CN111172092B

CN111172092B - sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用

Info

Publication number: CN111172092B
Application number: CN202010119666.4A
Authority: CN
Inventors: 陈谷; 刘秤利; 许白雪; 林诗琪; 周健
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-02-26
Also published as: CN111172092A

Abstract

本发明公开一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用，属于工业微生物领域。本发明通过同源重组的方法对集胞藻PCC6803中的sll0528基因进行过表达，得到一种对氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株Osll0528。在加有不同浓度(2.5μM～15μM)甲萘醌或不同浓度(1mM～3mM)过氧化氢的BG11培养基中，Osll0528的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的氧化胁迫耐受性藻株对构建耐受高氧化胁迫的基因工程菌和耐受各种环境胁迫的基因工程藻株底盘具有重要的理论、实际意义与广泛的应用前景。

Description

sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用。

背景技术

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)包括单线态氧(¹O₂)、超氧阴离子(O₂·^-)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(OH·)等，它们均是细胞内的强氧化剂，会抑制蛋白质的合成，可能导致核酸的裂解和不饱和脂肪酸的过氧化等。

集胞藻PCC6803遗传背景简单，遗传信息完全公布，被视为研究新能源开发和新原料生产的模式生物，现已有研究证明集胞藻是乙醇和烷烃等新一代生物燃料以及游离脂肪酸、工业酶、蔗糖和乳酸等化学物质的优质生产者。

集胞藻是地球上最古老的能进行光合自养的蓝藻原核生物之一，其在光合作用过程中产生ROS，同时能通过发挥各种抗氧化系统的作用使ROS的浓度保持在无害水平。但是各种激烈变化的外部环境，如光强度波动、紫外照射、温度变化、水分损失、重金属积累、盐浓度增加等胁迫压力，均会导致ROS升高，新能源和新材料生产过程中物质(如：不饱和脂肪酸)的积累也会导致ROS的升高。一旦ROS过度积累，集胞藻的代谢必将发生异常，此时其自身的抗氧化系统将不足以保护细胞成分免受ROS突然增加带来的伤害，ROS会通过破坏蛋白质、脂质和DNA直接影响细胞，也会通过抑制D1蛋白的合成影响光系统Ⅱ(PSⅡ)的修复，可能阻断光系统Ⅰ(PSⅠ)的电子流，降解叶绿素使集胞藻的整体光合效率被影响，总生物量也随之降低。因此，提高集胞藻PCC6803对氧化胁迫的耐受能力，对未来构建耐受各种胁迫的基因工程藻株底盘具有重要的意义，为未来利用蓝藻的光合特性来最大化生产下一代生物燃料和新原料奠定基础。

发明内容

为了克服现有技术中集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性低的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种对氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株的构建方法。

本发明的目的之三在于提供通过上述构建方法构建得到的一种对氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株。该藻株可应用于构建能耐受各种胁迫的基因工程藻株底盘。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用。

过表达sll0528基因提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性，敲除sll0528基因降低集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性。

所述的氧化胁迫包括甲萘醌胁迫或过氧化氢胁迫。

进一步的，所述的sll0528基因在构建对氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株中的应用。

所述的sll0528基因的核苷酸序列或基因序列如(a)、(b)或(c)所示：

(a)sll0528基因的cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示；

(b)sll0528基因的基因组DNA序列；

(c)与(a)或(b)具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。

所述的sll0528基因的过表达由光诱导型强启动子psbA2调控，其核苷酸序列或基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过将野生型WT与构建的集胞藻PCC6803中sll0528基因的敲除株Δsll0528及本发明构建的过表达株Osll0528的比较，鉴定出了一种与氧化胁迫耐受性相关的基因sll0528，其序列号如SEQ ID NO：1所示，sll0528基因的过表达由psbA2启动子调控，其序列号如SEQ ID NO：2所示，成功得到一株可以显著提高氧化胁迫耐受性的藻株，命名为Osll0528。

一种sll0528基因过表达株Osll0528的构建方法，包括如下步骤：

(1)扩增目的片段：以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4作为目的片段slr2030的上、下游引物，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为psbA2启动子的上、下游引物，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为sll0528的上、下游引物，SEQID NO：11和SEQ ID NO：12为slr2031的上、下游引物，扩增得到slr2030、psbA2、sll0528和slr2031；以质粒pET-30b为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6作为引物，扩增得到卡那霉素抗性基因km^r；

