CN111195254B

CN111195254B - Lpa2及其激动剂的应用

Info

Publication number: CN111195254B
Application number: CN202010118137.2A
Authority: CN
Inventors: 陈曦; 胡盛寿; 裴建秋; 丛祥凤; 蔡琳; 王芳; 白睿峰
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-02-25
Also published as: CN111195254A

Abstract

本发明公开了LPA2及其激动剂的应用，涉及生物医学技术领域。本发明公开的LPA2(溶血磷脂酸受体2亚型)或其激动剂的用途，该用途选自如下至少一种：(1)用于制备治疗或预防缺血性疾病的药物；(2)用于制备治疗或预防具有血管渗漏症状的疾病的药物。本发明为治疗或预防缺血性疾病及其他血管渗漏引起的疾病，提供了一种新的药物和治疗思路。

Description

LPA2及其激动剂的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及LPA2及其激动剂的应用。

背景技术

心脏疾病是全世界范围内导致成人死亡的最主要原因，我国心血管病患人数约2.9亿，且心血管病死亡占居民疾病死亡构成40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是最严重的急性心血管病之一，它是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，可导致严重心律失常、心源性休克、心力衰竭等，甚至死亡。当下的心血管药物治疗、介入治疗和外科手术治疗等干预手段虽然能通过恢复梗死及周边区的血流使得缺血心肌组织得到一定程度的修复，但就远期效果来看，仍有相当一部分患者修复效果并不理想，最终发生心力衰竭。通过促进血管新生提高梗死及周边区心肌组织血供是另一种被广泛关注且不容忽视的损伤心肌修复策略。

对于缺血组织，机体自身会通过新生血管来恢复血供。血管新生即通过刺激心肌缺血区小血管生长，实现心肌缺血区的自我搭桥，从而建立缺血心肌的侧支循环，改善心肌缺血区的血流状况。血管新生主要包括微血管生成、小动脉形成和大血管形成。在心肌缺血或心肌梗死的早期，一方面毛细血管密度会增加，大量的毛细血管生成，另一方面坏死的心肌细胞诱导许多细胞因子及生长因子的表达，最终形成正常的动脉。大量生成的毛细血管和新生的小动脉在瘀阻和狭窄的冠状动脉周围形成侧支循环，生成新的血流通路，从而改善心肌缺血状态，在心肌再生中发挥重要作用。早在20世纪70年代，医学家Folkman就提出了血管生成的概念，此后，研究血管新生成为治疗缺血性疾病的最前沿的科学。然而，天然的血管生成系统往往是滞后的，并且不能够应对大范围的组织缺血性损伤。此外，内皮细胞作为血管内膜，对于血管稳态维持具有重要作用。内皮功能受损可导致血管通透性的改变，而血管通透性的过度增加使得血管发生渗漏，是引起器官衰竭，导致休克和死亡的重要原因。因此，我们需要进一步探索AMI后血管新生以及早期血管稳态维持的机制，寻找潜在治疗靶点。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供LPA2及其激动剂的应用。

本发明是这样实现的：

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是一种结构最简单的水溶性甘油磷脂分子，通过其特异性受体发挥生物学功能。目前已确定至少有六种溶血磷脂酸受体(LPA1-LPA6)，均属于G蛋白偶联受体家族，溶血磷脂酸受体2亚型(LPA2)便是其中的一种。

本发明发明人首次发现，LPA2及其激动剂具有治疗或预防缺血性疾病以及血管渗漏引起的疾病的潜能，基于此，提出本发明。

第一方面，本发明提供了LPA2或其激动剂的用途，上述用途选自如下(1)-(2)中的至少一种：

(1)用于制备治疗或预防缺血性疾病的药物；

(2)用于制备治疗或预防具有血管渗漏症状的疾病的药物。

本发明的研究显示，LPA2或其激动剂在急性心梗早期可以维持血管稳态，降低血管通透性改变引起的渗漏导致急性休克甚至死亡的发生。此外，还可以促进血管新生，修复损伤心肌，可显著减小心梗面积(12.8％)，并显著提高心梗后心功能(LVEF增加近50％)，效果明显。

