CN111206031A

CN111206031A - 一种用于检测玉米植物naz-4的核酸序列及其检测方法

Info

Publication number: CN111206031A
Application number: CN202010167076.9A
Authority: CN
Inventors: 赵军; 冷鹏飞; 王磊; 范云六
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-05-29

Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米植物NAZ‑4的核酸序列及其检测方法，所述玉米植物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示序列或其互补序列、或者SEQ ID NO:2所示序列或其互补序列。本发明玉米植物NAZ‑4对干旱和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件NAZ‑4的DNA分子。

Description

一种用于检测玉米植物NAZ-4的核酸序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，涉及一种用于检测玉米植物 NAZ-4的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种耐受干旱和草铵膦除草剂施用的转基因玉米事件NAZ-4和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件NAZ-4的核酸序列及其检测方法。

背景技术

田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。据联合国粮食与农业组织统计，全球因杂草导致的粮食生产损失每年高达950亿美元，相当于损失了3.8亿吨小麦，约合2009年全球小麦产量的半数以上。在950亿美元的经济损失中，贫困的发展中国家承受了大约700亿美元 (FAO.The lurking menace of weeds [J/OL].(http://www.fao.org/news/story/en/item/29402/icode/)，2009-08-11.)。因此，有效地控制田间杂草是促进粮食增产的重要措施之一。在我国，危害玉米的杂草种类有40多种，其中危害较大的杂草有10多种。在一般年份杂草可使玉米减产10-20％，严重时更高达30-50％。另外，随着我国农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐该类灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题。在玉米生长期喷施 1-2次就能有效解决杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。因此，耐除草剂转基因玉米具有非常广阔的应用价值和市场潜力。

在当今世界，水资源短期是全球可持续发展面临的重要挑战，在世界总耕地面积中，干旱及半干旱地区占了43.9％(张木清，陈如凯.作物抗旱分子生理与遗传改良[M].2005，北京：科学出版社.)。尽管玉米是旱地作物，但其生长过程中的需水量较大，约至少2500mm的降水量，而且玉米对水分胁迫非常敏感，特别是花期干旱直接影响玉米产量(王士谦.玉米抗旱性的研究进展[J].河北科技师范学院学报，2005，19(3)：76-80.)，因此，在引起干旱及半干旱地区玉米减产的诸多因素中，干旱是最主要的非生物逆境胁迫因子(郝转芳，李新海，张世煌.玉米耐旱QTL定位研究进展[J].玉米科学，2007，15(2)：49-52.)。我国每年种植的玉米中，受到干旱影响的面积占了大约60％，造成减产20％～ 30％。因此培育抗旱玉米品种是减少产量损失、保障稳产的有效措施。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。

能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体 DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测玉米植物NAZ-4的核酸序列及其检测方法，转基因玉米事件NAZ-4对干旱和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件NAZ-4的 DNA分子。

为实现上述目的，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列，或其互补序列。

进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其互补序列。

更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其互补序列。

更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5所示序列或其互补序列。

另一方面，本发明提供了用于检测玉米转化事件的探针，其特征在于，包括 SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含上述用作探针的序列。

在一些实施方案中，上述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含上述的探针和/或上述的引物对。

本发明还提供了检测玉米转化事件的方法，其特征在于，包括利用上述的探针或上述的引物对或上述的探针和引物对或上述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述转化事件。

本发明还提供了对玉米进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含上述核酸分子的玉米；

2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，

3)对步骤2)所获得的后代植物进行除草剂和/或干旱的抗性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

进一步的，本发明还提供了利用上述方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。

所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因玉米事件NAZ-4中在插入序列的 5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO: 1或其互补序列跨越了玉米插入位点的左侧翼基因组DNA序列和插入序列的左边界5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件NAZ-4的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因玉米事件NAZ-4中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的右边界3’末端的 DNA序列和玉米插入位点的右侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2 或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件NAZ-4的存在。

本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’左侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:6的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA 扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO: 6的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件NAZ-4或其后代的存在。

所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因玉米事件NAZ-4中在插入序列的 5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1819个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由1140个核苷酸的玉米左侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-1140)、30个核苷酸的pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new构建体左边界DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1141-1170)和649个核苷酸的耐草铵膦基因的第一表达盒的5’末端DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1171-1819) 组成，包含所述SEQ ID NO:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件NAZ-4 的存在。

所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’右侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11 个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的所述SEQ ID NO:4 的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件NAZ-4或其后代的存在。

所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件NAZ-4中在插入序列的 3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1284个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由406个核苷酸的耐旱基因的第二表达盒的3’末端DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1-406)、22个核苷酸的 pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new构建体右边界DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸407-428)和856个核苷酸的玉米整合位点右侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO: 4的核苷酸429-1284)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件NAZ-4的存在。

所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因玉米事件NAZ-4的长度为 7624个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述 SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件NAZ-4的存在。

表1 SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件

1：单位bp。

本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列或第三和第四核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。

本发明还提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 5第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。

本发明还提供了一种保护玉米植物免受由干旱引起的损伤的方法，其特征在于，包括在缺水土壤中种植至少一种转基因玉米植物，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对干旱的耐受性。

本发明还提供了一种控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5 第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。

本发明还提供了一种提高玉米对干旱和草铵膦除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括将以下表达盒导入玉米的基因组中：

表达耐草铵膦基因的第一表达盒，如SEQ ID NO:5的第1171-2705位核苷酸所示序列；

表达耐旱基因的第二表达盒，如SEQ ID NO:5的第3044-6746位核苷酸所示序列。

在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA 可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、 100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组侧翼区”或“基因组5’侧翼序列”等。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组侧翼区”或“基因组3’侧翼序列”等。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组 DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

本发明提供了称为NAZ-4的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件NAZ-4即为玉米植物NAZ-4，其包括转基因玉米事件NAZ-4的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件NAZ-4的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物NAZ-4的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

本发明转基因玉米事件NAZ-4包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件NAZ-4获得对干旱和/或草铵膦除草剂的耐受性。所述DNA构建体包含一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码玉米b-ZIP类转录因子ABP9蛋白的基因ABP9，所述ABP9蛋白的核酸序列对干旱具有耐受性。所述DNA构建体包含另一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的基因bar，所述PAT蛋白的核酸序列对草铵膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、泛素蛋白(Ubiquitin) 启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 胭脂碱合成酶(NOS)启动子、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、夜香树属(Cestrum) 黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(Patatin)启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(GST)启动子、E9 启动子、GOS启动子、alcA/alcR启动子、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) RolD启动子和拟南芥属(Arabidopsis thaliana)Suc2启动子、玉米b-ZIP类转录因子ABP9基因启动子abp9。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(PINⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白 (α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活因子、CaMV35S增强子和FMV35S 增强子。所述信号肽/转运肽可以引导EPSPS蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网。

所述“草铵膦”是指能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶的膦酸类除草剂，用“草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草铵膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂处理包含了来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物材料的生长或产量。

所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源 DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。

所述基因枪转化法即为用包含外源DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的生物弹击转化)。

所述花粉管通道转化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又名花粉管引导组织)，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊。

转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”指包括异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还指转化体和含有异源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于转化体亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化体的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA 的亲本系(例如原始转化体和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。

