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CN111163807A - 亲脂性肽前体药物 - Google Patents

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CN111163807A
CN111163807A CN201880060520.8A CN201880060520A CN111163807A CN 111163807 A CN111163807 A CN 111163807A CN 201880060520 A CN201880060520 A CN 201880060520A CN 111163807 A CN111163807 A CN 111163807A
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CN
China
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peptide
certain embodiments
prodrug
group
amino acid
Prior art date
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Application number
CN201880060520.8A
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暗嫩·霍夫曼
柴姆·吉伦
约瑟夫·法努斯
阿迪·克林格
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Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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Publication date
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Abstract

本发明涉及具有提高的口服生物利用度和肠道渗透性的基于肽的前体药物的制备方法。所述前体药物的特征在于提高的亲脂性、减少的电荷和通过酶反应经历生物转化(例如在血流中)以形成生物活性肽的倾向性。

Description

亲脂性肽前体药物
技术领域
本发明涉及具有提高的口服生物利用度和肠道渗透性的基于肽的前体药物和它们的制备方法。本发明的前体药物具有提高的亲脂性、减少的电荷和通过酶反应经历生物转化以在所需治疗位置处形成生物活性肽的能力。
背景技术
肽是各种不同的生理和病理过程的关键参与者，并且在调节各种细胞功能中发挥重要作用。然而，肽具有不利的药代动力学和药效学性质，例如快速代谢、不良的生物利用度和非选择性受体活化，这限制了将它们开发成药物。因此，90％的医学上认可的基于肽的药物通过肠胃外途径给药。因此，在开发肽药物中的最重要挑战之一是缺乏能够使通过生物膜的吸收得以进行的适合的理化特性。在口服摄入后，肽类药物会遇到大量消化酶，这些酶将它们降解成可吸收的实体例如氨基酸、二肽和三肽。
口服摄取中的其他主要物理屏障是肠上皮细胞，其占肠道吸收表面中细胞的约80-90％。大多数肽过大且极性过高，无法穿过该屏障并穿透肠道。
已建议了几种方法来改进肽的药物样性质(DLP)。例如，环扫描(cycloscan)方法(Zimmer等，Liebigs Ann.der Chemie,vol.1993,no.5,pp.497–501,May 1993)是基于从具有构象多样性的合理设计的组合文库选择骨架环状肽。另一种建议的解决方案包括从具有构象多样性的专用组合文库“空间筛选”端对端N-甲基化的环状五肽和六肽(Chatterjee等，Acc.Chem.Res.,vol.41,no.10,pp.1331–1342,Oct.2008)。
WO 2014/130949公开了环状DKCLA(Asp-Lys-Cys-Leu-Ala)肽、其衍生物、模拟物、偶联物或拮抗剂，它们用于治疗或预防骨重塑障碍例如自体免疫疾病。所述公开的化合物、特别是亲水性带电荷的肽，不具有提高的肠或细胞渗透性。
旨在改善肽的DLP的另一种流行方法是前体药物方法。在这种方法中，所述前体药物是一种含有母体药物的活性较弱或无活性的化合物，其通过化学或酶促裂解经历一些体内生物转化。所述方法试图将活性化合物递送至其靶点，以克服药代动力学、药效学和毒理学挑战，而不会永久改变所述母体药物的药理特性。
Simplício等(Molecules,vol.13,no.3,pp.519–547,Mar.2008)综述了用于生产胺类的前体药物的已发表的策略。所述综述分为两类主要方法：依赖酶促活化的方法和利用生理化学条件释放药物的方法。
活性药物达比加群是一种非常极性、带正电荷的非肽分子，因此它在口服给药后生物利用度为零。在亲脂性更高的双功能前体药物达比加群酯(dabigatran etexilate)中，两个极性基团脒阳离子和羧酸根组成部分分别被氨基甲酸酯和羧酸酯基团掩蔽，这产生了更好的吸收，在口服给药后生物利用度为7％(G.Eisert等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,vol.30,no.10,pp.1885–9,Oct.2010)。
对显示出提高的生物利用度和肠穿透性的基于肽的药物仍存在着未满足的需求，因此制备所述基于肽的药物是有利的。
发明内容
本发明提供了基于肽的前体药物的制备方法，并涉及通过这些方法形成的基于肽的前体药物。所述基于肽的前体药物降低了母体肽的净电荷，优选地降低到使其不带电荷的程度。结果，得到的前体药物更加亲脂，从而导致它们的生物利用度提高。所述电荷降低通常通过将所述母体肽的某些带电荷的氨基酸侧链和/或带电荷的末端修饰成化学上中性的组成部分来实现。一种特定的修饰向所述得到的前体药物引入中性的氨基甲酸酯组成部分(–NCO2R)，掩蔽了所述母体肽中存在的带正电荷的氨基。另一种修饰向所述得到的前体药物引入中性酯组成部分(–CO2R)，掩蔽了所述母体肽中带负电荷的羧酸根。在某些实施方式中，所述氨基甲酸酯和/或酯源自于伯醇(即R是伯烷基)，使得所述前体药物向活性肽药物的转化被推迟到所述分子跨过肠壁或到达目标治疗位点。
根据一个方面，本发明提供了一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽；和
(b)将所述肽与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应，其中R1是伯烷基，由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，R1是n-C6H13。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个亲核的氮原子。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个–NHR2组成部分，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分，其中R2选自氢和步骤(a)的肽的碳原子。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽是环状肽。
在某些实施方式中，所述环状肽是环状骨架肽。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个伯胺，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NHCO2R1的氨基甲酸酯组成部分。在某些实施方式中，所述至少一个伯胺组成部分包含步骤(a)的肽的N-端末端。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000041
其中NT是步骤(a)的肽的N-端氮原子。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个选自组氨酸、赖氨酸、色氨酸及其组合的氨基酸残基。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000042
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
在某些实施方式中，步骤(b)在碱存在下进行。
在某些实施方式中，所述碱是三乙胺。
在某些实施方式中，步骤(b)在乙腈溶剂中进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(a)的肽或步骤(b)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤(c)。
在某些实施方式中，提供了一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的修饰的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000051
其中
R1是伯烷基，
PG1是碱不稳定性保护基团；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在碱性条件下从步骤(b)的产物除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(d)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000061
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000062
在某些实施方式中，所述方法包括将步骤(c)或(d)的产物与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应的步骤。在某些实施方式中，所述肽前体包含末端伯氨基。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含具有式-NHCO2R1的末端氨基甲酸酯组成部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。
在某些实施方式中，所述肽前体是固相树脂。
在某些实施方式中，所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。
在某些实施方式中，R1是n-C6H13。
在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与所述修饰的氨基酸在偶联剂存在下接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(a)的肽或步骤(b)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤。
在某些实施方式中，提供了一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的被保护的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000081
其中
PG1是碱不稳定性保护基团；
PG2是酸不稳定性保护基团；
n是3或4；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在酸性条件下从步骤(b)的产物除去所述酸不稳定性保护基团PG2；
(d)将步骤(c)的产物与具有选自下述的结构式的化合物反应：
Figure BDA0002415839430000082
其中R1是伯烷基；
(e)在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(f)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000083
并且其中步骤(d)的反应是与具有下述结构式的化合物进行：
Figure BDA0002415839430000091
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下述结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000092
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000093
并且其中步骤(d)的反应是与具有式ClCO2R1的化合物进行。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000094
在某些实施方式中，步骤(b)还包括在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团；和偶联具有第二碱不稳定性保护基团的至少一个另外的氨基酸，其中步骤(e)包括在碱性条件下除去所述第二碱不稳定性保护基团。在某些实施方式中，步骤(b)还包括在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团；和偶联各自具有第二碱不稳定性保护基团的多个另外的氨基酸，其中步骤(e)包括在碱性条件下除去每个所述第二碱不稳定性保护基团。
在某些实施方式中，所述酸不稳定性保护基团是4-甲基三苯甲基(Mtt)。
在某些实施方式中，R1是n-C6H13。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
在某些实施方式中，步骤(d)在选自三甲胺和N,N-二异丙基乙胺的碱的存在下进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(a)的肽或步骤(e)或步骤(f)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤(g)。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(e)或(f)的产物与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应的步骤。在某些实施方式中，所述肽前体包含末端伯氨基。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含具有式-NHCO2R1的末端氨基甲酸酯组成部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。
在某些实施方式中，所述肽前体是固相树脂。
在某些实施方式中，所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。
在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与所述被保护的氨基酸在偶联剂存在下接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。
本发明还提供了一种基于肽的前体药物，其包含至少一个氨基甲酸酯组成部分，其中所述至少一个氨基甲酸酯组成部分选自：
Figure BDA0002415839430000111
其中
R1是伯烷基；并且
NT是所述肽的末端氮原子。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是具有至少一个内部二硫键的基于环状肽的前体药物。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物包含骨架环化。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是生长抑素或生长抑素类似物。
在某些实施方式中，提供了一种基于环状肽的前体药物，其包含至少一个氨基甲酸酯组成部分，其中所述至少一个氨基甲酸酯组成部分选自：
Figure BDA0002415839430000121
其中R1是伯烷基。
从下文给出的详细描述和附图，本发明的其他实施方式、特点、优点和完整适用范围将变得显而易见。然而，应该理解，所述详细描述虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅以说明的方式给出，因为从这个详细描述，在本发明的精神和范围之内的各种不同改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见的。
附图说明
图1A-1C是肽药物(图1A)、BOC电荷掩蔽的肽前体药物(图1B)和Hoc电荷掩蔽的肽前体药物(图1C)的胃肠途径的建议的机制流程图。
图2A是描绘了可口服利用的含有RGD的N-甲基化的(NMe)环六肽的开发的流程图。氨基酸的缩写按照[9]。D-氨基酸被表示为单字母缩写但用小写字母格式。“a”是D-Ala；“r”是D-Arg；“d”是D-Asp。所述D-氨基酸总是获得第1位置，并且被书写在左侧。N-甲基化的氨基酸用单字母缩写的左侧上的上标星号表示。因此，NMe Ala是*A，NMe D-Ala是*a，NMe Arg是*R，NMe D-Arg是*r，NMe Asp是*D，NMe D-Asp是*d，NMe Trp是*W，NMe D-Trp是*w，NMePhe是*F，NMe D-Phe是*f，NMe Val是*V，并且NMe D-Val是*v。Hoc是己氧基羰基。因此，被两个己氧基羰基取代的Arg是R(Hoc)2，并且被两个己氧基羰基取代的N-Me D-Arg是*r(Hoc)2。被甲基酯化的天冬氨酸是D(OMe)。
图2B示出了N-甲基化的环状Ala六肽的某些成员的结构-渗透性关系(SPR)。在右侧示出了4个高度Caco-2渗透性的二-N-甲基化的环状六丙氨酸肽支架(肽#1、2、3、4)的结构。
图3A-3B示出了肽12(c(*aRGDA*A)SEQ ID NO：2)(图3A)及其前体药物肽12P(c(*aR(Hoc)2GD(OMe)A*A)SEQ ID NO：10)(图3B)的结构。
图4示出了肽12(SEQ ID NO：2)和肽12P(SEQ ID NO：10)的Caco-2表观渗透系数(Papp)。(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，**p<0.005。
图5示出了肽12P(SEQ ID NO：10)的Caco-2 A到B和B到A渗透率(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，***p<0.0005。
图6示出了肽12P(SEQ ID NO：10)、环孢菌素A和美托洛尔的Caco-2 Papp外排比(Papp BA/Papp AB)。
图7示出了在维拉帕米(100μM)存在下肽12P(SEQ ID NO：10)的A到B Caco-2 Papp(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，*p<0.05。
图8示出了单独的或与PC一起的肽12P(SEQ ID NO：10)的所指示的A-B和B-ACaco-2 Papp(每组n＝3)。(*)在单独的肽12P(SEQ ID NO：10)的Papp AB与BA之间发现显著差异(P<0.05)。
图9A-9B示出了肽12(SEQ ID NO：2)(图9A)和肽12P(SEQ ID NO：10)(图9B)在大鼠血浆中的代谢稳定性(平均值±SEM)。
图10示出了肽12(SEQ ID NO：2)和肽12P(SEQ ID NO：10)在大鼠BBMV中的代谢稳定性(平均值±SEM)。
图11示出了肽12P(SEQ ID NO：10)在人类肝微粒体存在下(平均值±SEM)和使用Cyp抑制剂(0.1μM酮康唑)和PNL制剂时的代谢稳定性。
图12示出了在肽12P(SEQ ID NO：10)(n＝3)和肽12(SEQ ID NO：2)(n＝4)的5mg/kg口服给药后，针对时间标度作图的血浆浓度。
图13示出了在将分散的12P SNEDDS比对具有酮康唑的12P以及单独的12P在分离的大鼠CYP3A4微粒体中温育30min后肽12P(SEQ ID NO：10)的浓度(每组n＝3)。在12P和具有SNEDDS的分散的12P之间(p<0.01)以及在12P和具有酮康唑的12P之间(P<0.05)发现显著差异。
