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CN111195234B - 一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂 - Google Patents

一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂 Download PDF

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CN111195234B CN201811364187.8A CN201811364187A CN111195234B CN 111195234 B CN111195234 B CN 111195234B CN 201811364187 A CN201811364187 A CN 201811364187A CN 111195234 B CN111195234 B CN 111195234B
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Abstract

本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体涉及一种重组FGF21‑Fc融合蛋白冻干粉制剂。该冻干粉制剂包含重组FGF21‑Fc融合蛋白、赋型剂、稳定剂、增溶剂和缓冲剂，通过本发明的处方及冻干工艺进行冻干后得到的重组FGF21‑Fc融合蛋白稳定性较高，适合大规模生产，且利于贮藏和运输。

Description

一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂
技术领域
本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体涉及一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂。
背景技术
成纤维细胞生长因子是在发育中的组织和成体组织中表达的多肽。存在超过20种成纤维细胞生长因子的整个家族(FGF家族)。FGF家族的三个成员(包括FGF19、FGF21和FGF23)构成了一个亚家族，起着充当内分泌因子参与代谢调节的作用。
FGF21是细胞代谢的一种调节因子，其作为葡萄糖和脂质内稳态的重要代谢调节物发挥作用。通过上调GLUT1表达，FGF21促进脂肪细胞中的葡萄糖摄取，其机制不同于胰岛素。在糖尿病啮齿动物和猴子中，人FGF21降低葡萄糖空腹血清浓度，并降低甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素的空腹血清浓度。此外，在饮食诱导的肥胖啮齿类动物模型中，施用FGF21导致累计体重呈剂量依赖性丧失。因此，FGF21具有用于治疗糖尿病、肥胖、异常脂血症、代谢综合征的潜在效用。
长期的研究和临床实践表明FGF21和其他蛋白药物一样，存在稳定性差，储存期短等缺点，影响其治疗效果。专利CN107088224A公开了一种人FGF21冻干制剂，稳定性有所提高，制剂含水量较高，制剂在37℃下放置3个月，活性和纯度发生明显的变化，不能从根本上解决FGF21长期储存稳定性差的问题。
天然FGF21很难被开发成临床治疗用生物制剂，主要原因包括：1、FGF21蛋白稳定性差，易受蛋白酶水解或酶促降解；2、天然FGF21构象非常不稳定，易发生聚集，低稳定性同时也增加了FGF21在大规模生产中的难度；3、天然FGF21半衰期非常短，人FGF21在小鼠体内半衰期只有0.5-1小时，在食蟹猴体内半衰期2-3小时。多种蛋白长效化技术被报道用于延长重组FGF21的体内半衰期。例如，专利WO2005091944，WO2006050247，WO2008121563、WO2012066075公开了FGF21与PEG分子链接，增加分子量，降低肾小球滤过率，延长体内滞留时间；WO2010084169和WO2012010553公开了FGF21与脂肪酸长链融合(能够结合血清蛋白)；WO2011071783、WO2011130417，WO2012158704，WO2012170438公开了能与FGFR/FGFR/β-klotho复合物特异性的结合的激动剂抗体模拟FGF21作用机制，来激活FGF/FGFR信号通路；WO2004110472，WO2005113606，WO2009149171等公开了通过与Fc片段融合来改善FGF半衰期。
在蛋白药物长效化技术领域，Fc融合技术运用最广泛，因为他具有更小的临床副作用(例如，不易诱发过敏反应或因半衰期延长而加剧药物的毒性作用)。开发FGF21-Fc长效融合蛋白药物关键在于以下几点：其一、能否保持FGF21的生物学活性。FGF21的C-末端含有β-Klotho的结合位点，因而Fc融合于FGF21C-末端会使其活性大幅降低，而融合在N-末端能最大程度地保留它与β-Klotho的结合亲和力。故现有技术中Fc片段大多融合与FGF21N-末端(Fc-FGF21)；其二，融合Fc后能显著改善FGF21的药动学特性，有效延长其半衰期以满足临床上每周两次甚至每周一次给药的用药需求；因FGF21的C-末端还含有蛋白酶水解位点，极易发生降解，其水解代谢物的体外活性下降近200倍。据Fc-FGF21药代动力学研究结果显示，其半衰期改善并不显著，这是因为融合蛋白中FGF21的C末端暴露，不能被Fc保护，因而易受蛋白酶攻击而发生降解。其三、如何降低接头序列或引入突变位点诱发免疫反应发生的风险；其四、融合Fc和/或引入突变位点是否可以改善FGF21的稳定性及其在高浓缩状态下的易聚合性。
所以，理想的FGF21-Fc融合蛋白，一方面FGF21C-末端的抗蛋白酶水解能力增强，并且获得显著延长的半衰期；再一方面FGF21C-末端与β-Klotho的结合亲和力不会因Fc的位阻效应而明显下降，导致其活性大幅度下降；同时，融合配体及连接肽的引入还不增加其免疫源性，且还能改善其稳定性。
FGF21-Fc融合蛋白克服了野生型FGF21相关的生理学不稳定性的显著障碍。但重组人FGF21-Fc融合蛋白有容易聚集的倾向。对于FGF21-Fc融合蛋白的冻干制剂鲜有报道，因此，需要开发一种FGF21-Fc融合蛋白的制剂来满足临床用药需求。
生物冻干制品的整个冻干过程中常常会受各种应力作用直接或间接导致蛋白质药物不稳定的因素。优良的蛋白保护剂不仅能够在冻干过程中对蛋白质药物起到很好的保护作用，而且能够对成品贮藏期内的蛋白质变性起到抑制作用。目前，还没有一种通用的冻干保护剂，任何一种新药生物制剂的冻干，选择合适的冻干赋形剂都是一项极为重要的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组FGF21-Fc融合蛋白的冻干制剂，该制剂配方简单，蛋白体系稳定，便于大规模生产、贮存和运输，临床给药方便。采用本发明的处方冻干重组FGF21-Fc融合蛋白，既可以提高蛋白的玻璃转化温度，又能抑制各种组份在冻干过程中的结晶，从而提高其稳定性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种注射用重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，包括重组FGF21-Fc融合蛋白、赋型剂、稳定剂、增溶剂、缓冲剂。
所述稳定剂为右旋糖酐和精氨酸的组合物。
所述赋形剂选自海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一种。
优选地，所述赋形剂为蔗糖。
所述增溶剂为吐-80。
所述缓冲剂为Tris/HCl。
所述重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂包含如下组份：
Figure BDA0001867972010000031
优选地，所述重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂包含如下组份：
