质或生物化学物质，诸如金属、核酸、抗体、适体、糖、碳水化合物、蛋白质、聚合物、寡核苷酸、催化剂、量子点等。作为非限制性示例，在某些实施例中，至少部分地涂覆纳米颗粒的反应实体是抗体或其片段。抗体可以是任何合适的抗体，包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体等。在一些实施例中，反应实体包括由标记在分析物上的显色底物诱导的酶促反应产物。显色底物可以包括例如，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、2,2'-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)等。
结合伴侣可以是可以与特定分析物进行结合的分子，并且包括本领域普通技术人员已知的特异性、半特异性和非特异性结合伴侣。当提及结合伴侣(例如，蛋白质、适体、核酸、抗体等)时，术语“特异性结合”是指确定在异质分子(例如，蛋白质和其它生物制剂)的混合物中的结合对的一个或其它成员的存在和/或身份的反应。因此，例如，在受体/配体结合对的情况下，配体将从分子的复杂混合物中特异性地和/或优先地选择其受体，或者反之亦然。酶将特异性结合到其底物，核酸将特异性结合到其补体(complement)，抗体将特异性结合到其抗原。其它示例包括特异性结合(杂交)到其补体的核酸、特异性结合到其抗原的抗体等。结合可以通过包括但不限于以下各项的各种机制中的一种或多种进行：离子相互作用、共价相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用和/或氢键等。
作为另一个示例，反应实体可以包括铂，其可以被用于确定氢。作为又一个示例，反应实体可以包括水凝胶，其可以被用于确定水或湿度。反应实体的非限制性示例包括在国际专利申请公开No.WO2015/175398中公开的那些，该国际专利申请公开出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些情况下，一个或多个颗粒可以相对于纳米结构被例如直接或间接地固定，例如经由一个或多个连接体(linker)或间隔体(spacer)。例如，颗粒可以被附接到纳米结构上的任何合适的位置，诸如侧面或端部。作为示例，纳米结构可以在第一端部被附接到基底，并且颗粒可以被附接到在第一端部远侧的第二端部。
纳米结构可以具有任何合适的形状和/或尺寸。在一些情况下，例如，纳米结构可以是纳米针、纳米线、纳米棒、纳米锥等。参见例如图8。其它形状也是可能的，例如，纳米带、纳米丝、纳米管、纳米柱等。在某些实施例中，纳米结构是竖直对准的，但是其它角度或对准也是可能的。
在一些实施例中，纳米结构具有从与基底附接的点或端部确定的长度，该长度小于约100微米、小于约50微米、小于约30微米、小于约20微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约3微米、小于约2微米、小于约1微米、小于约500nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约30nm、小于约20nm、小于约10nm等。在一些情况下，该长度可以是至少约10nm、至少约20nm、至少约30nm、至少约50nm、至少约100nm、至少约200nm、至少约300nm、至少约500nm、至少约1微米、至少约2微米、至少约3微米、至少约5微米、至少约10微米、至少约20微米、至少约30微米、至少约50微米、至少约100微米等。这些中的任何一个的组合是可能的，例如，纳米结构的长度可以在0.2微米至2微米之间。
纳米结构可以具有任何合适的截面形状，例如方形、圆形、三角形、椭圆形、多边形、星形、不规则形状等。纳米结构可以在其整个长度上维持相同的截面形状，或者可以在纳米结构的不同部分中存在不同的截面形状。另外，纳米结构可以具有任何合适的截面直径。截面直径可以是恒定的(例如，如在纳米针或纳米棒中那样)，或者可以是变化的(例如，如在纳米锥中那样)。平均直径可以是例如小于约1000nm、小于约500nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约30nm、小于约20nm、小于约10nm等。在一些情况下，长度可以是至少约10nm、至少约20nm、至少约30nm、至少约50nm、至少约100nm、至少约200nm、至少约300nm、至少约500nm、至少约1000nm等。在各种实施例中组合也是可能的。例如，纳米结构的平均直径可以在50nm至300nm之间。
纳米结构可以由任何合适的材料形成，并且可以与纳米结构被(例如竖直地)附接到其上的基底相同或不同。在一组实施例中，纳米结构由硅和/或其它合适的半导体材料(例如，锗)形成。材料的另外的非限制性示例包括金属(例如，镍或铜)、二氧化硅、玻璃等。在一些情况下，纳米结构(其可以被附接到基底上)可以由单一材料形成。