本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA分子和/ 或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

培养对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件NAZ-4，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件NAZ-4 及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件NAZ-4及其后代是通过利用本发明的对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对干旱或草铵膦除草剂具有耐受性；然后选择对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使干旱和草铵膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用草铵膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件NAZ-4中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。

还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件NAZ-4基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件NAZ-4或种子还是来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如 DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标 DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的 DNA序列同一性。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物材料中分离相应的DNA 分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件NAZ-4的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。

本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7 可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件NAZ-4通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件NAZ-4，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件NAZ-4，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件NAZ-4的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件NAZ-4也是诊断性的。

扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。PCR 扩增方法已经发展到可扩增22kb的基因组DNA和42kb的噬菌体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的外源DNA序列和来自转基因玉米事件NAZ-4的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件NAZ-4的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的 DNA进行标准的DNA测序。

基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO:9以及SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，其扩增与转基因玉米事件NAZ-4的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQID NO:1。鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对还包括SEQ ID NO:12 和SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，其扩增与转基因玉米事件NAZ-4的3’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:2。用作DNA引物的其它DNA分子可选自SEQ ID NO:5。

这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是 GeneticBit Analysis，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组 DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

另一种方法是Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。

荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法(Chen X,Levine L,and Kwok P Y.Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis[J]. Genome Res,1999,9(5):492-8.)。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入 DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/ 侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

也可应用分子标记对序列进行检测(Tyagi S and Kramer F R.Molecularbeacons:probes that fluoresce upon hybridization[J].Nat Biotechnol,1996,14(3): 303-8.)。设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管 (nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。

可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发 DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件 NAZ-4的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件NAZ-4的DNA的玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、 2、3、4、5、6或7的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA 扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在图1 和表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的DNA结构包含：位于转基因插入序列5’末端的玉米NAZ-4左侧翼基因组区域，来自农杆菌的左侧边界区域(LB)的一部分插入序列，第一个表达盒由花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S promoter)，可操作地连接到草丁膦(草铵膦)抗性基因序列(bar) 上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒的35S终止子胭脂碱合成酶基因终止子 (CaMV 35S terminator)上而组成；第二个表达盒由玉米ABP9基因启动子(abp9promoter)，可操作地连接到玉米b-ZIP类转录因子ABP9基因上，可操作地连接到ABP9基因3’非翻译区序列(3’-UTR)上，并可操作地连接到胭脂碱合成酶基因终止子(nosterminator)上而组成，来自农杆菌的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的玉米植物NAZ-4右侧翼基因组区域(SEQ ID NO:5)。在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件NAZ-4中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件NAZ-4中侧翼玉米基因组的DNA区域的任何部分。

转基因玉米事件NAZ-4可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草甘膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件NAZ-4一起育种，可以提供抗旱抗虫并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。

本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法，转基因玉米事件NAZ-4具有耐受含草铵膦的农业除草剂或耐受干旱的生长条件的作用。该性状的玉米植株表达转录因子ABP9和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)蛋白，其赋予植物对干旱和草铵膦的耐受性。同时本发明检测方法中SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ IDNO:3或其互补序列、SEQ ID NO: 4或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、或者SEQ IDNO:7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因玉米事件NAZ-4或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件NAZ-4的植物材料的存在。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1转基因插入序列与玉米基因组结合部位的结构示意图。

图2重组表达载体pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new的物理图谱。各元件英文及缩写含义列举如下：

T-Border(left) 农杆菌C58的T-DNA左边界序列。

CaMV 35S terminator 花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S终止子。

bar 编码PAT蛋白，解除草铵膦毒性。

CaMV 35S promoter 花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。

abp9 promoter 玉米ABP9基因的启动子。

ABP9 玉米ABP9基因CDS。

ABP9 3’-UTR 玉米ABP9基因3’非翻译区。

nos terminator 胭脂碱合成酶基因的终止子。

T-Border(right) 农杆菌C58的T-DNA右边界序列。

PVS1 sta pVS1质粒的质粒稳定位点。

PVS1 rep pVS1质粒的复制起始位点。

PBR322 bom pBR322质粒的bom位点。

PBR322 ori pBR322质粒的复制起始位点。

kanamycin(R) 编码氨基糖苷磷酸转移酶蛋白，赋予细菌卡那霉素抗性。

图3 NAZ-4外源基因插入拷贝数的Southern印记杂交图，杂交出的外源条带用箭头标注。

A：bar探针；泳道1-8分别表示不同的DNA样品。1：DNA Marker，条带大小标注在旁，单位kb；2：EcoRI酶切的阳性对照 pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new质粒；3：EcoRI酶切的阴性对照郑58基因组 DNA；4：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₂基因组DNA；5：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₃基因组DNA；6：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₄基因组DNA；7：DNA Marker，条带大小标注在旁，单位kb；8：BglII酶切的阳性对照 pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new质粒；9：BglII酶切的阴性对照郑58基因组DNA； 10：BglII酶切的NAZ-4BC₅F₂基因组DNA；11：BglII酶切的NAZ-4BC₅F₃基因组DNA；12：BglII酶切的NAZ-4BC₅F₄基因组DNA。

B：ABP9探针；泳道1-8分别表示不同的DNA样品。1：DNA Marker，条带大小标注在旁，单位kb；2：EcoRI酶切的阳性对照 pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new质粒；3：EcoRI酶切的阴性对照郑58基因组 DNA；4：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₂代基因组DNA；5：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₃代基因组DNA；6：EcoRI酶切的NAZ-4BC₅F₄代基因组DNA；7：DNA Marker，条带大小标注在旁，单位kb；8：HindIII酶切的阳性对照 pCAMBIA3301-pabp9-ABP9new质粒；9：HindIII酶切的阴性对照郑58基因组 DNA；10：HindIII酶切的NAZ-4BC₅F₂代基因组DNA；11：HindIII酶切的 NAZ-4BC₅F₃代基因组DNA；12：HindIII酶切的NAZ-4BC₅F₄代基因组DNA。

图4开花期干旱处理下对照(上)和转化体(下)的果穗表现。

图5草铵膦喷施4周后转化体和受体对照的田间表现。A：郑58-0×；B：郑 58-1×；C：NAZ-4-0×；D：NAZ-4-1×；E：NAZ-4-2×；F：NAZ-4-4×。0×、1×、 2×、4×代表0倍、1倍、2倍和4倍草铵膦喷施剂量。

图6转化体特异性PCR验证结果。M：Takara DL1000，大小标注在旁；1： BC₅F₂转基因玉米NAZ-4；2：BC₅F₃转基因玉米NAZ-4；3：空白对照；4：阴性对照郑58；左边界PCR片段预期大小675bp；右边界PCR片段预期大小597 bp。

图7外源插入序列PCR扩增图。M：Takara DL5000；大小标注在旁；1： P1序列，片段预期大小为1819bp；2：P2序列，片段预期大小为1690bp；3： P3序列，片段预期大小为1876bp；4：P4序列，片段预期大小为2139bp；5：P5序列，片段预期大小为1284bp。

