CN111195370B - 高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸在500μm以内，所述镁离子浓度为2.5mM‑10mM。本发明提出了构建局部高镁微环境干细胞微球载体的概念和制备方法，一方面，筛选出镁离子浓度在2.5mM‑5mM时，成骨诱导作用最佳；其次，制备的干细胞微球载体直径在500μm以内，有效提高了干细胞的负载率和存活率，同时利用局部高镁环境促负载的干细胞成骨向分化，降低使用蛋白因子带来的成本昂贵、缓释难控等弊端；最后，制备的高镁微环境干细胞微球载体用于骨缺损再生修复时，缺损区新生骨明显增多，修复效果显著提升。
Description
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学领域，更具体地讲，涉及一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用。
背景技术
干细胞具有自我更新能力和多向分化能力，理论上可在体外扩增至足够数量并被诱导分化为特定成体细胞，进而用于组织再生治疗。直接将细胞负载于支架材料上是常用的方法，但由于材料孔径和比表面积的影响，导致移植细胞数量明显受限：多孔支架材料孔径过小会限制细胞渗入支架深部，而孔径扩大，比表面积会随之减小，从而影响细胞的负载数量。微球作为干细胞载体，比之传统支架，具有尺寸小营养易渗透，比表面积大细胞负载量多的优势，同时以微球3D培养干细胞有效地维持了细胞干性，并为干细胞提供稳定的局部环境，有效抵抗受体的免疫排斥等，在组织再生应用中更具优势。
镁是人体常量元素，在骨生长发育中不可或缺，镁离子促进成骨的作用已有诸多研究报道。为了进一步提高再生修复效果，拟将具有成骨分化诱导能力的镁离子复合入微球中，构建高镁微环境微球并同时投递干细胞用于骨再生，该方面研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体。
本发明的第二个目的在于提供一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供高镁微环境骨髓干细胞微球载体在骨再生中的应用。
为实现本发明的第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体尺寸为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。
作为一个优选方案，所述镁离子浓度在2.5mM-5mM，此浓度时成骨诱导作用最佳。
作为一个优选方案，所述微球载体负载的干细胞密度在5×106-107/ml。
为实现本发明的第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)成骨相关干细胞的获取与培养；
(2)将步骤(1)得到的干细胞消化离心后，用高镁培养液重悬，所得细胞悬液与凝胶混合，使用注射器，滴入交联剂中得到载细胞微球，所述载细胞微球直径为100μm-500μm，所述镁离子浓度为2.5mM-10mM。
作为一个优选方案，步骤(2)筛选镁离子浓度在2.5mM-5mM，此浓度时成骨诱导作用最佳。
作为一个优选方案，步骤(2)使用海藻酸钠凝胶，成胶后海藻酸钠凝胶终浓度在1％—2％。
作为一个优选方案，使用的交联剂为CaCl2，SrCl2或者BaCl2中的一种。
作为一个优选方案，注射器针头内径在150μm—180μm，使用微量加样器滴加细胞-凝胶混合液，液滴体积在0.4μL以内，针头距交联剂液面1mm 以内。
为实现本发明的第三个目的，本发明公开以下技术方案：高镁微环境骨髓干细胞微球载体在骨再生中的应用。水凝胶干细胞微球载体可以注射的方式单独或与传统支架配合修复骨缺损，同时注射的方式可以减小手术创伤，避免创口感染等并发症。
