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CN111164204A - 来自iPS细胞的具有遗传多样性的T细胞群体的制备方法 - Google Patents

来自iPS细胞的具有遗传多样性的T细胞群体的制备方法 Download PDF

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CN111164204A
CN111164204A CN201880064382.0A CN201880064382A CN111164204A CN 111164204 A CN111164204 A CN 111164204A CN 201880064382 A CN201880064382 A CN 201880064382A CN 111164204 A CN111164204 A CN 111164204A
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CN
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cell population
population
cell
genetic diversity
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安井裕
桂義元
上野博之
金子新
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Thyas Co ltd
Kyoto University NUC
Original Assignee
Thyas Co ltd
Kyoto University NUC
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Abstract

[课题]提供通过iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法及相关再生T细胞群体。[解决手段]通过iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法，其包括：(1)自采集的具有遗传多样性的T细胞群体，浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的工序，(2)将上述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持遗传多样性的同时培养iPS细胞的工序，及(3)自上述培养的iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的工序。

Description

来自iPS细胞的具有遗传多样性的T细胞群体的制备方法
技术领域
本发明涉及制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法及相关再生T细胞群体。
背景技术
T细胞在免疫系统中对于细菌或者病毒等外来病原体或癌细胞等异常细胞起到主要的作用，若出于各种原因导致T细胞功能下降，则认为受试者变得具有易感染性，导致罹患癌症等。对于此类疾病而言，若能够补充、再生免疫细胞等，则将成为对于疾病的症状改善、治疗效果的提高等极为有效的手段。
已提出使用自iPS细胞等多能性干细胞诱导的T细胞进行补充疗法。以iPS细胞作为原料，通过使用对于目标抗原具有特异性的T细胞，可制备与原来的T细胞具有相同抗原特异性的再生T细胞(非专利文献1；本文献的内容，以其整体引入本说明书中作为参照)。在此方法中，所建立的iPS细胞是以来自单一细胞的细胞群体(集落，colony)为单位进行克隆化的。由此，细胞性状稳定，向目标细胞、组织的分化效率高，可利用通过基因分析等确认无变异或异常的iPS细胞株。在此，为了确认克隆的质量或对患者的适用性，有必要对克隆逐个检查，而克隆化一直以来被认为是重要的工序。
另一方面，在使用人及小鼠的研究中，在针对感染性疾病、肿瘤进行T细胞补充疗法时，已知通过使用具有遗传多样性的T细胞群体的方法可诱导针对目标组织、抗原的多种免疫反应，同时该方法不易受到由于抗原表达低下或变异而产生的免疫逃逸(escape)的影响，因此获得高的治疗效果。
另外，现有技术中，尽管存在向外周血T细胞导入T细胞受体(TCR)、人工抗原受体(嵌合抗原受体：CAR)的基因导入法，但其使用的T细胞所具有的抗原受体的基因序列是单一的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Cell Stem Cell(2013)12(1):114-126
发明概述
发明要解决的课题
现有的利用iPS细胞株的方法中，尽管进行克隆化，但由于克隆化等效于排除选定的克隆以外的其他克隆，使得建立iPS细胞的阶段所存在的遗传多样性完全丧失。由此，只能利用以单一的抗原表位为对象的免疫反应。然而，以单一的抗原表位为对象的免疫反应中，由于容易受到抗原分子的表达低下或变异等引起的免疫逃逸(escape)的影响，产生了难以获得高的治疗效果的问题。另一方面，在现行的T细胞补充疗法中，尽管能够使用具有遗传多样性的T细胞群体，但由于T细胞群体在体外的扩增使得T细胞发生疲劳，产生针对抗原的免疫反应下降的问题。为此，为了能够用于T细胞补充疗法中，期望开发制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的新的方法。
因此，本发明的课题是提供介由iPS细胞来制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法，以及相关的再生T细胞群体。本发明的另一方面的课题是将通过上述方法能够获得的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法中。另外，本发明的进一步的另一方面的课题是将肿瘤浸润T细胞用作上述方法的原材料的T细胞群体。