可以使用任何合适的方法来形成纳米结构。示例包括但不限于光刻技术，诸如电子束光刻、光蚀刻法、X射线光刻、极紫外光刻、离子投影光刻等。作为另一个示例，在一些实施例中，纳米结构可以是由易于用合适的蚀刻剂蚀刻的一种或多种材料形成。例如，纳米结构可以包括诸如二氧化硅或玻璃之类的材料，其可以使用HF(氢氟酸)或BOE(缓冲氧化物蚀刻)来蚀刻。作为另一个示例，纳米结构可以包括诸如铜、铁、镍和/或钢之类的金属，其可以使用诸如HCl(盐酸)、HNO3(硝酸)、硫酸(H2SO4)之类的酸和/或诸如氯化铁(FeCl3)或硫酸铜(CuSO4)之类的其它蚀刻化合物来蚀刻。作为又一个示例，纳米结构可以包括硅或其它半导体材料，其可以使用诸如EDP(乙二胺和邻苯二酚的溶液)、KOH(氢氧化钾)和/或TMAH(氢氧化四甲基铵)之类的蚀刻剂来蚀刻。在一些情况下，纳米结构还可以包含塑料或聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚全氟丁烯基乙烯醚等，其可以使用KOH(氢氧化钾)和/或诸如本文所述的那些之类的其它酸来蚀刻。
在一些实施例中，纳米结构可以包括或基本包括一种材料或者多于一种材料。例如，在一个实施例中，纳米结构由可以如本文所讨论地被蚀刻的单一材料或固体材料形成。
本发明的某些实施例一般而言还涉及微孔阵列，例如，该微孔阵列包括一个或多个孔，该一个或多个孔可以是圆形或非圆形的。可以存在任何数量的孔，例如至少1个、至少2个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个等。微孔还可以包括如本文所述的一个或多个传感器，例如，该一个或多个传感器包括一个或多个纳米针或其它纳米结构。在一些实施例中，根据可商购的ANSI/SLAS标准调整微阵列的维度，例如，具有6个孔、12个孔、24个孔、48个孔、96个孔、384个孔或1536个孔等。微孔阵列可以由任何合适的材料形成，包括诸如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃等之类的塑料或聚合物、二氧化硅、玻璃、金属等。
在某些实施例中，孔可以具有在10微米至50微米的范围内的直径。根据本发明的一些实施例，孔的直径为至少10微米、至少20微米、至少30微米或至少40微米。在某些实施例中，孔的直径小于50微米、小于40微米、小于30微米或小于20微米。这些中的任何一个的组合也是可能的，例如，孔可以具有20微米至40微米的直径。
根据某些实施例，孔的深度为至少20微米、至少30微米、至少40微米或至少50微米。在本发明的某些方面，孔的深度为小于60微米、小于50微米、小于40微米或小于30微米。这些中的任何一个的组合也是可能的，例如，孔可以具有在20微米至60微米的范围内的深度。
在一些实施例中，孔的节距(pitch)(或孔到孔的间距)可以不超过约1000微米、不超过约700微米、不超过约500微米、不超过约300微米、不超过约100微米、不超过约50微米、不超过约40微米、不超过约30微米、不超过约25微米、不超过约20微米、不超过约15微米、不超过约10微米、不超过约5微米、不超过约3微米、不超过约2微米、不超过约1微米等。在一些情况下，节距可以为至少约1微米、至少约3微米、至少约5微米、至少约10微米、至少约15微米、至少约20微米、至少约25微米、至少约30微米、至少约40微米、至少约50微米、至少100微米、至少300微米、至少500微米、至少700微米、至少1000微米等。此外，这些中的任何一个的组合也是可能的，例如，节距可以在约10微米至100微米之间。
在一些情况下，微孔阵列可以被配置为包含一个或多个细胞。例如，可以使用如本文所述的一个或多个传感器在一个或多个孔中确定源自细胞的一个或多个裂解物。但是，应该理解的是，细胞(或细胞裂解物)不是需要的，并且本发明的其它实施例可以针对源自其它来源的裂解物，包括生物和非生物分析物。
在一些情况下，微孔阵列可以被装载成每个孔具有一个细胞，或每个孔具有多于一个细胞。不同的孔可以具有存在的相同或不同数量的细胞。细胞可以是孤立的细胞、细胞聚集体或者在细胞培养物中、在包含细胞的组织构建体中等发现的细胞。细胞的示例包括但不限于细菌或其它单细胞生物体、真核细胞、植物细胞或动物细胞。如果细胞是动物细胞，那么细胞可以是例如无脊椎动物细胞(例如，来自果蝇的细胞)、鱼细胞(例如，斑马鱼细胞)、两栖动物细胞(例如，青蛙细胞)、爬行动物细胞、鸟类细胞或者人类或非人类哺乳动物。如果细胞来自多细胞生物体，那么细胞可以来自生物体的任何部分。
在一些实施例中，例如使用诸如半透膜之类的膜，一个或多个细胞被添加到一个或多个孔，并且可选地被密封在适当的位置(例如，以防止不同孔之间的污染或相互作用)。但是，根据一些实施例，细胞可以在孔内被裂解以释放感兴趣的一种或多种分析物，诸如蛋白质、核酸等。
可以使用各种技术来裂解细胞。例如，细胞可以经由暴露于裂解化学物质或细胞裂解缓冲物(例如，诸如Triton-X或SDS之类的表面活性剂，诸如溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、蛋白酶K等之类的酶)或物理条件(例如，超声、紫外光、机械搅拌等)来裂解。如果使用裂解化学物质，那么可以在添加细胞之前和/或之后将裂解化学物质添加到孔。在一些情况下，可以在添加膜之前或之后添加裂解化学物质，例如以将细胞包含在孔内。在一些情况下，膜是可渗透的和/或半渗透的，这可以促进裂解化学物质的进入。