图14示出了在口服给药5mg/kg肽12P-SNEDDS和肽12后，大鼠中肽12(SEQ ID NO：2)的血浆浓度随时间的变化曲线(每组n＝3)。
图15示出了在5mg/kg肽12P(SEQ ID NO：10)和12的口服给药后和肽12的0.5mg/kg快速浓注给药(标记为12IV)后，大鼠中肽12(SEQ ID NO：2)的血浆浓度随时间的变化曲线的半对数图(每组n＝3)。
图16A-16B示出了肽29(c(*vRGDA*A)，SEQ ID NO：5)(图16A)和肽29P(c(*vR(Hoc)2GD(OMe)A*A)，SEQ ID NO：9)(图16B)的结构。
图17示出了肽29P(SEQ ID NO：9)、肽29(SEQ ID NO：5)和阿替洛尔的Caco-2 A到BPapp(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，**p<0.005。
图18示出了肽29P(SEQ ID NO：9)的Caco-2 Papp：A到B相比于B到A Papp(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，***p<0.0005。
图19示出了肽5(SEQ ID NO：1)和肽5P(SEQ ID NO：11)与阿替洛尔相比的Caco-2Papp(平均值±SEM，n＝3)。
图20示出了肽5P(SEQ ID NO：11)的A到B相比于B到A的渗透率(平均值±SEM，n＝3)。未配对t-检验，**p<0.005。
图21A-21B示出了肽29(SEQ ID NO：5)及其前体药物(SEQ ID NO：11)的NMR分析。图21A是29的溶液状态NMR构象叠加其口服可利用的母体化合物的构象的立体视图。为清晰起见，非极性氢未被示出。图21B示出了29与αvβ3整合蛋白的结合模式。对配体结合重要的受体氨基酸侧链用棍表示。
图22示出了肽29(SEQ ID NO：5)、29P(SEQ ID NO：9)和它们的衍生物以及所检查的对照分子的结构。
图23描绘了从奥曲肽(SEQ ID NO：25)制备前体药物己氧基羰基奥曲肽(奥曲肽-P)的合成途径。
图24示出了肽类似物Somato8(SEQ ID NO：26)及其前体药物Somato8-P的结构。
图25示出了骨架环状生长抑素类似物的结构。A.PTR-3173(SEQ ID NO：27)，B.PTR-3046(SEQ ID NO：28)和C.PTR-3205(SEQ ID NO：29)。
图26示出了生长抑素类似物Somato3M(SEQ ID NO：30)及其前体药物Somato3M-P的结构。
具体实施方式
本公开涉及用于制备肽的前体药物的各种不同的合成方法。在某些实施方式中，所述前体药物通常以两个主要化学特点为特征：(a)肽序列中带电荷原子的减少或排除，例如通过带电荷氨基酸残基和末端氨基和羧酸组成部分的电荷掩蔽；和(b)通过亲脂性基团的引入提供的提高的亲脂性。根据本发明的方法的某些实施方式制备的基于肽的前体药物所表现出的另一个特点是它们在血流或靶组织中，在酶存在下的不稳定性，所述酶将所述前体药物转化成带电荷的生物活性肽药物。
根据某些实施方式，本文中公开的方法的共同特点是将氨基酸和/或氨基酸残基修饰成它们的修饰的对应物，这包括伯醇的酯和/或氨基甲酸酯。在某些实施方式中并且通常地，具有胺组成部分的氨基侧链被转化成具有–NCO2R片段的氨基甲酸酯；而具有羧酸组成部分的氨基侧链被转化成具有–CO2R组成部分的酯。在某些实施方式中，由于所述酯和胺具有伯醇，因此R是一级的，即共价键合到羰基的α-sp3氧的第一个基团是亚甲基。
本发明部分是基于下述发现，即不同于叔氨基甲酸酯，伯氨基甲酸酯不转化成它们相应的胺或铵离子，直至穿过肠壁到达血流和/或淋巴系统之后。不希望受到任何理论或作用机制限制，常用的叔氨基甲酸酯(例如具有叔丁氧基羰基-氨基、N-CO2CMe3组成部分、N-BOC的化合物)在胃肠pH下经历O-CMe3键断裂。相反，伯烷基氨基甲酸酯在穿过肠壁之前相对稳定。因此，叔氨基甲酸酯在到达靶治疗位点之前(通常在肠中)经历O-CMe3键断裂，形成相应的氨基甲酸(具有-N-CO2H片段)，其经历自发脱羧形成胺，并且
.所述胺然后在生理或胃肠pH下被质子化以形成带电荷的肽，其在到达靶治疗位点之前经历降解。另一方面，令人吃惊地发现对于伯氨基甲酸酯来说，只在穿过肠到达所述基于肽的药物在其中最具活性的血流和/或淋巴系统之后才发生类似的一串反应。假设所述差异源自于叔氨基甲酸酯在酸性条件下解离的高度倾向性(因为所述解离产物包括稳定的三级碳正离子)，而伯氨基甲酸酯倾向于在靶治疗位点处，在靶向并断裂O-CH2或羰基–OCH2键的酯酶存在下断开。
为清晰起见，参考图1A-C，不希望受到任何理论或作用机制限制，所述附图解释了不同肽衍生物的途径。图1A指的是肽药物Ia，其穿过胃肠道。由于肽药物Ia遇到相对高浓度的质子，并且由于它包括碱性氮原子(即末端NH2基团、赖氨酸侧链和/或组氨酸侧链)，因此肽药物Ia被质子化，变成带电荷的肽药物Ib。由于带电荷的分子在胃肠道中倾向于快速降解，因此带电荷的肽药物Ib在到达肠之前经历降解。因此，肽药物Ia不能完成其计划的生物学和/或治疗目的。图1B指的是BOC(叔丁氧基羰基)掩蔽的肽前体药物IIa，其穿过胃肠道。由于BOC掩蔽的肽前体药物IIa遇到相对高浓度的质子，并且由于它包括稳定的三级碳正离子片段叔丁基碳正离子IIc，因此它与它的解离产物——稳定的叔丁基碳正离子IIc和肽氨基甲酸酯阴离子IIb处于平衡之中。在质子存在下，肽氨基甲酸酯阴离子IIb经历质子化，以形成肽氨基甲酸IId，其进而经历快速脱羧，形成二氧化碳IIe和肽药物IIf。随后，肽药物IIf进入与图1A的肽药物Ia相似的途径，并通过带电荷的肽药物IIg降解。因此，BOC掩蔽的肽前体药物IIa不能完成其计划的生物学和/或治疗目的。图1C指的是Hoc(己氧基羰基)掩蔽的肽前体药物IIIa，其穿过胃肠道。Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa同样遇到相对高浓度的质子。然而，它包含不稳定的伯碳正离子片段(正己基伯碳正离子)。因此，Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa不与它的解离产物处于平衡之中。相反，Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa是稳定的，并且可以通过肠腔穿过肠道。所述Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa的己基链的亲脂性进一步促进所述穿过。在肠道内部，Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa遇到可以切开伯酯键的酯酶。因此，在穿过肠腔后，Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa经历脱酯化作用形成肽氨基甲酸IIIb，其进而经历快速脱羧，形成二氧化碳IIIc和肽药物IIId。因为Hoc掩蔽的肽前体药物IIIa的活性形式(即肽药物IIId)只在穿透到达血流或淋巴系统后才形成。
在某些实施方式中，本文中公开的某些方法在发生修饰的阶段方面有所不同。尽管在某些方法中修饰在肽合成中氨基酸掺入到前体药物中之前在所述氨基酸上进行；但在某些方法中，修饰在所述肽合成期间在氨基酸残基上进行；并且在某些方法中，修饰在所述肽合成完成之后进行。
术语“前体药物”是指在给药到使用它的个体后，通过靶治疗位点内的化学和/或生物学过程(例如通过水解和/或酶转化)提供活性化合物的化合物。所述前体药物本身可能是有活性的，或者它可能是相对无活性的，随后被转化成更有活性的化合物。
当在本文中单独地或相组合使用时，术语“氨基甲酸酯”是指由通用结构—N(CO)O—表示的化学基团或组成部分。氨基甲酸酯可以具有在氧上取代的烷基或芳基。
应该理解，当提到“–NCO2R”和/或“–NCO2R片段”时是指分子的片段。因此，尽管中性氮原子通常形成三个键，但NCO2R片段被描绘为具有更少的键，以强调形成所述氨基甲酸酯组成部分的羰基碳与氮之间的N-C键。应该理解，所述氮被共价连接到母体肽的其他原子，通常为碳和/或氢。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物的制备方法，所述方法包括：
(a)提供肽；和
(b)将所述肽与具有式XCO2R1的卤代甲酸烷基酯反应，其中R1是伯烷基并且X是卤素，由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，X选自氯和溴。在某些实施方式中，X是氯。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物的制备方法，所述方法包括：
(a)提供肽；和
(b)将所述肽与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应，其中R1是伯烷基，由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物，其通过包括下述步骤的方法来制备：
(a)提供肽；和
(b)将所述肽与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应，其中R1是伯烷基，由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中并且通常来说，通过上述方法制备的肽以具有亲脂性CO2R1片段为特征。具体来说，所述起始肽(即步骤(a)的肽)的骨架内的一个或多个亲核胺组成部分可能对氯甲酸酯具有反应性，形成亲脂性–NCO2R1片段。在某些实施方式中，所述一个或多个亲核胺组成部分源自于选自所述起始肽的氨基末端、组氨酸侧链的氨基组成部分、色氨酸侧链的氨基组成部分、赖氨酸侧链的氨基组成部分及其组合的片段。
在某些实施方式中，R1是伯烷基。
当在本文中使用时，术语“伯烷基”是指烷基，包括取代的烷基、未取代的烷基、直链烷基和支链烷基，只要它的第一个碳原子是一级的即可。对于其上伯烷基被共价连接到氧原子的ClCO2R1、NCO2R1、NR2CO2R1、CO2R1和类似的基团来说，“伯烷基”包含键合到α-sp3氧的亚甲基。
Figure BDA0002415839430000191
在某些实施方式中，所述伯烷基R1选自取代的伯烷基、未取代的伯烷基、直链伯烷基、支链伯烷基、伯烷基芳基、取代的伯烷基芳基、未取代的伯烷基芳基、直链伯烷基芳基、支链伯烷基芳基、伯芳基烷基、取代的伯芳基烷基、未取代的伯芳基烷基、直链伯芳基烷基和支链伯芳基烷基，其中在所述烷基中可能存在也可能不存在杂原子。每种可能性代表独立的实施方式。
在某些实施方式中，优选地所述伯烷基R1不形成稳定的碳正离子(即[R1]+不稳定)，因为假设提高所述碳正离子的稳定性可以促进在前体药物到达血流之前除去所述前体组成部分(pro-moiety)。除了叔碳正离子之外，苯甲基和烯丙基碳正离子也被认为是稳定的，因此，根据某些实施方式，优选地所述伯烷基不是伯苯甲基或烯丙基。
在某些实施方式中，R1是伯烷基，前提是R1不是选自CH2-Ar、CH2-HetAr和CH2-乙烯基的组成部分。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，R1是伯烷基，前提是R1不是伯苯甲基。
当在本文中使用时，术语“苯甲基”是指-CH2-芳基。
当在本文中使用时，术语“芳基”和“Ar”可以互换，并且是指芳香族基团例如苯基、萘基和菲基，其可以任选地含有一个或多个取代基例如烷基、烷氧基、烷基硫基、卤素、羟基、氨基等。
术语“杂芳基”和“HetAr”可以互换，并且是指含有至少一个O、N或S原子的5至14个原子的不饱和环。杂芳基可以任选地被至少一个取代基取代，包括烷基、芳基、环烷基、烷氧基、卤素、氨基等。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、吲哚基等。
当在本文中使用时，术语“乙烯基”是指乙烯基团—CH═CH2，其可以是取代或未取代的。它可以与其他基团组合以提供更大的基团例如乙烯基醚R—O—CH═CH—，其中R可以包括但不限于亚烷基、亚烯基、亚芳基等；乙烯基酮R(C═O)—CH═CH—，等等。
适当情况下，所述氯甲酸烷基酯可以具有上文根据某些实施方式所描述的烷基。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含所述烷基。具体来说，在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个NR2CO2R1组成部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000211
其中NT是步骤(a)的肽的N-端氮原子。
在某些实施方式中，R2选自氢和步骤(a)的肽的碳原子。在某些实施方式中，R2是氢。在某些实施方式中，R2是步骤(a)的肽的碳原子。例如，在所述反应物肽包含赖氨酸残基时，如所述与ClCO2R1的反应可以产生具有下式的片段的肽：
Figure BDA0002415839430000212
其中R2是H，即所述基于肽的前体药物产物包含至少一个NHCO2R1组成部分。可选地，在所述反应物肽包含组氨酸残基的情况下，如所述与ClCO2R1的反应可以产生具有下式的片段的肽：
Figure BDA0002415839430000221
其中R2是组氨酸侧链的碳原子，即所述基于肽的前体药物产物包含至少一个NR2CO2R1组成部分，其中R2是步骤(a)的肽的碳原子。同样地，在所述反应物肽包含色氨酸残基的情况下，如所述与XCO2R1的反应可以产生具有下式的片段的肽：
Figure BDA0002415839430000222
其中R2是色氨酸侧链的碳原子，即所述基于肽的前体药物产物包含至少一个NR2CO2R1组成部分，其中R2是步骤(a)的肽的碳原子。
在某些实施方式中，R1是伯C3-40烷基。在某些实施方式中，R1是伯C4-30烷基。在某些实施方式中，R1是伯C3-20烷基。在某些实施方式中，R1是伯C3-12烷基。在某些实施方式中，R1是伯C4-20烷基。在某些实施方式中，R1是伯C5-20烷基。本领域技术人员应该理解，“Cx-y”烷基是指具有x至y之间的碳原子的如上所定义的烷基。例如，C5-20烷基可以包括但不限于C5H11、C6H13、C8H17、C10H21、C12H25、C14H29、C20H41等。
在某些实施方式中，R1是直链烷基。在某些实施方式中，R1是未取代的烷基。在某些实施方式中，R1是n-CnH2n+1，其中n在3至15或5至12的范围内。在某些实施方式中，R1是n-C6H13。在某些实施方式中，R1是n-C14H29。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽是环状肽。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物环化以形成基于环状肽的前体药物的步骤。
当在本文中使用时，术语“肽”在本领域中是公知的，并被用于指称一系列连接的氨基酸分子。所述术语打算包括短肽序列例如但不限于三肽和更长的蛋白质序列例如但不限于多肽和寡肽两者。所述术语还包括肽杂合体。当在本文中使用时，术语“杂合体”是指具有至少一个其他类型的单体的含有氨基酸的寡聚物和聚合物。例如，杂合寡聚物除了氨基酸之外，还可以包括糖、核苷和/或核苷酸作为构件单体。术语“肽前体药物”和“基于肽的前体药物”可以互换，并且在本文中指称时，是指肽的前体药物变化形式。
当在本文中使用时，术语“环状肽”是指在两个不相邻氨基酸之间具有分子内键的肽。所述环化可以通过共价或非共价键或桥来实现。分子内桥包括但不限于骨架到骨架桥、侧链到骨架桥和侧链到侧链桥。术语“环状肽前体药物”和“基于环状肽的前体药物”可以互换，并且在本文中指称时，是指肽的前体药物变化形式。
在某些实施方式中，所述环状肽具有骨架到骨架分子内桥。在某些实施方式中，所述环状肽具有头到尾分子内桥。在某些实施方式中，所述环状肽具有骨架到骨架头到尾分子内桥。在某些实施方式中，所述环状肽在肽的N-端与C-端之间具有骨架到骨架分子内桥。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到骨架分子内桥。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在肽的N-端与C-端之间具有骨架到骨架分子内桥。
在某些实施方式中，所述环状肽具有骨架到侧链分子内桥。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到侧链分子内桥。
在某些实施方式中，所述环状肽具有侧链到侧链分子内桥。在某些实施方式中，所述环状肽在半胱氨酸侧链残基之间具有侧链到侧链分子内二硫桥。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有侧链到侧链分子内桥。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在两个半胱氨酸侧链残基之间具有侧链到侧链分子内二硫桥。
在某些实施方式中，所述环状肽是生长抑素或生长抑素类似物。
在某些实施方式中，所述环状肽包含选自精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的至少一种氨基酸残基。在某些实施方式中，所述环状肽包含选自精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的至少两种氨基酸残基。在某些实施方式中，所述环状肽包含选自精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的至少三种氨基酸残基。在某些实施方式中，所述环状肽包含精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸氨基酸残基。
在某些实施方式中，所述环状肽包含选自精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的至少一种氨基酸残基。在某些实施方式中，所述环状肽包含选自精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的至少两种氨基酸残基。在某些实施方式中，所述环状肽包含精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸氨基酸残基。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个亲核的氮原子。
术语“亲核的氮原子”是指有机化合物内的氮原子，其在相对温和的条件下对亲电试剂具有反应性。亲电试剂包括但不限于卤代甲酸烷基酯。
在某些实施方式中，所述亲核的氮原子在25℃下，在三甲胺存在下对氯甲酸烷基酯具有反应性。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个–NHR2组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个–NHR2组成部分，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分。
在某些实施方式中，所述至少一个–NHR2组成部分包含至少一个伯胺组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分。在某些实施方式中，所述至少一个–NHR2组成部分选自步骤(a)的肽的氨基末端、组氨酸侧链、色氨酸侧链、赖氨酸侧链及其组合。在某些实施方式中，所述至少一个–NHR2组成部分选自组氨酸侧链、色氨酸侧链、赖氨酸侧链及其组合。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个组氨酸残基。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个色氨酸残基。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个赖氨酸残基。
术语“伯胺组成部分”是指NH2基团。术语“伯胺”是指包含至少一个NH2基团的化合物。
在某些实施方式中，所述至少一个伯胺组成部分包含步骤(a)的肽的N-端末端。