解决课题的手段
本发明的发明人在探讨现有方法中的问题时发现，如果介由iPS细胞来制备具有遗传多样性的再生T细胞群体，则能够解决只能利用以单一抗原表位为对象的免疫反应的问题以及T细胞群体的疲劳的问题。即，本发明的要点为：
[1]介由iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法，其包括：
(1)自采集的具有遗传多样性的T细胞群体浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的工序，
(2)将上述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持遗传多样性的同时培养iPS细胞的工序，及
(3)自上述培养的iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体来自作为治疗对象的哺乳动物。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体为肿瘤浸润T细胞。
[4]根据[1]或[2]所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体来自血液、淋巴节或体腔积液(腔水)。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中工序(1)包括通过抗原蛋白质或肽的刺激而活化，并分离增殖的T细胞的步骤。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中工序(2)包括不经克隆化而回收iPS细胞，并进行传代的步骤。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中工序(3)所得到的T细胞群体为αβT细胞群体，γδT细胞群体，T辅助细胞群体，T调节细胞群体，细胞毒性T细胞群体，NKT细胞群体，或肿瘤浸润T细胞群体。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中工序(3)所得到的T细胞群体用于T细胞补充疗法。
[9]通过[1]～[8]中任一项所述的方法能够获得的再生T细胞群体。
[10]再生T细胞群体，其能够通过iPS细胞获得，并维持生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性。
[11]药物组合物，其含有[9]或[10]所述的再生T细胞群体。
[12]根据[11]所述的药物组合物，其用于通过自体或同种移植来处理癌症治疗对象。
[13]治疗癌症的方法，其中使用根据[11]或[12]所述的药物组合物。
发明的效果
通过本发明，可介由iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体。另外，在本发明的另一方面中，自生物体内存在的具有遗传多样性的T细胞群体，通过浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞而对其加以利用，可使得所制备的再生T细胞群体在T细胞补充疗法中显示高的治疗效果。特别是，已知肿瘤浸润T细胞(Tumor InfiltratingLymphocyte：TIL)对于肿瘤具有特异性且识别多种抗原，通过将TIL重编程为iPS细胞而制备再生TIL，可利用具有遗传多样性的获得新生的T细胞实施具有肿瘤特异性且有效的T细胞补充疗法。
附图简述
[图1]图1为显示自肺癌患者摘出的肿瘤分离的T细胞群体中，具有各TCR Vβ链的T细胞的比例的图。图1中的Vβ1～Vβ23表示所分离的T细胞群体是具有TCR遗传多样性的T细胞群体。
[图2]图2为显示在介由iPS细胞所制备的再生T细胞群体中，具有各TCR Vβ链的T细胞的比例的图。图2中的Vβ1～Vβ23表示再生的T细胞群体也是具有遗传多样性的T细胞群体。
具体实施方式
本发明提供介由iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法。上述方法包括：(1)自采集的具有遗传多样性的T细胞群体浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的工序，(2)将上述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持遗传多样性的同时培养的工序，及(3)自上述培养的iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的工序。
本发明的一个方面中，“介由iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体”是指从具有遗传多样性的T细胞群体出发，通过重编程为iPS细胞，再生出具有遗传多样性的T细胞群体。本发明中，经上述过程所制备的T细胞称为“再生T细胞”。
工序(1)
本发明的工序(1)为：自采集的具有遗传多样性的T细胞群体浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的工序。
·具有遗传多样性的T细胞群体
本发明的一个方面中，“具有遗传多样性的T细胞群体”是指生物体内存在的CD3及CD45为阳性的淋巴细胞的细胞群体，其中识别抗原的T细胞受体(TCR)的基因序列作为群体而言是多样的。对于生物体内存在的T细胞而言，由于T祖细胞在胸腺内发生分化时TCR基因发生随机重组，使得各个个体T细胞具有不同的TCR基因序列，从而可能对所有抗原均产生免疫反应。尽管各个个体T细胞所具有的TCR基因序列决定了其所各自特异性识别的抗原或肽的序列，但可理解通过以群体的形式捕获T细胞，T细胞群体是以多样的抗原作为免疫对象的。因此，在这个意义上，自生物体采集的T细胞群体是具有遗传多样性的T胞群体。