因此，LPA2及其激动剂可以用于制备治疗或预防缺血性疾病以及因血管渗漏引起的疾病的药物或制剂等领域中，为缺血性疾病以及具有血管渗漏症状的疾病，提供了一种新的药物和治疗思路。

在可选的实施方案中，上述缺血性疾病为缺血性心脏病。

在可选的实施方案中，上述缺血性心脏病为急性心肌梗死或缺血性心力衰竭。

在可选的实施方案中，上述缺血性疾病为血管性病变疾病。

在可选的实施方案中，上述血管性病变疾病为下肢缺血性疾病。

在可选的实施方案中，所述具有血管渗漏症状的疾病包括因血管渗漏引起的器官衰竭导致的休克或脓毒血症。

在可选的实施方案中，LPA2或其激动剂通过如下方式(a)-(j)中的一种或几种起到治疗或预防缺血性疾病或血管渗漏引起的疾病的效果：

(a)促进内皮细胞增殖；

(b)抑制内皮细胞凋亡；

(c)改善内皮细胞活力；

(d)修复内皮细胞损伤；

(e)提高内皮细胞成管能力；

(g)提高心肌血管密度；

(h)防止梗死部分纤维化；

(i)提高腓肠肌血管密度；

(j)维持血管稳态，降低血管渗漏。

本发明的研究进一步显示，LPA2或其激动剂具有如下作用：促进内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、改善内皮细胞活力、修复内皮细胞损伤、提高心肌间血管数量、提高心肌间血管密度、防止梗死部分纤维化、提高腓肠肌间血管数目以及提高血管通透性，通过这些作用方式，LPA2或其激动剂可以用于治疗或预防缺血性疾病或具有血管渗漏症状的疾病。

在可选的实施方案中，上述激动剂为LPA2的特异性激动剂；

在可选的实施方案中，上述激动剂为溶血磷脂酸。

本发明的研究显示，使用溶血磷脂酸可以促进内皮细胞增殖。

需要说明的是，根据本发明的内容，本领域技术人员容易想到采用其他的特异性激动剂来治疗或预防缺血性疾病或血管渗漏引起的疾病。

在可选的实施方案中，上述特异性激动剂为DBIBB。

DBIBB，英文名称2-(N-(4-(1，3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)butyl)sulfamoyl)benzoic acid其分子式为C23H20N2O6S，分子量为452.5，化学结构式如下：

本发明的研究显示，通过使用LPA2的特异性激动剂如DBIBB可以对心梗后血管稳态以及心功能产生积极作用，如提高心功能、降低梗死面积、提高心肌血管密度或明显降低血管通透性等。