具体来说，在某些实施方式中，步骤(a)的肽是未修饰的起始肽。当所述起始肽未修饰时，它可能包括末端伯胺组成部分，其在胃肠/生理pH下被质子化。在某些实施方式中，将所述肽与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应导致形成电子中性的-NR2CO2R1基团，由此掩蔽了步骤(a)的肽的电荷并形成基于肽的前体药物，其可以抗拒质子化，直至穿透到血流之后。
这些修饰的说明性实例呈现在反应图式A中。
反应图式A–肽CYIQNCPLG-NH2的氨基末端的修饰
Figure BDA0002415839430000261
正如在反应图式A中看到的，作为序列为CYIQNCPLG-NH2(SEQ ID NO：31)的神经肽催产素的化合物A1与氯甲酸伯烷基酯反应，形成前体药物A2(SEQ ID NO：32)。由于前体药物A2既比肽A1更加亲脂，又在生理pH下不带电荷，因此设想了前体药物A2与肽A1相比将具有更好的进入细胞的渗透性。还设想了在血流中，前体药物A2将经历例如与酯酶的酶反应，在血流中形成肽A1，它在那里能够执行它的药理作用(参见例如反应图式B)。在某些实施方式中，R1是n-C14H29(肉豆蔻基)。在某些实施方式中，所述肽是催产素并且R1是肉豆蔻基。
反应图式B–基于催产素的前体药物向肽药物的酶转化：
Figure BDA0002415839430000271
在某些实施方式中并且正如可以理解的，所述起始肽的氨基末端的NH2基团可能不是所述起始肽中唯一的碱性氮。相反，所述起始肽可能在其侧链中包含这些具有亲核氮的氨基酸残基，例如组氨酸、色氨酸和/或赖氨酸。当这些侧链在所述起始肽(即步骤(a)的肽)中出现时，类似的化学转化可能发生在它们相应的亲核氮原子上，从而降低它们的碱性和在到达血流之前形成正电荷的倾向性。此外，类似的化学转化增加了所述前体药物中氨基甲酸酯基团的数目，从而提高了它的亲脂性和血流渗透率。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个氨基酸残基，其包含含有NH和/或NH2组成部分的侧链。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含选自组氨酸、赖氨酸、色氨酸及其组合的至少一种氨基酸残基。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有NR2CO2R1的侧链。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000281
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000282
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000283
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000284
这些修饰的说明性实例呈现在反应图式C中。
反应图式C–肽的氨基末端和氨基侧链的修饰：
Figure BDA0002415839430000291
正如在反应图式C中看到的，作为化合物C1的肽Lys-Trp-His-NH2与氯甲酸伯烷基酯反应形成前体药物C2。由于前体药物C2既比肽A1更加亲脂又在生理pH下不带电荷，因此设想了前体药物C2与肽C1相比将具有更好的进入血流的渗透性。还设想了在血流中，前体药物C2将经历例如与酯酶的酶反应，以在血流中形成肽C1，它能够在那里执行它的药理作用(参见例如反应图式D)。
反应图式D–基于肽的前体药物向肽药物的酶转化：
Figure BDA0002415839430000292
在某些实施方式中并且通常来说，上面呈现的转化(反应图式A和C)涉及将胺转变成氨基甲酸酯。在某些实施方式中，由于含有胺的起始肽是碱性的，因此它们在胃肠/生理pH下可以被质子化，并且因此所述转化需要抑制所述前体药物获得正电荷。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷原子。应该理解，生理pH在7.3左右。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷原子。
在某些实施方式中并且正如本领域技术人员所理解的，在碱存在下可以促进步骤(b)的反应。不希望受到任何理论或作用机制限制，步骤(a)的肽可以包括质子化的氮原子。因此，所述质子化的氮原子可以显示出非常低的亲核性和与氯甲酸烷基酯反应的倾向性。结果，添加的碱可以将所述起始肽的质子化的氮原子去质子化并促进所述反应。
在某些实施方式中，步骤(b)在碱存在下进行。在某些实施方式中，步骤(b)还包括向步骤(b)的混合物添加碱。
在某些实施方式中，所述碱选自胺、碳酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物或其组合。在某些实施方式中，所述碱是胺。在某些实施方式中，所述碱是三甲胺和/或N,N-二异丙基乙胺。在某些实施方式中，所述碱是三乙胺。在某些实施方式中，所述碱是N-二异丙基乙胺。
在某些实施方式中，步骤(b)在选自乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇及其混合物的溶剂中进行。在某些实施方式中，所述溶剂是乙腈。
在某些实施方式中，尽管上面提出的转化需要抑制所述前体药物获得正电荷，但抑制肽中的负电荷以提高所述前体药物的血流渗透率，可能也是合乎需要的。在某些实施方式中并且通常地，肽上的负电荷可能源自于羧酸基团例如起始肽的羧基端、谷氨酸侧链和/或天冬氨酸侧链。已发现，这些负电荷可以使用SOCl2介导的酯化来掩蔽。还已发现，在给药所述酯化的前体药物后，在到达靶治疗位点之前所述酯基团可以保持完整；而在这个位点中，它们经历酶促脱酯成为它们的先前状态。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽至少包含COOH组成部分。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个氨基酸残基，其包含含有COOH组成部分的侧链。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含选自天冬氨酸、谷氨酸及其组合的至少一个氨基酸残基。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含至少一个天冬氨酸残基。在某些实施方式中，步骤(a)的肽包含含有至少一个谷氨酸残基的肽。
应该理解，所述酯化可以在所述起始肽与氯甲酸烷基酯的反应之前或之后进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(a)的肽酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(b)的前体药物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(a)的肽或步骤(b)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤。在某些实施方式中，所述酯化试剂选自亚硫酰氯、草酰氯、五氯化磷、三氯化磷、磷酰氯、光气、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和二碳酸二叔丁酯。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述酯化试剂是亚硫酰氯。
在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤(c)。在某些实施方式中，步骤(a)还包括将所述肽与醇在酯化试剂存在下反应。
在某些实施方式中，提供了一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的修饰的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000321
其中
R1是伯烷基，
PG1是碱不稳定性保护基团；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在碱性条件下从步骤(b)的产物除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(d)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物，其通过包括下述步骤的方法制备：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的修饰的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000331
其中
R1是伯烷基，
PG1是碱不稳定性保护基团；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在碱性条件下从步骤(b)的产物除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(d)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中并且通常来说，通过上述方法制备的肽以具有亲脂性CO2R1片段为特征。具体来说，所述充当构件的修饰的氨基酸为所述前体药物提供亲脂性氨基甲酸酯片段。
制备所述修饰的氨基酸构件的说明性实例呈现在反应图式E-I中：
反应图式E：修饰的精氨酸的制备：
Figure BDA0002415839430000341
反应图式F：修饰的精氨酸的制备：
Figure BDA0002415839430000342
反应图式G：修饰的赖氨酸的制备：
Figure BDA0002415839430000343
反应图式H：修饰的色氨酸的制备：
Figure BDA0002415839430000351
反应图式I：修饰的组氨酸的制备：
Figure BDA0002415839430000352
当在本文中使用时，“Z”表示羧基苯甲基；“Fmoc-2-MBT”表示Fmoc-2-巯基苯并噻唑；“Fmoc”表示芴基甲氧羰基；“Tf2O”表示三氟甲磺酸酐；“Tf”表示三氟甲磺酰基；并且“Boc”表示叔丁氧基羰基。
在某些实施方式中，R1是如上文中所定义的伯烷基。在某些实施方式中，R2如上文中所定义。在适合情况下，反应图式E-I中的氯甲酸烷基酯可以具有如上根据某些实施方式所描述的烷基。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含所述烷基。具体来说，在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个NR2CO2R1组成部分。
在某些实施方式中，步骤(d)包括偶联至少一个另外的氨基酸。在某些实施方式中，步骤(d)包括偶联多个另外的氨基酸。在某些实施方式中，所述另外的氨基酸是被保护的氨基酸。在某些实施方式中，所述另外的氨基酸是氨基被保护的氨基酸。在某些实施方式中，所述氨基被保护的氨基酸被碱不稳定性保护基团保护。
术语“多个”是指至少两个。
在某些实施方式中并且正如所理解的，上述方法是指向基于肽的前体药物的骨架并入修饰的氨基酸构件。具体来说，它是指向所述基于肽的前体药物的骨架并入修饰的精氨酸、色氨酸、赖氨酸和/或组氨酸构件。所述并入可以在所述肽合成期间进行，并因此可以设置一个阶段，此时将精氨酸、色氨酸、赖氨酸和/或组氨酸并入以形成所需肽。在某些实施方式中，当精氨酸、色氨酸、赖氨酸和/或组氨酸被最后插入(即肽的前体药物具有精氨酸、色氨酸、赖氨酸或组氨酸的末端残基)时，步骤(d)中另外的氨基酸的偶联可能是不需要的。另一方面，在精氨酸、色氨酸、赖氨酸和/或组氨酸将被插入到所述肽序列中的其他位置中的实施方式中，可能需要在步骤(d)中偶联另外的氨基酸。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物环化以形成基于环状肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在所述肽的N-端与C-端之间具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有侧链到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在两个半胱氨酸侧链残基之间具有侧链到侧链分子内二硫键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物不包括氨基末端。
在某些实施方式中，所述环状肽是生长抑素或生长抑素类似物。
在某些实施方式中，步骤(b)的修饰的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000371
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000372
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有下式：
Figure BDA0002415839430000373
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有下式：
Figure BDA0002415839430000374
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有下式：
Figure BDA0002415839430000381
在某些实施方式中，所述修饰的氨基酸具有下式：:
Figure BDA0002415839430000382
当在本文中使用时，术语“固相树脂”、“固相支持树脂”和“固相支持物”可以互换，并且打算意味着不溶性聚合物基质，在其上可以合成或偶联分子例如采取多肽形式的配体，并且在其之间具有或不具有连接物或间隔物。固相支持树脂通常用于肽合成中。这些聚合物通常以珠子的形式使用。优选用于肽合成的聚合物树脂是聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等，特别是苯乙烯与二乙烯苯的共聚物。在与第一个氨基酸偶联之前，所述固相支持树脂含有表面官能团或者可以被衍生以含有表面官能团，所述官能团可以与氨基酸(或肽)的胺基相互作用，以便将所述氨基酸(或肽)通过所述肽的胺基直接或间接附连到所述支持物。当在本文中使用时，固相树脂不限于采取在第一次偶联氨基酸或肽之前的形式的母体商业化衍生树脂。相反，在所述第一次偶联氨基酸后和在肽合成期间，尽管所述树脂被偶联到生长中的肽，但所述树脂仍被当作固相树脂。在某些实施方式中，所述固相树脂被偶联到至少一个氨基酸。在某些实施方式中，所述固相树脂不被偶联到氨基酸。
当在本文中使用时，术语“肽前体”是指被用于肽的制备的化学化合物。所述术语包括但不限于氨基酸、肽、肽杂合体、未偶联到氨基酸的固相树脂和偶联到氨基酸的固相树脂。
在某些实施方式中，所述肽前体包含末端伯氨基。在某些实施方式中，所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是未偶联到氨基酸的固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是偶联到至少一个氨基酸的固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是肽。在某些实施方式中，所述肽前体是氨基酸。在某些实施方式中，所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
当在本文中使用时，“FMOC”表示芴基甲氧羰基，“DIC”表示二异丙基碳二亚胺；“DMF”表示二甲基甲酰胺；“TBAF”是指四正丁基氟化铵；“DCC”是指二环己基碳二亚胺。
使用精氨酸和固相树脂生产所述基于肽的前体药物的方法的说明性实例呈现在反应图式J中：
反应图式J–向肽并入修饰的精氨酸：
Figure BDA0002415839430000391
正如在反应图式J中看到的，作为化合物J1的被CO2R1基团修饰并用Fmoc保护的精氨酸与具有游离的未保护的NH2基团的固相树脂在标准的偶联条件下反应。随后，作为肽延伸的一部分将产物树脂与苯丙氨酸偶联，以形成结合到树脂的修饰的二肽，其可以被进一步延伸或从所述树脂移除。
使用赖氨酸和固相树脂生产所述基于肽的前体药物的方法的说明性实例呈现在反应图式K中：
反应图式K–向肽并入修饰的赖氨酸：
Figure BDA0002415839430000401
正如在反应图式K中看到的，作为化合物K1的被CO2R1基团修饰并用Fmoc保护的赖氨酸与偶联到甘氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。这形成结合到树脂的修饰的二肽，其可以被进一步延伸或从所述树脂移除。
使用色氨酸和偶联到氨基酸的固相树脂生产所述基于肽的前体药物的方法的说明性实例呈现在反应图式L中：
反应图式L–向肽并入修饰的色氨酸：
Figure BDA0002415839430000402
正如在反应图式L中看到的，作为化合物L1的被CO2R1基团修饰并用Fmoc保护的色氨酸与偶联到丙氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。随后，作为肽延伸的一部分将产物与亮氨酸偶联，以形成结合到树脂的修饰的三肽，其可以被进一步延伸或从所述树脂移除。
使用组氨酸和氨基酸生产所述基于肽的前体药物的方法的说明性实例呈现在反应图式M中：
反应图式M–向肽并入修饰的组氨酸：
Figure BDA0002415839430000411
正如在反应图式M中看到的，作为化合物M1的被CO2R1基团修饰并用Fmoc保护的组氨酸与异亮氨酸乙基酯在标准的偶联条件下反应。这形成修饰的二肽，其可以被进一步延伸或去保护。
设想了在血流中，按照上述方法制备的前体药物将经历例如与酯酶的酶反应，以在血流中形成相应的肽，它们在那里能够执行它们的药理作用(参见例如反应图式D和N)。反应图式N示出了基于肽的前体药物N1(SEQ ID NO：33)向肽药物N2(血管加压素，SEQ IDNO：34)的酶转化。
反应图式N–基于肽的前体药物向肽药物的酶转化
Figure BDA0002415839430000421
在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤(e)。在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，所述PG1是碱不稳定性保护基团。术语“碱不稳定性保护基团”是指可以通过用水性或非水性碱处理来移除的保护基团。在某些实施方式中，所述PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。
在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与修饰的氨基酸在氨基酸偶联剂存在下相接触。在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与修饰的氨基酸在偶联剂存在下相接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。在某些实施方式中，所述碳二亚胺是二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。每种可能性代表独立的实施方式。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有NCO2R1和/或NHCO2R1组成部分的侧链。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有-NR2CO2R1组成部分的侧链。在某些实施方式中，所述NR2CO2R1组成部分具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000431
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000441
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000442
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000443