本发明评估了不同浓度镁离子对骨髓干细胞活性的影响，筛选出适宜细胞存活的镁离子浓度范围；在此基础上检测镁离子对干细胞成骨分化的影响，优化出骨诱导作用最佳的镁离子浓度范围；制备了高镁微环境骨髓干细胞微球载体，评估了干细胞存活率和成骨分化效果，筛选出细胞存活率最佳的微球尺寸及促干细胞成骨向分化的镁离子浓度；制备了高镁微环境骨髓干细胞微球载体，移植于体内观察骨再生效果。研究结果表明：(1)镁离子浓度在20mM 内无明显细胞毒性，且具有一定促细胞增殖的作用(2)镁离子浓度在10mM以内时，具有成骨诱导作用；镁离子浓度在2.5mM-5mM时，诱导干细胞成骨向分化效果最佳(3)成功制备直径在1mm以内的载干细胞海藻酸钠微球，且微球直径在500μm时细胞存活率最高；(4)微球局部镁离子浓度在2.5mM-5 mM可促进干细胞成骨向分化，且具有促细胞增殖效果(5)高镁微环境干细胞微球明显促进骨缺损修复。
本发明的优点在于：本发明提出了构建局部高镁微环境干细胞微球载体的概念和制备方法，一方面，筛选出浓度在20mM以内的镁离子对细胞无毒性，且具有促进细胞增殖效果，镁离子浓度在2.5mM-10mM时具有成骨诱导作用，镁离子浓度在2.5mM-5mM时成骨诱导效果最佳；其次，制备的干细胞微球载体直径在100μm-500μm，有效提高了干细胞的负载率和存活率，同时利用局部高镁环境促负载的干细胞成骨向分化，降低使用蛋白因子带来的成本昂贵、缓释难控等弊端；最后，制备的高镁微环境干细胞微球载体用于骨缺损再生修复时，缺损区新生骨明显增多，修复效果显著提升。本发明不需专门、复杂和昂贵的设备，操作流程简单，有利于推广使用。
附图说明
图1：不同浓度镁离子对干细胞活性的影响。(a)镁离子半数抑制浓度 (IC50)曲线，IC50＝65.91mM；(b)MTT法检测不同浓度镁离子对细胞增殖影响(★★，p<0.01)。
图2：不同浓度镁离子对干细胞成骨分化的诱导作用。(a)ALP染色结果； (b)ALP半定量结果(★★，p<0.01)；(c)Weternblot检测干细胞骨钙蛋白 (osteocalcin，OCN)表达情况；(d)干细胞OCN免疫荧光染色结果。
图3：不同浓度镁离子诱导干细胞镁离子通道MagT1的表达变化。(a) 成骨诱导后干细胞MagT1qPCR结果；(b)成骨诱导后干细胞MagT1、OCN 免疫荧光双染；(c)不同浓度镁离子诱导后干细胞MagT1qPCR结果；(d)不同镁离子诱导后干细胞MagT1免疫荧光染色。
图4：培养3天后不同尺寸微球内干细胞活死染色结果(绿色表示活细胞，红色表示死亡细胞)。
图5：高镁微环境对微球内干细胞活性的影响。(a)培养1天、3天时微球内干细胞活死染色结果；(b)CCK8法检测微球内干细胞存活情况。
图6：EdU染色检测高镁微环境微球内干细胞增殖活力。(a)高镁微环境干细胞微球冰冻切片后EdU染色结果(红色为EdU阳性细胞，蓝色为细胞核，粉色为EdU真阳性细胞)；(b)微球干细胞载体内干细胞增殖率(★★，p<0.01)。
图7：高镁微环境微球内干细胞成骨分化的qPCR检测结果。(a)培养3 天时，微球内干细胞runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx 2)表达情况；(b)培养7天时，微球内干细胞OCN表达情况(★★，p<0.01)。
图8：为高镁微环境干细胞微球载体修复大鼠颅骨临界骨缺损实验结果， (a)X线及CT三维重建图，(b)CT扫描分析各组BV/TV结果，(c)CT扫描分析各组BMD结果(★★，p<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
实施例1.镁离子对大鼠骨髓干细胞毒性检测
步骤一、大鼠骨髓干细胞的分离培养
取3至4周龄Sprague Dawley大鼠，断颈处死后，将大鼠尸体浸泡在75％酒精溶液中消毒3分钟。消毒完成后在超净台中进行骨髓间充质干细胞的获取。在大鼠腹股沟处剪开皮肤，钝性分离下组织暴露胫骨及股骨。用剪刀在膝关节处减断，取出胫骨及股骨，将骨表面的肌肉等软组织剔除干净，并剪去胫骨两端骺；用注射器吸取适量DMEM完全培养液，将注射器针头插入骨髓腔，用 DMEM培养液冲洗的同时上下提拉，保证将骨髓腔内容物冲出至离心管中用，培养液冲洗至长骨颜色发白时即可。将收集到的骨髓腔冲洗液在离心机内按1500rpm-1800rpm，离心10分钟；弃上清后用培养液重悬细胞沉淀，均匀接种至10cm培养皿中，37℃恒温培养箱中培养；3-4天后观察、换液，细胞长至80％融合度时进行传代。试验中使用第2代至第4代骨髓干细胞。
步骤二、镁离子IC50的测定