需要说明的是，基于本发明的内容，本领域技术人员容易想到采用其他LPA2的特异性激动剂来治疗或预防缺血性疾病或血管渗漏引起的疾病。

再一方面，本发明还提供LPA2或其激动剂的另一用途，该用途选自如下(a)-(j)中的如下至少一种：

(a)用于制备促进内皮细胞增殖的制剂或药物；

(b)用于制备抑制内皮细胞凋亡的制剂或药物；

(c)用于制备改善内皮细胞活力的制剂或药物；

(d)用于制备修复内皮细胞损伤的制剂或药物；

(e)用于制备提高内皮细胞成管能力的制剂或药物；

(f)用于制备提高心肌间血管数量的制剂或药物；

(g)用于制备提高心肌血管密度的制剂或药物；

(h)用于制备防止急性心肌梗死状态下梗死部分纤维化的制剂或药物；

(i)用于制备提高下肢缺血性疾病状态下腓肠肌血管密度的制剂或药物；

(j)用于制备提高血管稳态，抑制血管渗漏的制剂或药物。

在可选的实施方案中，上述激动剂为LPA2的特异性激动剂。

在可选的实施方案中，上述特异性激动剂为DBIBB。

再一方面，本发明还提供一种药物，其具有如下用途(1)-(2)中的任意一种：

(1)用于制备治疗或预防缺血性疾病的药物；

(2)用于制备治疗或预防具有血管渗漏症状的疾病的药物；

上述药物含有：治疗有效量的LPA2或其激动剂。

在可选的实施方案中，上述激动剂为LPA2的特异性激动剂。

在可选的实施方案中，上述特异性激动剂为DBIBB。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的溶血磷脂酸受体2亚型(LPA2)缺失对成年小鼠心梗后4周存活率以及心功能的影响。

图中：A为小鼠动物实验规划图；

B为小鼠心梗后4周存活曲线，可见LPA2缺失小鼠存活率显著低于野生型小鼠；图中：实线代表野生型(WT)小鼠存活曲线，虚线代表LPA2缺失(KO)小鼠的存活曲线，即LPA2的缺失可以引起小鼠心梗后早期的死亡率增加；

C-D为本发明实施例中的LPA2缺失(以KO表示)对成年小鼠心梗后心功能的影响；术后8周，LPA2缺失小鼠心功能较野生鼠显著降低(C为左室短轴M型超声代表图，sham表示假手术组，MI代表心梗手术组；D为LPA2缺失小鼠术后8周(8wpM)左室射血分数(LVEF)，以及左室短轴缩短率(LVFS)，二者是评价心功能的重要指标)；

E-F为本发明实施例中的LPA2缺失对成年小鼠心梗后8周心肌梗死面积的影响(图中：E为Masson染色显示梗死面积的代表图；F为梗死面积以及梗死壁厚计算结果，梗死面积的计算方法为：(梗死内径+梗死外径)/(左心室内径+左心室外径)；

G-H为本发明实例中小鼠心梗后8周心脏天狼猩红染色，显示心肌纤维化程度，结果显示LPA2缺失小鼠心梗后心肌纤维化程度较野生型小鼠加重(G是天狼猩红染色代表图；H为统计结果)；以上结果表明LPA2缺失可以引起小鼠心梗后死亡率升高，心功能下降，心脏恶性重构加重。

图2为本发明实施例中的LPA2缺失对成年小鼠心梗后梗死周边区新生血管密度的影响；结果显示LPA2缺失小鼠(KO)心梗后心肌中血管密度较野生鼠显著降低；图中：A为血管内皮细胞标志物vWF免疫荧光染色代表图，DAPI为细胞核染色；B血管内皮细胞标志物CD31免疫荧光染色代表图，DAPI为细胞核染色为染色结果；此时炎症细胞如单核巨噬细胞和中性粒细胞浸润也较野生鼠有升高趋势，C中CD68为巨噬细胞标志物，D中Ly6G为中性粒细胞标志物。

图3为本发明实施例中的LPA2缺失对新生乳鼠心梗后心脏再生的影响；结果表明LPA2缺失可阻碍乳鼠再生，且心肌间血管密度显著降低；图中：A为心脏再生情况比较Masson染色，B为心功能M型超声代表图，C为梗死面积大小统计结果，D为左室射血分数(LVEF)心功能统计结果，E为血管CD31标志分子免疫组化染色，F为CD31免疫组化染色统计值。

图4为本发明实施例中的LPA2缺失对血管新生能力的影响，结果揭示了LPA2缺失后，可以通过降低血管新生能力影响小鼠下肢血流恢复，体外细胞实验也表明LPA2缺失后内皮细胞成管能力以及迁移能力均较野生型内皮细胞显著下降；图中：A为多普勒检测小鼠下肢缺血后不同时间点血流情况代表图及为血流情况统计图；B为术后14天腓肠肌间血管密度的CD31染色代表图及血管密度统计图；C为分离自野生(WT)和LPA2缺失(KO)的原代内皮细胞体外成管实验代表图及成管数目及长度的统计值；D为WT和KO原代内皮细胞迁移实验代表图及统计图。