图8转化事件NAZ-4的检测结果。1：分子量标准，从上到下依次为2kb、 1kb、750bp、500bp、250bp；2-4：转化体BC₂F₁代植株基因组DNA为模板扩增产物；5～7：转化体BC₅F₂代植株基因组DNA为模板扩增产物；8：阴性对照，以非转基因玉米郑58基因组DNA为模板扩增产物；左边界PCR片段预期大小 675bp；右边界PCR片段预期大小597bp。

具体实施方式

本申请涉及的转化事件NAZ-4是指以玉米自交系HiII为受体经过遗传转化后再回交转育到自交系郑58后得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物 (T-DNA插入物)的玉米植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有图1 所示的物理图谱，所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:5的第1171-6746位核苷酸所示序列。转化事件NAZ-4可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体转化其他受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件NAZ-4还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

实施例1转化载体的构建

在ABP9启动子Pabp9序列5’端设计含HindIII锚位点的正向引物，在3’端设计含HindIII和SpeI(由外向内)锚位点的反向引物，以玉米基因组DNA为模板PCR扩增Pabp9；PCR产物经HindIII酶切克隆到pCAMBIA3301载体上，获得pCAMBIA3301-Pabp9中间载体。将ABP9cDNA克隆载体T-easy-ABP9用 XhoI酶切补平后用XbaI酶切，回收小片段与经XbaI和Ecl136II双酶切的pBI121 载体连接，获得中间载体pBI121-35S-ABP9。将pCAMBIA3301-Pabp9用SpeI 酶切补平后用AflII酶切，回收大片段；将pBI121-35S-ABP9用XbaI酶切补平后用AflII酶切，回收小片段；将两个回收的片段连接，获得 pCAMBIA3301-Pabp9-ABP9表达载体。

所得载体大小为11.972kb，载体物理图谱见图1。

实施例2玉米遗传转化

转化玉米所用的方法是农杆菌介导法，其操作程序如下：

(1)选取授粉10-13天的玉米雌穗，从中剥离大小适中的幼胚(1.5-2.0mm)；

(2)用接种环从19℃生长三天的YEP平板上挑取一满环农杆菌LBA4404 (含表达载体)，悬浮在侵染培养液中，室温，75rpm，2-4h，至OD₅₅₀＝0.3-0.5，侵染剥离的幼胚；

(3)侵染完的幼胚转移到共培养基上，20℃暗中培养3天；

(4)三天后将幼胚转移到恢复培养基中，28℃暗中培养7天；

(5)恢复培养后将幼胚转移到筛选培养基中，每两周转换一次，从中选择生长迅速的II型愈伤组织；

(6)选择出来的愈伤组织光下萌发，长成再生植株；

(7)对再生植株进行分子检测确定转基因植株。

实施例3转化体的筛选

(1)对转化获得的转化苗进行bar和ABP9目的基因分子检测。根据基因序列设计PCR引物对，引物序列分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17以及 SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19。取转化苗叶片提取基因组DNA，按照以下PCR 参数进行扩增：

反应体系：

反应程序：

根据bar基因预期扩增片段大小672bp和ABP9基因预期扩增片段大小582 bp筛选阳性转化苗。

(2)将阳性植株与郑58杂交并回交一次，收获BC₁F₁种子。对BC₁F₁植株进行草铵膦除草剂鉴定，选取抗性优良的转化体NAZ-1～NAZ-6，并继续与郑 58回交。

(3)对BC₂F₁植株进一步考察抗旱性状和农艺性状，筛选得到转化体 NAZ-4。

实施例4转化事件NAZ-4的拷贝数检测

采用Southern印记杂交的方法确定外源基因插入的拷贝数。Southern杂交选取EcoRI和HindIII或BglII两种酶消化阳性对照质粒、阴性对照非转基因郑58 以及BC₅F₂、BC₅F₃和BC₅F₄代NAZ-4基因组DNA，并选择T-DNA上的外源基因的部分片段作为探针进行Southern杂交。其中bar基因探针用SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21引物对扩增制备，ABP9基因探针用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23引物对扩增制备。

bar基因的插入拷贝数杂交检测选取EcoRI和BglII两种限制性内切酶分别酶切NAZ-4转化体不同世代和阴性对照非转基因郑58基因组DNA以及阳性对照质粒DNA。杂交结果见图3A所示。

EcoRI在T-DNA区有两个酶切位点，都位于bar基因探针的右侧，经过酶切的NAZ-4转化体基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括 1.9kb的T-DNA序列及其左侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于1.9 kb，实验中标记出一条杂交条带，大小约为5kb(泳道4-6)，符合>1.9kb预期。

BglII在T-DNA区有一个酶切位点，全部位于CaMV35S启动子和bar基因探针的右侧，经过酶切的NAZ-4转化体基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括3.2kb的T-DNA序列及其左侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于3.2kb，实验中标记出一条杂交条带，大小约为9.4kb(泳道 10-12)，符合>3.2kb预期。

ABP9基因的插入拷贝数杂交检测选取EcoRI和HindIII两种限制性内切酶分别酶切NAZ-4转化体不同世代和阴性对照非转基因郑58基因组DNA以及阳性对照质粒DNA。杂交结果见图3B所示。

ABP9基因为玉米内源片段，EcoRI和HindIII酶切阴性对照郑58的基因组后，与标记探针杂交可得到内源条带，其中EcoRI酶切可标记出5kb条带(泳道3)，其中HindIII酶切可标记出5kb、7kb和20kb条带(泳道9)。

EcoRI在T-DNA区的酶切位点有两个，位于ABP9基因探针的左侧，经过酶切的NAZ-4转化体基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括 3.8kb的T-DNA序列及其右侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于3.8 kb。实验中标记出两条杂交条带，分别为5kb和7kb条带(泳道4-6)，排除内源的5kb条带，外源片段标记出的条带大小为7kb，符合>3.8kb的预期。

HindIII在T-DNA区的酶切位点有一个，位于ABP9基因探针的左侧，经过酶切的NAZ-4转化体基因组DNA与特异性探针杂交后获得的标记条带应该包括 3.8kb的T-DNA序列及其右侧基因组上大小未知的序列，整个片段长度大于3.8 kb。实验中标记出4条杂交条带，分别为5、7、7.5和20kb条带(泳道10-12)，排除内源的5、7和20kb的三个条带，外源片段标记出的条带大小为7.5kb，符合>3.8kb的预期。

以上实验结果表明，NAZ-4的T-DNA区含有单拷贝的bar和ABP9基因片段，且T-DNA区单位点插入玉米基因组。不同世代间外源插入片段可通过有性生殖稳定遗传。

实施例5转化事件NAZ-4对干旱的耐受性

在符合隔离要求的田间环境下，通过正常水分和干旱胁迫处理评价转化体 NAZ-4在种子萌发期、苗期、开花期的耐旱指数和耐旱等级，明确转化体耐旱目标性状的有效性。

种子萌发期耐旱性鉴定采用高渗溶液法，在实验室内进行。在培养皿(Φ9 cm)内放置两层灭菌滤纸作为发芽床，转基因耐旱玉米品种(系)和对应的非转基因玉米品种(系)各选取800粒饱满度一致的消毒种子(70％乙醇溶液浸泡 3min，3％次氯酸钠溶液紧迫20min，灭菌去离子水洗净)。