取大鼠骨髓间充质干细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中(n＝6)，待细胞长满，更换含不同浓度镁离子的DMEM完全培养液100μL(Mg离子浓度为1.6mM；2.5mM；5mM；10mM；20mM；40mM；60mM；80mM；以正常DMEM完全培养液为对照)。24h后，避光，向每个孔中加入MTT反应液10μL，小心混匀后将96孔板放回细胞培养箱中继续培养4h，此时可见孔底出现紫色结晶。吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min后，见紫色结晶全部溶解后检测490nm处吸光，以实验组OD值与对照组比较，计算细胞存活率，使用GraphPadPrism 5.0软件绘制镁离子IC50 曲线，实验结果见图一(a)，镁离子浓度在20mM以内时，细胞活性无明显影响，超过20mM后，细胞活性明显下降，IC50浓度为65.91mM。
实施例2.镁离子对细胞生物活性影响
步骤一、不同浓度镁离子对细胞增殖的影响
按照实例1中筛选的镁离子浓度，配置镁离子浓度分别为1.6、2.5、5、10、 20mM的DMEM完全培养液备用，取大鼠骨髓干细胞，以1000个/孔的密度接种于96孔板中(n＝6),待细胞贴壁后，更换100μL高镁培养液，以正常DMEM 完全培养液为对照组，此时记为第0天。于第1、4、7天时，毎孔加入10μl MTT 液，孵育4小时后吸去板内原有液体，毎孔加入150μlDMSO,振荡10min，使结晶充分溶解。酶标仪检测吸光度值，分析细胞增殖情况。
实验结果见图一(b)，高镁离子浓度组与对照组相比，在第1、4天时细胞增殖活力没有明显差异，到第7天时，高镁离子浓度各组细胞的增殖活力要强于对照组(图一(b))。以上结果说明，在高镁离子浓度环境中有利于间充质干细胞的增殖。
步骤二、碱性磷酸酶(ALP)染色及碱性磷酸酶半定量检测
取细胞以5×104个/mL密度接种于24孔板中，细胞汇合后更换含不同浓度镁离子的DMEM完全培养液。7天后，吸去培养液用PBS洗涤3遍后，用4％多聚甲醛固定后，PBS洗涤3遍，用BCIP/NBT碱性磷酸酶试剂盒配制染色液进行染色。在孔板中加入ALP活性半定量裂解液，在37℃孵育至细胞裂解完全，将样本与p-NPP工作液按1:1比例混合于37℃孵育后，检测405nm处吸光度。另用BCA法测量各样品蛋白浓度，根据体积计算蛋白质质量。ALP 半定量活性＝OD405/蛋白质量。
实验结果见图二(a)、(b)，通过ALP染色发现，镁离子浓度在2.5mM-10 mM，ALP染色阳性细胞数量与对照组相比有增加，其中以2.5mM和5mM 最为明显。ALP活性半定量检测发现，2.5mM组、5mM组的ALP活性相对于对照组有显著差异，而5mM效果最佳。这说明镁离子浓度在2.5mM-10mM 具有一定促干细胞成骨分化效果，其中镁离子浓度在2.5mM-5mM时促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化效果最佳。
步骤三、Westernblot检测镁离子刺激下干细胞成骨相关蛋白表达情况
取细胞以1×106个/mL密度接种于10cm培养皿中，细胞融合后，根据ALP 半定量结果，加入2.5mM和5mM的高镁培养液。7天后，收集蛋白样本， BCA法检测上清蛋白浓度，调整样品蛋白使得上量一致。行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭1h。OCN抗体按1:200稀释、磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体按1:5000稀释，一抗4℃下孵育过夜。PBST洗涤3遍，二抗(稀释比例)室温孵育1h 后PBST洗3遍，显影。
实验结果见图二(c)，比之正常培养液，2.5mM与5mM组OCN表达量明显提高，其中5mM组提高更为明显，与ALP染色及半定量结果一致。
步骤四、免疫荧光染色检测