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000451
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000452
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000453
在某些实施方式中并且通常来说，上文呈现的转化(反应图式J、K、L和M)涉及将胺转变成氨基甲酸酯。在某些实施方式中，由于所述含有胺的起始肽是碱性的，因此它们在胃肠/生理pH下可能被质子化，并且因此所述转化需要抑制所述前体药物获得正电荷。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷原子。
在某些实施方式中并且正如上文提到的，抑制肽中的负电荷以提高所述前体药物的血流渗透率，可能也是合乎需要的。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸至少包含COOH组成部分。在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸包含至少一个氨基酸残基，其包含含有COOH组成部分的侧链。在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸包含选自天冬氨酸、谷氨酸及其组合的至少一个氨基酸残基。
应该理解，所述酯化可以在所述起始肽前体与所述修饰的氨基酸的反应之前或之后进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将所述COOH组成部分酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将选自肽前体、步骤(c)的产物或步骤(d)的产物的含有COOH的化合物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(c)或(d)的产物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(d)的产物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(d)的前体药物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述酯化包括将含有COOH的化合物与醇在酯化试剂存在下进行反应。在某些实施方式中，所述酯化试剂选自亚硫酰氯、草酰氯、五氯化磷、三氯化磷、磷酰氯、光气、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和二碳酸二叔丁酯。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述酯化试剂是亚硫酰氯。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下反应的步骤(e)。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个COOR3组成部分。在某些实施方式中，R3不是氢或金属。在某些实施方式中，R3是烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基、乙基和异丙基的烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基和乙基的烷基。在某些实施方式中，R3是乙基。
在某些实施方式中，所述COOR3组成部分是选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸侧链的一部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含不超过单个COOH基团。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含COOH基团。
在某些实施方式中，提供了一种用于制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的被保护的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000481
其中
PG1是碱不稳定性保护基团；
PG2是酸不稳定性保护基团；
n是3或4；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在酸性条件下从步骤(b)的产物除去所述酸不稳定性保护基团PG2；
(d)将步骤(c)的产物与具有选自下述的结构式的化合物反应
Figure BDA0002415839430000482
其中R1是伯烷基；
(e)在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(f)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物，其通过包括下述步骤的方法来制备：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的被保护的氨基酸偶联：
Figure BDA0002415839430000483
其中
PG1是碱不稳定性保护基团；
PG2是酸不稳定性保护基团；
n是3或4；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在酸性条件下从步骤(b)的产物除去所述酸不稳定性保护基团PG2；
(d)将步骤(c)的产物与具有选自下述的结构式的化合物反应
Figure BDA0002415839430000491
其中R1是伯烷基；
(e)在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团PG1；和
(f)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
在某些实施方式中并且通常地，通过上述方法制备的肽以具有亲脂性的CO2R1片段为特征。具体来说，在所述方法期间一个或多个氨基酸残基被修饰，从而向所述前体药物提供亲脂性NR2CO2R1片段。
在某些实施方式中，R1是如上文中所定义的伯烷基。在某些实施方式中，R2如上文中所定义。在适合情况下，所述氯甲酸烷基酯和步骤(d)中的修饰的胍可能具有如上根据某些实施方式所描述的烷基。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含所述烷基。具体来说，在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基甲酸酯组成部分。
在某些实施方式中，步骤(f)包括偶联一个另外的氨基酸。在某些实施方式中，步骤(f)包括偶联多个另外的氨基酸。
在某些实施方式中并且正如所理解的，上述方法涉及基于肽的前体药物的骨架内的氨基酸残基的修饰。具体来说，它涉及在所述基于肽的前体药物的骨架中形成修饰的精氨酸、色氨酸、赖氨酸和/或组氨酸残基。所述在步骤(d)中完成的修饰可以在肽合成的不同阶段中进行，取决于例如所需的修饰的氨基酸的数目和它们被并入以形成所需肽时的阶段。在某些实施方式中，步骤(b)还包括在偶联被保护的氨基酸(步骤(b)中所定义)之后偶联至少一个另外的氨基酸。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物环化以形成基于环状肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在所述肽的N-端与C-端之间具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有侧链到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有在两个半胱氨酸侧链残基之间的侧链到侧链分子内二硫键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物不包括氨基末端。
在某些实施方式中，所述环状肽是生长抑素或生长抑素类似物。
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000501
在某些实施方式中，步骤(d)的反应使用具有下述结构式的化合物：
Figure BDA0002415839430000511
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000512
并且步骤(d)的反应使用具有下述结构式的化合物：
Figure BDA0002415839430000513
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000514
当在本文中使用时，“Mtt”表示4-甲基三苯甲基；“NMP”表示N-甲基吡咯烷酮；“HATU”表示1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；“TIPS”表示三异丙基甲硅烷；并且“HOAt”表示1-羟基-7-氮杂苯并三唑。
使用鸟氨酸和固相树脂生产所述基于肽的前体药物的方法的说明性实例呈现在反应图式O中：
反应图式O–向肽并入修饰的精氨酸：
Figure BDA0002415839430000521
正如在反应图式O中看到的，作为化合物O1的在侧链处用酸不稳定性Mtt基团修饰并在α氮处用碱不稳定性Fmoc基团修饰的鸟氨酸与偶联到丙氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。随后，除去所述碱不稳定性Fmoc基团，并且作为肽延伸的一部分将产物与亮氨酸偶联。然后，在酸性条件下除去酸不稳定性Mtt基团，并将产物与修饰的胍O2反应，以形成结合到树脂的修饰的三肽，其可以被进一步延伸或从树脂移除。
在某些实施方式中，所述反应序列可以被改变。使用鸟氨酸和固相树脂的类似方法的说明性实例呈现在反应图式P中：
反应图式P–向肽并入修饰的精氨酸：
Figure BDA0002415839430000531
正如在反应图式P中看到的，作为化合物P1的在侧链处用酸不稳定性Mtt基团修饰并在α氮处用碱不稳定性Fmoc基团修饰的鸟氨酸与偶联到丙氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。然后，在酸性条件下除去酸不稳定性Mtt基团，并将产物与修饰的胍O2反应，以形成结合到树脂的修饰的二肽。随后，除去所述碱不稳定性Fmoc基团，并且作为肽延伸的一部分将产物与亮氨酸偶联，以形成结合到树脂的修饰的三肽，其可以被进一步延伸或从树脂移除。
所述修饰的胍O2可以如反应图式Q中所示来制备：
反应图式Q–修饰的胍O2的制备：
Figure BDA0002415839430000532
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000541
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000542
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000543
在某些实施方式中，所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000544
在某些实施方式中，步骤(d)的反应使用具有式ClCO2R1的化合物。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000551
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000552
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000553
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000554
在某些实施方式中，步骤(b)还包括在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团；以及偶联至少一个具有第二碱不稳定性保护基团的另外的氨基酸，其中步骤(e)包括在碱性条件下除去所述第二碱不稳定性保护基团。在某些实施方式中，步骤(b)还包括在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团；以及偶联多个各自具有第二碱不稳定性保护基团的另外的氨基酸，其中步骤(e)包括在碱性条件下除去每个所述第二碱不稳定性保护基团。
在某些实施方式中，步骤(a)还包括偶联至少一个具有另外的碱不稳定性保护基团的另外的氨基酸，以及在碱性条件下除去所述另外的碱不稳定性保护基团。
在某些实施方式中，步骤(a)还包括偶联至少一个具有在先碱不稳定性保护基团的在先氨基酸，以及在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团。
包括色氨酸、赖氨酸和组氨酸的修饰的方法的说明性实例呈现在反应图式R和S中：
反应图式R–向肽并入修饰的赖氨酸：
Figure BDA0002415839430000571
正如在反应图式R中看到的，作为化合物R1的在侧链处用酸不稳定性Mtt基团修饰并在α氮处用碱不稳定性Fmoc基团修饰的赖氨酸与偶联到丙氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。随后，除去所述碱不稳定性Fmoc基团，并且作为肽延伸的一部分将产物与亮氨酸偶联。然后，在酸性条件下除去酸不稳定性Mtt基团，并将产物与氯甲酸烷基酯反应，以形成结合到树脂的修饰的三肽，其可以被进一步延伸或从树脂移除。
当在本文中使用时，“DIEA”代表N,N-二异丙基乙胺。
在某些实施方式中，所述反应序列可以被改变。使用组氨酸和固相树脂的类似方法的说明性实例呈现在反应图式S中：
反应图式S–向肽并入修饰的组氨酸：
Figure BDA0002415839430000581
正如在反应图式S中看到的，作为化合物S1的在侧链处用酸不稳定性Mtt基团修饰并在α氮处用碱不稳定性Fmoc基团修饰的组氨酸与偶联到丙氨酸的固相树脂在标准的偶联条件下反应。然后，在酸性条件下除去酸不稳定性Mtt基团，并将产物与氯甲酸烷基酯反应，以形成结合到树脂的修饰的二肽。随后，除去所述碱不稳定性Fmoc基团，并且作为肽延伸的一部分将产物与亮氨酸偶联，以形成结合到树脂的修饰的三肽，其可以被进一步延伸或从树脂移除。
在某些实施方式中并且正如本领域技术人员所理解的，与反应图式R和S中所呈现的相似的反应序列，可以使用具有下述结构式的修饰的色氨酸来进行：
Figure BDA0002415839430000582
在某些实施方式中，所述肽前体包含末端伯氨基。在某些实施方式中，所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是未偶联到氨基酸的固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是偶联到至少一个氨基酸的固相树脂。在某些实施方式中，所述肽前体是肽。在某些实施方式中，所述肽前体是氨基酸。在某些实施方式中，所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤(g)。在某些实施方式中，所述方法还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤。
在某些实施方式中，所述PG1是碱不稳定性保护基团。在某些实施方式中，所述PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。在某些实施方式中，所述PG2是酸不稳定性保护基团。术语“酸不稳定性保护基团”是指可以通过用水性或非水性酸处理来除去的保护基团。在某些实施方式中，所述PG1是4-甲基三苯甲基(Mtt)。
在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与所述被保护的氨基酸在氨基酸偶联剂存在下相接触。在某些实施方式中，步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与所述被保护的氨基酸在偶联剂存在下相接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。在某些实施方式中，所述碳二亚胺是二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。每种可能性代表独立的实施方式。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有-NCO2R1和/或NHCO2R1组成部分的侧链。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有-NR2CO2R1组成部分的侧链。在某些实施方式中，所述NR2CO2R1组成部分具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000601
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000602
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000611
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000612
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000613
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000614
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000621
在某些实施方式中并且通常地，上面呈现的转化(反应图式O、P、R和S)涉及制备包含氨基甲酸酯的肽作为包含胺的肽的前体药物。在某些实施方式中，由于所述含有胺的肽是碱性的，因此它们在胃肠/生理pH下可以被质子化，并且因此所述转化需要抑制所述前体药物获得正电荷。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷原子。
在某些实施方式中，步骤(d)在选自三甲胺和N,N-二异丙基乙胺的碱存在下进行。
在某些实施方式中并且正如上文提到的，抑制肽中的负电荷以提高所述前体药物的血流渗透率，可能也是合乎需要的。
在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸至少包含COOH组成部分。在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸包含至少一个氨基酸残基，其包含含有COOH组成部分的侧链。在某些实施方式中，步骤(a)的肽前体和/或所述至少一个另外的氨基酸包含选自天冬氨酸、谷氨酸及其组合的至少一个氨基酸残基。
应该理解，根据某些实施方式，所述酯化可以在所述起始肽前体与所述修饰的氨基酸的反应之前或之后进行。
在某些实施方式中，所述方法还包括将所述COOH组成部分酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将选自肽前体、步骤(e)的产物或步骤(f)的产物的含有COOH的化合物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(e)或(f)的产物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(f)的产物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(f)的前体药物酯化的步骤。在某些实施方式中，所述酯化包括将所述含有COOH的化合物与醇在酯化试剂存在下进行反应。在某些实施方式中，所述酯化试剂选自亚硫酰氯、草酰氯、五氯化磷、三氯化磷、磷酰氯、光气、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和二碳酸二叔丁酯。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述酯化试剂是亚硫酰氯。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下进行反应的步骤。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯存在下进行反应的步骤(g)。