(2)构建重组质粒：以pUC118作为质粒载体，用限制性内切酶Hind Ⅲ和Pst Ⅰ将目的片段slr2030和质粒pUC118酶切，再用T4 DNA酶将酶切好的slr2030连接到pUC118上；同样地，用限制性内切酶Pst Ⅰ和Pst Ⅰ，Pst Ⅰ和Xba Ⅰ，Xba Ⅰ和Sma Ⅰ，Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ依次剪切获得目的片段km^r，psbA2启动子，sll0528，slr2031，并将其用T4 DNA酶依次连接插入载体质粒pUC118中，构建得到同源重组双交换质粒P3031。

(3)构建过表达菌株：将同源重组双交换质粒P3031通过自然转化的方法转入集胞藻PCC6803野生型中，使带强启动子psbA2、sll0528和km^r基因的目的片段通过同源双交换的方式插入集胞藻PCC6803的基因组，构建sll0528过表达菌株，命名为Osll0528。

本发明通过上述构建方法，得到了一株耐受氧化胁迫的集胞藻PCC6803中sll0528基因的过表达株Osll0528。

通过上述方法构建的藻株Osll0528的氧化胁迫耐受性显著提高，其在含有2.5μM～15μM甲萘醌或1mM～3mM过氧化氢的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。

所述的藻株Osll0528可用于构建耐受氧化胁迫的基因工程菌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过同源重组的方法对集胞藻PCC6803中的sll0528基因进行过表达，得到一种对氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株Osll0528。

(2)在加有不同浓度(2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM)甲萘醌的BG11培养基中，Osll0528的生长状态明显优于WT，WT生长状态优于Δsll0528。

(3)在加有不同浓度(1mM，2mM，3mM)过氧化氢的BG11培养基中，Osll0528的生长状态明显优于WT，而1mM～2mM过氧化氢下WT生长状态优于Δsll0528。

(4)本发明得到的氧化胁迫耐受性藻株及其构建方法对未来利用蓝藻的光合特性来最大化生产下一代生物燃料提供指导思路。

(5)本发明得到的氧化胁迫耐受性藻株及其构建方法为在利用蓝藻生产新能源和原料物质过程中产生的各种环境胁迫伴随的氧化胁迫提供应对方法。

(6)本发明得到的氧化胁迫耐受性藻株对构建耐受高氧化胁迫的基因工程菌和耐受各种环境胁迫的基因工程藻株底盘具有重要的理论、实际意义与广泛的应用前景。

附图说明

图1是同源重组双交换质粒P3031的结构示意图。

图2是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM甲萘醌胁迫下培养至第5天表型对比图，图中MD代表甲萘醌。

图3是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM甲萘醌胁迫下培养至第3天存活率图，图中MD代表甲萘醌。其中存活率以甲萘醌胁迫下OD₇₃₀/正常BG11下OD₇₃₀(即OD₇₃₀(％Control))表示。

图4是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在10μM甲萘醌胁迫下的生长曲线图，图中MD代甲萘醌。

图5是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在10μM甲萘醌胁迫下培养至第3天的全细胞吸收图，图中MD代甲萘醌。

图6是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM H₂O₂胁迫下培养至第12h的存活率图，其中存活率以H₂O₂胁迫下OD₇₃₀/正常BG11下OD₇₃₀(即OD₇₃₀(％Control))表示。

图7是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在2.5mM H₂O₂胁迫下的生长曲线图。

图8是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在2.5mM H₂O₂胁迫下培养至第12h的全细胞吸收图。

图9是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在3mM H₂O₂胁迫下的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株从ATCC27184中分离纯化得到，ATCC是美国菌种保藏中心的简称，27184是菌株编号。质粒pUC118购自Takara公司，pET-30b购自Novagen公司。

实施例1

sll0528基因过表达株Osll0528的获得，包括同源重组双交换质粒P3031的构建，同源重组双交换质粒与集胞藻PCC6803野生型基因组的同源交换及Osll0528的筛选和验证：