取细胞以5×105个/mL密度接种于玻底皿中，细胞贴壁后即更换为不同浓度镁离子的DMEM完全培养液。培养5天后将玻底皿内的旧有细胞培养液吸除干，用PBS缓冲液润洗3遍。4％多聚甲醛固定后，进行免疫荧光染色检测细胞OCN的表达情况。OCN抗体稀释比例为1:50；二抗稀释比例为1：:200。染色完毕后，用罗丹明标记鬼笔环肽(稀释比例1:200)染色30min后，PBS 缓冲液洗涤后，用DAPI(1:500)染核5分钟。在荧光显微镜下观察并拍摄照片。
实验结果见图二(d)，2.5mM与5mM组的干细胞其OCN表达量皆高于对照组且以5mM组为甚。以上结果皆说明高镁环境具有促进干细胞成骨分化的作用。
实施例3.不同浓度镁离子诱导干细胞镁离子通道MagT1表达变化的检测
步骤一、成骨诱导后干细胞MagT1表达变化检测
取融合度达90％以上的大鼠骨髓干细胞，消化离心后计数，接种于6孔板和共聚焦小皿中，待细胞融合度达到80％时，更换成骨诱导液(赛业生物提供)，同时以正常DMEM培养液为对照(n＝3)，进行成骨诱导。诱导3天、5天后收样，进行qPCR检测及免疫荧光检测，其中免疫荧光染色方法同前述；qPCR 样本则先加入trizol 1mL裂解细胞，收集各组样品的总RNA,紫外分光光度计 260nm和280nm下测定提取RNA的浓度及纯度，根据逆转录试剂盒说明，合成cDNA。之后进行PCR检测MagT1的表达。以管家基因GAPDH作为内参。 CT值代表Real-time PCR结果，根据公式：2-△△CT计算出基因的相对表达量。
实验结果见图三。如图三(a)所示，成骨诱导5天后MagT1表达显著升高；图三(b)显示，成骨诱导5天干细胞OCN与MagT1表达皆升高。此提示MagT1与干细胞成骨分化有关，可作为干细胞成骨分化的间接评估指标。
步骤二、不同浓度镁离子诱导后干细胞MagT1表达情况
配置浓度为1.6mM；2.5mM；5mM；10mM；20mM；40mM；60mM 的高镁培养液，并以正常DMEM完全培养液为对照。取生长状况良好的大鼠骨髓干细胞，消化离心，接种于培养皿中；待细胞长满后更换高镁培养液(n＝3)， 5天后收样，进行qPCR检测和免疫荧光染色。
结果如图三所示，图三(c)中可知，2.5mM及5mM镁离子浓度下干细胞MagT1表达明显上调，图三(d)免疫荧光染色结果与qPCR结果一致，说明在2.5mM-5mM浓度下镁离子促成骨分化效果最佳。
实施例4.不同尺寸干细胞微球载体制备及细胞存活评估
步骤一、不同尺寸干细胞微球载体的制备
取融合度达90％以上的大鼠骨髓干细胞，消化离心后培养液重悬计数，与高温高压消毒的4％海藻酸钠溶液以1:1-3:1比例均匀混合，调整细胞密度在 5×106—107/ml后，微量加样器吸取，以0.1M CaCl2为交联剂，注射器针头内径为150μm，控制针头与CaCl2液面距离在1mm以内，将水凝胶-细胞混合液滴入CaCl2中交联3min，液滴体积控制在0.4μL以内。弃CaCl2，生理盐水洗 3遍后，加入DMEM完全培养液，镜下观察可见微球直径在500μm左右(见图四)。以内径在500μm左右的针头制备大尺寸微球，镜下观察微球尺寸在 1-2mm(见图四)。将制备的干细胞微球载体置于24孔板中，37℃恒温培养箱培养。
步骤二、活死染色检测微球载体中干细胞存活情况
步骤一中制备的不同尺寸微球在培养3天后，使用Calcein-AM/PI活死染色试剂盒染色，共聚焦显微镜检测，重建后分析细胞存活情况。
微球尺寸大小与针头内径(在实验所选范围内可形成复合尺寸，过大则微球大，过小挤压难度大，细胞受压后难存活)、液滴距液面距离(与微球形态有关，距离越高微球形态偏椭圆而非圆)、液滴体积有关。
实验结果见图四，活死染色后，活细胞在镜下将发绿色荧光，死细胞则显示红色荧光，由图可知培养3天后，随着直径的增大死细胞逐渐增多，2mm 微球中细胞死亡率接近50％，而500μm微球中则鲜有细胞死亡，细胞存活率比之大尺寸组显著提高，提示500μm或更小，理论上为100μm-500μm为当前实验条件下微球载体最佳尺寸。
实施例5.不同浓度高镁干细胞微球载体的制备及细胞存活评估
步骤一、不同浓度高镁干细胞微球载体的制备
根据实施例2结果，选取镁离子浓度为2.5mM和5mM为实验组，取融合度达90％以上的大鼠骨髓干细胞，消化离心后用不同浓度高镁培养液重悬计数(正常DMEM对照)，与高温高压消毒的4％海藻酸钠溶液以1:1-3:1比例均匀混合，调整细胞密度在5×106-107/ml，镁离子终浓度在2.5mM与5mM。制备500μm左右微球若干(方法同实施例4)，加入正常DMEM培养液37℃恒温培养。