本发明的一些实施例一般而言涉及半透膜，该半透膜可以应用于微孔阵列和/或纳米结构基底，例如以将细胞或其它样品包含在孔内。在某些情况下，半透膜的尺寸被调整为防止细胞的通过但允许较小的化合物的通过。
在本发明的某些实施例中，半透膜可以被定位在微孔阵列和纳米结构基底之间，或者被定位在微孔阵列或纳米结构基底顶上。在一些情况下，半透膜可以被从微孔阵列和/或纳米结构基底移除。在某些实施例中，半透膜是通过显微术来评估的，该显微术诸如暗场显微术或其它光学显微术技术。
可以使用例如具有各种渗透性的各种半透膜。例如，半透膜可以是亲水的或疏水的、多孔的或无孔的等。在某些实施例中，半透膜可以包括诸如聚碳酸酯之类的聚合物。半透膜的其它示例包括阳离子交换膜、阴离子交换膜等。
如前所述，物品和方法的实施例可以包括直接或间接与微孔阵列有关的纳米结构基底。在本发明的一些实施例中，纳米结构基底包括本文描述的多个纳米传感器。根据某些实施例，微孔阵列和纳米结构基底是可分开的。在一些情况下，分开可以在不使用工具的情况下被执行。在本发明的其它实施例中，微孔阵列和纳米结构基底是不可分开的。在本发明的某些实施例中，微孔阵列和纳米结构基底直接彼此附接，例如使得纳米传感器存在于微孔阵列的至少一个孔中。
在一些实施例中，光可以被施加到纳米传感器，例如以如本文所讨论的确定分析物。在一些情况下，光可以经由表面等离子共振和/或诸如电和/或磁共振之类的其它共振与纳米传感器(例如，纳米传感器中的纳米颗粒)相互作用，并且相互作用的效果可以例如通过确定光的折射和/或吸光度来确定。在一组实施例中，施加到纳米传感器的光可以是包括来自诸如He-Ne激光器之类的激光器的平面偏振光的入射光束。其它激光器也是可商购的。
在一些情况下，入射光撞击诸如硅表面或金属表面(例如，金)之类的基底表面，例如颗粒的基底表面。在一些情况下，分析物与纳米传感器的相互作用(例如，经由反应实体)可以更改入射光的折射率或其它特性，并且这可以例如使用检测器来确定。例如，在某些实施例中，局部表面等离子振荡可以对纳米传感器产生光学变化，这可以例如在紫外和/或可见光区域内产生吸收。这些可以被确定并用于确定分析物和反应实体(诸如蛋白质或核酸)之间的结合或其它相互作用。
在一些情况下，可以用显微镜和/或光谱仪或其它光学检测器来检测光。包括光谱仪的各种合适的光学检测器是可商购的。在一些情况下，可以存在其它光学部件，例如，以促进相互作用或检测。光学部件的示例包括但不限于波导，光学传感器、光学检测器、光纤等。
但是，应该理解的是，附加于或代替诸如本文描述的之类的表面等离子共振效应，其它检测方法是可用的。例如，在一些实施例中，分析物可以与相对于纳米结构(即，其可以具有或可以不具有诸如纳米颗粒之类的颗粒)固定的反应实体相互作用，并且光学外观的变化，例如颜色变化，可以被确定以确定分析物与反应实体的结合。可以使用任何合适的方法来确定光学外观的变化，例如，光学显微术、荧光光谱测定法等。
在本发明的某些实施例中，当纳米传感器经由电共振或磁共振与入射光相互作用时，分析物可以与纳米传感器相互作用，从而引起光学外观的变化。不希望受到任何理论的束缚，当光与纳米传感器或其部分(诸如纳米颗粒)相互作用时，可以发生电共振或磁共振。在一些情况下，例如，在施加合适的电场或磁场后，共振可能被更改。各种电场和/或磁场发生器是可容易地商购的。
在一些情况下，例如，周期性结构中的纳米结构之间的距离或节距可以被控制以使得纳米结构形成超表面。例如，节距可以被设置为小于入射光的波长。例如，节距可以小于700nm、小于600nm、小于500nm等，和/或大于400nm、大于500nm或大于600nm。例如，节距可以在400nm和500nm之间。纳米结构可以具有本文提供的任何维度。在一些情况下，纳米结构的平均截面直径小于入射光的波长。
不希望受到任何理论的束缚，来自各个纳米结构的散射光可能会发生干涉，并且干涉的量可能对结合到纳米结构的分析物或其它实体敏感。以这种方式，颜色或其它光学性质的变化可以被用于确定分析物相互作用的变化。
应该理解的是，例如在施加红外或紫外光时，可以使用其它节距。例如，节距可以小于1000nm、小于约500nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约30nm、小于大约20nm、小于大约10nm等，和/或节距可以是至少约10nm、至少约20nm、至少约30nm、至少约50nm、至少约100nm、至少约200nm、至少约300nm、至少约500nm、至少约1000nm等。在各种实施例中，这些中的任何一个的组合也是可能的。
国际专利申请公开No.WO 2015/175398通过引用整体并入本文。此外，Quan等人于2017年9月8日提交的名称为“Nanosensor Methods and Apparatuses for Determinationof Analytes”的美国临时专利申请序列No.62/556,186也通过引用整体并入本文。
以下示例旨在说明本发明的某些实施例，但不是例示本发明的全部范围。
示例1
硅纳米结构被生产并用作无标记的纳米传感器。使用硅纳米结构的优点在于制造工艺是互补金属氧化物半导体兼容的并且是可大量生产的。所生产的硅纳米结构可以是例如以纳米棒的形式，其中直径在50nm至300nm之间，并且高度在0.2微米至2微米之间，如本示例中的图6所示。在暗场图像下具有不同直径的纳米棒的颜色显示各种颜色的谱(参见图7A-图7B)。对于在250nm以下的直径，每个纳米棒具有独特的颜色。当直径大于约300nm时，色谱变得相似。硅纳米结构还可以采用其它形式，诸如锥、针、线和颗粒，如图8A-图8D所示。所使用的维度的范围是从50nm至1微米。