图5为本发明实施例中的LPA2缺失引起小鼠心梗后早期损伤的探索实验。结果提示LPA2缺失使得血管通透性增加，导致小鼠心梗后早期损伤范围增加，急性心功能衰竭，可能为其早期急性死亡升高的原因；图中：A为实验检测时间安排；B为左室短轴M型超声代表图及心梗后2天左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)的统计值；C为心梗后1天TTC染色，其中深色区域为存活心肌，白色部分为缺氧损伤区域，以及损伤区域统计值；D为外周血乳酸脱氢酶(LDH)含量变化，LDH含量越高代表心肌损伤越严重；E为心梗后3天心肌组织凋亡检测TUNEL染色，其统计结果显示KO小鼠心梗后心脏组织细胞凋亡增加；F为术后3天尾静脉注射70kD FITC-Dextran后小鼠心肌间渗漏情况代表图，以及荧光强度统计值。血管通透性升高，则心肌组织间FITC-Dextran含量增加；G为Evans blue显示小鼠心梗后心脏血管渗漏的检测统计图；H-I为分离的原代野生及LPA2缺失型内皮细胞在缺氧刺激下细胞的凋亡及活性检测结果：H图表示Annexin V/PI染色流式检测细胞凋亡显示KO型内皮细胞凋亡比例较野生型显著增加；I图表示KO型内皮细胞活性也显著低于WT型内皮细胞。

图6为本发明实施例中的LPA刺激对内皮细胞增殖的影响。结果显示LPA2的缺失可使得内皮细胞对LPA刺激引起的增殖现象消失(纵坐标为细胞增殖情况，横坐标为不同浓度LPA；#和&代表分别于无LPA以及相同浓度LPA刺激下与KO组比较差异，均为p<0.0001)。

图7为本发明实施例中携带Lpar2基因的腺病毒Ad-Lpar2介导的LPA2过表达处理对小鼠心梗后心功能和梗死面积大小的影响，以及对心脏组织血管新生的影响；结果表明LPA2过表达可以降低小鼠心梗后的恶性重构，改善心功能；图中：A为梗后4周心脏梗死情况的示意图和统计值；B为心梗后4周心功能检测的M型超声示意图和统计值；C为心梗后7天心肌间血管密度CD31免疫荧光染色示意图和统计值；D为心梗后4周心肌间血管密度CD31免疫荧光染色示意图和统计值。

图8为本发明实施例中LPA2特异激动剂DBIBB处理对小鼠心梗后心功能和梗死面积大小的影响，以及DBIBB处理后早期存活和心脏组织血管通透性变化；结果表明LPA2激动剂DBIBB可以降低小鼠心梗后的恶性重构，改善心功能，且在心梗后早期具有降低血管通透性，维持血管稳态，改善早期因心功能衰竭引起死亡率增加的情况；图中：A为DBIBB和对照control组心梗后早期存活曲线；B为梗后4周心脏梗死情况的示意图和统计值；C分别为心梗后4周心功能超声检测的示意图和统计值；D为心梗后4周心肌间血管密度CD31免疫荧光染色示意图和统计值；E为心梗后3天心肌组织凋亡检测TUNEL染色，显示DBIBB处理可以保护心脏组织，降低心肌细胞凋亡；F为FITC-Dextran渗漏代表图以及荧光强度统计图，表明DBIBB处理可以改善心梗后血管通透性，降低心脏损伤。

图9为本发明实施例8中LPA2缺失对LPS诱导小鼠脓毒症损伤后各脏器血管通透性的相对变化检测结果，图中：A为心脏组织(Heart)，B为肝脏组织(Liver)，C为脾组织(Spleen)，D为肺组织(Lung)，E为肾组织(Kidney)。