步骤二、微球内细胞存活评估
取培养1天、3天的不同高镁微环境微球载体，行活死染色，共聚焦显微镜显像。结果见图五(a)，高镁组在培养1天时少见细胞凋亡，3天时细胞凋亡略增加，但与对照组无明显差异。
取培养0天、1天、3天的各组微球各50μL(n＝3)，加入至55mM柠檬酸钠的生理盐水溶液中，37℃摇床反应5—10min，待海藻酸钠微球完全降解后，3000rpm离心5min，弃上清后培养液重悬，接入96孔板中。待细胞贴壁后，换100μL培养液，每孔加入10μL CCK8工作液，避光37℃孵育1.5h。吸上清后，酶标仪检测450nm处OD值，GraphPad Prism 5.0软件分析计算细胞存活率。实验结果见图五(b)，高镁组细胞存活率与对照组无明显差异，3 天时存活率稍降，但仍在90％左右。
实施例6.高镁微环境对微球载体内干细胞生物活性影响
步骤一、高镁微环境干细胞微球载体的制备
根据实施例2、5结果，选取镁离子终浓度为5mM。微球制备方法见实施例4。
步骤二、微球载体内干细胞增殖情况检测
配置浓度为5mg/mL的EdU溶液，以1:1000比例稀释加入培养液中，孵育24h后，取培养1天、3天、7天的微球行冰冻切片(n＝3)，层厚5μm，95％乙醇固定30min后，流水冲洗5min，2mg/mL甘氨酸溶液洗10min，0.5％triton 溶液通透10min，PBS缓冲液洗涤10min，EdU染色液避光室温孵育30min， 0.5％triton溶液洗涤两次，每次10min，PBS缓冲液洗涤10min。DAPI染核5 min，荧光显微镜观察，EdU阳性(粉色细胞)为增殖细胞。Image J软件统计分析。
实验结果见图六，如(a)所示，培养1天时，微球内细胞增殖较少，随时间增加，增殖细胞比例逐渐增加，第7天时增殖细胞比例明显上升，同时5 mM组比之对照组，细胞增殖更为活跃，提示高镁微环境可促进微球内干细胞增殖。
步骤三、微球内干细胞成骨分化情况检测
取培养3天、7天干细胞微球各50uL(n＝3)，柠檬酸钠溶液溶解后，离心后去上清，加入trizol 1mL裂解细胞，收集各组样品的总RNA,检测相关基因的表达。紫外分光光度计260nm和280nm下测定提取RNA的浓度及纯度，根据逆转录试剂盒说明，合成cDNA。之后进行PCR检测成骨相关基因Runx2、 OCN的表达。以管家基因GAPDH作为内参。CT值代表Real-timePCR结果，根据公式：2-△△CT计算出基因的相对表达量。
实验结果显示3天时5mM组Runx2表达明显高于对照组(图七(a)★★，p<0.01)，7天时，OCN在5mM组表达明显高于对照组(图七(b)★★，p<0.01)。提示高镁微环境对干细胞成骨分化有诱导作用。
实施例7.高镁微环境干细胞微球在修复大鼠颅骨临界骨缺损中的作用效果
步骤一、高镁微环境干细胞微球载体的制备
根据实例2、5、6结果，选取镁离子终浓度为5mM；根据实例4结果，制备尺寸在500μm的干细胞微球，制备方法见实例4，记为SA-Mg/BMSCs 组；以普通DMEM培养液悬浮大鼠骨髓干细胞制备同尺寸微球，记为 SA-BMSCs组；选取镁离子终浓度5mM，制备海藻酸钠微球，记为SA-Mg 组，同时海藻酸钠凝胶微球为空白对照组，记为SA组。
步骤二、大鼠颅骨临界骨缺损的制备
取6-8周龄Sprague Dawley大鼠，称重，以4μL/g体重剂量注射10％水合氯醛溶液进行麻醉。待大鼠夹腿反射及角膜反射消失后，剃毛，75％酒精消毒颅顶手术区，沿颅中缝作矢状切口至骨膜，骨膜剥离子分开骨膜，沿颅中缝两侧制备5mm直径圆形骨缺损。
步骤三、干细胞微球载体的植入
纱布止血，巴氏管吸取高镁干细胞微球载体(SA-Mg/BMSCs组)，滴至缺损区，用镊子将微球分铺均匀，将骨膜拉拢，辅助微球固位，依次缝合骨膜皮肤，再次消毒术区，观察大鼠呼吸与神态，确认大鼠状态平稳，做好标记后放回鼠笼。同法植入SA-BMSCs组、SA-Mg组及SA组，各组微球体积均为50μ L，每组样本量n＝6。
步骤四、大鼠颅骨临界骨缺损的修复效果评估