(1)同源重组双交换质粒P3031的构建

以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，设计引物，以序列表中SEQ ID NO：3和SEQID NO：4作为目的片段slr2030的上、下游引物，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为psbA2启动子的上、下游引物，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为sll0528的上、下游引物，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为slr2031的上、下游引物，通过PCR扩增得到目的基因slr2030，psbA2启动子，sll0528，slr2031。以质粒pET-30b为模板，设计引物，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6作为引物，PCR扩增得到卡那霉素抗性基因km^r片段。本发明中集胞藻PCC6803的基因组提取采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(广州东胜生物科技有限公司，货号N1191)，质粒提取采用高纯度质粒小量提取试剂盒(广州东胜生物科技有限公司，货号N1011)。

PCR产物大小经琼脂糖电泳验证，与理论长度一致。在进行后续实验前，各PCR产物还需胶回收纯化。

将目的片段用限制性内切酶酶切和T4 DNA酶连接后，一一插入质粒载体pUC118中，构成同源重组双交换质粒P3031，具体地：用限制性内切酶双酶切目的片段和pUC118，按顺序将目的片段slr2030，km^r，psbA2启动子，sll0528，slr2031与质粒pUC118连接，酶切位点分别为Hind Ⅲ和Pst Ⅰ，Pst Ⅰ和Pst Ⅰ，Pst Ⅰ和Xba Ⅰ，Xba Ⅰ和Sma Ⅰ，Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ，构成带有km^r、psbA2启动子、sll0528和同源臂slr2030/slr2031的同源重组双交换质粒P3031。对同源重组双交换质粒P3031进行DNA水平和Sanger测序水平的验证以证明重组质粒构建成功，目的片段与质粒载体连接成功。P3031结构示意图如图1所示。

各阶段的重组质粒利用感受态大肠杆菌DH10B复制，LB固体培养基培养16h，LB液体培养基培养8h，收集菌液提取质粒用于后续的验证和实验。

(2)同源重组双交换质粒P3031与集胞藻PCC6803野生型基因组的同源交换

取30mL处于对数期的野生型集胞藻PCC6803，6000rpm离心7min，去上清，加入新的BG11培养基同上离心洗涤，重复一次。

向上述构建的同源重组双交换质粒P3031加入一定量的BG11培养基(BG11培养基加HEPES缓冲液)使其终浓度约10ng/μL，用0.22μm的微孔滤膜将重组质粒过滤除菌。

洗涤后的藻泥用含质粒的BG11培养基重悬，质粒和藻混合于光照培养箱(29℃，150rpm，1400Lux)培养6h。

在BG11固体培养基上平铺混合纤维滤膜，将藻液涂布于纤维膜上，光照培养24h后将纤维膜转移到含有10μg/mL卡那霉素的BG11固体培养基中，光照培养数天至膜表面长出单藻落。

(3)Osll0528的筛选和验证

挑取上述单菌落至含有10μg/mL卡那霉素的20mL BG11小瓶培养基中培养，待长至对数期后转接至含20μg/mL卡那霉素的BG11中培养，以此类推，不断提高抗生素浓度直至50μg/mL，将藻于含50μg/mL卡那霉素的固体BG11培养基中划线培养，待长出单菌落后，挑取单菌落至含有50μg/mL卡那霉素的BG11培养基中培养，以获得过表达株Osll0528。

对过表达株Osll0528进行DNA和RNA水平的验证，以证明Osll0528中含有sll0528、psbA2和km^r片段。

本发明中所用PCR反应体系为：DNA模板1μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μL，dNTPMixture(各2.5mM)1.6μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 13.2μL补足至20μL。

本发明所用PCR反应条件为：94℃预变性3min；98℃变性10s；退火15s，温度一般比引物Tm值低5～10℃；72℃延伸，每扩增1kb DNA需1min；38个循环；72℃延伸5min。

本发明所用双酶切(插入片段)体系为：DNA 10μL，10×Buffer 3μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH₂O 15μL补足至30μL。

本发明所用双酶切(质粒)体系为：DNA10μL，10×Buffer 2μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH₂O 6μL补足至20μL。