图1-图9中：ns表示无差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

LPA2缺失对小鼠心梗后心功能和梗死面积的影响

(1)成年小鼠心肌梗死模型的建立

小鼠称重记录体重后，按照400mg/kg的浓度腹腔注射三溴乙醇溶液进行麻醉(25g左右小鼠约0.2mL)；

用75％酒精对小鼠左侧胸部进行消毒，使用脱毛膏将手术视野附近毛发脱去；进行气管插管，连接呼吸机；

沿左侧肋骨平行方向左胸外部剪开皮肤，沿肌肉走形方向钝性分离各层肌肉露出肋骨，用撑开器撑开肌肉，让肋骨层暴露在视野中央；在第3-4肋间隙用精细直镊分开肌肉层，用小鼠撑开器撑开上、下肋间，暴露心脏和肺脏器官；

用精细直镊及弯镊小心拉开心包膜；用7-0带针丝线在心耳下缘1-2毫米处结扎血管，打结后可见远端左心室心肌迅速缺血变白，以此作为结扎成功的依据；

撤出撑开器至皮下肌肉层，用7-0带针丝线缝合开口后的上下肋骨，肌肉逐层覆盖后，5-0带针线缝皮；用75％酒精清洁切口及周围皮肤，将小鼠俯卧平放于温热的加热垫上，待小鼠清醒后归还于饲养笼中。

(2)实验分组和处理

a.野生小鼠假手术组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

b.LPA2缺失小鼠假手术组：取LPA2缺失小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

c.野生小鼠心梗组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，按上述方法构建心肌梗死模型。

d.LPA2缺失小鼠心梗组：取LPA2缺失缺失小鼠(该小鼠由Sanford BurnhamPrebys医学研究中心的Jerold Chun赠予，国内繁殖所得)，构建心肌梗死模型。

(3)实验方法

利用LPA2缺失小鼠和小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，于心梗后8周进行心脏超声检测心功能，超声后进行心脏取材，多聚甲醛固定48小时，脱水石蜡包埋，采用Masson染色确定梗死面积。Masson染色具体方法为：将石蜡包埋组织切片，厚约3-5μm；68℃烤片机上烤片1小时，脱蜡；2.5％重铬酸钾溶液中浸泡16小时以上；自来水冲5分钟；酸性品红染色5分钟；磷钨酸分色1-2分钟；水冲洗，滴加苯胺蓝染色约30秒，立即水洗；切片脱水透明，中性树胶封片，通风橱晾干后拍照。

(4)结果

小鼠心梗后进行4周的存活记录，于术后8周进行心脏超声，随后取材。从图1中B可以看出心梗后，LPA2缺失小鼠的死亡率显著高于野生型小鼠，且图1中C和D显示术后8周心功能也较野生型小鼠显著降低。图1中E和F中Masson染色显示LPA2缺失小鼠的左室壁梗死范围更大，且梗死壁更薄。图1中G和H天狼猩红染上色显示纤维化加重。这与其心功能降低结果一致。同样，作为血管内皮细胞标注物-vWF以及CD31染色显示LPA2缺失小鼠心脏梗死周边区心肌间血管数目下降(图2)。

实施例2

LPA2缺失对乳鼠心肌再生的影响

(1)新生乳鼠心肌梗死模型的建立

新生乳鼠出生后第二天(P2)进行手术。将乳鼠从窝中取出，与亲代隔离，在冰上进行麻醉(大约2-4分钟)；

侧卧位固定小鼠，沿左侧肋骨平行方向左胸外部剪开皮肤，让肋骨层暴露在视野中央；在第2-3肋间隙用显微剪剪开，用精细弯镊撑开上、下肋间，暴露心脏和肺脏器官；

用精细直镊及弯镊小心拉开心包膜；用7-0带针丝线在心耳下缘结扎血管，打结后可见远端左心室心肌迅速缺血变白，以此作为结扎成功的依据；

结扎完毕，用7-0带针丝线缝合开口后的上下肋骨，7-0带针线缝皮；用75％酒精清洁切口及周围皮肤，将乳小鼠俯卧平放于温热的加热垫上，待其清醒后归还于饲养笼中。

(2)实验分组和处理

同实施例1。

(3)实验方法

利用LPA2缺失乳小鼠和乳小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，于心梗后21天进行心脏超声检测心功能，超声后进行心脏取材，多聚甲醛固定24小时，脱水石蜡包埋，采用Masson染色确定梗死面积。Masson染色具体方法参照实施例1。