本发明的一个方面中，T细胞优选来自哺乳动物，更优选来自人，进一步优选来自治疗对象的哺乳动物(优选人)。作为T细胞，尽管没有特别限定，但可例举αβT细胞，γδT细胞，T辅助细胞，T调节细胞，细胞毒性T细胞，及NKT细胞等。另外，外周血由于其侵袭性低而作为优选的T细胞供给源，但作为其它优选的供给源可例举，癌或者肿瘤或其它器官或者组织、体腔积液(胸水或腹水等)、体液(血液等)、淋巴节或者脐带血等体内的所有供给源。本发明的其它的方面中，优选的T细胞是肿瘤浸润T细胞。
本发明的一个方面中，具有遗传多样性的T细胞群体可能用于针对任何抗原或组织起作用。特别是，将所制备的再生T细胞用于T细胞补充疗法中时，所采集的T细胞群体优选对于作为治疗对象的癌症、肿瘤、癌抗原、肿瘤特异的突变抗原或病毒等具有指向性。作为所述治疗对象的癌症或肿瘤，优选地，可例举实体瘤(肺癌或胃癌等)，白血病(急性或慢性的骨髓性白血病或淋巴性白血病)或淋巴瘤等可在体内发生的所有癌症或肿瘤。另外，作为所述癌抗原、肿瘤特异的变异抗原或病毒，优选地，可例举在各种肿瘤中特异的或非特异性表达的WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、p53 nonmutant、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1或Survivin等癌抗原，伴随基因变异的p53、Ras、ERG、bcr-abl，或新抗原(Neoantigen)，或者来自各种病毒的蛋白LMP2、HPV E6或者E7、EB-NA、或HTLV-1Tax等。
·浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的步骤
在生物体内，尽管存在非常多样的T细胞以使得可对所有抗原产生反应，但这些细胞中多半是与T细胞补充疗法中的目标抗原无关的T细胞。为此，事先将对于T细胞补充疗法的对象癌症、肿瘤或病毒具有反应性的T细胞群体浓缩，作为介由iPS细胞重编程而制备T细胞的原料，可以在使治疗效果获得飞跃式提高的同时，也可出乎意料地抑制针对抗原的免疫反应并具有很高的安全性。
本发明的一个方面中，“目标组织或抗原”优选地是指含有上述治疗对象的癌症、肿瘤、癌抗原、肿瘤特异的变异抗原，或者病毒的组织，或含有这些成分的抗原。
本发明的一个方面中，“具有指向性”是指一方面各个个体T细胞分别特异性识别不同的抗原或肽序列，另一方面这些T细胞作为群体针对目标组织或抗原显示免疫反应。
本发明的一个方面中，作为对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的浓缩方法，可例举通过抗原蛋白质或肽的刺激而活化T细胞群体，并分离增殖的T细胞的方法。在所述方法中，将含有抗原呈递细胞的单核细胞级分进行培养，向培养液中添加抗原蛋白质或肽。反复通过抗原蛋白质或肽的刺激使反应性T细胞增殖，其在T细胞群体中所占的比例升高。另一方面，与所添加的抗原蛋白质或肽不反应的T细胞不被活化，在体外的培养中比例慢慢降低，最终死亡。因此，在一定的培养期间后获得对所添加的抗原蛋白质或肽具有特异的反应性、同时所识别的抗原或肽序列具有多样性的T细胞群体。在此，作为“抗原蛋白质或肽”，优选上述作为目标组织或抗原所记载的抗原蛋白质或肽，例如可使用上述物质的肽片段化产物来作为癌抗原、肿瘤特异的变异抗原或病毒。另外，已知由抗原肽所刺激的T细胞可表达或释放各种活化分子或细胞因子。本发明的一个方面中，利用这一性质，在使所述分子与抗体特异性结合的基础上，可将其供于利用磁珠进行的磁性分离或利用荧光标记通过流式细胞仪进行的选择性分离。另外，本发明的一个方面中，可使用这样的系统，其利用双极性抗体(细胞侧及细胞因子侧)来捕获细胞因子释放细胞。
本发明的另一方面中，作为对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的浓缩方法，可例举使用MHC四聚体(Tetramer)或MHC六聚体(Dextramer)等抗原肽-HLA复合体的寡聚体的方法。在该方法中，用荧光色素标记由特定HLA分型及可被该HLA呈递的目标抗原肽的复合体构成的寡聚体，用流式细胞仪分选与该寡聚体结合的细胞，由此获得对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞。
工序(2)
本发明的工序(2)是将上述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持遗传多样性的同时培养的工序。
·将浓缩的T细胞群体重编程入iPS细胞的步骤
iPS细胞的制备方法是该领域公知的。本发明的一个方面中，iPS细胞优选地通过向工序(1)中浓缩的T细胞群体中导入重编程因子而制备。在此，作为重编程因子，可例举Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，所述重编程因子可单独使用，也可组合使用。
·在维持遗传多样性的同时培养所建立的iPS细胞的步骤
在培养iPS细胞中优选进行传代。然而，在一般的传代方法中，除传代所用的细胞以外的其他细胞被废弃，使得自具有遗传多样性的T细胞群体建立的iPS细胞群体的多样性逐渐丧失。
对此，本发明的一个方面中，优选地在建立iPS细胞之后将培养器洗涤，优选除去iPS细胞以外的细胞，不经克隆化而回收iPS细胞，在其它的培养器中传代，反复进行这样的传代。
