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CN111163785A - 作为生物疗法的人罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌及其组合 - Google Patents

作为生物疗法的人罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌及其组合 Download PDF

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CN111163785A
CN111163785A CN201880050848.1A CN201880050848A CN111163785A CN 111163785 A CN111163785 A CN 111163785A CN 201880050848 A CN201880050848 A CN 201880050848A CN 111163785 A CN111163785 A CN 111163785A
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T·古杰拉尔
A·W·韩
A·W·古德耶
M·L·山本
T·Z·德桑蒂斯
K·达巴
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Second Genome Inc
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Abstract

本公开涉及活生物疗法产品、益生菌、包含所述益生菌的药物组合物以及使用它们治疗各种人类疾病的方法。在一些方面，本公开提供了包含细菌人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的菌株的这些组合物及其在治疗代谢相关疾病或障碍中的用途。

Description

作为生物疗法的人罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌及其组合
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月4日提交的美国临时申请号62/541,387的优先权权益，其在此通过引用整体并入。
电子提交的文本文件的说明
一起电子提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：文件名为“序列表”的计算机可读格式副本：SEGE_004_01WO_SeqList_ST25.txt，创建日期为2018年8月2日，文件大小≈21.4千字节。
技术领域
本公开涉及新型的且治疗有效的组合物和用于包含活细菌的疗法治疗的方法。该微生物组合物尤其用于恢复受试者的健康葡萄糖稳态。设想了该组合物在治疗、改善和/或预防高血糖症、糖尿病以及与异常代谢调节和/或胃肠道障碍有关的病症和疾病状态中的用途。
背景技术
胃肠道的微生物组包含各种各样的微生物，主要是原核生物，其在宿主生物的健康中起重要作用。就其种群组成和复合功能两者而言，微生物组的复杂性最近已成为研究的重点领域，因为越来越多的研究表明，对微生物组的操作可提供健康益处，并可能有效治疗多种疾病和障碍。当前，市场上销售许多含有活细菌和酵母的益生菌，据信它们可以增加人体中天然存在的这些微生物的益处。越来越多地开发活生物疗法产品(LBP)用于控制临床研究和疾病治疗方面的监管批准。这些疾病是多方面的，并且以多种方式诊断存在。
在本领域中非常需要开发一种疗法，该疗法不仅可以恢复血糖稳态，而且可以治疗个体的有关并发症。研究表明，血糖控制和调节功能不正常会导致各种各样的代谢综合征、病症和/或障碍。如本文所教导的活生物疗法产品、益生菌及其组合物将许多人健康方面恢复到可以恢复和建立稳态的水平，以预防或治疗疾病、病症或代谢或炎性因子的任何轻微失衡。
发明内容
在一些实施方式中，提供了一种用于治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用包含治疗有效量的活细菌的组合物，其中，所述活细菌是人罗斯拜瑞氏菌(R.hominis)和挑剔真杆菌(E.eligens)的组合，其中，人罗斯拜瑞氏菌细菌包含与SEQID NO：1至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，且挑剔真杆菌包含与SEQ ID NO：5至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因。
在一些实施方式中，提供了一种治疗正在经历或被诊断患有高血糖症的受试者的方法。
在一些实施方式中，提供了一种改善受试者的葡萄糖稳态的方法。
在一些实施方式中，受试者已被诊断患有或正在遭受代谢障碍。
在一些实施方式中，代谢障碍选自由高血糖症、高胰岛素血症、糖尿病前期、1型糖尿病、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、心脏代谢风险、高血压、血脂异常、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、肝脂肪变性、肾脏疾病、心血管疾病、脑血管疾病和外周血管疾病组成的组。在其它实施方式中，代谢障碍选自由高血糖症、胰岛素抵抗和2型糖尿病组成的组。在其它实施方式中，代谢障碍是高血糖症。
在一些实施方式中，受试者尚未被诊断患有2型糖尿病。在其它实施方式中，受试者尚未被诊断患有1型糖尿病。
在一些实施方式中，受试者已表现出空腹血糖水平大于约125mg/dL或130mg/dL。
在一些实施方式中，受试者已表现出对于75克口服葡萄糖耐量试验的2小时值大于约140mg/dL。
在一些实施方式中，施用导致受试者的空腹血糖水平降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％或40％的第一次施用组合物之前的受试者的空腹血糖水平。