(4)实验结果

从图3中可以看出，新生乳鼠心梗后21天取材，Masson染色显示，LPA2缺失小鼠心肌再生能力显著下降，与野生鼠心梗后可再生，修复为正常心肌相比，LPA2缺失小鼠有纤维瘢痕组织替代(图3中A)，梗死面积显著大于野生小鼠(图3中C)。功能上，LPA2缺失乳鼠由于梗死部位纤维化，导致心功能下降(图3中B和D)，左室射血分数下降。且LPA2缺失乳鼠术后21天取材，CD31染色显示，心肌间血管数目较野生型小鼠显著降低(图3中F为CD31免疫组化染色，图3中F为血管数目统计图)。

实施例3

LPA2缺失对小鼠血管新生的影响

(1)成年小鼠下肢缺血模型的建立

成年小鼠麻醉后，脱去左右下肢处毛发，于体视镜下游离出左下肢股动脉，在股动脉分叉前段用7-0线结扎。

(2)实验分组和处理

a.野生型小鼠手术组；b.LPA2缺失小鼠手术组。以其自身右后肢为对照。

(3)实验方法

利用野生型和LPA2缺失小鼠和小鼠下肢缺血模型分别于术前，术后(0天)，4、7和14天，多普勒检测小鼠下肢血流。

(4)结果

图4中A显示LPA2缺失小鼠下肢缺血后较野生型小鼠血流恢复受到抑制，取材结扎下端腓肠肌CD31免疫组化染色显示，LPA2缺失小鼠腓肠肌间血管数目显著少于野生鼠(图4中B)。分离得野生型和LPA2缺失型原代胸腹主动脉血管内皮细胞体外培养显示，LPA2缺失使得内皮细胞成管和迁移能力下降(图4中C和D)。

实施例4

LPA2缺失通过调节血管通透性对小鼠心梗后早期存活的影响

(1)成年小鼠心肌梗死模型的建立

同实施例1中方法。

(2)实验分组和处理

a.对照假手术组：取SPF级BALb/c品系野生及LPA2缺失小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

b.手术组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)和LPA2缺失型小鼠，按上述方法构建心肌梗死模型。

(3)实验方法

利用LPA2缺失小鼠和小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，利用LPA2缺失小鼠和小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，分别于心梗后2天超声检测心功能判定是否发生心衰，心梗后3天尾静脉注射70kD FITC-Dextran或Evans blue，冰冻切片检测FITC-Dextran组织中浸润程度，甲酰胺提取Evans blue，测定其OD_620nm与OD_740nm差值，用于检测小鼠心脏组织血管通透性，以及心梗后2天进行心脏超声检测心功能。采用TTC染色判断心脏缺血损伤面积。TTC染色具体方法为：将心脏组织切片，配制1％浓度TTC，避光染色15-30分钟，拍照。

(4)结果

小鼠心梗后2天和7天进行心脏超声(图5中A)。从图5中B可以看出心梗后2天，LPA2缺失型小鼠心功能较野生型小鼠显著降低，TTC染色显示心脏损伤范围显著增加(图5中C)，心脏损伤加重(图5中D)，心肌组织细胞凋亡增加(图5中E)。FITC-Dextran和Evans blue显示LPA2缺失可引起血管通透性升高(图5中F和G)。由此，我们推测LPA2缺失是心梗后早期使得血管通透性升高，导致心脏组织水肿，急性心衰，引发急性死亡增加的原因。表明LPA2对于心梗后血管稳态的维持具有重要作用，即LPA2存在有助于降低因血管渗漏引起的组织器官衰竭导致的休克和死亡。