Figure BDA0001867972010000032
所述重组FGF21-Fc融合蛋白采用如下工艺制备半成品液：
称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的稳定剂、赋形剂、增溶剂和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂的冻干工艺，采用如下步骤冷冻干燥：
1)预冻：冻干样品-2℃预冻0.5-1h，降温至-40℃维持2-5h进行冷冻，
2)升华干燥：维持真空度，升温至-25℃--20℃，维持40-55h，
3)再干燥：维持真空度，升温至20-30℃，维持8-10h进行解析干燥，冻干结束。
优选地，所述的重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂的冻干工艺，采用如下步骤冷冻干燥：
1)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间10～30min达到预设温度，维持0.5-1h，再降温至-40℃，设定时间5～10min达到预设温度，维持2-5h进行冷冻；
2)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃--20℃，设定时间40～60min达到预设温度，维持40-55h，同时维持真空度0.05-0.2mBar，完成升华干燥；
3)再干燥：将隔板体系温度升温至20-30℃，设定时间80～120min达到预设温度，维持8-10h进行干燥，同时维持真空度0.1-0.3mBar，冻干结束。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明。应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。
实施例1
1)处方
Figure BDA0001867972010000041
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至7.5，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的甘露醇，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：将灌装后的重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间10min达到预设温度，维持0.5h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：抽真空至0.1mBar，将隔板体系设定温度升温至-20℃，设定时间40min达到预设温度，维持40h，同时维持真空度0.05mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至20℃，设定时间80min达到预设温度，维持8h进行解析干燥，同时维持真空度0.1mBar，冻干结束。
实施例2
1)处方
Figure BDA0001867972010000051
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.5，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的山梨醇，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间10min达到预设温度，维持5h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间60min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.2mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间120min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.3mBar，冻干结束。
实施例3
Figure BDA0001867972010000061
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的蔗糖，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
实施例4
Figure BDA0001867972010000062
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间20min达到预设温度，维持0.6h，再降温至-40℃，设定时间7min达到预设温度，维持3h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-23℃，设定时间50min达到预设温度，维持45h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至30℃，设定时间90min达到预设温度，维持9h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例1
1)处方
Figure BDA0001867972010000071
2)制备工艺：将FGF21-Fc融合蛋白用20mM，pH7.4PB缓冲液透析，随后4℃离心浓缩到6mg/mL；再将上述处方辅料用20mM PB缓冲液溶解混合，将pH调至7.4，再定容使其浓度为终浓度的两倍得辅料储液。然后将FGF21-Fc融合蛋白溶液和辅料储液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；并且蛋白溶液和辅料储液以1∶1的比例混合，使得蛋白浓度为3mg/mL，混匀后，在2～8℃条件下量取1mL溶液置于5mL西林瓶中，西林瓶半塞橡胶塞置于冻干机中冻干。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例2
1)处方：
Figure BDA0001867972010000081
2)制备工艺：将FGF21-Fc融合蛋白用20mM，pH7.4PB缓冲液透析，随后4℃离心浓缩到6mg/mL；再将上述处方辅料用20mM PB缓冲液溶解混合，将pH调至7.4，再定容使其浓度为终浓度的两倍得辅料储液。然后将FGF21-Fc融合蛋白溶液和辅料储液用0.22μm滤膜进行无菌过滤；并且蛋白溶液和辅料储液以1∶1得比例混合，使得蛋白浓度为3mg/mL，混匀后，量取1mL溶液置于5mL西林瓶中，在2～8℃条件进行。西林瓶半塞橡胶塞置于冻干机中按照下述冻干条件冻干。
3)冻干工艺：
将西林瓶置于隔板上2h，其室温和隔板温度为-40℃，膛内压力排空至70mTorr，随后隔板温度以2.5℃/min的速率从-40℃升至-20℃，并维持此温度30h后进行第一次干燥。第一次干燥结束时，隔板温度以0.3℃/min从-20℃升至24℃，并维持此温度2h做第二次干燥。第二次干燥完成后，膛室内回填干燥的氮气，然后加塞。最后西林瓶用铝盖进行密封。
对比实施例3
1)处方
Figure BDA0001867972010000082
Figure BDA0001867972010000091
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例4
1)处方
Figure BDA0001867972010000092
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，右旋糖酐，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HC1缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例5
1)处方