本发明所用酶切反应条件为：反应温度37℃，反应时间1h。反应结束后，80℃温浴5min，灭活酶。酶切产物经胶回收纯化后，以T4 DNA连接酶进行连接反应。

本发明所用连接反应体系为：插入片段DNA 12μL，质粒DNA 5μL，10×Buffer 2μL，酶1μL，共20μL。连接反应温度为16℃，反应8h。

本发明中所用BG11培养基配方为：1L培养基中含有NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，Na₂CO₃ 0.02g，H₃BO₃ 0.00286g，MnCl₂·4H₂O 0.00181g，ZnSO₄·7H₂O 0.000222g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g，CuSO₄·5H₂O 0.000079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0000494g。使用时，每50mL培养基中加入1mL 1mol/L的HEPES缓冲液(pH＝7.5)。配制固体培养基时，加入终浓度为0.3％硫代硫酸钠和8mM的TES(三羧甲基甲氨基乙磺酸)，再加入2％的琼脂。121℃，1.1MPa，30min灭菌。

实施例2

基因敲除株Δsll0528在专利“201811591708.3、sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用”中公开。

集胞藻PCC6803野生型WT，基因敲除株Δsll0528，基因过表达株Osll0528在甲萘醌氧化胁迫下的表型分析：

将生长至对数期的野生型WT，敲除株Δsll0528，过表达株Osll0528作为种子液，分别接种至含有0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM甲萘醌的50mL BG11培养基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.1。测量第3天OD₇₃₀，以0μM甲萘醌中藻为对照，将各胁迫下藻OD₇₃₀与对照组OD₇₃₀作对比，将OD₇₃₀(％Control)表示各浓度甲萘醌氧化胁迫下WT，Δsll0528，Osll0528的存活率，绘制存活率曲线。培养至第5天的WT，Δsll0528，Osll0528进行表型对比，拍照记录。

将生长至对数期的野生型WT，敲除株Δsll0528，过表达株Osll0528作为种子液，分别接种至含有10μM甲萘醌的50mL BG11培养基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.1，连续培养5天，每隔24h取样测OD₇₃₀值，绘制生长曲线。取第3天藻测量800nm～400nm波长扫描吸收值，绘制全细胞吸收图。

以上培养条件为30℃，150rpm，1800Lux连续光照，实验组和对照组各三个平行。

图2是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM甲萘醌氧化胁迫下培养至第5天表型对比图，图中MD代表甲萘醌。从图中可以看出Δsll0528在甲萘醌浓度较低(5μM)时呈绿色，增加甲萘醌浓度后泛白；WT较Δsll0528稍耐受甲萘醌，7.5μM时呈绿色，10μM时颜色变浅，表示其能在7.5μM甲萘醌浓度下生长；而Osll0528在甲萘醌浓度达12.5μM时绿色才变浅，稍偏黄，15μM时仍能看到偏黄的颜色，提示Osll0528能在更高浓度的甲萘醌氧化胁迫下生长，较WT更耐受甲萘醌。

图3是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM甲萘醌氧化胁迫下培养至第3天存活率图，图中MD代表甲萘醌。其中存活率以甲萘醌氧化胁迫下OD₇₃₀/正常BG11下OD₇₃₀(即OD₇₃₀(％Control))表示。从图中可以看出，随着甲萘醌浓度的增加，三株藻的存活率均降低，但在所有浓度的甲萘醌氧化胁迫下，Osll0528的存活率高于WT，WT的存活率高于Δsll0528，说明Osll0528相对WT能耐受更高浓度的甲萘醌氧化胁迫。

图4是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在10μM甲萘醌氧化胁迫下的生长曲线图，图中MD代甲萘醌。从图中可以看到在10μM甲萘醌氧化胁迫下，Osll0528的生长速率稍微受阻，WT在前3天受阻严重，直至第4天生长稍微恢复，而Δsll0528在此浓度甲萘醌氧化胁迫下完全不能生长。

图5是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在10μM甲萘醌氧化胁迫下培养至第3天的全细胞吸收图，图中MD代甲萘醌。可以看到10μM甲萘醌氧化胁迫下，Osll0528的叶绿素和藻胆蛋白的峰值均高于WT，甚至跟在正常BG11培养基下生长的Osll0528峰值相差无几，说明在此浓度的甲萘醌氧化胁迫下Osll0528光合系统损伤没有WT严重。