为了测试硅纳米棒的灵敏度，用2％APTM的乙醇溶液(v/v)官能化(functionalized)芯片或微孔阵列达20分钟。接着，将10mM戊二醛、10mM氰基硼氢化钠和1/1000稀释的抗-BSA滴到微孔阵列上，然后温育(incubate)微孔阵列达2小时。然后漂洗微孔阵列。将不同浓度的BSA溶液滴到纳米传感器上。在去离子水中洗涤微孔阵列并在具有20x物镜的暗场显微镜下对微孔阵列进行成像。如图9A-图9D所示，随着BSA蛋白质的浓度增加，每个纳米传感器的颜色色调移向红色(即，波长增加)。
示例2
在这个示例中测试了不同浓度的链霉亲和素(参见图10A-图10C)。随着链霉亲和素浓度增加，色谱具有红移(red-shift)。在链霉亲和素的情况下，硅纳米传感器中的每一个分开地工作。因此，如图11A-图11C所示，在这个示例中，制造了直径为80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm和240nm的九个不同的硅纳米棒，并测试了它们对不同浓度的链霉亲和素溶液的颜色响应。每个硅纳米传感器之间的间距为5微米。
当纳米传感器之间的距离减小到光子波长以下时，来自各个纳米棒的散射光发生干涉并共同形成硅超表面。超表面充当传感器，其可以被用于检测蛋白质浓度。例如，如图12所示，当每个纳米棒的直径为～100nm时，间距为～400nm。这在去离子水中产生大致为绿色的颜色，并且在蛋白质吸附到其表面时，整体颜色发生红移，如图13A-图13C所示。
每个单独的纳米棒的直径减小到～180nm(参见图14)，而间距为～420nm。如图15A-图15C所示，整体颜色色相在去离子水中为橙绿色，并在蛋白质吸附到其表面时发生红移。此外，用抗-BSA官能化的1.8nm直径的金颗粒被用作辅助标记，以放大来自超表面纳米传感器的颜色偏移。由于纳米颗粒的结合而引起的颜色色相偏移比由于分子分析物的结合而引起的偏移大一个数量级(30nm相对于3nm)(图16A-图16B)。例如，诸如这些之类的颜色偏移可以使用合适的比色检测器来进行量化。
示例3
为了检测单细胞中的蛋白质表达，在这个示例中，使用电子束光刻和反应离子刻蚀在硅晶片上制造了硅纳米传感器。使用单层的2％950K PMMA(A2)。首先将晶片在150℃脱水达30分钟。接下来，以1600rpm旋转PMMA达40秒，这导致100nm的厚度。将晶片在200℃预烘烤达2分钟。在125keV以剂量1800微库伦/cm2使用ELIONIX F125。在1:3甲基异丁基酮:异丙醇(v/v)中将抗蚀剂显影达30秒，然后在异丙醇中漂洗抗蚀剂。然后，使用热蒸发器用30nm氧化铝涂覆晶片，并在热丙酮中剥离晶片达3小时。然后，使用STS-RIE蚀刻晶片达2分钟。通过暗场成像对每个孔中具有3x3单独纳米传感器阵列的微孔阵列进行分析，如图17所示。3x3组中的每个纳米传感器具有稍微不同的维度，因此看起来是不同的颜色。
示例4
在这个示例中，创建单细胞悬浮液(细胞浓度为20000/mL)，并将20微升滴到微孔阵列上。细胞以对微孔的几何形状敏感的捕获效率扩散到微孔中。
在将细胞装载到微孔阵列上之前，在2％APTMS的乙醇(v/v)中温育微孔阵列达10分钟。在乙醇中彻底漂洗微孔阵列，并用氮气吹干微孔阵列。接下来，将10mM戊二醛、10mM氰基硼氢化钠和1/1000稀释的抗-β-肌动蛋白(anti-beta-actin)滴到微孔阵列上并进行温育达2小时。然后用去离子水漂洗微孔阵列。将单细胞悬浮液的液滴(20微升)施加到具有微孔和纳米传感器两者的传感器芯片上，如图18A-图18C所示。在将细胞接种在芯片上达10分钟之后，将亲水性半透膜(具有10nm孔尺寸、6微米厚度的聚碳酸酯膜)施加到微孔阵列上。膜由于亲水性而密封了表面。接下来，细胞裂解缓冲物的液滴被施加到膜上，从而穿过进入到各个微孔中。在各个微孔内裂解细胞，并通过纳米传感器捕捉靶蛋白。蛋白质在纳米传感器上的结合诱导了与蛋白质浓度相关的颜色偏移，如图19A-图19C所示。
示例5
在这个示例中，为了检测来自单细胞的多种蛋白质，多个微孔阵列被集成到载玻片上。单个微孔阵列具有1cmx1cm的尺寸，包含1000个细胞阱，其中每个微孔内部都集成有纳米传感器。75mmx25mm的载玻片上有10个微孔，如图20所示。每个微孔被用不同的抗体官能化。因此，具有10个微孔的载玻片可以检测10组1000个单细胞中的10种不同的蛋白质。
为了检测同一组单细胞中的多种蛋白质，纳米传感器被制造在硅纳米尺寸或微米尺寸针顶上。纳米传感器使用金、银或硅。纳米针以与微孔相同的周期性间隔开(参见图21A-图21C)。因此，每个纳米针可以与每个微孔对准。每个纳米针顶上的纳米传感器检测来自每个微孔的细胞裂解中的蛋白质浓度。为了分析来自同一组单细胞的多种蛋白质，依次让用不同抗体官能化的不同纳米针与相同的微孔阵列接触。
示例6