实施例5

LPA2缺失对血管内皮细胞增殖的影响

(1)小鼠胸腹主动脉分离

A.鼠颈椎脱臼处死，置入75％的乙醇中浸泡消毒1分钟，超净台铺无菌巾，将小鼠置操作台上并固定；

B.胸腹正中切口逐层切开，显露整个胸腹腔，于脊柱左侧找到主动脉，10倍体式显微镜下解剖主动脉弓，仔细分离动脉被膜及周围脂肪组织，切断其在胸腹腔的分支血管，完整取出胸、腹主动脉，立即放入无菌PBS培养皿中；

C.在含有PBS液的无菌容器中反复冲洗血管3～4次，再放入另一无菌培养皿中，纵行剖开血管，用显微器械将其剪成1mm×1mm大小的血管植块，将血管内面贴在6孔板上，约1cm²放1个植块。

D.37℃、5％CO₂培养箱中静置5-10min，至血管植块贴牢板底部，加入含20％FBS的ECM完全培养基，继续放入CO₂培养箱中培养。

E.60小时右观察细胞生长情况，将血管植块除去，换液1次。F.以后每2天换液1次，待细胞融合成单层铺满孔底后进行传代培养。传至第三代，利用流式鉴定内皮细胞纯度，用于后续试验。

(2)实验分组和处理

培养分别有野生型和LPA2缺失型小鼠胸腹主动脉内皮细胞。分组为：对照组，LPA刺激组，其中LPA刺激组又设不同浓度组，分别为1μM、5μM、10μM和20μM四个组别。以及正常培养和缺氧培养两组。

处理：分别配制含不同浓度LPA的培养基，每个96孔板孔加入100μl。缺氧组放入缺氧盒培养6小时。

(3)实验方法

待细胞约覆盖至90％左右，消化下传至96孔板，于培养箱培养，待细胞贴壁后，换液为无血清的基础培养基，饥饿处理24小时，使得细胞同步化。加入CCK-8培养3-4小时后测定OD_450nm，为细胞的基线水平。随后更换培养基为无或不同浓度LPA培养48小时，或者放入缺氧盒中培养6小时，再加入CCK-8培养3-4小时后测定OD_450nm，代表LPA不同浓度刺激后细胞数目以及缺氧培养下不同类型内皮细胞活性。

(4)结果

如图6中A所示，随着LPA浓度增加，野生型内皮细胞增殖在升高，而LPA2缺失的内皮细胞对LPA刺激无反应，表现出没有明显增殖的现象。同时，LPA2缺失使得内皮细胞活性减弱(图6中B)。

实施例6

Lpar2基因过表达对小鼠心梗后血管稳态以及心功能的影响

(1)成年小鼠心肌梗死模型的建立

同实施例1中方法。

(2)实验分组和处理

a.将野生型小鼠分为两组，分别注射Ad-Lpar2(表达LPA2的腺病毒载体)和对照Ad-GFP(表达GFP的腺病毒载体)。

b.手术分组：心梗手术：参照实施例1。假手术组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

c.病毒注射方式：取野生型小鼠，分别于术前由左心室室腔注入病毒，待血液循环进行1min后，再行结扎。

(3)实验方法

利用小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，于结扎前1min注入病毒。4周超声检测心功能，随后取材，Masson染色检测梗死大小。并在术后7天和4周取材检测血管新生情况。

(4)结果

从图7中可以看出心梗后，LPA2过表达小鼠梗后4周心功能检测显示LPA2过表达，可显著降低小鼠心肌梗死面积(图7中A)显著提高心功能(图7中B)和心肌间血管密度(图7中C和D)。