本发明的一个方面中，对于本步骤中所用培养液没有特别的限制，可将动物细胞培养中所用的培养基作为基础培养基，向其中添加用于维持iPS细胞的未分化能力的细胞因子类来调配。作为基础培养基，例如可例举Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)，199培养基，Eagle氏最小基本培养基(EMEM)，αMEM培养基，Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)，Ham氏F12培养基，RPMI 1640培养基，Fischer氏培养基，神经基础培养基(LifeTechnologies)，StemFit AK03N(味之素)及其混合培养基等。培养基中可含有血清或无血清。作为细胞因子类，优选可例举bFGF，其在培养液中的浓度例如为1～100μg/mL(优选地50μg/mL)。
本发明的一个方面中，iPS细胞的培养方法可为贴壁培养或悬浮培养，但贴壁培养是优选的。作为iPS细胞的分离方法，可例举物理分离方法以及使用具有蛋白酶活性的分离溶液，具有胶原酶活性的分离溶液，或具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(商标)及Accumax(商标)等)进行的分离方法。
本发明的一个方面中，iPS细胞优选在细胞密度为1x103～1x104个细胞/cm2，1x104～1x105个细胞/cm2，1x105～1x106个细胞/cm2的情况下向其它的培养器中传代。传代的次数可为足以得到T细胞补充疗法所必要的量的iPS细胞的任何次数，优选为1～5次、5～10次。
本发明的一个方面中，能够获得的具有遗传多样性的iPS细胞可原样使用，或冷冻保存至必要时为止。
工序(3)
本发明的工序(3)为自上述培养的iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的工序。
本发明的一个方面中，优选地，可自工序(2)中培养的iPS细胞经造血祖细胞分化为CD4CD8双阳性T细胞而获得具有遗传多样性的再生T细胞群体，或可自工序(2)中培养的iPS细胞经这些细胞分化为CD8阳性T细胞而获得具有遗传多样性的再生T细胞群体。
·自iPS细胞诱导造血祖细胞的步骤
造血祖细胞(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))是指可能分化为淋巴细胞、好氧细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、红细胞、或巨核细胞等血细胞系细胞的细胞。本发明的一个方面中，造血祖细胞和造血干细胞之间没有区别，只要无特别否定则表示相同的细胞。造血干细胞/祖细胞可通过例如表面抗原CD34及/或CD43为阳性而识别。
本发明的一个方面中，造血祖细胞优选通过在添加维生素C类的培养液中培养iPS细胞而制备。在此，“维生素C类”是指L-抗坏血酸及其衍生物，“L-抗坏血酸衍生物”是指在生物体内经酶反应生成维生素C的物质。作为L-抗坏血酸的衍生物，可例举磷酸维生素C，抗坏血酸糖苷，抗坏血酸乙酯，维生素C酯，抗坏血酸四己基癸酸酯，抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸酯。L-抗坏血酸的衍生物优选为磷酸维生素C，例如可例举磷酸-L抗坏血酸钠或磷酸-L-抗坏血酸镁等磷酸-L抗坏血酸盐。在培养液中例如可含有5μg/ml至500μg/ml的浓度的维生素C类。
本发明的一个方面中，造血祖细胞的制备中所用的培养液没有特别限定，可将动物细胞的培养中所用的培养基作为基础培养基，向其中添加维生素C类等进行调配。作为基础培养基，可例举Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)，199培养基，Eagle氏最小基本培养基(EMEM)，αMEM培养基，Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)，Ham氏F12培养基，RPMI1640培养基，Fischer氏培养基，神经基础培养基(Life Technologies)，StemPro34(LifeTechnologies)及其混合培养基等。培养基中可含有血清或无血清。根据需要，基础培养基例如可含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
本发明的一个方面中，可向造血祖细胞的制造中所用的培养液中进一步添加选自BMP4(骨形成蛋白4)，VEGF(血管内皮生长因子)，bFGF(基本成纤维细胞生长因子)，SCF(干细胞因子)、TPO(血小板生成素)、及FLT-3L(Flt3配体)的细胞因子。
本发明的一个方面中，其浓度例如为：BMP4为1ng/ml至100ng/ml，VEGF为1ng/ml至100ng/ml，bFGF为1ng/ml至100ng/ml，SCF为10ng/ml至100ng/ml，TPO为1ng/ml至100ng/ml，FLT-3L为1ng/ml至100ng/ml。
本发明的一个方面中，可向培养液中添加TGFβ抑制剂。“TGFβ抑制剂”是指干扰TGFβ家族信号传导的小分子抑制剂，例如可例举SB431542，SB202190(以上：R.K.Lindemann etal.,Mol.Cancer 2：20(2003))，SB505124(GlaxoSmithKline)，NPC30345，SD093，SD908，SD208(Scios)，LY2109761，LY364947，及LY580276(Lilly Research Laboratories)等，培养基中的浓度优选为0.5μM～100μM。
本发明的一个方面中，iPS细胞可与C3H10T1/2(Takayama N.,et al.J ExpMed.2817-2830,2010)或异种来源的间质细胞(Niwa A et al.J Ce11Physiol.2009Nov；221(2)：367-77)等饲养细胞共培养，但优选不使用饲养细胞而培养iPS细胞。