Figure BDA0001867972010000101
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至8.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻，
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例6
1)处方
Figure BDA0001867972010000102
2)制备工艺：配置pH至8.0的磷酸盐缓冲液，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例7
1)处方
Figure BDA0001867972010000111
2)制备工艺：配置pH至8.0的Tris缓冲液，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的葡萄糖，聚乙烯吡咯烷酮，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例8
1)处方
Figure BDA0001867972010000121
2)制备工艺：配置pH至8.0的Tris/HCl缓冲液，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的甘露醇，右旋糖酐，蛋氨酸，PEG8000和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例9
1)处方
Figure BDA0001867972010000122
Figure BDA0001867972010000131
2)制备工艺：配置pH至8.0的Tris/HCl缓冲液，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的甘露醇，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间30min达到预设温度，维持1h，再降温至-40℃，设定时间5min达到预设温度，维持2h进行冷冻；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-25℃，设定时间50min达到预设温度，维持55h，同时维持真空度0.1mBar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持10h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
对比实施例10
1)处方
Figure BDA0001867972010000132
2)制备工艺：称取处方量的Tris用适量注射用水溶解，用盐酸调整pH至7.0，取样检测pH及内毒素合格后，再准确量取处方量的海藻糖，右旋糖酐，精氨酸，吐温-80和重组人FGF21-Fc融合蛋白原液加入到Tris/HCl缓冲溶液中，混合均匀既得半成品液；将半成品液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，检测内毒素合格后灌装。
3)冻干工艺：
a)预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-45℃预冻，设定时间20min达到预设温度，维持时间为5h；
b)升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-20℃，设定时间100min达到预设温度，维持20h，同时维持真空度0.2mPar，完成升华干燥；
c)再干燥：将隔板体系温度升温至25℃，设定时间100min达到预设温度，维持5h进行解析干燥，同时维持真空度0.2mBar，冻干结束。
验证实施例
1.差示量热扫描(DSC)
采用MicroCalTM VP-Capillary DSC仪，在仪器程序控制温度下，分别测定实施例1-4和对比实施例1-10的重组人FGF21-Fc融合蛋白的半成品溶液的熔化温度Tm值。样品用对应的缓冲溶液稀释至FGF21-Fc融合蛋白浓度为1mg/mL后，取350μL样品加入到96孔板的样品孔，相应的缓冲液取350μL加入到buffer孔，扫描温度设置为20～90℃，扫描速率为60℃/hr。数据分析采用MicroCal VP-Capillary DSC自动分析软件。结果见表1。
表1、重组人FGF21-Fc融合蛋白的Tm值结果
样品 T<sub>m onset</sub>/℃ T<sub>m1</sub>/℃ T<sub>m2</sub>/℃
实施例1 41.94 64.57 73.39
实施例2 42.24 65.64 73.42
实施例3 43.88 67.12 73.48
实施例4 42.57 66.12 74.07
对比实施例1 33.37 57.20 73.07
对比实施例2 33.37 57.21 72.98
对比实施例3 35.06 58.57 73.68
对比实施例4 35.85 59.16 73.56
对比实施例5 34.18 57.91 73.68
对比实施例6 37.79 61.18 73.26
对比实施例7 36.27 60.03 73.29
对比实施例8 37.05 60.81 73.35
对比实施例9 37.57 61.72 73.94
对比实施例10 38.01 62.16 72.94
Tm值表示蛋白热转变中点温度，对于多结构域蛋白可以有多个Tm值，它是蛋白质热稳定性的重要指标，上移代表了稳定性的增强，可以用来评估寡聚体和聚集体的形成趋势。Tmonset是去折叠起始的温度，Tm1是第一个转变温度，Tm2是第二个转变温度。对比实施例1和2为现有技术的处方，表1结果显示，现有技术的Tm onset约为33.37℃，本发明Tmonset最高可达到43.88℃，与现有技术相比提高了近10℃。对比实施例3-10在改变处方后，均比本发明的Tm onset低。
2.稳定性试验
分别按照实施例1-4及对比实施例1-10制备样品三批，每批各取60瓶，采用加速稳定性试验和长期试验考察贮存稳定性。
加速试验在25℃±2℃的条件下进行，时间为12个月。所用设备能控制温度±2℃，并对实际温度进行监测。在试验期间第0个月、3个月、6个月、12个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。长期试验在2～8℃的条件下进行，分别于0个月、3个月、6个月、12个月、24个月末按稳定性重点考察项目进行检测；(水分含量测定采用梅特勒-扎利多DL37卡尔费休滴定仪按照《2015版中国药典》第三部通则中规定的库伦法来测定，纯度检查按照通则0514分子排组色谱法和通则0542毛细管电泳法测定，活性按照基于生物发光的报告基因法确定)，结果显示与0月对比均无显著性变化，且比对比实施例具有更稳定的特征，结果见表2、表3。
表2. 2～8℃长期稳定性实验结果
Figure BDA0001867972010000151
Figure BDA0001867972010000161
Figure BDA0001867972010000171
表3. 25℃加速稳定性实验结果
Figure BDA0001867972010000172
Figure BDA0001867972010000181
Figure BDA0001867972010000191
表2和表3的稳定性数据结果显示，实施例1-4的冻干制剂为白色疏松体，复溶后澄清透明，略带微乳光；水分含量小于1.00％；在2-8℃条件下保存6个月，SEC-HPLC检测的单体含量≥97.3％，基本保持不变，保存24个月单体含量≥96.7％；25℃条件下保存12个月单体含量仍能达到≥95％的效果。现有技术中对比实施例1-2在2-8℃条件下保存24个月后，单体含量分别为90.4％和90.8％，25℃条件下保存12个月单体含量分别为83.3％和86.4％，保存时间远低于本发明，对比实施例3-10改变处方冻干工艺后，冻干制剂的稳定性也均远低于本发明。