在某些实施方式中，所述方法还包括将步骤(e)或(f)的产物与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯进行反应的步骤。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个COOR3组成部分。在某些实施方式中，R3不是氢或金属。在某些实施方式中，R3是烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基、乙基和异丙基的烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基和乙基的烷基。在某些实施方式中，R3是乙基。
在某些实施方式中，所述COOR3组成部分是选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸侧链的一部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含不超过单个COOH基团。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含COOH基团。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物，其包含至少一个氨基甲酸酯组成部分，其中所述至少一个氨基甲酸酯组成部分选自：
Figure BDA0002415839430000641
其中
R1是伯烷基；并且
NT是所述基于肽的前体药物的N-端氮原子。
在某些实施方式中，所述氨基甲酸酯组成部分具有式NR2CO2R1。
在某些实施方式中，所述氨基甲酸酯组成部分具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000651
在某些实施方式中，所述氨基甲酸酯组成部分具有选自下述的结构式：
Figure BDA0002415839430000652
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000661
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000662
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000663
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure BDA0002415839430000664
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含具有式NTHCO2R1的N-端氮原子。
在某些实施方式中，提供了一种基于肽的前体药物，其包含含有末端氮原子的氨基端、羧基端和至少一个-NR2CO2R1组成部分，其中所述至少一个-NR2CO2R1组成部分选自：
Figure BDA0002415839430000671
其中
R1是伯烷基；并且
NT是所述末端氮原子。
在某些实施方式中并且通常地，如上所提供的肽以具有亲脂性CO2R1片段为特征。具体来说，所述充当构件的修饰的氨基酸为所述前体药物提供亲脂性氨基甲酸酯片段。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物可以按照上述任一方法来制备。
在某些实施方式中，R1是如上文中所定义的伯烷基。在某些实施方式中，R2如上文中所定义。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含2至50个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含2至35个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含2至20个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含3至50个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含3至35个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含3至20个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含4至50个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含4至35个之间的氨基酸。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含4至20个之间的氨基酸。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物是基于环状肽的前体药物。
在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在所述肽的N-端与C-端之间具有骨架到骨架分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有骨架到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物具有侧链到侧链分子内键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物在两个半胱氨酸侧链残基之间具有侧链到侧链分子内二硫键。在某些实施方式中，所述基于环状肽的前体药物不包括氨基末端。
在某些实施方式中，所述环状肽是生长抑素或生长抑素类似物。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少两个-NR2CO2R1组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少三个-NR2CO2R1组成部分。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少四个-NR2CO2R1组成部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含不超过单个伯胺基团。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含伯胺基团。应该理解，所述“伯胺基团”是指胺，并且不包括酰胺，因此，例如，包括伯–CONH2基团的肽可能仍然不含伯氨基。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含组氨酸、精氨酸、色氨酸和/或赖氨酸残基，每个所述残基包含-NR2CO2R1组成部分。
在某些实施方式中，所述-NR2CO2R1组成部分具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000691
在某些实施方式中，所述-NR2CO2R1组成部分具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000692
在某些实施方式中，所述-NR2CO2R1组成部分具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000693
在某些实施方式中，所述-NR2CO2R1组成部分具有下述结构式：
Figure BDA0002415839430000701
在某些实施方式中，所述-NR2CO2R1组成部分具有式NTHCO2R1。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个氨基酸残基，其包含含有-NR2CO2R1组成部分的侧链。
当在本文中使用时，术语“氨基端”(缩写为N-端)是指在肽或基于肽的前体药物的氨基端处游离或修饰的(例如NHCO2-烷基)α-氨基(组成部分)。术语“末端氮原子”是指所述氨基端的氮原子。
同样地，术语“羧基端”是指在肽或基于肽的前体药物的羧基端上的游离或酯化的羧基。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在生理pH下不含带电荷原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷的氮原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下具有净中性电荷。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带正电荷的原子。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物在胃肠pH下不含带电荷原子。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含至少一个CH2COOR3组成部分。在某些实施方式中，R3不是氢或金属。在某些实施方式中，R3是烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基、乙基和异丙基的烷基。在某些实施方式中，R3是选自甲基和乙基的烷基。在某些实施方式中，R3是乙基。
在某些实施方式中，所述CH2COOR3组成部分是选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸侧链的一部分。
在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物包含不超过单个COOH基团。在某些实施方式中，所述基于肽的前体药物不含COOH基团。
提供了包含至少一种本文中所公开的基于肽的前体药物的药物组合物。
根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式，使用一种或多种生理上可接受的载体来配制，所述载体包含便于将活性化合物加工成可药物使用的制剂的赋形剂和辅助剂。适合的制剂取决于所选的给药途径。
根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于口服给药。
根据其他实施方式，所述药物组合物被配制成用于肠胃外给药。
根据某些实施方式，所述制剂还包含适合于口服或肠胃外给药的赋形剂、载体或稀释剂。在本发明中使用的适合的可药用赋形剂包括本领域普通技术人员所知的那些，例如稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂。稀释剂可以包括但不限于乳糖、微晶体纤维素、磷酸氢二钙、甘露糖醇、纤维素等。粘合剂可以包括但不限于淀粉、藻酸盐、胶质、纤维素、乙烯基聚合物、糖等。润滑剂可以包括但不限于硬脂酸盐例如硬脂酸镁、滑石、胶体二氧化硅等。
根据某些实施方式，根据本发明的药物组合物包含至少一种吸收促进剂，例如但不限于纳米粒子、胡椒碱、姜黄素和白藜芦醇。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含选自下述的递送系统：纳米脂球前体(Pro-NanoLipospheres)(PNL)组合物，高级PNL和自纳米乳化药物递送系统(SNEDDS)。
根据某些实施方式，本发明的药物组合物和用途可以包含至少一种另外的活性药剂。
为了更充分地说明本发明的某些实施方式，提出了下述非限制性实施例。然而，它们绝不应该被解释为限制本发明的广阔范围。专业技术人员可以容易地设计本文中公开的原理的许多变化形式和改良形式，而不背离本发明的范围。
实施例
材料和方法
层析
半制备型反相HPLC使用Waters的仪器来进行：Waters 2545(二元梯度模块)，Waters SFO(系统流体管理器)，Waters 2996(光电二极管阵列检测器)，Waters 2767(样品管理器)。使用Dr.Maisch C18-柱：Reprosil 100 C18，5μm，150x 30mm。所述半制备型RP-HPLC使用40mL/min的流速，使用H2O(0.1％v/v三氟乙酸(TFA))和乙腈(0.1％v/v TFA)的线性梯度(20min)来运行。分析型HESI HPLC-MS(加热电喷雾电离质谱)在连接有UltiMate3000UHPLC focused(Dionex)的LCQ Fleet(Thermo Scientific)上进行，使用C18柱：S1：Hypersil Gold aQ
Figure BDA0002415839430000731
3μm，150x 2.1mm(用于8或20分钟测量)；S2：Accucore C18，
Figure BDA0002415839430000732
2.6μm，50x 2.1mm(用于5分钟测量)(Thermo Scientific)。使用以H2O(0.1％v/v甲酸)和乙腈(0.1％v/v甲酸)作为洗脱剂的线性梯度(5％-95％的乙腈含量)。
NMR
所有NMR共振在DMSO-d6中，在298K(除了温度梯度共振之外)和400MHz或500MHz的质子共振频率下指派。化学位移以2.50ppm处的DMSO 1H共振和39.51ppm处的DMSO 13CMe共振为参比。
环状肽的合成
CTC-树脂的装载。肽合成使用CTC-树脂(0.9mmol/g)，遵照标准的Fmoc策略来进行。在无水DCM(0.8mL/g树脂)中，在室温(rt)下，将Fmoc-Xaa-OH(1.2eq.)用N,N-二异丙基乙胺(DIEA；2.5eq.)附连到所述CTC-树脂1h。通过添加MeOH(1mL/g(树脂))、DIEA(5:1；v:v)的溶液将剩余的三苯甲基-氯化物基团封端15min。将树脂过滤，用DCM清洗5次并用MeOH清洗三次。装载容量通过所述树脂在真空下干燥后的重量来确定，并在0.4-0.9mmol/g的范围内。
树脂上Fmoc去保护。将Fmoc肽基-树脂用NMP中的20％哌啶(v/v)处理10分钟，并第二次处理5分钟。将树脂用NMP清洗5次。
标准的氨基酸偶联。将Fmoc-Xaa-OH(2eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸脲(HATU)(2eq.)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt；2eq.)和DIEA(3eq.)在NMP(1mL/g树脂)中的溶液添加到游离氨基肽基-树脂，在室温下振摇60min，并用NMP清洗5次。
树脂上N-甲基化。将直链的Fmoc去保护的肽用DCM清洗(3x)，在室温下，与2-硝基苯磺酰氯(o-Ns-Cl，4eq.)和2,4,6-三甲吡啶(10eq.)在DCM中的溶液温育20min。将所述树脂用DCM(3x)和THF abs.(5x)清洗。将在THF abs.中含有PPh3(5eq.)和MeOH abs.(10eq.)的溶液添加到树脂。将在少量THF abs.中的DIAD(5eq.)逐步添加到树脂，并将所述溶液温育15min，用THF(5x)和NMP(5x)清洗。对于o-Ns去保护来说，将所述o-Ns-肽基-树脂在巯基乙醇(10eq.)和DBU(5eq.)在NMP中的溶液中(1mL/g树脂)搅拌5分钟。将所述去保护程序再重复一次，并将树脂用NMP清洗5次。
从树脂切下直链肽。为了从树脂完整切下，将所述肽用DCM和六氟异丙醇(HFIP；4:1；v:v)的溶液在室温下处理三次共半小时，并在减压下蒸发掉溶剂。
使用二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)的环化。向肽在DMF中的溶液(1mM肽浓度)和NaHCO3(5eq.)在室温(rt)下添加DPPA(3eq.)，并搅拌过夜或直至通过HPLC-MS不能观察到直链肽。在减压下蒸发溶剂至小体积，将肽在饱和NaCl溶液中沉淀，并在HPLC级的水中清洗两次。
酸不稳定性侧链保护基团的去除。将环化的肽在TFA、水和TIPS(95:2.5:2.5)的溶液中在室温搅拌1小时或直至通过HPLC-MS不再能够观察到被保护的肽，并在二乙醚中沉淀。在离心和倾析后收集所述沉淀的肽。将该沉淀的肽用二乙醚清洗并收集两次。
溶液中的Dde去保护。Dde-保护基团(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)的正交去保护使用水合肼在二甲基甲酰胺(DMF)中的2vol％溶液在室温进行30min。反应进度通过HPLC-MS来监测。在反应完成后，将所述肽用饱和NaCl水溶液沉淀，并用水清洗两次。
溶液中的胍基化。将Dde去保护的肽在1H-吡唑-甲脒盐酸盐(2.0eq.)和DIEA(3.0eq.)的溶液中，在室温下搅拌12小时。反应进度通过HPLC-MS来控制。在完成后，在减压下除去溶剂。
还原去保护。苯甲基通过氢解作用的正交去保护，使用活性炭上的钯催化剂(10％Pd/C和作为稳定剂的50％H2O，15mg/mmol)和氢气氛(1atm.H2)在室温下进行。去保护的完成通过HPLC-MS来监测，在硅藻土上除去催化剂，并在减压下除去溶剂。
Hoc保护的精氨酸的合成
羧酸的三甲基甲硅烷基(TMS)保护。在氩气气氛下向干燥的Fmoc保护的精氨酸添加DCM和DIEA(4.eq.)。在继续搅拌的同时向所述溶液分2-4份添加TMSCl(4eq.)，并使用回流冷凝器在40℃下搅拌1.5h。这产生TMS保护的Fmoc-精氨酸。
己氧基羰基(Hoc)保护。将TMS保护的Fmoc-精氨酸的溶液冷却至0℃并向其添加DIEA(3eq.)，然后逐步添加氯甲酸己酯(3eq.)。将所述溶液在0℃搅拌30mins，然后升温至室温并搅拌过夜。反应的完成通过HPLC-MS来确认。
TMS的去除。通过添加1N HCl将反应内含物酸化，直至有机层的pH为2并因此所述TMS基团去保护。将所述化合物Fmoc-Arg(Hoc)2-OH用DCM萃取(3-5x)，然后将萃取液合并，用MgSO4脱水，然后在减压下除去DCM。在从甲醇和水(4:1；v/v)的溶液结晶后获得最终产物并通过HPLC-MS确认。
整合蛋白结合测定法
整合蛋白配体的活性和选择性通过固相结合测定法，按照以前描述的流程[11,12]，使用包被的细胞外基质蛋白和可溶性整合蛋白来确定。下述化合物被用作内标：西仑吉肽(SEQ ID NO：20)，c(f(NMe)VRGD)(αvβ3–0.54nM，αvβ5–8nM，α5β1–15.4nM)，直链肽RTDLDSLRT4(SEQ ID NO：24)(αvβ6–33nM；αvβ8–100nM)和替罗非班5(αIIbβ3–1.2nM)。将平底96孔ELISA板(BRAND，Wertheim,Germany)用碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)中的ECM-蛋白(1)(每孔100μL)在4℃包被过夜。然后将每个孔用PBS-T缓冲液(磷酸盐缓冲盐水/Tween20，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.01％Tween20，pH7.4；3×200μL)清洗，并在室温(rt)下用TS-B缓冲液(Tris-盐水/BSA缓冲液(牛血清白蛋白)；150μL/孔；20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，pH 7.5，1％BSA)阻断1h。同时，在额外的板中制备所述化合物和内标的连续稀释液，以1:5的稀释步级从20μM到6.4nM。在用PBS-T(200μL)清洗测定板三次后，将50μl的连续稀释液转移到从B-G的每个孔。孔A装填100μl TSB溶液(空白)，孔H装填50μl TS-B缓冲液，将50μl的人类整合蛋白(2)在TS-B缓冲液中的溶液转移到孔H–B，并在室温(rt)温育1h。将板用PBS-T缓冲液清洗三次，然后向板添加第一抗体(3)(每孔100μL)。在rt温育1h后，将板用PBS-T清洗三次。然后，向板添加过氧化物酶标记的第二抗体(4)(100μL/孔)，并在rt温育1h。在用PBS-T清洗板三次后，通过快速添加SeramunBlau(每孔50μL，Seramun Diagnostic GmbH,Heidesee,Germany)并在暗处在rt温育5min，将板显色。使用3M H2SO4(50μL/孔)终止反应，并使用读板器(GENios,TECAN)在405nm处测量吸收值。