本发明的一个方面中，制备造血祖细胞时的iPS细胞培养方法可为贴壁培养或悬浮培养，但悬浮培养是优选的。例如，可将iPS细胞培养至对于所使用的培养皿达到80％汇集，然后将培养的群体分离，在解离为单细胞后供于悬浮培养。作为iPS细胞的分离方法，可例举物理分离方法以及使用具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(商标)及Accumax(商标)等)或具有胶原酶活性的分离溶液的分离方法。
悬浮培养是指在对培养容器非粘附的状态下培养细胞。本发明的一个方面中，对悬浮培养没有特别限定，可以使用未以提高与细胞的粘附性为目的进行人工处理(例如通过细胞外基质等进行涂布处理)的培养容器进行，或使用经人工粘附抑制处理(例如通过聚羟乙基甲基丙烯酸(po1y-HEMA)或者非离子性的表面活性多元醇(普朗尼克F-127等)进行涂布处理)的培养容器进行。悬浮培养时，优选使胚状体(EB)形成的培养。
本发明的另一方面中，造血祖细胞可自iPS细胞的培养中获得的网状构造物(称为iPS-sac)调配。在此，“网状构造物”是由指来自iPS细胞的立体囊状(伴有内部空间)的构造体、内皮细胞群体等形成的在内部含有造血祖细胞的构造体。
本发明的一个方面中，为制备造血祖细胞而培养时的温度条件，尽管没有特别限定，但可例举为约37℃～约42℃左右，优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间，本领域技术人员可在监控造血祖细胞数量等的同时适当决定。只要获得造血祖细胞，则不特别限定天数，但可例举至少6天以上，7天以上，8天以上，9天以上，10天以上，11天以上，12天以上，13天以上，14天以上，优选为14天。对于较长的培养期间而言，不会在造血祖细胞的制备中产生问题。另外，可在低氧条件下培养，在本发明的一个方面中，作为低氧条件可例举15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或其以下的氧浓度。
·自造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤
本发明中，“CD4CD8双阳性T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4及CD8共同呈阳性的细胞(CD8+CD4+)，由于T细胞可通过表面抗原CD3及CD45为阳性而被识别，因此CD4CD8双阳性T细胞可作为CD4、CD8、CD3及CD45为阳性的细胞而加以鉴定。CD4CD8双阳性T细胞可诱导分化为CD4阳性细胞或CD8阳性细胞。
本发明的一个方面中，CD4CD8双阳性T细胞可通过使用包括在添加p38抑制剂及/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞的工序的方法制备。
＜p38抑制剂＞
本发明中，“p38抑制剂”定义为抑制p38蛋白质(p38MAP激酶)的功能的物质。本发明的一个方面中，例如可例举p38的化学抑制剂、p38的显性阴性变异体或编码其的核酸等，但不限于此。
本发明的一个方面中，作为p38的化学抑制剂，可例举SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物，SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物，SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)及其衍生物，SB220025及其衍生物，PD169316，RPR200765A，AMG-548，BIRB-796，SCl0-469，SCIO-323，VX-702，以及FR167653，但不限于此。这些化合物是市售的，例如SB203580，SB202190，SC239063，SB220025及PD169316可从Calbiochem公司购买，SCl0-469及SCIO-323可从Scios公司等购买。
本发明的一个方面中，作为p38的显性阴性变异体，可例举位于p38的DNA结合域的180位的苏氨酸发生点突变成为丙氨酸的p38T180A，以及人及小鼠中的p38的182位的酪氨酸发生点突变成为苯丙氨酸的p38Y182F等。
在培养基中含有例如约1μM～约50μM的范围的p38抑制剂。
＜SDF-1＞
本发明的一个方面中，SDF-1(间质细胞衍生因子1)不仅可为SDF-1α或其成熟型，也可以为SDF-1β，SDF-1γ，SDF-1δ，SDF-1ε或
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等同种型或它们的成熟型，或者为它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α使用。需要说明的是，SDF-1有时称为CXCL-12或PBSF。
本发明的一个方面中，SDF-1只要保有其趋化因子活性即可，其氨基酸序列中的1或数个氨基酸可取代、缺失及/或添加，同样地，糖链也可以发生取代、缺失及/或添加。SDF-1中在至少保持4个半胱氨酸残基(人SDF-1α的情况下为Cys30，Cys32，Cys55及Cys71)、并且相对于天然体氨基酸序列具有90％以上的同一性的范围内，可允许氨基酸变异。SDF-1可来自哺乳动物，例如人或例如猴、羊、牛、马、猪、狗、猫、兔子、大鼠、或小鼠等非人哺乳动物。例如，作为人的SDF-1α，可使用以GenBank登录编号NP_954637登录的蛋白质，作为SDF-1β，可使用以GenBank登录编号NP_000600登录的蛋白质。
本发明的一个方面中，SDF-1可使用市售品，也可使用从天然产物提纯的物质，或使用肽合成或基因工程学手段制备的物质。
本发明的一个方面中，在培养基中含有例如约10ng/ml至约100ng/ml的范围的SDF-1。