实施例7

LPA2特异激动剂DBIBB对小鼠心梗后血管稳态以及心功能的影响

(1)成年小鼠心肌梗死模型的建立

同实施例1中方法。

(2)实验分组和处理

a.将野生型小鼠分为两组，分别注射LPA2特异激动剂DBIBB和对照-Control：DMSO。

c.LPA2特异激动剂DBIBB给药方式：取野生型小鼠，分别于术前，术后24小时和48小时，按3mg/kg注射3次LPA2激动剂DBIBB。

(3)实验方法

利用小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，统计小鼠存活，于术后3天尾静脉注射70kD FITC-Dextran，利用冰冻切片检测FITC-Dextran组织中浸润程度用于检测小鼠心脏组织血管通透性。术后4周超声检测心功能，随后取材，Masson染色检测梗死大小。

(4)结果

小鼠心梗后3天，于取材前30分钟注射通透性检测染料FITC-Dextran或Evansblue。从图8中可以看出心梗后，DBIBB处理小鼠存活率较对照组有所改善(图8中A)，降低梗死面积(图8中B)。梗后4周心功能检测显示DBIBB处理小鼠还可显著提高心功能(图8中C)，还提高了心肌间血管密度(图8中D)。DBIBB处理野生型小鼠较对照组小鼠，心脏组织细胞凋亡水平降低(图8中E)，血管通透性明显降低(绿色荧光表示从血管中渗漏至组织间隙的染料，以渗漏出染料多少显示血管通透性能)(图8中F)。

实施例8

LPA2缺失对LPS(脂多糖(lipopolysaccharide)，一种内毒素，制备小鼠脓毒症实验动物模型的常用诱导因子)诱导小鼠脓毒症损伤后各脏器血管通透性的影响。

(1)成年小鼠脓毒症模型的建立

成年小鼠称重后，按照15mg/kg的剂量腹腔注射LPS(25g小鼠约注射0.25mL)。

(2)实验分组和处理

取SPF级Balb/c野生型小鼠和LPA2敲除小鼠，两组小鼠分别设置PBS对照组和LPS模型组。

(3)实验方法

LPS注射后24h，取存活小鼠尾静脉注射Evans Blue，30min后取材各脏器(心、肝、脾、肺、肾)，称重后置于1mL甲酰胺溶液中，55℃水浴48h，取上清离心，测定吸光度(OD_620nm和OD_740nm)。

(4)结果

图9中A-E显示LPA2缺失小鼠在LPS诱导脓毒症后较野生型小鼠各脏器血管通透性均显著升高，表明全身血管稳态的破坏。

综上，本发明实施例的研究结果表明：溶血磷脂酸或溶血磷脂酸受体2及其激动剂可以促进内皮细胞增殖和血管新生进而修复损伤心肌，可显著减小心梗面积(12.8％)，并显著提高心梗后心功能(LVEF增加近50％)，效果明显。此外，溶血磷脂酸或溶血磷脂酸受体2及其激动剂可以在病理情况下保护血管稳态，降低因血管渗漏引起器官衰竭导致休克和死亡的疾病。因此，溶血磷脂酸或溶血磷脂酸受体2及其激动剂可以用于制备治疗或预防缺血性疾病如缺血性心脏病或下肢缺血性疾病，或具有血管渗漏症状的疾病如脓毒血症或因血管渗漏可能引起器官衰竭导致休克死亡的药物或制剂等领域中，为治疗或预防心脏病例如缺血性心脏病或其他血管疾病如血管渗漏提供一种新的药物和治疗思路。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.LPA2或其激动剂的用途，其特征在于，所述激动剂为DBIBB，所述用途选自如下(1)-(2)中的至少一种：

(1)用于制备治疗或预防缺血性疾病的药物；所述缺血性疾病为缺血性心脏病或血管性病变疾病，所述缺血性心脏病为急性心肌梗死或缺血性心力衰竭，所述血管性病变疾病为下肢缺血性疾病；

(2)用于制备治疗或预防具有血管渗漏症状的疾病的药物；所述具有血管渗漏症状的疾病为脓毒血症。