在一些实施方式中，在第一次施用组合物后的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月时测量受试者空腹血糖水平的降低。
在一些实施方式中，受试者已被诊断患有胃肠道障碍。在其它实施方式中，胃肠道障碍与肠上皮屏障功能降低有关。在其它实施方式中，胃肠道障碍选自由溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肠易激综合征(IBS)、胃肠道粘膜炎、化学疗法引起的粘膜炎、放射引起的粘膜炎、坏死性小肠结肠炎、囊炎、功能性腹泻、功能性消化不良、功能性便秘、功能性腹痛、功能性腹胀、上腹痛综合征、餐后窘迫综合征、胃肠道反流病(GERD)及其任何组合组成的组。
在一些实施方式中，该方法包含在约1-52周的时间段内每天一次、两次或三次向受试者施用组合物。在其它实施方式中，该方法包含在大于一年的时间段内每天一次、两次或三次向受试者施用组合物。
在一些实施方式中，人罗斯拜瑞氏菌进一步包含：与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，与SEQ ID NO：3至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，和/或与SEQ ID NO：4至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因。
在一些实施方式中，人罗斯拜瑞氏菌包含与人罗斯拜瑞氏菌GenBank登录号CP003040至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、99.999％或100％相同的基因组。在其它实施方式中，以整个参考基因组序列的80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、99.999％或100％计算同一性百分比。在其它实施方式中，使用BLAST程序计算序列同一性。
在一些实施方式中，人罗斯拜瑞氏菌是菌株A2-183(DSM 16839)。
在一些实施方式中，挑剔真杆菌进一步包含：与SEQ ID NO：6至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，与SEQ ID NO：7至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，与SEQ ID NO：8至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因，和/或与SEQ ID NO：9至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的16S rRNA基因。
在一些实施方式中，挑剔真杆菌包含与挑剔真杆菌GenBank登录号NC_012778至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、99.999％或100％相同的基因组。在其它实施方式中，以整个参考基因组序列的80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％、99.999％或100％计算同一性百分比。在其它实施方式中，使用BLAST程序计算序列同一性。
在一些实施方式中，挑剔真杆菌是菌株C15-B4(DSM 3376)。
在一些实施方式中，组合物中的人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌是活的。
在一些实施方式中，治疗有效量的人罗斯拜瑞氏菌包含约1×107至1×1012个菌落形成单位(CFU)。
在一些实施方式中，治疗有效量的挑剔真杆菌包含约1×107至1×1012个菌落形成单位(CFU)。
在一些实施方式中，包含人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌的组合物选自由片剂、胶囊、液体和液体悬浮液组成的组。
在一些实施方式中，包含人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌的组合物是选自由酸奶、奶酪、乳、肉、奶油或巧克力组成的组中的食品类产品。
在一些实施方式中，包含人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌的组合物是宠物食品。在其它实施方式中，该宠物是狗、猫或牛。
附图说明
图1A和图1B显示了ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对血糖水平(图1A)和血糖水平变化百分比(图1B)的影响，如实施例1中所述。
图2A、图2B、图2C和图2D显示了ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对葡萄糖稳态的影响，如实施例2中所述。
图3A和图3B显示了在治疗两周后(第15天；图3A)和在治疗终点时(第22天；图3B)，ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对血胰岛素水平的影响，如实施例2中所述。
图4A和图4B显示了ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对体重减轻(图4A)和体重减轻百分比(图4B)的影响，如实施例3中所述。
图5显示了炎性肠病的DSS模型中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对上皮中心屏障功能读数的影响，如实施例4中所述(R.h.代表人罗斯拜瑞氏菌且E.e代表挑剔真杆菌)。
图6显示了炎性肠病的DSS模型中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对响应于受损屏障功能的炎症读数的影响，如实施例4中所述(R.h.代表人罗斯拜瑞氏菌且E.e代表挑剔真杆菌)。