当溶液中的分析物达到亚pM浓度水平时，只有最大数量的一种分析物分子将可用于结合每个单独的纳米传感器，而阵列中的大多数纳米传感器都没有被结合任何分子。在这种检测方案中，来自纳米传感器的信号(例如，颜色变化、荧光)的阈值水平可以被指定为或者1或者0。溶液中分析物的浓度可以通过对信号分配为1的纳米传感器的数量直接计数而得出，从而抑制在超低浓度处传统体比色法或荧光测量固有的噪声信号。
由于纳米传感器阵列的典型节距在1-10微米的范围内，因此有可能在小的区域(例如，1毫米乘1毫米)中密集地包装10000至1000000个纳米传感器。图22A-图22I图示了在这种方案下的纳米传感器阵列的光学信号。在图22A-图22I中，16个纳米传感器阵列块被制造在硅芯片上。每个块具有32乘32纳米传感器的矩阵，间距为2微米。每个纳米传感器具有纳米棒形状，其中直径为95nm并且长度为200nm。图22A示出了在暗场成像下的芯片，其中每个纳米传感器示出了由彩色相机收集到的绿色散射点。纳米芯片被用在95％乙醇中的2％(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)官能化达10分钟，并用乙醇洗涤，在80℃加热达2小时。
然后，用10mM的戊二醛和10mM的氰基硼氢化钠官能化芯片达1小时。用1微克/mltau蛋白涂覆传感器表面。然后将不同浓度的抗-tau蛋白流到芯片上作为检测目标。抗-tau蛋白是在包含0.1％明胶和150mM NaCl的PBS缓冲溶液中制备的。抗-tau蛋白被辣根过氧化物酶标记。在与显色底物反应之后，在纳米传感器表面上形成不溶性沉积物层，从而产生纳米传感器的光学共振变化。
图22B示出了测定之后的暗场图像，其中每个纳米传感器在检测到被纳米传感器上官能化的抗体捕捉的蛋白质时具有从绿色变为黄色的颜色。图22C示出了从对准图22A和图22B并减去对应的点所提取的色相变化。在10pM的抗-tau蛋白浓度处，图22C中的每个纳米传感器显示出约-40的色相变量(delta-hue)。图22D-图22F示出了其中抗-tau蛋白浓度减小至1pM的实施例，以及图22G-图22I示出了其中抗-tau蛋白浓度减小至0.1pM的实施例。在图22D-图22F中，纳米传感器的子集具有可观察到的色相变量。如图22G-图22I所示，大多数纳米传感器没有可观察到的色相变量，表明大多数纳米传感器的表面没有结合蛋白质。
虽然本文已经描述和说明了本发明的几个实施例，但是本领域普通技术人员将容易想到用于本文描述的执行功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的各种其它手段和/或结构，并且这样的变化和/或修改中的每一个被认为是在本发明的范围内。更一般而言，本领域技术人员将容易认识到的是，本文描述的所有参数、维度、材料和配置意在是示例性的，并且实际的参数、维度、材料和/或配置将取决于使用本发明的教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定，本文描述的本发明的具体实施例的许多等同物。因此，要理解的是，前述实施例仅作为示例给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以以与具体描述和要求保护的方式不同的方式来实践。本发明针对本文描述的每个单独特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法没有相互不一致，那么两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任意组合都被包括在本发明的范围内。
在本说明书和通过引用并入的文档包含矛盾和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文档包含矛盾和/或不一致的公开内容，那么应以生效日期较晚的文档为准。
如本文所定义和使用的，所有定义都应当被理解为控制字典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义。
除非有明确指示为相反，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应当理解为意指“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当理解为意指如此连结的元素的“任一个或两者”，即，在一些情况下联合地存在并且在其它情况下分离地存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即，如此连结的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”从句具体识别出的元素之外，可以可选地存在其它元素，不管与具体识别出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施例中仅指A(可选地包括除B以外的元素)，在另一个实施例中仅指B(可选地包括除A以外的元素)，在又一个实施例中指A和B两者(可选地包括其它元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，“或”应当被理解为具有与以上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项时，“或”或“和/或”应当被解释为包含性的，即，包括多个元素或元素列表中的至少一个元素，但也包括多于一个元素，以及可选地包括附加的未列出的项。