每种化合物的IC50值进行一式两份试验，并使用OriginPro 9.0G软件分析得到的抑制曲线。拐点描述了IC50值。所有确定的IC50值以内标的活性作为参比。
αvβ3
(1)1.0μg/mL人玻连蛋白；Millipore。
(2)2.0μg/mL，人αvβ3-整合蛋白，R&D。
(3)2.0μg/mL，小鼠抗人CD51/61抗体，BD Biosciences。
(4)2.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
α5β1
(1)0.5μg/mL；人纤连蛋白，Sigma-Aldrich。
(2)2.0μg/mL，人α5β1-整合蛋白，R&D。
(3)1.0μg/mL，小鼠抗人CD49e抗体，BD Biosciences。
(4)2.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
αvβ5
(1)5.0μg/mL；人玻连蛋白，Millipore。
(2)3.0μg/mL，人αvβ5-整合蛋白，Millipore。
(3)1:500稀释液，抗αv小鼠抗人MAB1978抗体，Millipore。
(4)1.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
αvβ6
(1)0.4μg/mL；LAP(TGF-β)，R&D。
(2)0.5μg/mL，人αvβ6-整合蛋白，R&D。
(3)1:500稀释液，抗αv小鼠抗人MAB1978抗体，Millipore。
(4)2.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
αvβ8
(1)0.4μg/mL；LAP(TGF-b)，R&D。
(2)0.5μg/mL，人αvβ8-整合蛋白，R&D。
(3)1:500稀释液，抗αv小鼠抗人MAB1978抗体，Millipore。
(4)2.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
αIIbβ3
(1)10.0μg/mL；人纤连蛋白，Sigma-Aldrich。
(2)5.0μg/mL，人血小板整合蛋白αIIbβ3，VWR。
(3)2.0μg/mL，小鼠抗人CD41b，BD Biosciences。
(4)1.0μg/mL，抗小鼠IgG抗体-POD，Sigma-Aldrich。
渗透性研究
结肠直肠腺癌2(Caco-2)细胞的培养。将Caco-2细胞(ATTC)在75cm2摇瓶中以大约0.5×106个细胞/摇瓶(Thermo-Fischer)的密度在37℃下，在5％CO2气氛和95％相对湿度下生长。所述生长培养基由增补有10％热失活FBS、1％MEM-NEAA、2mM l-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、50,000单位青霉素G钠和50mg硫酸链霉素的DMEM构成(Biological Industries)。所述培养基每隔天更换。
Caco-2细胞生长和处理。将细胞(传代55-60次)以25×105个细胞/cm2的密度接种在孔径为0.4μm并且表面积为1.1cm2的聚碳酸酯膜的未处理的培养插片上。将含有Caco-2单层的培养插片置于12mm transwell板(Corning)中。每隔天更换培养基。在接种后一周直至实验日(第21-23天)通过Millicell ERS-2系统(Millipore)来测量跨上皮细胞电阻(TEER)值，以确保所述细胞的增殖和分化。当细胞完全分化时，TEER值变得稳定(200–500Ω·cm2)。将所述TEER值与只含培养基的对照插片进行比较。
使用Caco-2细胞的体外渗透率研究。实验通过用均升温至37℃的上侧(600μl)和下侧(1500μl)缓冲液从两侧替换培养基来启动。将细胞与所述缓冲溶液在37℃下，在摇床(100转/min)上温育30min。将上侧缓冲液用含有10μg/ml 29(SEQ ID NO：5)或10μg/ml 29P(SEQ ID NO：9)的上侧缓冲液替换。在实验开始时立即从上侧取50μl样品，导致在实验期间上侧体积为550μl。在固定时间点(20、40、60、80、100、120和150min)从下侧取样200μl并用相同体积的新鲜下侧缓冲液替换，以维持恒定的体积。所述实验包括两种对照化合物阿替洛尔和美托洛尔作为细胞旁和跨细胞渗透性标志物。
Caco-2渗透性研究数据分析。每种化合物的渗透系数(Papp)从累积药物随时间变化的线形图，使用下述方程计算：
Figure BDA0002415839430000781
其中dq/dt是所述化合物在接收侧上的稳态表观速率，C0是所述药物在供体侧上的初始浓度，并且A是暴露的组织表面积(1.1cm2)。
酶抑制研究。为了确定自纳米乳化药物递送系统(SNEDDS)[13]或酮康唑的酶抑制，使用了合并的大鼠CYP3A4微粒体(BD Biosciences,Woburn,MA,USA)。通过向含有NADPH(0.66mg/mL)和分散的12P(SEQ ID NO：10)-SNEDDS(2.8μL，等同于12P 1μM)、酮康唑(3μM)或单独的12P(SEQ ID NO：10)(1μM)的预热的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.4)添加冰冷的微粒体(终浓度为0.5mg/mL)来启动所述反应。在预定时间(0、15和30min)取出50μL样品，通过添加100μL冰冷的ACN来终止反应，并按照下文分析方法部分中所描述的进一步处理。
体内研究。将体重275-300g的雄性Wistar大鼠(Harlan,Israel)用于所有手术程序。在手术期间，通过腹膜内注射1mL/kg氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(9:1)将动物麻醉，放置在预热过的表面上并维持在37℃(Harvard Apparatus Inc.,Holliston,MA)。通过以前描述的方法将留置套管置于每只动物的右颈静脉中，用于系统采血。所述套管在皮肤下方穿过，并在颈部背侧外露。在所述手术程序完成后，将动物转移到笼子，恢复过夜(12-18h)。在这个恢复期中，剥夺食物但不剥夺水。在整个实验期间，在口服给药后4h可以自由取用食物。动物被随机指派到不同的实验组。对于生物利用度研究来说，分散的12P SNEDDS在每个实验前30min，通过将预浓缩物在预热至37℃的水中(1:10，v/v)涡旋混合30s新鲜制备。将分散的12P SNEDDS(5mg/kg)通过口饲管给药到动物(n＝3)。在给药前5min、给药后20、40、60、90、180、240和360min获取系统血样(0.35mL)。为了防止脱水，在每次抽取血样后向大鼠给药等体积的生理溶液。通过离心(5322g，10min)分离血浆并在分析前储存在-20℃下。在12P药代动力学研究中，分析确定母体肽12。
药代动力学分析。通过用最后一次测量的浓度除以消除速率常数(kel)，使用梯形积分法并外推到无穷来计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。所述消除速率常数值使用血浆浓度随时间变化曲线的对数图上的最后一点，通过线性回归分析来确定。药代动力学参数例如Tmax、Cmax、清除率(CL)、分布容积(V)和生物利用度，使用非房室分析来计算。
分析方法。将血浆或BBMV样品用作为内标的美托洛尔(1.5μg/mL)掺杂。向每个样品添加ACN(2:1)并涡旋混合1min。然后将所述样品离心(14 635g，10min)，将上清液转移到新鲜的玻璃管并蒸发至干(真空蒸发系统，Labconco，Kansas City,MO,USA)。然后，将所述玻璃管在80μL流动相中重构并第二次离心(14 635g，10min)。化合物的量使用装备有Micromass ZQ检测器的HPLC-MS Waters 2695分离模块来确定。将得到的溶液进样(10μL)到HPLC系统中。系统条件如下：对于母体药物肽(包括12)来说，使用Kinetex 2.6μm HILIC
Figure BDA0002415839430000801
100mm×2.1mm柱(Phenomenex，Torrance,CA,USA)，等度流动相，以及乙腈:水:乙酸铵缓冲液50mM(70:10:20，v/v/v)；对于前体药物肽(包括12P)来说，使用Luna(Phenomenex)3μm C8
Figure BDA0002415839430000803
Figure BDA0002415839430000802
100mm×2.0mm柱和ACN:增补有0.1％甲酸的水(70:30，v/v)的等度流动相，0.2mL/min的流速和25℃。所有肽和前体药物的定量极限为25ng/mL。
统计分析。如果没有另外陈述，则所有值被表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。为了确定实验组之间的统计显著差异，使用t-检验或单向ANOVA，然后进行Tukey’s检验。小于0.05的p-值被称为是显著的。
实施例1：筛选具有空间多样性的肽文库以获得高度活性和选择性的含有RGD的N- 甲基化的环状六肽
方法以及每种肽的编号和序列描绘在图2A中示出的流程图中。
步骤1.主干肽cyclo(D-Ala-Ala5)(c(aAAAAA)，SEQ ID NO：19)的所有可能的N-甲基化类似物的组合文库的合成和具有最高肠道渗透性的环状肽的选择
评估了所有63种可能的具有不同N-甲基化模式的Ala环状六肽c(aAAAAA)中的54种的组合文库的结构-渗透性关系(SPR)。选择具有最高渗透性的肽作为用于“重新功能化”的模板。发现这些肽在渗透性方面极为可变，它们中的一些表现出极高的Caco-2渗透率或甚至比Caco-2标准品睾酮[2]更高(肽1-4，图2B)。结果证明环状六肽的渗透率强烈依赖于它们的分子结构[5,6]，并清楚地提供了转运蛋白的参与造成了这些肽中的某些肽的高渗透率的证据。我们已显示，Caco-2渗透率不与单一参数相关，所述单一参数例如i)N-甲基化的氨基酸的数目，ii)外部取向的NH基团的数目[2]和iii)亲脂性。具有最高渗透率的肽被证明是一组在不同位置中具有两倍N-甲基化的肽：1,5-、1,6-、3,5-和5,6-二甲基化的肽(肽1-4，图2A和2B)[1,2]。另一个具有四倍N-甲基化模式(NMe 1,4,5,6)的高渗透性肽c(*aAA*A*A*A)没有被用作支架，因为它在化学上不太稳定并且更难合成制备。
步骤2.在所有可能的位置中包括RGD序列的每个所选环状肽的子文库的合成
将渗透性最高的支架(肽1-4，图2A和2B)用于构建第二代组合子文库，其中Ala侧链被源自于肽或蛋白质的活性区域的氨基酸的侧链代替。将三个连续的Cα甲基系统性地用RGD侧链代替(或者对于G来说省略)。这个操作允许将RGD侧链以非常不同的空间取向呈递，这不可能从结合有肽配体的整合蛋白头部基团的几个X-射线结构的知识[7-10]来预测。
步骤3.识别RGD的整合蛋白亚型的最佳配体的选择
筛选了24种(图2A中的#5-#28)RGD肽以研究它们与结合RGD的各种不同整合蛋白的结合。选择的肽的结果示出在表1中。结果证实只有非常少的化合物对于与整合蛋白亚型αvβ3的结合来说具有低的纳摩尔级的亲和性并且对α5β1具有低仅仅1至2个数量级的亲和性。这是引人注目的，因为含有RGD的直链肽通常也以一定的亲和性结合到某些其他的结合RGD的整合蛋白(αvβ5、αvβ6、αvβ8和αIIbβ3)[11]。一个例外是(3,5)-NMe肽(肽#17-22)家族，它们对所有整合蛋白亚型显示出低的亲和性。母体(3,5)-NMe全Ala肽(肽3)在NMR波谱中表现出两种构象(在DMSO溶液中)，这与在NMR时间尺度上构象均质的1,5-和1,6-二甲基化的母体肽(肽1和2)相反。显然，肽3的两种构象是围绕一个或多个肽键的顺/反异构体。
表1.识别RGD的整合蛋白亚型αvβ3、αvβ5、αvβ6、α5β1的肽配体的IC50值
Figure BDA0002415839430000821
*西仑吉肽是SEQ ID NO：20，肽#5是SEQ ID NO：1，肽#12是SEQ ID NO：2，肽#17是SEQ ID NO：3，肽#23是SEQ ID NO：4，肽#29是SEQ ID NO：5，肽#30是SEQ ID NO：6，肽#32是SEQ ID NO：7，并且肽#33是SEQ ID NO：8。
步骤4.通过另外的Ala到Xaa替换对最佳配体进行精细调节以优化亲和性和选择性
下一步是通过替换RGD基序两侧的Ala残基来优化活性最高的肽。从许多结构活性关系(SAR)研究已知，RGD序列两侧的芳香族残基提高对识别RGD的整合蛋白亚家族的成员的亲和性和选择性，参见例如[12]。例如，用D-Phe和D-Val残基替换肽12中的D-Ala残基产生的配体(肽29和30)对αvβ3具有低于纳摩尔级的亲和性，比对α5β1的亲和性低几乎两个数量级(表1)。新化合物的亲和性和选择性与西仑吉肽可比或甚至更好。
步骤5.通过前体药物概念保护带电荷的官能团以重新获得活性肽的肠和口服渗透性
在Caco-2模型中试验了肽#5、12、17、23、29和30的肠道渗透性。结果证明所有的肽与它们的母体全丙氨酸肽(肽#1-4)相比都具有显著降低的渗透性。这种渗透性的丧失可能归因于RGD三肽序列的胍和羧酸基团的封锁。事实上，在肽#1的任何位置中引入单个羧基(天冬氨酸代替Ala)或单个胍基(Arg代替Ala)(总共2x 6个肽)全都降低渗透性。因此，为了使在步骤iv和v中选择的含有RGD的肽能够肠和口服生物利用，必须掩蔽Arg和Asp两者的电荷。为此目的使用了前体药物方法，其中将所述带电荷的残基用被酯酶切开的前体组成部分掩蔽。Asp残基上的电荷用甲基酯前体组成部分掩蔽，Arg的胍基的电荷用二己氧基羰基前体组成部分掩蔽。具体来说，将下面的实施例中描述的前体药物的Arg残基的胍基用两个己氧基羰基(Hoc)组成部分掩蔽，并将Asp的羧酸侧链转变成中性电荷的甲基酯(OMe)。两种亲脂性烷基前体组成部分都含有酯键。因此，所述前体药物被存在于整个身体中的遍在的酯酶容易地生物转变成它们的原始活性肽。
实施例2：肠道渗透性、代谢稳定性和口服生物利用度研究
对于前体药物方法的概念验证来说，使用了肽12(SEQ ID NO：2)及其前体药物肽12P(SEQ ID NO：10)(图3A和3B)。
使用Caco-2模型的体外渗透性研究是设计肽的DLP的必不可少的组分，因为它们允许良好地预测化合物的体内口服吸收[13]。Caco-2模型在学术界和制药工业中是评估和预测化合物的渗透机制的广泛使用的工具。Caco-2系统由人类结肠癌细胞构成，它们繁殖并生长以产生模仿人类小肠粘膜的单层[14]。
通过安装在尤斯型腔室装置中的Caco-2单层进行运输研究，并进行连续的跨上皮电阻(TEER)测量，以确保TEER在800至1200Ω*cm2之间。使用增补有10mM MES并调整至pH6.5的HBSS作为供体区室中的运输介质，并且调整至pH 7.4作为受体区室中的运输介质。供体溶液含有测试化合物。有效渗透系数(Papp)由受体室中每种测试化合物的浓度-时间曲线计算得出[15]。在每个测定中，将所述化合物与分别代表细胞旁和跨细胞渗透机制的标准品阿替洛尔和美托洛尔进行比较[16]。
化合物的渗透机制通过评估化合物从上侧到下侧(A到B)膜的Papp和它从下侧到上侧膜(B到A)的Papp来研究。所述A到B测定模拟了被动和转运蛋白介导的渗透。所述B到A测定是指示P-gp的活性的必需补充实验。计算A到B与B到A Papp的比率(外排比)以确定渗透机制。两个方向上的渗透系数之间的显著差异(外排比为1.5-2或更高)，是主动运输或外排系统参与的强烈指示[17]。
肽12(c(*aRGDA*A))，在本文中被称为“药物”，因为它对整合蛋白受体的高亲和性和选择性而从RGD文库(肽#5-28)选出。图4呈现了肽12(c(*aRGDA*A))及其前体药物肽12P(c(*aR(Hoc)2GD(OMe)A*A))的Caco-2 A到B测定的结果。结果显示，电荷被掩蔽的前体药物具有显著提高的渗透速率，前体药物的Papp为15.79，与此相比药物的Papp为0.0617。
此外，B到A研究揭示出肽12P的Papp比他的A到B Papp更高(335.8相比于15.7，图5)。肽12P的外排比约为20。已知的P-gp底物环孢菌素的外排比为3(图6)。这个比率指示了外排系统在12P的渗透机制中的显著参与。事实上，任何高于2的比率都是外排活性参与的有效指示。
重要的是指出外排系统的参与是所述前体药物渗透肠细胞膜并随后被外排系统从这些细胞移除的真实指示。
为了进一步研究参与肽12P的渗透机制的外排系统，在已知的P-gp抑制剂维拉帕米(100mM)存在下进行了Caco-2研究。结果(图7)显示，在维拉帕米存在下肽12P的Papp提高3倍，从15.7提高到47.4。另外，在氯化棕榈酰肉碱(PC)存在下对前体药物肽12P进行测试，所述PC通过作用于上皮屏障的TJ而增强亲水性化合物的渗透。图8显示，与涉及外排系统的抑制的维拉帕米相比，PC的存在影响Papp值。在单独的肽12P的Papp之间存在显著差异(1.64±0.15相比于12.52±0.20cm/s×106)，而在PC存在下，AB和BA Papp值相近(5.37±0.16相比于6.80±0.28cm/s×106)。这个结果进一步加强了肽12P在外排系统的参与下透过肠单层这一假设。
实施例3：代谢稳定性研究
通常，代谢稳定性研究的目的是评估在敌对环境(大鼠血浆或肠壁提取物存在下化合物的消除速率。在这些环境中化合物容易发生酶促降解，因为存在高浓度的肽酶、酯酶、脂肪酶和其他肽，它们可以将异生物质代谢成用于合成身体内的基本结构的构建单元[18,19]。
具体来说，在我们的案例中，代谢稳定性研究的目的是(1)证明前体药物(肽12P)被酯酶消化以提供药物(肽12)，并且(2)证实肽12和12P对于肠中的消化来说是稳定的。
所述酶反应如下进行：将测试化合物的2mM储用溶液用血清或纯化的刷状缘膜囊泡(BBMV)溶液稀释至终浓度为0.5mM。在37℃下温育期间获取样品，时间长度为90分钟。通过添加1:1v/v的冰冷乙腈终止酶反应，并在分析之前离心(4000g，10min)。BBMV的制备：所述BBMV从合并的十二指肠、空肠和上段回肠(雄性Wistar大鼠)，通过Ca++沉淀方法来制备。BBMV的纯化使用GGT、LAP和碱性磷酸酶作为膜酶标志物来测定。
使肽12和12p接触大鼠血浆并跟踪它们的降解。已知大鼠血浆富含酯酶。图9A和9B证实了在大鼠血浆中由于酯酶活性造成的肽12和12P的降解。在温育时间中肽12保持稳定，因为它缺少酯键。另一方面，肽12P被降解以产生肽12，因为它含有酯键(参见图3B)。
这个实验证明了肽12P是肽12的前体药物。
接下来，使肽12和12P接触肠壁提取物(刷状缘膜囊泡，BBMV)并跟踪它们的降解速率。BBMV测定法确定了在肠的刷状缘膜中的消化酶特别是肽酶存在下所述肽的稳定性。
从图10可以看出，两种肽对于BBMV中的酶来说都是稳定的，这指示了口服生物利用性并因此满足DLP规范。
通过合并的人类肝微粒体测定法对肽12P进行了另外的体外测定，以评估肝代谢的参与。肝微粒体是源自于肝细胞内质网的亚细胞粒子。这些微粒体是药物代谢酶包括细胞色素P-450的丰富来源。来自于各种不同来源的微粒体合并物可用于异生物质代谢和药物相互作用的研究。图11显示了肽12P被人类肝脏微粒体的降解。酮康唑的存在在某种程度上抑制了被肝酶的代谢。然而，将肽12P与自组装型纳米脂球前体(PNL)一起温育，导致细胞色素P-450的好得多的抑制。这个结果是另一个证据，表明肽12P是P-gp外排系统和细胞色素P-450的底物，并且在克服渗透挑战的同时，肽12P剂型提供保护以对抗肠和肝脏中的外排系统和酶促代谢。
在分离的大鼠CYP3A4微粒体中进一步测试了吸收的机制。还研究了酮康唑这种特异性CYP3A4抑制剂和SNEDDS如何影响外排的问题。发现它们降低CYP3A4的代谢并降低P-gp外排(图13)。比较了在与分散的肽12P温育60min后剩余的浓度。分组包括肽12P与SNEDDS、12P与酮康唑和单独的12P(分别为102.2±19.7％、67.0±3.61％和14.0±4.06％)。在肽12P与分散的12P和SNEDDS之间(p<0.01)以及12P与12P和酮康唑之间(p<0.01)发现显著差异。向大鼠口服给药5mg/kg的肽12或12P后，肽12和分散的12P SNEDDS的血浆浓度-时间曲线示出在图14和15中。在这些体内实验中获得的相应AUC和Cmax参数列于表2中，并且与肽12相比分散的12P SNEDDS的这些参数明显更大。在口服给药后，肽12P的相对生物利用度比肽12高出约70倍(图15)。