本发明的一个方面中，CD4CD8双阳性T细胞的制备中所用的培养液没有特别限定，可将动物细胞的培养中所用的培养基作为基础培养基，向其中添加p38抑制剂及/或SDF-1、进一步优选添加维生素C类从而调配。需要说明的是，CD4CD8双阳性T细胞制备工序中使用的维生素C类的种类例如为上述种类，但维生素C类的浓度例如为5μg/ml至200μg/ml。作为基础培养基，例如可例举Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)，199培养基，Eagle氏最小基本培养基(EMEM)，αMEM培养基，Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)，Ham氏F12培养基，RPMI 1640培养基，Fischer氏培养基，OP9培养基，神经基础培养基(Life Technologies)，及其混合培养基等。培养基中可含有血清或无血清。根据需要，基础培养基例如可含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
本发明的一个方面中，对于CD4CD8双阳性T细胞的制备中所用的培养液，可向培养液中进一步添加选自SCF、TPO(血小板生成素)、FLT-3L及IL-7的细胞因子。其浓度例如为：SCF为10ng/ml至100ng/ml，TPO为10ng/ml至200ng/ml，FLT-3L为1ng/ml至100ng/ml，IL-7为1ng/ml至100ng/ml。
本发明的一个方面中，在制备CD4CD8双阳性T细胞时，可使用饲养细胞培养造血祖细胞，但优选不使用饲养细胞进行培养。
本发明的一个方面中，造血祖细胞可贴壁培养或悬浮培养，但本步骤优选为贴壁培养。在贴壁培养的情况下，可使用经涂布的培养容器，作为涂布剂例如可例举：基质胶(Niwa A,et al.PLoS One.6(7):e22261,2011)，胶原蛋白，明胶，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，RetroNectin，Fc-DLL4或巢蛋白，及其组合。
本发明的另一方面中，悬浮培养胚状体获得造血祖细胞时，优选在将其解离为单细胞后实施贴壁培养。
本发明的一个方面中，为了制备CD4CD8双阳性T细胞而培养造血祖细胞时，培养的温度条件没有特别限定，但可例举为约37℃～约42℃左右，优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间，本领域技术人员可在监控CD4CD8双阳性T细胞数量等的同时适当决定。只要获得CD4CD8双阳性T细胞，则不特别限定天数，但可例举至少10天以上，12天以上，14天以上，16天以上，18天以上，20天以上，22天以上，23天以上，优选23天。
本发明的一个方面中，能够获得的CD4CD8双阳性T细胞可在分离后使用，也可作为含有其它种类细胞的细胞群体。分离时，可使用CD4、CD8、CD3及CD45中的任一者作为指标进行分离，可使用本领域技术人员周知的分离方法，例如可例举通过抗体对CD4、CD8、CD3及CD45进行标记，使用流式细胞仪进行分离的方法，或将所需的抗原固定化，使用亲和柱等进行提纯的方法。
·自CD4CD8双阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞的步骤
“CD8阳性T细胞”是指T细胞中表面抗原CD8为阳性的细胞(CD8+CD4-)，也称为细胞毒性T细胞。由于可通过表面抗原CD3及CD45为阳性而识别T细胞，CD8阳性T细胞可作为CD8、CD3及CD45为阳性且CD4为阴性的细胞加以鉴定。
在本发明的一个方面中，CD8阳性T细胞可通过包括在添加肾上腺皮质激素剂的培养液中培养CD4CD8双阳性T细胞的工序的方法制备。
本发明的一个方面中，肾上腺皮质激素剂优选为糖皮质激素或其衍生物，例如可例举醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氟可的松、泼尼松龙、曲安西龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松或丙酸倍氯米松。优选地，肾上腺皮质激素剂为地塞米松。其在培养液中的浓度例如为1nM至100nM。
本发明的一个方面中，CD8阳性T细胞的制备中所用的培养液没有特别限定，可将动物细胞的培养所用的培养基作为基础培养基，向其中添加肾上腺皮质激素剂并进行调配。作为基础培养基，例如可例举Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)，199培养基，Eagle氏最小基本培养基(EMEM)，αMEM培养基，Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)，Ham氏F12培养基，RPMI 1640培养基，Fischer氏培养基，神经基础培养基(LifeTechnologies)，及其混合培养基等。培养基中可含有血清或无血清。根据需要，基础培养基可含有例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
本发明的一个方面中，CD8阳性T细胞的制备中所用的培养液优选进一步含有抗CD3抗体、维生素C类或细胞因子。作为该细胞因子，可例举IL-2及IL-7等。
本发明的一个方面中，作为抗CD3抗体，只要是特异性识别CD3的抗体即可，没有特别限定，但可例举由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体在培养液中的浓度例如为10ng/ml至1000ng/ml。
本发明的一个方面中，CD8阳性T细胞的制备中所用的维生素C类例如为上述物质，可在与上述相同的条件下使用。