只有明确指示相反的术语(诸如“仅一个”或“恰好一个”)，或者“由......组成”当在权利要求中被使用时，将指包括多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，如本文所使用的术语“或”仅当前面有排他性术语(诸如“任一个”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”)时才被解释为指示排他性替代(即，“一个或另一个，但不是两者”)。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应当被理解为意指选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括在元素列表内具体列出的每个和所有元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任意组合。这个定义还允许可以可选地存在除在短语“至少一个”所指的元素列表内具体识别出的元素之外的元素，不管与具体识别出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或者等同地，“A或B中的至少一个”，或者等同地，“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施例中指至少一个(可选地包括多于一个)A，而不存在B(并且可选地包括除B以外的元素)；在另一个实施例中指至少一个(可选地包括多于一个)B，而不存在A(并且可选地包括除A以外的元素)；在又一个实施例中指至少一个(可选地包括多于一个)A，以及至少一个(可选地包括多于一个)B(并且可选地包括其它元素)；等等。
当本文关于数字使用词“约”时，应当理解的是，本发明的又一个实施例包括没有通过存在词“约”来修改的数字。
还应当理解的是，除非明确指示为相反，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的次序不一定限于方法的步骤或动作被记载的次序。
在权利要求书以及以上说明书中，诸如“包括”、“含有”、“携带”、“具有”、“包含”、“涉及”、“保持”、“由......构成(composed of)”等之类的所有过渡性短语都应当被理解为是开放式的，即，意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡性短语“由......组成(consisting of)”和“基本上由......组成”才分别是封闭式或半封闭式过渡性短语。

Claims (61)

1.一种用于确定分析物的物品，包括：
微孔阵列，所述微孔阵列包括孔，所述孔包括纳米结构、远侧定位在所述纳米结构的端部上的纳米颗粒以及被配置为密封所述孔的半透膜，以及
反应实体，所述反应实体相对于所述纳米颗粒固定，其中分析物到所述反应实体的结合引起所述纳米颗粒的折射率的改变，其中所述纳米颗粒的折射率的改变影响所述纳米颗粒与入射光共振的能力，从而引起从纳米颗粒反射到相对于可见光源处于所述微孔阵列同侧的探测器的光的颜色的变化，
其中（i）所述纳米颗粒被配置为与来自所述可见光源的入射光相互作用，所述可见光源被定位成将所述入射光引导到所述纳米颗粒，（ii）所述纳米颗粒包括半导体并经由电共振和/或磁共振与入射光相互作用，从而使所述入射光发生颜色上的变化，（iii）在施加电场或磁场后，电共振和/或磁共振能够被更改，（iv）所述孔具有选自10微米至50微米的范围的直径使得所述孔被配置为容纳要经受裂解缓冲物的细胞，并且（v）所述半透膜被配置为允许所述裂解缓冲物进入到所述孔中，但防止细胞裂解物离开所述孔。
2.如权利要求1所述的物品，其中所述反应实体包括抗体。
3.如权利要求1所述的物品，其中所述反应实体包括适体。
4.如权利要求1所述的物品，其中所述反应实体包括蛋白质。
5.如权利要求1所述的物品，其中所述反应实体包括寡核苷酸。
6.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，还包括检测器，所述检测器被定位成检测从所述纳米颗粒反射的光。
7.如权利要求6所述的物品，其中所述检测器是光谱检测器。
8.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述入射光是平面偏振的。
9.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述入射光包括可见光。
10.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中仅一个纳米颗粒被附接到所述纳米结构。
11.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米颗粒包括量子点。
12.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米颗粒具有小于3 nm的平均直径。