转化体NAZ-4和对应的非转基因对照郑58各四次重复，每个重复100粒，每培养皿放20粒，加入20ml-0.3MPa的聚乙二醇-6000(PEG-6000)水溶液(150 g聚乙二醇-6000溶解在1000mL去离子水中)作为干旱胁迫处理，加入20mL 灭菌去离子水作为正常水分处理，用透气保水的保鲜膜封口，防止水分蒸发。将培养皿放入人工气候箱中，25℃暗陪养，7d后调查种子发芽的胚芽长度并按式(1)计算胚芽长伤害率。

DG_S＝(IR_WW-IR_WS)/IR_WW×100.........................................(1)

DGS：胚芽长伤害率，单位为百分率(％)；

IR_WW：正常水分处理四个重复在7d后萌发种子的胚芽长度平均值；

IR_WS：干旱胁迫处理四个重复在7d后萌发种子的胚芽长度平均值。

比较转化体NAZ-4和非转基因郑58在胚芽长伤害率方面的差异，按表2的标准判别种子萌发期的耐旱性水平。

表2玉米种子萌发期耐旱性评价指标

在干旱胁迫处理条件下，转化体NAZ-4和非转基因对照材料郑58种子发芽的胚芽长度均受到显著抑制，但转化体NAZ-4的胚芽长度显著高于非转基因对照，进一步计算胚芽长伤害率，转化体NAZ-4的伤害率为45.0％，低于郑58的胚芽长伤害率(56.5％)。具体结果如表3所示。

根据玉米种子萌发期耐旱性评价指标，NAZ-4种子萌发期的耐旱性水平达“极强”，对照郑58的耐旱性水平为“强”。说明转化体在种子萌发期的耐旱性比对照强。

表3种子萌发期耐旱性鉴定

1：数值以4次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料不同处理间数据的差异显著性(α＝0.05)。

苗期耐旱性鉴定在日平均气温为(25±5)℃条件下的可移动旱棚内进行。在长×宽×高＝60cm×40cm×15cm的塑料箱中装入8cm厚的中等肥力水平的耕层土 (田间待播种耕层土壤过筛后壤土)，灌水至土壤相对含水量达到(85±5)％，每箱等分成6个小区，每小区播30粒(最后定苗20株)，覆土3cm。

转化体NAZ-4和非转基因对照郑58各三个重复，每个重复在玉米幼苗长至三叶一心时定苗60株。胁迫处理采用反复干旱法：玉米幼苗长至三叶一心时停止供水，开始进行干旱胁迫，当土壤相对含水量保持在(20±5)％时复水，使土壤相对含水量达到(85±5)％；第一次复水后停止供水，进行第二次干旱胁迫，当土壤相对含水量保持在(20±5)％时，第二次复水，24h后取地上部植株。正常水分处理的土壤相对含水量始终保持在(85±5)％，与对应的干旱胁迫处理同时取地上部植株，105℃烘箱中杀青1.0h，然后72℃烘至恒重，称干重，计算苗期生物学产量。按式(2)计算苗期生物学产量耐旱指数。

DS_BB＝1-(BB_WW-BB_WS)/BB_WW.........................................(2)

DS_BB：苗期生物学产量耐旱指数；

BB_WW：正常对照处理三个重复平均生物学产量；

BB_WS：干旱胁迫处理三个重复平均生物学产量。

比较转化体NAZ-4和非转基因郑58苗期生物学产量耐旱指数的差异，按表 4标准判别苗期的耐旱性水平。

表4玉米苗期耐旱性评价指标

干旱胁迫处理下转化体NAZ-4的地上生物量为0.13±0.03g，与正常水分处理(0.14±0.03g)无显著差异；郑58在干旱处理下的地上生物量为0.11±0.01g，显著低于正常水分处理(0.17±0.01g)。

根据玉米苗期耐旱性评价指标，NAZ-4的耐旱等级为“极强”，非转基因对照的耐旱等级为“中等”(表5)。说明转化体在种子萌发期的耐旱性比对照强。

表5苗期耐旱性鉴定

1：数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料不同处理间数据的差异显著性(α＝0.05)。

开花期耐旱性鉴定在新疆乌鲁木齐进行，其生育期内自然降水量小于150 mm，满足试验条件。转化体NAZ-4、阴性对照郑58各三次重复，随机区组分布。播种前浇底墒水，保证出全苗，前期保证植株正常生长，自抽雄前一周停止供水，使0-50cm土层土壤相对含水量保持在40％-50％。开花期耐旱性鉴定直至植株吐丝后恢复正常浇水。正常水分处理一直保持土壤相对含水量在70％以上，满足玉米正常生长，直至成熟。在成熟期每小区随机收获60株玉米果穗(边际行与边际列不做采样)，风干后脱粒，称其籽粒干重，按标准水分(14％)折算，用kg表示。按式(3)计算开花期耐旱指数。

DI_YF＝GY² _WS×GY_CK.WW/GY_WW×GY² _CK.WS................................(3)

DI_YF：开花期耐旱指数；

GY_WS：干旱胁迫处理下转基因或非转基因品种(系)三个重复的平均籽粒产量；

GY_WW：正常灌溉处理下转基因或非转基因品种(系)三个重复的平均籽粒产量；

GY_CK.WW：正常灌溉处理下对照品种三个重复的平均籽粒产量；

GY_CK.WS：干旱胁迫处理下对照品种三个重复的平均籽粒产量。

比较转化体NAZ-4与阴性对照非转基因郑58在开花期耐旱指数方面的差异，按表6的标准判别NAZ-4在开花期的耐旱性水平。

表6玉米开花期耐旱性评价指标

花期干旱胁迫处理总用水量为177m³，正常水分管理用水量为234m³。开花期干旱胁迫下NAZ-4的产量为7.4±0.2kg，显著高于同处理下郑58产量 (3.5±0.4kg)，计算而得的NAZ-4的耐旱指数为0.98，对应的耐旱等级为“中等”；而郑58的耐旱指数为0.24，对应的耐旱等级为“极弱”，这说明转化体在开花期干旱处理下耐旱性比对照显著提升。(表7，图4)。

表7 NAZ-4开花期处理耐旱表现

1：数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料不同处理间数据的差异显著性(α＝0.05)，“-”表示未计算。

实施例6转化事件NAZ-4对靶标除草剂的耐受性

在田间自然环境下，通过人工喷施除草剂的方法测定NAZ-4转化体对除草剂草铵膦的耐受性，以明确转化体耐除草剂目标性状的有效性。在转基因玉米和对照材料长至三叶一心至五叶一心时，用可以精准控制喷施量的利农 JactoHD400型手动背负式喷雾器喷施目标除草剂。

处理方式为：草铵膦，田间推荐剂量为200-300mL/亩(制剂用药量)，取中剂量为250mL/亩。清水(0×)、田间推荐剂量中量的1倍(1×，250mL/亩或 45g/亩)、2倍(2×，500mL/亩或90g/亩)和4倍(4×，1000mL/亩或180g/ 亩)。

性状调查：分别在用药后1周、2周和4周调查和记录成苗率、植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)。