本发明的一个方面中，CD8阳性T细胞的制备中所用的细胞因子在培养液中的浓度例如为：IL-2为10U/ml至1000U/ml，IL-7为1ng/ml至100ng/ml。
本发明的一个方面中，为制备CD8阳性T细胞而培养CD4CD8双阳性T细胞时的温度条件没有特别限定，但可例举约37℃～约42℃左右，优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间，本领域技术人员可在监控CD8阳性T细胞数量等的同时适当决定。只要获得CD8阳性T细胞，则不特别限定天数，但可例举至少1天以上，2天以上，3天以上，4天以上，5天以上，优选为3天。
作为通过本发明的制备方法能够获得的再生T细胞群体，尽管没有特别限定，但可例举αβT细胞群体，γδT细胞群体，T辅助细胞群体，T调节细胞群体，细胞毒性T细胞群体，NKT细胞群体及肿瘤浸润T细胞群体等。
本发明的一个方面中，所维持遗传多样性的程度优选为作为原料的具有遗传多样性的T细胞群体的30％以上，40％以上，50％以上。
本发明的一个方面中，所制备的再生T细胞群体优选用于T细胞补充疗法。本发明中，T细胞补充疗法是指向生物体补充T细胞而实施的治疗方法。本发明的一个方面中，作为T细胞补充疗法，优选可例举包括再生T细胞的输注、肿瘤内注入、动脉注射、门静脉注射等的细胞移植治疗方法。
本发明的一个方面是能够介由iPS细胞获得的再生T细胞群体，其维持生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性，所述再生T细胞群体例如包括能够通过上述方法获得的再生T细胞群体。可将包含本发明的再生T细胞群体的药物组合物用于处理癌症治疗对象。在本发明的一个方面中，包括使用本发明的药物组合物治疗癌症的治疗方法。本发明的药物组合物可包含药学上可接受的添加剂。作为该添加剂，可例举细胞培养液，磷酸缓冲食盐水等。
在本发明的一个方面中，包括将能够通过本发明的制备方法获得的再生T细胞群体适用于T细胞补充疗法进行治疗的方法。另外，在本发明的一个方面中，包括通过本发明的制备方法能够获得的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法的治疗中的用途。
本发明的一个方面包括上述说明中列举的所有一般的方面及/或具体的方面的所有组合。
本发明通过以下实施例进一步的具体说明，但本发明的范围不受这些实施例的限定。
实施例
工序(1)的具体的程序
对于采集的T细胞群体，使用经CD3及CD28抗体标记的磁珠给予活化刺激，在添加有200U/ml的IL-2、10ng/ml的IL-7、10ng/ml的IL-15的RPMI-1640培养基(10％胎牛血清，包含1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺)中培养2天。
工序(2)的具体的程序(重编程为iPS细胞)
接着，将T细胞回收于15ml管中，悬浮于约250μl的RPMI-1640培养基中后，使用CytoTune-iPS 2.0试剂盒(ID Pharma株式会社：#DV-0304)，以MOI＝5的效价，将含有重编程所必需的四种因子(Oct3/4，Sox2，Klf4及c-Myc)的仙台病毒添加至培养基中，在37℃温育2小时。温育后，用RPMI-1640培养基洗涤T细胞，自培养基中除去病毒。
接着，为了除去磁珠，通过移液将磁珠与细胞分离后，将管静置于配有磁石的基座上，由此仅回收培养基中悬浮的T细胞。
将所获得的T细胞以接种于以0.5μg/cm2涂布iMatrix-511(Nippi公司：#892011)的6cm培养皿上，在RPMI-1640培养基中以37℃、5％CO2、5％O2设定温育条件开始培养。
在6cm培养皿上开始培养之翌日起，除去不含细胞的培养上清液的一半的量，向StemFit AK03N(味之素公司)中添加1mM丙戊酸作为建立用培养基，以与除去的培养基相同的量添加建立用培养基。
此后，每天进行相同的半量培养基交换，继续培养20～40天，在6cm培养皿中获得多数的iPS细胞集落。在获得了一定数量集落的阶段，将建立用培养基转换为iPS细胞用培养基(仅StemFit AK03N)继续培养。
工序(2)的具体的程序(在维持所建立iPS细胞的遗传多样性的同时进行培养)
在iPS细胞的集落变大到肉眼可确认的阶段，将iPS细胞在新涂布的iMatrix-511的6cm培养皿中传代。
在传代时，将贴附于培养皿的iPS细胞用PBS(-)清洗之后，添加TrypLeSelect(Life Technologies公司：A12859-01)并温育约7分钟，以解离iPS细胞的贴附，使其分散为单个的细胞。使用iPS细胞用培养基洗涤细胞，测得细胞数。然后将分散的细胞接种于新的涂布有iMatrix-511的6cm培养皿，使其达到1,500个细胞/cm2。此时，所回收的iPS细胞不加废弃，而是全部接种于新的培养皿。
将所回收的细胞全部继续接种，由此逐渐扩大培养规模。因此，在建立后进行3～5次传代，在获得使用iPS细胞进行T细胞补充疗法所需量的iPS细胞的阶段，通过以下程序将细胞冷冻保存。
使用与传代相同的程序回收iPS细胞，然后在TC Protector(DS Pharma公司：#KBTCP001)等细胞冷冻液中将细胞悬浮，以-1℃/分钟的速度降温，冷却至-80℃，由此将iPS细胞冷冻。为了长期稳定地保存iPS细胞，优选进一步将其保存于液氮(-196℃)中。
工序(3)的具体的程序
在经超低粘附处理的6孔板(CORNING公司：#3471)上，以3x105～6x105个/孔接种工序(2)所得到的iPS细胞(第0天)，向EB培养基(向StemPro34中添加10μg/ml人胰岛素，5.5μg/ml人转铁蛋白，5ng/ml亚硒酸钠，2mM L-谷氨酰胺，45mMα-单硫甘油，及50μg/ml抗坏血酸)中添加10ng/ml BMP4，5ng/ml bFGF，15ng/ml VEGF，2μM SB431542，在低氧条件下(5％O2)培养5天(第5天)。