13.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米颗粒具有至少0.5 nm的平均直径。
14.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构包括硅。
15.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是基本上竖直对准的。
16.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是纳米针。
17.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是纳米线。
18.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是纳米棒。
19.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是纳米锥。
20.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构是纳米柱。
21.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构具有小于5微米的长度。
22.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构具有至少0.1微米的长度。
23.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构具有至少50 nm的平均截面直径。
24.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构具有小于500 nm的平均截面直径。
25.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述微孔阵列包括玻璃。
26.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述微孔阵列包括硅。
27.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述微孔阵列是使用光蚀刻法来制造的。
28.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构包括半导体。
29.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构和所述微孔阵列具有基本相同的组成。
30.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构和所述微孔阵列限定单一材料。
31.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述孔具有至少20微米的深度。
32.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述微孔阵列包括多个孔，每个孔包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒。
33.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述微孔阵列包括至少10个孔，每个孔包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒。
34.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述纳米结构具有小于100微米的平均节距。
35.如权利要求1-5中的任一项所述的物品，其中所述半透膜包括聚碳酸酯。
36.如权利要求1所述的物品，其中所述纳米结构包括聚合物。
37.一种用于确定分析物的方法，包括：
从光源向纳米颗粒施加电磁辐射，其中（i）所述纳米颗粒包括半导体并被配置为经由电共振和/或磁共振与所述电磁辐射相互作用从而使所述电磁辐射产生颜色上的变化从而更改所述电磁辐射，其中在施加电场或磁场后，电共振和/或磁共振能够被更改，以及（ii）微孔阵列包括孔，所述孔包括要经受裂解缓冲物的细胞、纳米结构以及被配置以密封所述孔的半透膜，其中所述纳米颗粒远侧定位在所述纳米结构的端部上，其中反应实体相对于所述纳米颗粒固定，其中分析物到所述反应实体的结合引起所述纳米颗粒的折射率的改变，其中所述纳米颗粒的折射率的改变影响所述纳米颗粒与所述电磁辐射共振的能力，从而引起从所述纳米颗粒反射到相对于所述光源处于所述微孔阵列同侧的探测器的电磁辐射的颜色的变化，并且其中所述半透膜被配置为允许所述裂解缓冲物进入到所述孔中，但防止细胞裂解物离开所述孔；以及
确定被更改的电磁辐射。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述电磁辐射包括可见光。
39.如权利要求37-38中的任一项所述的方法，还包括通过确定更改的电磁辐射来确定所述分析物。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述纳米结构包括聚合物。
41.一种用于确定分析物的方法，包括：