实施例3

集胞藻PCC6803野生型WT，基因敲除株Δsll0528，基因过表达株Osll0528在过氧化氢氧化胁迫下的表型分析：

将生长至对数期的野生型WT，敲除株Δsll0528，过表达株Osll0528作为种子液，分别接种至含有0mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM H₂O₂的30mL BG11培养基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.24。测量第12h OD₇₃₀，以0mM H₂O₂中藻为对照，将各胁迫下藻OD₇₃₀与对照组OD₇₃₀作对比，将OD₇₃₀(％Control)表示各浓度过氧化氢氧化胁迫下WT，Δsll0528，Osll0528的存活率，绘制存活率曲线。

将生长至对数期的野生型WT，敲除株Δsll0528，过表达株Osll0528作为种子液，分别接种至含有2.5mM或3mM H₂O₂的30mL BG11培养基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.24，连续培养60h，每隔12h取样测OD₇₃₀值，绘制生长曲线。取第12h藻测量800nm～400nm波长扫描吸收值，绘制全细胞吸收图。

图6是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在0mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM H₂O₂氧化胁迫下培养至第12h的存活率图，其中存活率以H₂O₂氧化胁迫下OD₇₃₀/正常BG11下OD₇₃₀(即OD₇₃₀(％Control))表示。可以看到随着H₂O₂浓度的增加，三者存活率降低，但在1mM和2mM H₂O₂胁迫下，Osll0528存活率高于WT，WT高于Δsll0528，说明Osll0528较WT更耐受H₂O₂氧化胁迫。

图7是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在2.5mM H₂O₂氧化胁迫下的生长曲线图。可以看到在2.5mM H₂O₂胁迫下，WT和Δsll0528均不能生长，而Osll0528只是生长速率稍微受阻，说明Osll0528比WT能耐受H₂O₂氧化胁迫。

图8是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在2.5mM H₂O₂氧化胁迫下培养至第12h的全细胞吸收图。可以看到2.5mM H₂O₂氧化胁迫下，Osll0528的叶绿素和藻胆蛋白的峰值均高于WT，说明在此浓度的H₂O₂氧化胁迫下Osll0528光合系统损伤没有WT严重。

图9是集胞藻PCC6803野生型WT，Osll0528和Δsll0528藻株在3mM H₂O₂氧化胁迫下的生长曲线图。可以看到在3mM H₂O₂氧化胁迫下，WT和Δsll0528均不能生长，而Osll0528比WT更能耐受H₂O₂氧化胁迫。

综合图6和图9可说明在1mM～3mM H₂O₂氧化胁迫下，Osll0528的生长状态明显优于WT，1mM～2mM H₂O₂氧化胁迫下WT生长状态优于Δsll0528。

综上，过表达藻株Osll0528比WT和Δsll0528更耐受高浓度甲萘醌和过氧化氢两种氧化胁迫，sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中发挥重要作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttaagcc tcagtttagg ggggcagttt atgaacaaca atatccgcgt cggcagtctg 60