表2.在肽12和分散的12P SNEDDS的口服给药后获得的肽12得AUC、Cmax、kel值和Tmax值(中值(范围))
12 12P
C<sub>max</sub>(ng/ml) 119±86 1993±967<sub>l</sub>
T<sub>max</sub>(min 45(20-90) 20(20-60)
AUC(min*μg/ml) 1.91±0.37 216.9±75.6
k<sub>el</sub>(min<sup>-1</sup>) 0.04±0.005 0.009±0.0001
F(％) 0.58±0.11 43.8±14.9
实施例4：药代动力学研究
药代动力学体内研究允许在完整动物中进一步评估所述前体药物概念。所述PK研究在神志清醒的Wistar雄性大鼠中进行。在PK实验之前24小时将留置套管植入到颈静脉中，允许动物从手术程序完全恢复。动物(n＝4)接受所调查的化合物的IV快速浓注给药或口服给药。在最长为给药后6小时的几个时间点处收集血样(含有肝素15U/ml)，并通过HPLC-MS方法进行测定。使用WinNonlin软件进行非房室药代动力学分析。
这项研究显示在肽12P给药后，肽12的曲线下面积(AUC)显著增加。换句话说，所述PK研究显示在口服给药肽12P(前体药物)后，肽12(药物)出现在系统血液循环中。这证明了(a)肽12P是口服可利用的，(b)它在肠中稳定，(c)它在血液中被代谢以重新生成肽12。为了确保药物的良好生物利用度，将所述前体药物配制成已知抑制P-gp外排系统的纳米粒子剂型。应该提到的是，肽12也被配制成相同的纳米粒子。在这种情况下，所述剂型不提高口服生物利用度，因为这种肽事实上在肠中不可渗透(图4)。这些结果是前体药物方法的体内概念证明。
对其他肽和它们的前体药物类似物进行Caco-2测定，并显示出与肽12相同的行为。
由于对整合蛋白受体的高亲和性和选择性，从RGD文库(肽#5-28，图2A)选择肽29(c(*vRGDA*A))及其前体药物29P(c(*vR(Hoc)2GD(OMe)A*A))用于进一步的概念证明。两种肽的结构示出在图16A和16B中。
两种肽(肽29和29P)的渗透性低。如图17中所示，在A到B测定中，肽29P的Papp低于肽29的Papp(分别为0.08和0.6)。
当将肽29P的B到A Papp与它的A到B Papp进行比较时，这种意料之外的结果变得明朗(图18)。所述前体药物的B到A Papp明显高于A到B Papp(0.08相比于1.06)，表明所述低的A到B Papp是外排系统的广泛活性的结果。
还评估了肽5(c(*rGDA*AA)，SEQ ID NO：1)及其前体药物肽5P(c(*r(Hoc)2GD(OMe)A*AA)，SEQ ID NO：11)。在这些肽中，N-甲基化模式是1,5而不是1,6(肽29及其前体药物中的模式)。在这些肽(5和5P)中，所述D-氨基酸也是精氨酸。在Caco-2模型中，所述药物(肽5)和前体药物(肽5P)两者都表现出相对低的Papp(0.03和0.06)，非常接近阿替洛尔的Papp(0.025，图19)。
肽5P的B到A渗透产生的Papp远远高于它的A到B Papp(2.12相比于0.06，图20)，再次表明了外排系统的参与，这归因于前体药物肽5P的低的A到B渗透性。
肽17、23和30和它们相应的前体药物17P(SEQ ID NO：13)、23P(SEQ ID NO：12)和30P(SEQ ID NO：14)显示出与肽12和12P、29和29P以及5和5P相同的肠道渗透性模式。表3概述了所调查的RGD肽的Papp外排A-B和B-A。
表3.在Caco-2细胞模型中RGD肽和它们的前体药物衍生物的AB和BA渗透性的Papp值(每组n＝3)和外排比
Figure BDA0002415839430000891
a阿替洛尔是细胞旁渗透性的标志物，b美托洛尔是跨细胞渗透性的标志物。
以前的工作显示，西仑吉肽具有抗血管生成效果的潜力。然而，不幸的是，使用这种药物治疗成胶质细胞瘤的临床试验令人失望，并且这种药物的生产已被中断。我们已报道，实际上低剂量的西仑吉肽可以具有血管促进作用，即增加肿瘤血管生成高于并超过未治疗的肿瘤[20]。事实上，我们有证据表明，在临床前癌症小鼠模型中，与适合的化学疗法相结合，由低剂量西仑吉肽治疗诱导的血管促进足以阻止肿瘤生长[15]。这提供了令人兴奋的机会，可以与化学疗法或事实上增加向肿瘤的递送可能有益的其他疗法相组合利用血管促进作用。本文提出的前体药物方法可能会超过西仑吉肽的疗效。
实施例5：分子对接方法
准备将与西仑吉肽复合的αvβ3的晶体结构(PDB编号：1L5G)[21]用于使用
Figure BDA0002415839430000902
2016分子建模软件包的Protein Preparation Wizard工具的对接计算[22]。首先，将MIDAS处的Mn2+离子用Mg2+代替。接下来，分派所有的键顺序，创建二硫键并添加所有氢原子；使用Epik 3.7对侧链杂基电离和互变异构状态进行预测[23,24]。最后，分别使用ProtAssing和impref实用程序对氢键网络和氢原子位置进行优化。在对接计算之前，删除所有水分子。对接研究使用基于网格的程序Glide v.7.2来进行[25,26]。为了生成网格，创建了一个围绕配体RGD结合腔的
Figure BDA0002415839430000901
的虚拟盒。选择肽配体(SP-肽)的标准精度模式和OPLS3力场[27]运行计算并对预测的结合位姿进行评分。选择了能正确重演典型的RGD相互作用模式的最低能量解决方案(对接得分：-7.433)用于结合方式描述。所有图片均使用PyMOL渲染。
为了在原子水平上描述环状六肽与整合蛋白受体的结合方式，通过NMR研究计算了29的溶液状态结构(图21A)，并将其用于进行29在αvβ3RGD结合位点处的对接计算。根据对接结果，29与参比配体西仑吉肽非常相似地结合到αvβ3(图21B)。详细来说，Asp3羧酸基团与MIDAS处的金属离子配位，并形成两个H键(β3)-Asn215，而NMe-d-Arg1胍基与(αv)-Asp218侧链建立紧密盐桥并与(αv)-Tyr178酚环建立阳离子-π键。所述29/αvβ3复合体通过Asp4骨架CO与(β3)-Arg214侧链之间的附加H键并通过NMe-Ala6与(β3)-Met180之间的亲脂性接触进一步稳定化。因此，预测的结合方式总体上与在αvβ3受体处为29观察到的亚纳摩尔IC50相符。
实施例6：肽29和29P衍生物与对照分子的比较
使用LogD、caco-2和PAMPA模型进一步调查了RGD环状六肽文库的体外理化性质。所调查的肽衍生物描绘在图22中。
LogD.分配系数的确定如下所述来进行：
温育在Eppendorf类型的聚丙烯微量管中一式三份进行。将化合物DMSO储用液(10mM)的5μL等分试样溶解在含有500μL PBS(pH 7.4)和500μL辛醇的事先相互饱和的混合物中，然后在旋转混合器上以30rpm混合1小时。通过以6000rpm离心2min来确保相分离。将辛醇相用40％乙腈稀释100倍，水性相不需稀释直接分析。所述样品(两相)使用与串联质谱仪偶联的HPLC系统进行分析。甲苯达唑被用作参比化合物(pH 7.4下的实验logD范围为2.9-3.15)。表2中描绘的logD值显示，向肽添加亲脂性残基提高了logD值，指示在亲脂性相和环境中更高的分配。这对于肽29(#29)、具有单一Hoc的肽29P(#29P-Hoc；(SEQ ID NO：21))和具有2个Hoc分子的肽29P(#29P)来说是明显的。所述结果显示，不具有亲脂性残基时(#29)，logD<-1。添加一个Hoc和OMe基团(#29P-Hoc)将logD值提高到1.85，并且完全保护的肽(#29P)具有4.86的最高值。当与表4中的其他肽和它们的前体药物衍生物的logD值相比时，看到相似的结果。
表4.环状肽与甲苯达唑的Log D值的比较
Figure BDA0002415839430000921
PAMPA.平行人工膜渗透性测定法(PAMPA)被用作被动跨细胞渗透的体外模型。PAMPA消除了主动转运的复杂性，允许仅基于简单的膜渗透特性即可对化合物进行排序。这种测定法还允许评估在较大pH范围内的渗透性，这对于初步了解口服递送的化合物可以如何在整个胃肠道中被吸收来说非常有价值。PAMPA由Kansy等人首先提出，并且自从被广泛用于制药行业以来，就作为高通量、快速且廉价的渗透性测定法用于粗略评估口服吸收潜力。取决于所用脂质的类型和其他实验条件，PAMPA可以被设计成用于建立胃肠道中的吸收(PAMPA-GIT)、血脑屏障穿透(PAMPA-BBB)或皮肤穿透(皮肤PAMPA)的模型。PAMPA的所有步骤均按照pION Inc.PAMPA ExplorerTM手册进行。所述测定法的主要原理是将化合物在具有水性缓冲液的供体区室(供体板中的孔)中温育，所述供体区室与具有另一种缓冲液的受体区室(受体板中的孔)通过固定在滤膜支持物上的磷脂或烃类膜分隔开。在测试后，测量相应的供体孔和受体孔中的浓度并计算渗透率。使用GIT-0磷脂混合物模拟GIT模型。维拉帕米和奎尼丁(高渗透率)和雷尼替丁(低渗透率)被用作参比化合物。所有化合物一式三份进行测试。将包含50μM测试化合物和0.5％DMSO的Prisma HT缓冲液(pH 7.4)添加到供体板孔中。将受体下槽缓冲液添加到受体板的每个孔中。温育在室温下不搅动进行4小时。温育后，将来自于两个板的等分试样转移至光学UV-Vis板，并在微孔板读板器上，在102-500nm范围内以4nm的步级以吸光度模式读取光学板。具有低UV-Vis信号的化合物通过LC-MS/MS方法进行检测。然后计算表观渗透系数。结果示出在表5中。
表5.肽文库与奎尼丁、维拉帕米和雷尼替丁的PAMPA渗透系数的比较
Figure BDA0002415839430000931
*化合物的结构示出在图22中。#29P是SEQ ID NO：9，#29是SEQ ID NO：5，#29P-Hoc是SEQ ID NO：21，#29P*是29P(SEQ ID NO：9)的对映异构体,Cil.-P是西仑吉肽的前体药物(c(f*VR(Hoc)2GD)；SEQ ID NO：20)，并且1,6CHA是SEQ ID NO：22(*aAAAA*A)。
在PAMPA-GIT模型系统中肽29P(#29P)和#29P*(对映异构体)显示出高渗透率(>-5)。两种测试化合物(AR372(SEQ ID NO：15)和AR373(SEQ ID NO：16))的渗透率在>-5至>-6的范围内。这些结果强化了LPCM增强RGD环状六肽通过亲脂性膜的渗透性的假说。显然，#29(未保护的衍生物)显示出低渗透率(<-7)，并且有趣的是，半保护的#29P-Hoc在PAMPA中也表现出低的渗透率，表明完全保护的肽渗透性更高。
西仑吉肽是具有一个N-甲基化的基团的环状五肽(测试的其他肽是具有两个N-甲基化的基团的环状六肽)。它在PAMPA中显示出低的渗透率，然而，LPCM保护(Cil.-P；SEQ IDNO：23)没有提高渗透率，这表明除了肽的亲脂性之外还存在影响渗透率的结构性考虑因素(Cil.-P的logD为3.95，相比于西仑吉肽中的<-1)。
Caco-2。将Caco-2细胞按照ATCC和Millipore的推荐，在37℃和5％CO2下，在加湿气氛中在75cm2摇瓶中培养至80-90％合生。用胰蛋白酶/EDTA溶液使细胞脱离，并重悬于细胞培养基中至终浓度为2×105个细胞/ml。将500μl细胞悬液添加到HTS 24-多孔插板系统的每个孔中，并将1000μl预热的完全培养基添加到进料板的每个孔中。在转运实验之前，将Caco-2细胞在多孔插板系统中温育21天。每隔一天更新滤板和进料盘中的培养基。在细胞生长21天后，通过使用Millicell-ERS系统欧姆计测量每个孔的跨上皮电阻(TEER)，验证了单层的完整性。最终TEER值在150-600Ω×cm2的范围内(Srinivasan B.等，2015)，这是测定法条件所要求的。从进料板上取下24孔插板，并将其置于新的无菌24孔转运分析板中。在培养基抽吸后，用PBS洗涤所述插板。普萘洛尔、阿替洛尔、奎尼丁和地高辛被用作参比化合物。为了确定化合物在上侧(A)到下侧(B)方向上的转运速率，将300μL以10μM溶解在转运缓冲液(HBSS，25mM HEPES，pH＝7.4)中的测试化合物添加到滤板孔中；将1000μL缓冲液(HBSS，25mM HEPES，pH＝7.4)添加到转运分析板孔中。为了确定在下侧(B)到上侧(A)方向上的转运速率，将1000μL测试化合物溶液添加到转运分析板孔中，滤板的孔中装填300μL缓冲液(上侧仓室)。所述测试化合物的最终浓度为10μM。抑制剂对所述测试化合物的P-gp介导的运输的影响，通过在存在或不存在维拉帕米的情况下确定双向转运来评估。在上侧和下侧两个仓室中将Caco-2细胞与100μM维拉帕米在37℃下预温浴30min。在除去所述预温浴培养基后，在供体孔中添加转运缓冲液中的测试化合物(终浓度为10μM)和维拉帕米(100μM)，而受体孔装填适合体积的含有100μM维拉帕米的转运缓冲液。将板在37℃下，在50rpm连续振摇下温育90分钟。从供体和受体仓室中取出75μL等分试样用于LC-MS/MS分析。将所有样品与2体积的乙腈混合，然后通过以10000rpm离心10分钟来沉降蛋白质。使用与串联质谱仪偶联的HPLC系统分析上清液。结果示出在表7和8中。
表7.A-B和B-A渗透率数据
Figure BDA0002415839430000951
*外排比被表示为Papp(BA)与Papp(AB)的商
**对于化合物来说为受体区室获得的实验值小于LOD(3×信噪比值)
表8.在维拉帕米存在下的A-B和B-A渗透率数据
Figure BDA0002415839430000961
*外排比被表示为Papp(BA)与Papp(AB)的商
**对于化合物来说为受体区室获得的实验值小于LOD(3×信噪比值)
在PAMPA中，#29P和#29P*(对映异构体)显示出高的渗透率，而#29P-Hoc显示出较低渗透率。这与caco-2结果相符，即LPCM方法提高通过亲脂性膜的渗透率，并且caco-2(AB)中的低渗透率是由外排活性造成的。在过去的caco-2结果中，仅仅两个Hoc基团保护或仅仅OMe保护(在肽12中)也不足以显著提高渗透率。似乎所有三个保护基团更好地提高渗透率。AR372(SEQ ID NO：15)和AR373(SEQ ID NO：16)分别是OM1186(SEQ ID NO：17)和FRX068(SEQ ID NO：18)的前体药物。这些肽的caco-2和PAMPA结果与RGD文库相容。在维拉帕米存在下，这些肽中的外排比明显更低。
用于西仑吉肽的前体药物修饰在Caco-2中没有提高渗透率并且没有显示出外排活性，这对于其他RGD前体药物衍生物来说是典型的。LPCM在这里似乎不起作用，因为它在caco-2或PAMPA中不提高渗透率，并且不显示出外排活性。
实施例7：体内研究
为了估算所述肽在人类癌症抑制中的效能，在肿瘤小鼠模型中研究了所述肽。将小鼠用人类癌细胞激惹并用浓度逐渐提高的上文中描述的前体药物治疗。所述肽口服给药并与对照进行比较。
实施例8：奥曲肽前体药物的制备
前体药物己氧基羰基奥曲肽(奥曲肽-P)使用图23中示出的合成途径从奥曲肽合成。
实施例9.Somato 8前体药物的合成
从高效六肽环状生长抑素类似物c(PFwKTF)(SEQ ID NO：35)的所有可能的N-甲基化的类似物的组合文库选择了被称为“Somato 8”的环状N-甲基化的六肽生长抑素类似物(SEQ ID NO：26)(Veber DF,Freidlinger RM,Perlow DS等，Nature 1981；292(5818):55-8)，以试图开发改进的生长抑素类似物。在合成的30种类似物中，发现只有7种类似物具有与母体肽相近的生长抑素受体(SSTR)亲和性，所述母体肽在纳摩尔范围内对SSTR2和SSTR5具有选择性。从这个文库，具有序列c(-PF(NMe)w(NMe)KT(NMe)F-)并具有三个N-甲基的被命名为“生长抑素8”的类似物(生长抑素8，反应图式U)，在体外具有最有希望的PK参数(包括针对肠酶的稳定性和肠道渗透性)。与母体序列相比，进一步调查了它在大鼠口服给药后的生物利用度。在大鼠中，多种N-甲基化的类似物的计算绝对口服生物利用度为～10％，比母体肽高几乎5倍[28]。被命名为生长抑素8P的生长抑素8的二己氧基羰基前体药物(图24)以与奥曲肽P(图23)相同的方式制备。
实施例9：骨架环状肽的前体药物的合成
具有三个N-甲基化的活性序列(NMe)w-(NMe)K-T-(NMe)F的新的骨架环状生长抑素类似物Somato3M(SEQ ID NO：30)被用于生产它的三己氧基羰基前体药物。
在鉴定新的生长抑素类似物的尝试中，以前已从具有与生长抑素的药效序列一致或高度相似的序列的化合物制备了骨架环状肽的文库。合成了各自含有96种化合物的四个文库并筛选它们对生长抑素受体的结合亲和性。在筛选过程后，进一步调查了几种候选物的代谢稳定性和药效学情况，并与SRIF和奥曲肽进行比较。一些化合物是图25中描绘的PTR-3046[29]、PTR-3205[30]和PTR-3173(SEQ ID NO：27)[31]。
发现所有骨架环状类似物对血清和肾匀浆液中的酶降解稳定。然而，它们的生物活性和对生长抑素受体的选择性不同：尽管发现PTR-3046对SSTR5具有选择性(IC50在纳摩尔范围内)，但发现PTR-3205对SSTR2并且PTR-3173对SSTR2、SSTR4和SSTR5具有选择性。也与奥曲肽相比评估了这些类似物的体内效能。发现PTR-3173在GH的体内抑制中比胰高血糖素的体内抑制强1000倍，并且在生理浓度下对胰岛素分泌没有影响(GH:胰岛素效价比>10,000)。这是在GH与胰岛素抑制之间具有完全的体内选择性的长效SRIF类似物的首次描述。PTR-3046抑制铃蟾肽和雨蛙肽诱导的淀粉酶和脂肪酶从胰腺的释放，但不抑制GH或胰高血糖素释放。已报道PTR-3173在体外独特地结合到SSTR2、SSTR4和SSTR5，并在GH抑制中具有显著的体内选择性[31]。发现所有骨架环状类似物对血清和肾匀浆液中的酶降解稳定。将有活性的N-甲基化的序列(NMe)w-(NMe)K-T-(NMe)F-并入到骨架环状类似物PTR 3173的构架中，以形成类似物Somato3M，并且它的被命名为Somato3M-P的三己氧基羰基前体药物(图26)以与奥曲肽-P相同的方式制备。
所述骨架环化桥可以用其他类型的化学桥例如硫脲、S-酰胺和通过其他类型和长度的连接基团代替。每种组合提供了对生长抑素受体亚型的某种药效学选择性。在不同位点处的N-甲基化可能提高肠道渗透性。
上面的特定实施方式的描述如此充分地揭示出本发明的普遍本质，使得其他人可以使用当前的知识，不需过多实验并且不背离通用概念，容易地修改和/或改编这些特定实施方式以适应于各种不同的应用，因此这些改编和修改应当并且打算被涵盖在所公开的实施方式的等同性的含义和范围之内。应该理解，本文中使用的短语或术语是出于描述而不是限制的目的。用于执行公开的各种不同功能的手段、材料和步骤可以采取各种不同的可替选形式而不背离本发明。
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Figure BDA0002415839430001031
Martin Huenges§,Barbara
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§,Gary Gellerman⊥,VeredHornik⊥,Michel Afargan⊥等，环状骨架、受体5选择性的生长抑素类似物：合成、生物活性或核磁共振构象分析(A Backbone-Cyclic,Receptor 5-Selective SomatostatinAnalogue:Synthesis,Bioactivity,and Nuclear Magnetic Resonance ConformationalAnalysis)