(1)如果药害能被计数或测量，则用绝对数值表示，例如植株数(喷药株数、死亡株数)或植株高度(选取最高的5株)。

(2)用药1周后，按表8给每个处理药害定级。

表8除草剂药害症状分级表

除草剂受害率按公式(1)计算。

式中：

X—受害率，单位为百分率(％)；

N—同级受害株数；

S—级别数；

T—总株数；

M—最高级别。

在喷施草铵膦溶液1周，2周和4周后，观察不同剂量处理下不同材料的田间表现，并调查药害情况和株高。在1倍、2倍和4倍草铵膦推荐剂量中量处理条件下，转基因玉米NAZ-4在药后1周均可以全部成苗，且直到4周都没有药害症状发生；而受体对照郑58在喷施1倍推荐剂量中量草铵膦后1周内，植株就全部死亡，植株药害严重，药害等级达到5级(表9，图5)。

进一步，调查在各剂量草铵膦处理条件下玉米植株的株高。喷施前(0周) 调查发现，NAZ-4不同处理区组间株高有一定差异，这可能是不同区组肥力差异导致玉米苗期生长有所差异，但是随着植株不断长大，这种差异逐渐减少。喷施4周后，转化体在不同剂量除草剂处理下的株高无显著差异，植株长势已经一致(表9)。这表明草铵膦对玉米植株的生长无显著影响，转化体具有较强的草铵膦除草剂耐受性。

表9 NAZ-4对草铵膦的耐受性表现

用药剂量以推荐剂量中量的倍数表示。数值以3次生物学重复的平均值±标准差表示，同列不同喷施剂量间数据采用LSD法检验差异显著性(α＝0.05)，“-”表示未调查。

这些结果表明，转化事件NAZ-4具有较强的草铵膦耐受性。在推荐剂量中量4倍处理时，药害率仍为0，其耐受等级达到优秀。因此，转化事件NAZ-4 可以保护玉米免受由除草剂引起的损伤。通过种植转化事件NAZ-4并喷施适当剂量的除草剂可以控制玉米田中的杂草。

实施例7转化事件NAZ-4外源序列的侧翼序列及玉米基因组插入位置

根据载体序列，设计TAIL-PCR载体特异性引物以及基因组的简并引物(表 10)。利用相关的引物对转化体NAZ-4进行巢式TAIL-PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测及测序。通过TAIL-PCR扩增获得了插入序列右边界旁的侧翼序列。将侧翼序列与玉米B73基因组进行BLAST分析并通过T-DNA区边界序列和插入位置旁侧玉米基因组序列设计引物，利用转化体特异性PCR检测NAZ-4外源片段插入玉米基因组的位置。

表10侧翼序列分离和全长测序扩增所用的引物信息

利用Tail-PCR扩增并测序的方法获得了转化体NAZ-4的右侧翼序列，并根据基因组序列用普通PCR方法分离左侧翼序列。在PlantGDB数据库 (http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)中用BLASTN工具将侧翼序列与玉米基因组序列进行同源比对分析，以B73 RefGen_V2为参考序列。分析可知转化体NAZ-4正向插入玉米基因组Chr10:16531140-16531184位置处，且T-DNA整合进玉米基因组时，受体材料基因组发生44bp的碱基缺失。利用 MAIZEGDB数据库(https://www.maizegdb.org/gbrowse)中Genome Context分析插入位点上下游各5kb基因组内(Chr10:16526140-Chr10:16536184)，可知插入位点附近没有内源基因。因此T-DNA的插入不会影响内源基因的表达和功能。

Tail-PCR的操作步骤如下：

1)提取玉米基因组DNA。

2)以植物基因组DNA作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下：

反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；62℃，2min；72℃，2.5min) ×5cycles；94℃，30sec；25℃，3min；72℃(32％ramp)，3min；(94℃，30sec； 62℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；62℃，1min；72℃，2.5min；94℃， 30sec；45℃，1min；72℃，2.5min)×15cycles；72℃，7min；20℃，10min。

3)以步骤2)中相应的PCR产物(母液)为模板进行第二轮PCR扩增。反应体系如下：

反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min； 94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；45℃，1min；72℃，2.5min)×20cycles；72℃，7min；20℃，10min。

4)以步骤3)中相应的PCR产物(稀释30倍)为模板进行第三轮PCR扩增。反应体系如下：

反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min； 94℃，30sec；65℃，1min；72℃，2.5min；94℃，30sec；45℃，1min；72℃， 2.5min)×20cycles；72℃，7min；20℃，10min。

5)取步骤4)中第三轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收符合目的大小的DNA片段。

6)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接。

7)转化6)的连接产物。

8)扩增7)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇菌提质粒。

9)送质粒进行测序。

根据侧翼序列和插入位置的结果利用基因组上游引物(SEQ ID NO:8)与载体左边界引物(SEQ ID NO:9)扩增以及载体右边界引物(SEQ ID NO:12) 与基因组下游引物(SEQID NO:13)对NAZ-4转化体进行PCR扩增，以验证外源片段插入位置。结果见图6。结果证明NAZ-4外源片段稳定插入到玉米基因组Chr10:16531140-16531184位置处。

进一步根据载体和侧翼序列，分别设计引物(表10)，通过重叠PCR进行5 段重叠序列的PCR扩增，扩增结果见图7。将扩增序列测序并通过序列比对和拼接，获得NAZ-4的全长插入序列。转化体NAZ-4实际插入序列和左右侧翼玉米基因组序列如SEQ ID NO:5所示。其中，P1序列(SEQ ID NO:3)和相应的扩增引物SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11以及P5序列(SEQ ID NO:4)和相应的扩增引物SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15仅存在于含有NAZ-4的玉米材料中，可以用来对NAZ-4进行鉴定。SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9引物扩增出的序列SEQID NO:6，以及SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13引物扩增出的序列 SEQ ID NO:7，也可以用来对NAZ-4进行鉴定。

实施例8转化事件NAZ-4的检测方法

可由转基因玉米事件NAZ-4进行育种，并用育成的新品种生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因玉米事件NAZ-4材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和 /或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的转基因玉米事件NAZ-4核苷酸序列，其中探针序列或引物扩增序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7中所示的序列，以诊断转基因玉米事件NAZ-4的存在。

其中一个检测方法为：利用PCR方法对BC₂F₁和BC₅F₂两个NAZ-4植株中的特异性边界序列进行检测，所用的PCR引物对分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，PCR反应体系：

反应程序为：

94℃，5min；(94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1.0min)×35循环； 72℃，7min；4℃，5min。

取PCR产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，结果见图8。BC₂F₁和BC₅F₂代的转化事件中可以扩增得到预期的目标条带(分别为SEQ ID NO:6和 SEQ ID NO:7)，但是其他非来源于转化事件的样品则不能扩增出目标条带。而且在转化事件从转化受体HiII到郑58回交的过程中，该PCR方法能够追踪转化事件的存在，从而应用于育种工作。

综上所述，本发明转基因玉米事件NAZ-4对干旱和草铵膦除草剂具有较高的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件 NAZ-4的DNA分子。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种用于检测玉米植物NAZ-4的核酸序列及其检测方法