tttggcattc ctttttacgt caacccatcc tggtttttaa ttttaggatt ggtgaccctg 120

agctatggcc aagacttagc ccgctttccc caactttccg gtggcacacc ctggattttg 180

gggttaatta cagctttact cctctttgct tccgttgtcg cccacgagtt gggccatagt 240

ttggttgcct tagcccaggg cattgaagtt aaatccatca ctctgttttt gttcggtggt 300

ctagcgagtt tagaaaagga atccaacact ccctggcaag cttttgcggt ggcgatcgcc 360

gggccggcgg tgagtttagt gctctttttg ggtttaacca tagttggtac ccaaatcccc 420

ctacctgtgc cggggcaggc catcattggt ttattgggca tgatcaacct cgccctggca 480

ttgtttaacc tcattcctgg tttacctttg gacggcggca atgtgctcaa atccattgtg 540

tggcaaatca cgggcaatca aaacaaaggt attctcattg ctagtcgggt gggccagggt 600

ttcggttggt tggcgatcgc cattggtagc ttaggtattt taaatattct gcccatcggt 660

agcttctgga ccattttgat cggttggttc ctgttacaaa atgctggttc ctccgcccgc 720

aacgcccagg tcaaagagca aatggaagcc tttactgctg aagatgcggt tattcccaac 780

agccccatta ttcctgccgg gttaaatatt cgggaatttg ctaacgatta tgtgattggt 840

aaaaccccct ggcgacggtt cttggttatt ggtgccgaca atcaactgtt aggtgtactt 900

gctacggaag acatcaaaca cgtccccact tccgattggc cccaggtcac agtggatagc 960

ttgatgcagt atccccaaca gatggtcacc gttaacgcca atcaatcttt gtttgaagtg 1020

gcccagttgt tagatcaaca gaaactgtcg gaacttttgg tggtgcaacc ttcgggagaa 1080

gtggtgggat tattggaaaa agcttccatc atcaaatgtc tgcaaacctc cgccgcctag 1140

<210> 2

<211> 562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcagaatc cttgcccaga tgcaggcctt ctggcgatcg ccatggtgag caacgattgc 60

ggctttagcg ttccagtgga tatttgctgg gggttaatga aacattgtgg cggaacccag 120

ggacaatgtg accaaaaaat tcagggatat caataagtat taggtatatg gatcataatt 180

gtatgcccga ctattgctta aactgactga ccactgacct taagagtaat ggcgtgcaag 240

gcccagtgat caatttcatt atttttcatt atttcatctc cattgtccct gaaaatcagt 300

tgtgtcgccc ctctacacag cccagaacta tggtaaaggc gcacgaaaaa ccgccaggta 360

aactcttctc aacccccaaa acgccctctg tttacccatg gaaaaaacga caattacaag 420

aaagtaaaac ttatgtcatc tataagcttc gtgtatatta acttcctgtt acaaagcttt 480

acaaaactct cattaatcct ttagactaag tttagtcagt tccaatctga acatcgacaa 540

atacataagg aattataacc aa 562

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagctta cactacatta ccggacaaac t 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaactgcag tcttcctggg gacgaaaacg 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aactgcagct cagttcggtg taggtcgtt 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aactgcagca ttcaaatatg tatccgctca 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaactgcag tatcagaatc cttgcccaga t 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgctctagat tggttataat tccttatgta t 31

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctctagaa tgttaagcct cagtttaggg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcccccggga tcccaatctt tatggtttcc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcccccggga ggagttggtg gctaagttgt 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggaattct ccaggtcggc atacattac 29

Claims

1.sll0528基因在提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性中的应用，其特征在于：过表达sll0528基因提高集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性，敲除sll0528基因降低集胞藻PCC6803氧化胁迫耐受性；

所述的氧化胁迫包括甲萘醌胁迫或过氧化氢胁迫；

所述的sll0528基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的sll0528基因在构建氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，其过表达的基因sll0528由光诱导型强启动子psbA2调控，启动子psbA2的核苷酸序列或基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述的氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株的构建方法，包括如下步骤：

（1）扩增目的片段：以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4作为目的片段slr2030的上、下游引物，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为psbA2启动子的上、下游引物，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10为sll0528的上、下游引物，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12为slr2031的上、下游引物，扩增得到slr2030、psbA2、sll0528和slr2031；以质粒pET-30b为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6作为引物，扩增得到卡那霉素抗性基因km ^r；

（2）构建重组质粒：以pUC118作为质粒载体，用限制性内切酶Hind Ⅲ和PstⅠ将目的片段slr2030和质粒pUC118酶切，再用T4 DNA酶将酶切好的slr2030连接到pUC118上；同样地，用限制性内切酶PstⅠ和PstⅠ，PstⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和SmaⅠ，SmaⅠ和EcoRⅠ依次剪切获得目的片段km ^r，psbA2启动子，sll0528，slr2031，并将其用T4 DNA酶依次连接插入载体质粒pUC118中，构建得到同源重组双交换质粒P3031；

（3）构建过表达菌株：将同源重组双交换质粒P3031通过自然转化的方法转入集胞藻PCC6803野生型中，使带强启动子psbA2、sll0528和km ^r基因的目的片段通过同源双交换的方式插入集胞藻PCC6803的基因组，构建sll0528过表达菌株，命名为Osll0528。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，在含有2.5μM～15μM甲萘醌的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，在含有1mM～3mM过氧化氢的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的氧化胁迫耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株用于构建耐受氧化胁迫的基因工程菌。