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31.Afargan M,Janson ET,Gelerman G,Rosenfeld R,Ziv O,Karpov O等，具有内分泌选择性的新的长效生长抑素类似物：强力抑制生长激素但不抑制胰岛素(Novel Long-Acting Somatostatin Analog with Endocrine Selectivity:Potent Suppression ofGrowth Hormone But Not of Insulin)，Endocrinology.2001；142:477–86。
序列表
<110> 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司
<120> 亲脂性肽前体药物
<130> Yissum/0147 PCT
<150> US 62/560214
<151> 2017-09-19
<160> 35
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N-甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N-甲基化
<400> 1
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 2
Ala Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<400> 3
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 4
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 5
Val Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 6
Phe Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<400> 7
Arg Gly Asp Ala Ala Val
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<400> 8
Arg Gly Asp Ala Ala Phe
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 9
Val Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 10
Ala Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<400> 11
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 12
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> N 甲基化
<400> 13
Arg Gly Asp Ala Ala Ala
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 14
Phe Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<400> 15
Leu Pro Pro Phe Arg Gly Asp Leu Ala
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<400> 16
Leu Pro Pro Gly Leu Arg Gly Asp
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<400> 17
Leu Pro Pro Phe Arg Gly Asp Leu Ala
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<400> 18
Leu Pro Pro Gly Leu Arg Gly Asp
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<400> 19
Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> N 甲基化
<400> 20
Phe Val Arg Gly Asp
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> 己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> 甲基酯(OMe)组成部分
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> N 甲基化
<400> 21
Val Arg Gly Asp Ala Ala
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<400> 22
Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-氨基酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> N 甲基化
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<400> 23
Phe Val Arg Gly Asp
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 24
Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> D-Phe
<220>
<221> 二硫化物
<222> (2)..(7)
<223> 桥
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> D-Trp
<220>
<221> 其他特征
<222> (8)..(8)
<223> (ol) = 醇C端
<400> 25
Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(6)
<223> 头-尾环化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> N-甲基D-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> N-甲基Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基Phe
<400> 26
Pro Phe Trp Lys Thr Phe
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4Abu, GABA
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(8)
<223> GlyC3的N-alpha-omega-官能化衍生物与N-端之间的骨架-末端环化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> GlyC3构建单元
<400> 27
Xaa Phe Trp Trp Lys Thr Phe Xaa
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PheN2构建单元
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(6)
<223> X1的N-alpha-omega-官能化衍生物与X6的N-alpha-omega-官能化衍生物之间的骨架环化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> PheC3构建单元
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 28
Phe Tyr Trp Lys Val Phe Thr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PheC3构建单元
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(9)
<223> X1的N-alpha-omega-官能化衍生物与X9的N-alpha-omega-官能化衍生物之间的骨架环化
<220>
<221> 二硫化物
<222> (2)..(7)
<223> 桥
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> D-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> PheN3构建单元
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 29
Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Phe Phe
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(6)
<223> 头-尾环化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> N-甲基D-Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> N-甲基Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基Phe
<400> 30
Phe Trp Trp Lys Thr Phe
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(6)
<223> 桥
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 31
Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(6)
<223> 桥
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 己氧基羰基(Hoc)组成部分
<400> 32
Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 两个己氧基羰基(Hoc)组成部分
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(9)
<223> 环化
<400> 33
Gly Arg Pro Cys Asn Gln Phe Tyr Cys
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(9)
<223> 环化
<400> 34
Gly Arg Pro Cys Asn Gln Phe Tyr Cys
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(6)
<223> 头-尾环化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Trp
<400> 35
Pro Phe Trp Lys Thr Phe
1 5

Claims (45)

1.一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽；和
(b)将所述肽与具有式XCO2R1的卤代甲酸烷基酯反应，其中R1是伯烷基并且X是卤素，由此形成所述基于肽的前体药物。
2.权利要求1所述的方法，其中R1是n-C6H13。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤(a)的肽包含至少一个–NHR2组成部分，并且其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有式-NR2CO2R1的氨基甲酸酯组成部分，其中R2选自氢和步骤(a)的肽的碳原子。
4.权利要求3所述的方法，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure FDA0002415839420000011
其中NT是步骤(a)的肽的N-端氮原子。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(a)的肽包含至少一个选自组氨酸、赖氨酸、色氨酸及其组合的氨基酸残基。
6.权利要求5所述的方法，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure FDA0002415839420000021
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。
8.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。
9.权利要求8所述的方法，其中所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在碱存在下进行。
11.权利要求10所述的方法，其中所述碱是三乙胺。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(b)在乙腈溶剂中进行。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其还包括将步骤(a)的肽或步骤(b)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤。
14.一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的修饰的氨基酸偶联：
Figure FDA0002415839420000031
其中
R1是伯烷基，
PG是保护基团；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)从步骤(b)的产物除去所述保护基团PG1；和
(d)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述修饰的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure FDA0002415839420000032
16.权利要求14所述的方法，其中所述修饰的氨基酸具有下述结构式：
Figure FDA0002415839420000033
17.权利要求14-16中任一项所述的方法，其还包括将步骤(c)或(d)的产物与具有式ClCO2R1的氯甲酸烷基酯反应的步骤。
18.权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述肽前体包含固相树脂。
19.权利要求18所述的方法，其中所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
20.权利要求18-19中任一项所述的方法，其还包括从所述固相树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤(e)。
21.权利要求14-20中任一项所述的方法，其中PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。
22.权利要求14-21中任一项所述的方法，其中R1是n-C6H13。
23.权利要求14-22中任一项所述的方法，其中步骤(b)的偶联包括将所述肽前体与所述修饰的氨基酸在偶联剂存在下接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。
24.权利要求14-23中任一项所述的方法，其中所述基于肽的前体药物具有净中性电荷。
25.权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
26.权利要求25所述的方法，其中所述基于肽的前体药物不含带正电荷的原子。
27.权利要求14-26中任一项所述的方法，其还包括将步骤(a)的肽或步骤(b)的基于肽的前体药物与醇在酯化试剂存在下反应的步骤。
28.一种制备基于肽的前体药物的方法，所述方法包括：
(a)提供肽前体；
(b)将所述肽前体与具有选自下述的结构式的被保护的氨基酸偶联：
Figure FDA0002415839420000051
其中
PG1是碱不稳定性保护基团；
PG2是酸不稳定性保护基团；
n是3或4；
其中所述肽前体选自：氨基酸，肽和固相树脂；
(c)在酸性条件下从步骤(b)的产物除去所述酸不稳定性保护基团PG2；
(d)将步骤(c)的产物与选自下述的化合物反应：
Figure FDA0002415839420000052
和ClCO2R1
其中R1是伯烷基；
(e)在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团；和
(f)任选地偶联至少一个另外的氨基酸；
由此形成所述基于肽的前体药物。
29.权利要求28所述的方法，其中所述被保护的氨基酸具有下述结构式：
Figure FDA0002415839420000061
并且其中步骤(d)的反应是与具有下述结构式的化合物进行：
Figure FDA0002415839420000062
30.权利要求28所述的方法，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有下述结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure FDA0002415839420000063
31.权利要求28所述的方法，其中所述被保护的氨基酸具有选自下述的结构式：
Figure FDA0002415839420000064
并且其中步骤(d)的反应是与具有式ClCO2R1的化合物进行。
32.权利要求31所述的方法，其中所述基于肽的前体药物包含至少一个具有选自下述的结构式的氨基甲酸酯组成部分：
Figure FDA0002415839420000071
33.权利要求28-32中任一项所述的方法，其中步骤(a)还包括偶联至少一个具有在先碱不稳定性保护基团的在先氨基酸和在碱性条件下除去所述碱不稳定性保护基团。
34.权利要求28-33中任一项所述的方法，其中所述酸不稳定性保护基团是4-甲基三苯甲基(Mtt)。
35.权利要求28-34中任一项所述的方法，其中R1是n-C6H13。
36.权利要求28-35中任一项所述的方法，其中所述基于肽的前体药物不含带电荷原子。
37.权利要求28-36中任一项所述的方法，其中步骤(d)在选自三甲胺和N,N-二异丙基乙胺的碱的存在下进行。
38.权利要求28-37中任一项所述的方法，其还包括将所述基于肽的前体药物与醇在亚硫酰氯的存在下反应的步骤(g)。
39.权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述肽前体包含末端伯氨基。
40.权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述肽前体是固相树脂。
41.权利要求40所述的方法，其中所述肽前体是具有至少一个氨基酸残基的固相树脂。
42.权利要求40-41中任一项所述的方法，其还包括从所述固体树脂除去所述基于肽的前体药物的步骤。
43.权利要求28-43中任一项所述的方法，其中PG1是芴基甲氧羰基(Fmoc)。
44.权利要求28-43中任一项所述的方法，其中步骤(b)的偶联包括将所述肽前体和所述被保护的氨基酸在偶联剂存在下接触，所述偶联剂选自碳二亚胺、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐、1-羟基-7-氮杂苯并三唑及其组合。
45.一种基于肽的前体药物，其包含至少一个氨基甲酸酯组成部分，其中所述至少一个氨基甲酸酯组成部分具有选自下述的结构式：
Figure FDA0002415839420000081
Figure FDA0002415839420000082
和NTHCO2R1
其中
R1是伯烷基；和
NT是所述基于肽的前体药物的肽序列的N-端氮原子。
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