Claims (4)

1.一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，其特征在于，所述冻干粉制剂由重组FGF21-Fc融合蛋白、赋形剂、稳定剂、增溶剂和缓冲剂组成，其中所述稳定剂为右旋糖酐和精氨酸的组合物，所述增溶剂为吐温80，所述缓冲剂为Tris/Hcl，所述赋形剂选自海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一种，所述重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂包含如下组分：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂采用如下步骤冷冻干燥：
1）预冻：冻干样品-2℃预冻0.5-1h，降温至-40℃维持2-5h进行冷冻，
2）升华干燥：维持真空度，升温至-20℃~ -25℃，维持40-55h，
3）再干燥：维持真空度，升温至20-30℃，维持8-10h进行解析干燥，冻干结束。
2.根据权利要求1所述的重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，其特征在于，所述赋形剂为蔗糖。
3.根据权利要求1所述的重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂，其特征在于，所述冻干粉制剂由重组FGF21-Fc融合蛋白、赋形剂、稳定剂、增溶剂和缓冲剂组成，其中所述稳定剂为右旋糖酐和精氨酸的组合物，所述增溶剂为吐温80，所述缓冲剂为Tris/Hcl，所述赋形剂为蔗糖，所述重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂包含如下组分：
Figure 653256DEST_PATH_IMAGE002
。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂的冻干工艺，其特征在于，采用如下步骤冷冻干燥：
1）预冻：先将装有重组FGF21-Fc融合蛋白溶液的西林瓶置于冻干机隔板上，设定温度-2℃预冻，设定时间10~30min达到预设温度，维持0.5-1h，再降温至-40℃，设定时间5~10min达到预设温度，维持2-5h进行冷冻；
2）升华干燥：将隔板体系设定温度升温至-20℃~ -25℃，设定时间40~60min达到预设温度，维持40-55h，同时维持真空度0.05-0.2mBar，完成升华干燥；
3）再干燥：将隔板体系温度升温至20-30℃，设定时间80~120min达到预设温度，维持8-10h进行干燥，同时维持真空度0.1-0.3mBar，冻干结束。
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