<130> 1

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 1

ctgcagtcgg acgtttttaa tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 2

cagtgtttga ccggcgaagt ga 22

<210> 3

<211> 1819

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 3

tcctatttgc tattttacag agagatacgc cgctgacctc gccctgaaac agcaaacgct 60

tcgcctttgg ggtctccttg ggcctcgctg acaccaccaa ccaaaacctg acacctcccc 120

gtcccacgtg cctctgcgga gcaccagctc tgcagtgcag tgcagtgcag gagaagcctg 180

ttgggacggg acttgccact ttgccagtgc acaacggaag catcgaccgc gtcgccgcac 240

tccagtcctc caccatggcc gaggagcacc tgctggcact agcgcttccg cccaccaaag 300

gcaacaagga ggcctcgcca ggggccacgg cggcggaggc agagcgcgcg cgccgccgcc 360

gcatgtccag gctctacgcc gagctgggtg cgcagctccc cggcctgccc cctcgggtcc 420

gtccgtccac attttcttcc cgacacctgg tccattcttc ctcggccatg gcctcacgtt 480

cccaccacgc cgtgcaggca aacatggcgc ggatcctgga ggacgcgatc gcctacgtgg 540

gggtgctgcg ggccacggtc gcggggctcg aggcgcgcgc cgcgttcgcg aggtcagcgc 600

ggacggccgc gcccgccgac gtgctcgtgg ctaggaaggc gtcgtgcttc gtcgtccgcc 660

tggcggaagc gccgcggcgc gctgacgcgc gtgctggagg tgttccaacg gcacggtctg 720

cccgtcctca cggccgcggt gaccagcggt ggcggggagg ccgtggtcac gatcaccacc 780

gcgccagtgc tgccgagatt ccggggctta gcccgagtcc gagccctggg tcgggcggag 840

cggagttcgt cgtcttccgt ggcttagccc gagtccgagc cctgggtcgg gcggagcgga 900

gttcgccgtc ttccggggcc ttgcccgagt ccgagccctg ggtcggacgg agcggagttc 960

gccgtcttcc ggggcctaac ccgagtccga gccctaggtc gggcggagcg aagttcgtcg 1020

tcttccgggg cttagcccga gtccgagccc tgggtcgggc ggagcggagt ttcctatggc 1080

gcctttggca aggcctgacg tcctgtcagt ctcactctgt caagtggcac tgcagtcgga 1140

cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctggatt ttagtactgg 1200

attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat acaaatacat 1260

actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc ctaattccct 1320

tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga gtcaaatctc ggtgacgggc 1380

aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc cacgtcatgc 1440

cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata tccgagcgcc 1500

tcgtgcatgc gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga cagcgaccac gctcttgaag 1560

ccctgtgcct ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg tggagcccag tcccgtccgc 1620

tggtggcggg gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc agtcgtaggc gttgcgtgcc 1680

ttccaggggc ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt ccacctcggc gacgagccag 1740

ggatagcgct cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact cctgcggttc ctgcggctcg 1800

gtacggaagt tgaccgtgc 1819

<210> 4

<211> 1284

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 4

cgtctgcgag ggacgatatg gggcatgggc gagagcttcc gcgttggcct gctgctgttc 60

atgagcctgg gttgtacaaa caataaagca actgtaagat agtagtaatt aaacacaaag 120

ctctgtgttt tcgtcaactc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 180

ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 240

gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 300

attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 360

taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag 420

tgtttgaccg gcgaagtgac ggcggtcact tcggctctgc cggggggcgc acgtcaggat 480

aaaggtgtca ggctaccttt gcgttaaatg ctcctgcgac tcgatcggtc ggcgcggcga 540

tttagtcagg gttgcttctt agcgaaggca agacctcggg cgagccggag atgtgtccgc 600

cgttaaaagg ggggcctcga gcgagacgga aacccctcgg ggtcggctgc ccttgctcga 660

ggctaggctc gggcgaggcg tgatcgagtc gctcgtatgg actgatccct gacttaatcg 720

cacccatcag ccctctgcag ctttatgctg atggggttac cagctgagaa ttaggcgttt 780

tgagggtacc cctaattatg gtccccgaca atagcccccg agcctcgaag ggagtgttag 840

cactcgcttg gaggctttcg tcgcactttt ttgcaagggg accagccttt ctcggttgca 900

ttttgttccg gtgggtgcgc gcgagcgcac ccgccggata tagcccccga ggtcttaatg 960

ccttgcgtaa tgcttcggct ggtctggttg ttccctcatg cgaactggcc gtagcccgag 1020

tgcacggtcg gggcccaagt tctcgggccg gtatgttgac gctgtcaacg gttcggccgg 1080

agctgggttt gcgagagcag cccccgagcc tccgcacagg gtgagagggc gatcagggac 1140

agactcggct tttttacata cgcccctacg tcgcctttcc gcaaggagga ggggggagag 1200

cgccatgtta ccctcaatgg gcatcgaaca tggtgtctcc ggtgagctgc aagcgggtaa 1260

tccgagtgga cgtccgtgcc ccgt 1284

<210> 5

<211> 7624

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 5

tcctatttgc tattttacag agagatacgc cgctgacctc gccctgaaac agcaaacgct 60

tcgcctttgg ggtctccttg ggcctcgctg acaccaccaa ccaaaacctg acacctcccc 120

gtcccacgtg cctctgcgga gcaccagctc tgcagtgcag tgcagtgcag gagaagcctg 180

ttgggacggg acttgccact ttgccagtgc acaacggaag catcgaccgc gtcgccgcac 240

tccagtcctc caccatggcc gaggagcacc tgctggcact agcgcttccg cccaccaaag 300

gcaacaagga ggcctcgcca ggggccacgg cggcggaggc agagcgcgcg cgccgccgcc 360

gcatgtccag gctctacgcc gagctgggtg cgcagctccc cggcctgccc cctcgggtcc 420

gtccgtccac attttcttcc cgacacctgg tccattcttc ctcggccatg gcctcacgtt 480

cccaccacgc cgtgcaggca aacatggcgc ggatcctgga ggacgcgatc gcctacgtgg 540

gggtgctgcg ggccacggtc gcggggctcg aggcgcgcgc cgcgttcgcg aggtcagcgc 600

ggacggccgc gcccgccgac gtgctcgtgg ctaggaaggc gtcgtgcttc gtcgtccgcc 660

tggcggaagc gccgcggcgc gctgacgcgc gtgctggagg tgttccaacg gcacggtctg 720

cccgtcctca cggccgcggt gaccagcggt ggcggggagg ccgtggtcac gatcaccacc 780

gcgccagtgc tgccgagatt ccggggctta gcccgagtcc gagccctggg tcgggcggag 840

cggagttcgt cgtcttccgt ggcttagccc gagtccgagc cctgggtcgg gcggagcgga 900

gttcgccgtc ttccggggcc ttgcccgagt ccgagccctg ggtcggacgg agcggagttc 960

gccgtcttcc ggggcctaac ccgagtccga gccctaggtc gggcggagcg aagttcgtcg 1020

tcttccgggg cttagcccga gtccgagccc tgggtcgggc ggagcggagt ttcctatggc 1080

gcctttggca aggcctgacg tcctgtcagt ctcactctgt caagtggcac tgcagtcgga 1140

cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctggatt ttagtactgg 1200

attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat acaaatacat 1260

actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc ctaattccct 1320

tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga gtcaaatctc ggtgacgggc 1380

aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc cacgtcatgc 1440

cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata tccgagcgcc 1500

tcgtgcatgc gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga cagcgaccac gctcttgaag 1560

ccctgtgcct ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg tggagcccag tcccgtccgc 1620

tggtggcggg gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc agtcgtaggc gttgcgtgcc 1680

ttccaggggc ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt ccacctcggc gacgagccag 1740

ggatagcgct cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact cctgcggttc ctgcggctcg 1800

gtacggaagt tgaccgtgct tgtctcgatg tagtggttga cgatggtgca gaccgccggc 1860

atgtccgcct cggtggcacg gcggatgtcg gccgggcgtc gttctgggct catggtagac 1920

tcgagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc tccaaatgaa 1980

atgaacttcc ttatatagag gaagggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 2040

ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 2100

ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 2160

catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 2220

tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 2280

ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 2340

tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttcacatca atccacttgc 2400

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 2460

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga 2520

tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct 2580

gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc 2640

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc 2700

accatgttgg caagctgctc tagccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 2760

ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg 2820

caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg 2880

ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgaca 2940

tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctagc tagtaagctt atcgataccg 3000

tcgacctcga ctccaccgcg gtggcggccg cgggaattcg atacgaccag caaatccagc 3060

ataattcctc ctcgactcct cctaacccta gccgccaggc tccaggtgcc cttgtctggt 3120

tcgacctagt acaaatatag agggcattct tgtcttcctc atacaaaaga atcctattaa 3180

caactcaaat aatctgggta aacaaacagg actaatcaga ttatataatt cagattatat 3240

aacatgaggg taaacaaaca ggcccttagt ctgcactttc gcgcagctac taaagtctgt 3300

ctgttccaaa cagatacagc tgcggatgca ccagcacaca gcacaggtaa tagtccctgc 3360

aggtattcgt ttgcagccgc aacaagcgaa aggtgcagct gcatgcttga cttggactcc 3420

acactagagt cacagtcact ggacacacac tgacacacac atatggactc tggagtctgg 3480

agatagagca tgctgccacg ctctatttac actgtacccg gacaagtacg tcatgcacga 3540

acaaatactg gtaccgtacg tagcgcgtcc ttcgagtttg aataggagta gacgatcacg 3600

cgctacgtcc gcgcatatag acggaggtag agatggcaac ggttacaaac ccgtcgggtt 3660

ttgttattct aaaccggtac ccgttaaaaa tatttacatc cattaaaaag tctgtaccca 3720

tgacggcttt gaaattttac ccaaacccgt acccatcggg tttgcgggta cccatgggtt 3780

acccgcgggt ttttatctcc aatatgctta ttctttttat aatcaataag tatcgtaatg 3840

attaatgaga tcatggtcca aaagttatgt aatgaacaac gagttcatga tttggtataa 3900

aaatattagt agagagaatt aaatacaaat aataagttgt ataatcaagt taccttgcac 3960

taagttatac atccaccaca tatataacgc tagtaataac tataatagca agcaagcaac 4020

actatcacca actacttata cattcactat ttgataaaaa ttaggaagta aataggttga 4080

taacaagttt gttgttcgtt tataaaataa aatgacaata tgcactaggt ttggtcgggt 4140

ttaaaaaacc cacaggttca cgggtttggg tactatagga acaaacccgt acccatgaac 4200

ccgtcgagta tacatttatg gccattaaca aactcatggg tatgaaaatt gacccaaact 4260

cgtatcctaa tggagtaaaa actcatcggg tttcggatac ccatcgccat ctctacacgg 4320

aggtgtctcc gcggcagccg agctagatgt caacagcgtc ctcgtcagat ctcgcgcgtc 4380

gcgcacggcc ggggttggct gtatctgtat gtatccccac agaagccgta ggaaaccggt 4440

tcagatggcc acgcctcctc gcggctctat cagcagtgac ctgtcccgtt tgggaaacgg 4500

ccggagagca acgtcacccg cgcagtcgga ttctctgccg gacaaccgaa cagaaaaaga 4560

gagcccgagt tttcgtataa caccgccagt atctgtatct atccatctag ctgatctgat 4620

ctcgtgccgc aaaagataag tcgacaacaa gcacgtgcgg tgtgcggaat gtcgccaggg 4680

tcctggagtg cgtagagtat ttttgttagc catagcatgc gacgacgcgt aggagagcac 4740

acaagatcct cctgctgttc gtaattccct gagtaaagat ccaaacgagg aagagtcgtc 4800

cactcgctag agccgatcag tcatcaaacc agctgagcga accgcaccag ctgcgactgc 4860

gacaagcacc acccggcacc ccgcacctgg gttttctcga cccatctaac ccgaaccgtt 4920

tctaatcacc acgtccacgc ctgcctggct ttcgcatgca ggctttaagg acccgcgtgc 4980

cgcgttcgac gacgcatcag cagagcgcta aaaggagtct ttgcagttgc aggtcgatct 5040

agatatgata tggcgtcgga gacgaccaag aacgtgaagg ccaccctcga cgagcaggag 5100

gtaacctcgc atcagcgcga ccagagcgct gccgaggagg aggaggtggt ggtagtggtg 5160

gatccgctgg cgcggcagtc gtccgtcatg tcgcttacgc tggaggagct gcagagctcg 5220

ctctgcgagc cggggcgcaa cttcgggtcc atgaacatgg acgagttcat ggccaacata 5280

tggaacgccg aggagttcca ggccgccacc gccaccgcca ccggcggctg cagcaagcag 5340

gagggcacgc agcgggagcc gatgatgccc gtggcgaatg gaacaggtga gaacggagga 5400

ttggttcggc aggccaacgc ggcggcgcag gccgtggtgc agccccagat ggggagcggc 5460

ggtggcggcg gcggcgtcgc cgccagcggg cggcagcagg tgacgctggc cgacatgacg 5520

ctggaggact tcctggtgaa ggctggcgtc gtgcgaggag ccttcgccgg ccacggccac 5580

gcggtcgtcg gcatggcccc aatcccagcc gggcggatgg gcatccagca gcagcacgcg 5640

gctcccacga tgtcgtacca agtggcagcg ccggcgccca acgccgtgta cccggttatg 5700

ggcaacggca cggggtacca caacgggtac cccagggcca tcgcggtggt gccgccgtct 5760

cagtgcgtga cggccgccgt gagcccgggg tcgtcggacg gggtgagcgc gatgacgcag 5820

gcggagatga tgagctgcat tggcaacgaa ggggcaggga cggtccggaa ctacggcggc 5880

ggcggcggcg gcggcagcgc gcggaagcgc gactcccccg aggacgcgtg caccgagaag 5940

accgtggagc gccggcagcg gcggatgatc aagaaccgtg agtccgcggc ccggtcacgc 6000

gccaggaagc aggcgtatac ggtggagctc gaagctgaac tgaaccacct caaagaggag 6060

aacgatcgcc tcagagcaga gcagaagacg attctgctat cgaagaaaaa gaagctggtg 6120

gagaagatgg tggagcaggc aagggagaat gtgagcgcca agaagggcgg tcgcgggctg 6180

cgccgctcgg gcagcgccat gtggtgaact gtgacgactg acgagtgtct cgaattgtgc 6240

agttccagtc cgcttgctta gttgcttgta tgggaaaaaa aatcctgtac ctgtcggtag 6300

cagcaccgtt agtaacagta tgccatgtgg tcgacacaaa cgtctgcgag ggacgatatg 6360

gggcatgggc gagagcttcc gcgttggcct gctgctgttc atgagcctgg gttgtacaaa 6420

caataaagca actgtaagat agtagtaatt aaacacaaag ctctgtgttt tcgtcaactc 6480

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 6540

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 6600

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 6660

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 6720

ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag tgtttgaccg gcgaagtgac 6780