接着，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，进一步培养5～9天(～第14天)。
在涂布有Fc-DLL4(5μg/ml)(Sino Biological Inc.)及RetroNectin(5μg/ml)(TAKARA-BIO株式会社)的48孔板上，在添加有50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/mlFlt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580(Tocris Bioscience)、30ng/ml SDF-1α(PeproTech)的OP9培养基(添加15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、55μM 2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)中培养所得造血祖细胞21天(第35天)。
在第35天，用FACS分离CD45、CD3、CD4及CD8全部为阳性的级分，得到CD4CD8双阳性(Double positive)细胞(称为DP细胞)。
在96孔板上，在添加15％胎牛血清、500ng/ml抗CD3抗体(eBioscience)、200U/mlIL-2、10ng/ml IL-7、及10nM地塞米松的RPMI 1640培养基中培养所得CD4CD8双阳性细胞2天(第37天)。用加入15％胎牛血清的RPMI 1640培养基洗涤细胞，由此除去抗体，用添加15％胎牛血清及10ng/ml IL-7的RPMI 1640培养基进一步培养5天，得到CD8阳性T细胞(第42天)。
实施例1
使用上述方法，自肺癌患者的摘出肿瘤分离的具有遗传多样性的T细胞群体建立iPS细胞，诱导其再分化为具有遗传多样性的T细胞。
T细胞所表达的T细胞受体(TCR)的遗传多样性，尽管通常由DNA或RNA的测序来确定，但也可使用与TCR的Vβ链各区段特异性结合的抗体面板进行简单的检测。
使用TCRVβ分析试剂盒(BECKMAN COULTER公司：#IM-3497)，将自肺癌患者的摘出肿瘤分离的T细胞群体的TCR池(repertoire)进行分析(图1)。患者检测样本，含有约1～13％比例的表达各Vβ链的细胞，确认了其为具有遗传多样性的T细胞群体。通过上述方法将这些T细胞群体重编程入iPS细胞中。
iPS细胞是具有多能性的干细胞，不表达包括TCR基因的T细胞关联基因。即，难以在未分化iPS细胞阶段分析TCR基因的多样性。在不丧失遗传多样性的情况下将所建立的iPS细胞传代后，经造血祖细胞阶段将其诱导分化为T细胞。
对于所再生的T细胞表达的TCR池，使用与上述相同的试剂盒进行分析(图2)。伴随iPS细胞的建立及T细胞的分化诱导，T细胞表达Vβ的2、3、4、7.1、7.2、8、12、14、16、20及21.3号区段的多样性丧失了，但仍保存了约半数的Vβ池，由此确认再生的T细胞是具有遗传多样性的T细胞群体。

Claims (13)

1.一种介由iPS细胞来制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法，其包括：
(1)自采集的具有遗传多样性的T细胞群体浓缩对于目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的工序，
(2)将上述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持遗传多样性的同时培养iPS细胞的工序，及
(3)自上述培养的iPS细胞制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体来自作为治疗对象的哺乳动物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体为肿瘤浸润T细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中工序(1)的采集的T细胞群体来自血液、淋巴节或体腔积液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中工序(1)包括通过抗原蛋白质或肽的刺激而活化、并分离增殖的T细胞的步骤。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中工序(2)包括不经克隆化而回收iPS细胞，并进行传代的步骤。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中工序(3)所得到的T细胞群体为αβT细胞群体，γδT细胞群体，T辅助细胞群体，T调节细胞群体，细胞毒性T细胞群体，NKT细胞群体，或肿瘤浸润T细胞群体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中工序(3)所得到的T细胞群体用于T细胞补充疗法。
9.通过权利要求1～8中任一项所述的方法能够获得的再生T细胞群体。
10.再生T细胞群体，其能够介由iPS细胞获得，并维持生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性。
11.药物组合物，其含有权利要求9或权利要求10所述的再生T细胞群体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其用于通过自体或同种移植来处理癌症治疗对象。
13.治疗癌症的方法，其中使用根据权利要求11或权利要求12所述的药物组合物。
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