图7显示了炎性肠病的DSS模型中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对体重减轻的影响，如实施例4中所述(R.h.代表人罗斯拜瑞氏菌且E.e代表挑剔真杆菌)。
图8显示了炎性肠病的DSS模型中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对总体病理的影响，如实施例4中所述(R.h.代表人罗斯拜瑞氏菌且E.e代表挑剔真杆菌)。
图9显示了炎性肠病的DSS模型中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对结肠重量与长度比的影响，如实施例4中所述(R.h.代表人罗斯拜瑞氏菌且E.e代表挑剔真杆菌)。
图10示出了ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对上皮中心屏障功能读数的影响，如实施例5中所述。
图11A和图11B示出了在治疗两周后(第15天；图11A)和在治疗终点时(第22天；图11B)，ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对响应于受损屏障功能的炎症读数的影响，如实施例5中所述。
图12A和图12B描绘了在治疗终点时(第22天)，ob/ob小鼠模型中用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗分别对小肠(SI)长度和结肠长度的影响，如实施例5中所述。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学结合使用的命名法和技术是本领域众所周知的和通常使用的那些。因此，虽然以下术语被认为是本领域普通技术人员很好理解的，但是提出以下定义以促进对当前所公开主题的解释。
在整个说明书中，词语“包含”或诸如变体“包括”或“含有”将被理解为暗示包括陈述的部件或部件组，但不排除任何其它部件或部件组。
术语“一个”或“一种”是指一个或多个该实体，即可以指复数个指示物。这样，术语“一个”或“一种”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，不定冠词“一个”或“一种”中提及“一个要素”并不排除存在多个要素的可能性，除非上下文明确要求是一个且仅有一个要素。
如本文所用，术语“微型生物”或“微生物”应广义地理解。这些术语可互换使用，包括但不限于两个原核域、细菌和古细菌，以及真核真菌和原生生物。在一些实施方式中，本公开涉及“微生物”。该表征不仅可以指所鉴定的微生物的分类细菌属，而且可以指所鉴定的分类学种类，以及各种新颖的和新近鉴定的细菌菌株。
如本文所用，“分离”、“分离的”、“分离的微生物”和类似术语旨在表示一种或多种微生物已经在特定环境(例如胃肠液、胃肠组织、人体消化液、人体消化组织等)中从与之有关的至少一种物质中分离出来。因此，“分离的微生物”在其自然存在的环境中不存在；而是通过本文所述的各种技术，微生物已经从其自然环境中移出并置于非自然存在的状态。因此，分离的菌株可以以例如生物学纯的培养物或孢子(或菌株的其它形式)与适于人施用的药学上可接受的载体结合存在。
在本公开的某些方面，分离的微生物以分离的和生物学纯的培养物存在。如本文所用，术语“生物学纯的”是指基本上不含其它生物物种的实验室培养物。优选地，细菌物种是单一生物物种的培养物的形式。本领域技术人员将理解，特定微生物的分离的和生物学纯的培养物表示所述培养物基本上(在科学原因内)不含其它活生物体并且仅含有所讨论的单个微生物。培养物可以含有不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学纯的微生物经常“与纯度较低或不纯的物质有必然不同”。参见In re Bergstrom，427F.2d1394，(CCPA 1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见In re Bergy,596F.2d 952(CCPA 1979)(讨论纯化的微生物)，还参见Parke-Davis&Co.v.H.K.Mulford&Co.,189F.95(SDNY 1911)(Learned Hand讨论纯化的肾上腺素)，部分修改，部分修订，196F.496(2d Cir.1912)，其各自通过引用并入本文。此外，在一些方面，本公开提供了必须在分离的且生物学纯的微生物培养物中发现的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方式中，这些纯度值的存在是将当前公开的微生物与以自然状态存在的那些微生物区分开的另一属性。参见例如Merck&Co.v.Olin Mathieson Chemical Corp.,253F.2d 156(4th Cir.1958)(讨论微生物生产的维生素B12的纯度限制)，其通过引用并入本文。
在本公开的某些方面，分离的微生物还包括本文所述细菌物种或菌株的突变体或变体的使用。如本文所用，术语“突变体”和“变体”包括与参考菌株的基因组序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性，或至少99％同一性的衍生细菌菌株。突变体和变体可通过自然过程、诱变运动、随机培养和基因工程技术等获得。术语“突变体”在本文中可以与术语“变体”互换。
如本文所用，“个体分离物”应被理解为是指与一种或多种其它微生物分离后，包含微生物的单个属、种或菌株的优势组合物或培养物。该短语不应被理解为表示分离或纯化微生物的程度。然而，“个体分离物”可以基本上仅包含微生物的一个属、种或菌株。
如本文所用，“益生菌”是指基本上纯的微生物(即单个分离物)或所需微生物的混合物，并且还可以包括可以施用于受试者(例如人)以用于恢复或改变微生物群的任何其它组分。本公开的益生菌或微生物接种剂组合物可以与一种试剂一起施用，以使微生物能够在胃肠道的环境中生存(即抵抗低pH)并在胃肠道环境中生长。在一些实施方式中，本发明的组合物(例如微生物组合物)在某些方面是益生菌。