ggcggtcact tcggctctgc cggggggcgc acgtcaggat aaaggtgtca ggctaccttt 6840

gcgttaaatg ctcctgcgac tcgatcggtc ggcgcggcga tttagtcagg gttgcttctt 6900

agcgaaggca agacctcggg cgagccggag atgtgtccgc cgttaaaagg ggggcctcga 6960

gcgagacgga aacccctcgg ggtcggctgc ccttgctcga ggctaggctc gggcgaggcg 7020

tgatcgagtc gctcgtatgg actgatccct gacttaatcg cacccatcag ccctctgcag 7080

ctttatgctg atggggttac cagctgagaa ttaggcgttt tgagggtacc cctaattatg 7140

gtccccgaca atagcccccg agcctcgaag ggagtgttag cactcgcttg gaggctttcg 7200

tcgcactttt ttgcaagggg accagccttt ctcggttgca ttttgttccg gtgggtgcgc 7260

gcgagcgcac ccgccggata tagcccccga ggtcttaatg ccttgcgtaa tgcttcggct 7320

ggtctggttg ttccctcatg cgaactggcc gtagcccgag tgcacggtcg gggcccaagt 7380

tctcgggccg gtatgttgac gctgtcaacg gttcggccgg agctgggttt gcgagagcag 7440

cccccgagcc tccgcacagg gtgagagggc gatcagggac agactcggct tttttacata 7500

cgcccctacg tcgcctttcc gcaaggagga ggggggagag cgccatgtta ccctcaatgg 7560

gcatcgaaca tggtgtctcc ggtgagctgc aagcgggtaa tccgagtgga cgtccgtgcc 7620

ccgt 7624

<210> 6

<211> 675

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 6

ctaggaaggc gtcgtgcttc gtcgtccgcc tggcggaagc gccgcggcgc gctgacgcgc 60

gtgctggagg tgttccaacg gcacggtctg cccgtcctca cggccgcggt gaccagcggt 120

ggcggggagg ccgtggtcac gatcaccacc gcgccagtgc tgccgagatt ccggggctta 180

gcccgagtcc gagccctggg tcgggcggag cggagttcgt cgtcttccgt ggcttagccc 240

gagtccgagc cctgggtcgg gcggagcgga gttcgccgtc ttccggggcc ttgcccgagt 300

ccgagccctg ggtcggacgg agcggagttc gccgtcttcc ggggcctaac ccgagtccga 360

gccctaggtc gggcggagcg aagttcgtcg tcttccgggg cttagcccga gtccgagccc 420

tgggtcgggc ggagcggagt ttcctatggc gcctttggca aggcctgacg tcctgtcagt 480

ctcactctgt caagtggcac tgcagtcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat 540

taattcgggg gatctggatt ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt 600

gatagaagta ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg 660

agcgaaaccc tatag 675

<210> 7

<211> 597

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 7

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 60

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 120

ctatgttact agatcgggaa ttaaactatc agtgtttgac cggcgaagtg acggcggtca 180

cttcggctct gccggggggc gcacgtcagg ataaaggtgt caggctacct ttgcgttaaa 240

tgctcctgcg actcgatcgg tcggcgcggc gatttagtca gggttgcttc ttagcgaagg 300

caagacctcg ggcgagccgg agatgtgtcc gccgttaaaa ggggggcctc gagcgagacg 360

gaaacccctc ggggtcggct gcccttgctc gaggctaggc tcgggcgagg cgtgatcgag 420

tcgctcgtat ggactgatcc ctgacttaat cgcacccatc agccctctgc agctttatgc 480

tgatggggtt accagctgag aattaggcgt tttgagggta cccctaatta tggtccccga 540

caatagcccc cgagcctcga agggagtgtt agcactcgct tggaggcttt cgtcgca 597

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 8

ctaggaaggc gtcgtgctt 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 9

ctatagggtt tcgctcatgt gttg 24

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 10

tcctatttgc tattttacag agagatacgc cgc 33

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 11

gcacggtcaa cttccgatcc 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 12

gcatgacgtt atttatgaga tggg 24

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 13

tgcgacgaaa gcctccaag 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 14

cgtctgcgag ggacgatatg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 15

ggacgtccac tcggattacc 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 16

tcaaatctcg gtgacgggc 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 17

acgcacaatc ccactatcct tc 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 18

cgaagaaaaa gaagctggtg gag 23

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 19

tgcgggactc taatcataaa aacc 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 20

gaagtccagc tgccagaaac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 21

aaggaagttc atttcatttg 20

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 22

cagcgtcctc gtcaga 16

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 23

aacggttcgg gttagat 17

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 24

ccgcaattat acatttaata cgcg 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 25

caaaatatag cgcgcaaact agga 24

<210> 26

<211> 16

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 26

agwgnagwan cawagg 16

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 27

agtcaaatct cggtgacggg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 28

tggtcgtatc gaattcccgc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 29

atgcttccgg ctcgtatgtt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 30

tcttgtgtgc tctcctacgc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 31

acagaagccg taggaaaccg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 32

taatcatcgc aagaccggca 20

Claims

1.一种核酸分子，其特征在于，包括如下任意一种：

i)包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列，或其互补序列；

ii)包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其互补序列；

iii)包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其互补序列；

iv)包含SEQ ID NO:5所示序列，或其互补序列。

2.用于检测玉米转化事件的探针，其特征在于，包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其互补序列。

3.用于检测玉米转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含权利要求2所述的序列；

任选地，所述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列或其互补序列；或者SEQID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列或其互补序列。

4.用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含权利要求2所述的探针和/或权利要求3所述的引物对。

5.检测玉米转化事件的方法，其特征在于，包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：

i)权利要求2所述的探针；

ii)权利要求3所述的引物对；

iii)权利要求2所述的探针和权利要求3所述的引物对；或者

iv)权利要求4所述的试剂盒或微阵列。

6.对玉米进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含权利要求1所述核酸分子的玉米；

3)对步骤2)所获得的后代植物进行除草剂和/或干旱的抗性鉴定，并利用权利要求5所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

7.由权利要求6的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。

8.一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。

9.一种保护玉米植物免受由干旱引起的损伤的方法，其特征在于，包括在缺水土壤中种植至少一种转基因玉米植物，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对干旱的耐受性。

10.一种控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1171-6746位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。

11.提高玉米对干旱和草铵膦除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括将以下表达盒导入玉米的基因组中：