术后四周，大鼠安乐死，取颅骨标本固定于福尔马林固定液中；固定后行 X线影像学检测(结果见图八)；随后使用microCT检测新骨形成情况，分析各组骨形成效果。
实验结果见图八，由图八(a)可知，SA组骨修复效果最差，留有大量缺损，而SA-Mg组与SA-BMSCs组相较而言皆有部分新骨形成，二者差异不大； SA-Mg/BMSCs组新骨再生较其他三组显著增加，修复效果最为显著。由图八 (b)可知，BV/TV(％)，SA-Mg/BMSCs组＝32.425±4.337，SA-BMSCs组＝18.148 ±3.911，SA-Mg组＝14.005±2.864，SA组＝3.492±1.103；由图八(c)可知， BMD(mgHA/cc),SA-Mg/BMSCs组＝344.690±51.246；SA-BMSCs组＝213.863 ±35.839，SA-Mg组＝180.706±25.860，SA组＝85.622±22.522；综上可知， SA-Mg/BMSCs组新生骨量显著高于其他组。
综上所述，镁离子浓度20mM以内时，细胞毒性较小，且对细胞增殖具有促进作用，镁离子浓度在2.5mM-10mM以内时，具有成骨诱导作用；镁离子浓度在2.5mM-5mM时，诱导干细胞成骨向分化效果最佳；在此基础上，构建高镁微环境干细胞微球载体，在微球尺寸为500μm时，细胞存活率高，增殖活力良好，且在局部高镁的刺激下具有更强的成骨分化能力。将该干细胞微球载体用于骨缺损修复时，在局部高镁环境的刺激下干细胞分化能力提高，比之对照组新骨形成量显著提升，达到促进骨再生的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如负载含镁颗粒以达到缓释镁离子目的以及扩大标记细胞结合镁离子的应用范围或应用于其他研究，以及使用其它已知的水凝胶同样可以达到维持局部高镁微环境的体系，如透明质酸、丝蛋白、壳聚糖、明胶、胶原、环糊精等常用水凝胶，还包括用于其他组织再生修复或用于体外微组织构建和相关研究等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用于骨再生的高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，将镁离子复合入微球载体中形成局部高镁环境，所述微球载体的尺寸为100μm-500μm，所述微球载体所含的所述镁离子的浓度为2.5mM-10mM；所述微球载体负载成骨相关干细胞，所述成骨相关干细胞为骨髓间充质干细胞，所述骨髓间充质干细胞的密度为5×106-107/ml；所述局部高镁环境促进所述骨髓间充质干细胞成骨向分化；所述高镁微环境骨髓干细胞微球载体滴至骨缺损区，以用于骨缺损再生修复；
所述微球载体含有海藻酸钠凝胶，所述海藻酸钠凝胶的终浓度在1％-2％。
2.根据权利要求1所述的一种用于骨再生的高镁微环境骨髓干细胞微球载体，其特征在于，所述镁离子的浓度为2.5mM-5mM。
3.一种用于骨再生的高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)、成骨相关干细胞的获取与培养；所述成骨相关干细胞为骨髓间充质干细胞；
(2)、将步骤(1)得到的成骨相关干细胞消化离心后，用高镁培养液重悬，所得细胞悬液与海藻酸钠凝胶混合，使用注射器，滴入交联剂中得到载细胞微球，所述载细胞微球的直径为100μm-500μm，所述载细胞微球所含的所述镁离子的浓度为2.5mM-10mM；
所述载细胞微球中的所述成骨相关干细胞的密度为5×106-107/ml，所述注射器的针头内径为150μm—180μm，使用微量加样器滴加细胞-凝胶混合液，液滴体积在0.4μL以内，针头距所述交联剂的液面在1mm以内；步骤(2)使用的所述海藻酸钠凝胶在成胶后，海藻酸钠凝胶的终浓度在1％-2％；
所述交联剂为CaCl2，SrCl2或者BaCl2中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种高镁微环境骨髓干细胞微球载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)镁离子浓度为2.5mM-5mM。
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