将细胞定位在微孔阵列的孔内，其中所述孔还包括远侧定位在纳米结构的端部上的纳米颗粒和至少部分地涂覆在所述纳米颗粒上的反应实体并且分析物到所述反应实体的结合引起所述纳米颗粒的折射率的改变，其中所述纳米颗粒的折射率的改变影响所述纳米颗粒与电磁辐射共振的能力，从而引起从纳米颗粒反射到相对于光源处于所述微孔阵列同侧的探测器的光的颜色的变化，其中所述光源发射电磁辐射，并且其中所述孔被配置被半透膜密封；
在所述孔内用裂解缓冲物来裂解所述细胞以释放被怀疑能够结合所述反应实体的分析物，其中所述半透膜被配置为允许所述裂解缓冲物进入到所述孔中，但防止细胞裂解物离开所述孔；
向所述纳米颗粒施加电磁辐射，其中所述纳米颗粒包括半导体并经由电共振和/或磁共振与所述电磁辐射相互作用以更改所述电磁辐射，其中在施加电场或磁场后，电共振和/或磁共振能够被更改；以及
确定被更改的电磁辐射以确定所述分析物。
42.如权利要求41所述的方法，还包括在所述细胞被定位于所述孔内之后，利用半透膜密封所述孔。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述纳米结构包括聚合物。
44.一种用于确定分析物的方法，包括：
获取设置在基底上的孔中的纳米结构的阵列的第一光学彩色图像，其中所述孔包括要经受裂解缓冲物的细胞，其中所述孔被配置为被半透膜密封，其中所述半透膜被配置为允许所述裂解缓冲物进入到所述孔中，但防止细胞裂解物离开所述孔，其中所述纳米结构具有小于700 nm的与获取所述第一光学彩色图像的方向正交的截面维度，其中所述纳米结构包括远侧定位在所述纳米结构的端部上的纳米颗粒，并且其中所述纳米结构和/或纳米颗粒被至少部分地涂覆有反应实体；
引起所述反应实体和分析物之间的相互作用，其中分析物到所述反应实体的结合引起所述纳米颗粒的折射率的改变，其中所述纳米颗粒的折射率的改变影响所述纳米颗粒与入射光共振的能力，从而引起从所述纳米颗粒反射到相对于光源处于所述纳米结构同侧的探测器的光的颜色的变化，其中所述光源发射入射光，其中所述纳米颗粒包括半导体并被配置为经由电共振和/或磁共振与入射光相互作用以产生颜色上的变化，其中在施加电场或磁场后，电共振和/或磁共振能够被更改；
获取所述纳米结构的阵列的第二光学彩色图像；以及
确定所述第一光学彩色图像和所述第二光学彩色图像之间的颜色变化，其中所述颜色变化是由所述反应实体和所述分析物之间的相互作用引起的。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述纳米结构的阵列具有小于3μm的纳米结构之间的平均间距。
46.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构的阵列具有小于500nm的纳米结构之间的平均间距。
47.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述反应实体包括抗体。
48.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述反应实体包括适体。
49.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述反应实体包括蛋白质。
50.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述反应实体包括寡核苷酸。
51.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述反应实体包括由标记在所述分析物上的显色底物诱导的酶促反应产物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述显色底物是3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述显色底物是3,3'-二氨基联苯胺。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述显色底物是2,2'-连氮基-二-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。
55.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构是纳米针。
56.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构具有小于5微米的长度。
57.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构具有至少0.1微米的长度。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述纳米结构包括半导体。
59.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构包含硅。
60.如权利要求44-45中的任一项所述的方法，其中所述纳米结构基本上由硅组成。
61.如权利要求44所述的方法，其中所述纳米结构中的每个纳米结构包括聚合物。
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