如本文所用，“益生元”是指增加一种或多种所需微生物的数量和/或活性的试剂。可用于本公开方法的益生元的非限制性实例包括低聚果糖(例如低聚果糖、菊粉、菊粉型果聚糖)，低聚半乳糖，氨基酸，醇及其混合物。参见Ramirez-Farias等人(2008.Br.J.Nutr.4:1-10)以及Pool-Zobel和Sauer(2007.J.Nutr.137:2580-2584和补充)。
如本文所用，“活生物疗法产品”或“LBP”是指以下生物产品：1)含有活生物体，例如细菌，和2)适用于有此需要的受试者疾病或病症的预防、治疗或治愈。在一些实施方式中，LBP是将经历或已经历临床监管批准的治疗性组合物。
两种或更多种细菌的“组合”包括细菌在相同材料或产品中或在物理连接的产品中的物理共存，以及不同细菌的时间上共施用或共定殖。
如本文所用，“序列同一性”，“同一性百分比”，“同源性百分比”或例如包含“与…50％相同的序列”是指在比较窗口中核苷酸对核苷酸基础上序列相同的程度。因此，可以通过以下计算“序列同一性的百分比”：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)出现的位置数以产生匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。
如本文所用，序列“同一性”可以使用本领域技术人员已知的标准技术来确定。例如，可以使用在线算法“BLAST”程序确定同一性，该程序可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上公开获得。替代地或另外地，为了确定两个核酸序列的％同一性，可以为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如为了最佳比对，可以在第一序列和第二序列中的一个或两个中引入缺口，并且为了比较目的，可以适当地忽略部分不相同的序列)。在某些实施方式中，为了比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。然后比较相应核苷酸位置上的核苷酸。考虑到缺口数和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数，这需要引入以进行两个序列的最佳比对。
在至少两个核酸的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常是指多核苷酸包含与参考多核苷酸相比具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
宿主生物体的“定殖”包括细菌或其它微观生物体的非暂时性居留。
术语“患者”、“受试者”和“个体”可以互换使用，并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人，非人灵长类动物，家畜(例如牛、猪、绵羊、山羊、家禽)，伴侣动物(例如犬、猫、马、兔)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，该术语是指人患者。在示例性实施方式中，该术语是指患有例如2型糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、肥胖症，胃肠道炎性病症(例如IBD)或其任何组合的人患者。
如本文所用，“抑制和压制”和类似术语不应被解释为需要完全抑制或压制，尽管这在一些实施方式中可能是期望的。因此，“抑制的免疫应答”或“炎性细胞因子的抑制”不需要绝对抑制。
如本文所用，术语“高血糖症”是指其中血流中过量葡萄糖的病症。例如，大于约125mg/dL或130mg/dL(大于约7mmol/L)的空腹血糖水平可用于诊断受试者的高血糖症。
如本文所用，术语“肥胖症”是指以体内脂肪过多为特征的病症。例如，BMI(体重指数，kg/m2)为30或更高被认为是肥胖。
如本文所用，术语“肠”是指整个胃肠道或消化道(也称为消化道)，并且是指多细胞动物内的器官系统，该多细胞动物摄取食物，消化它以提取能量和营养，并排出剩余的废物。如本文所用，术语“胃肠道”是指从口腔到直肠的整个消化道。术语“胃肠道”包括但不限于嘴，并延续到食道、胃、小肠、大肠、直肠以及最后是肛门。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指对于治疗的受试者以适用于任何药物治疗的合理受益/风险比赋予治疗效果的治疗性试剂(例如本公开的微生物、活生物疗法产品(LBP)和/或益生菌)的量。这样的治疗效果可以是客观的(即可以通过某种测试或标记测量)或主观的(即受试者给出指示或感觉到效果)。在一些实施方式中，“治疗有效量”是指诸如通过改善与疾病有关的症状、预防或延迟疾病发作和/或还减轻疾病症状的严重性或频率来有效治疗、改善或预防(例如延迟发作)相关疾病或病症和/或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗性试剂或组合物的量。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指根据治疗性方案的治疗性试剂(例如本公开的微生物、活生物疗法产品(LBP)和/或益生菌)的任何施用，所述治疗性方案达到所需效果，即部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或降低特定疾病、障碍和/或病症(例如慢性或复发性免疫应答和胃肠道(GI)炎症、慢性或复发性高血糖症)的一种或多种症状或特征的发生率；在一些实施方式中，根据治疗性方案的治疗性试剂的施用与所需效果的实现相关。这种治疗可以针对没有表现出相关疾病、障碍和/或病症的受试者和/或针对仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期迹象的受试者。替代地或另外地，这种治疗可以针对表现出相关疾病、障碍和/或病症的一种或多种所确定迹象的受试者。在一些实施方式中，治疗可以针对已被诊断患有相关疾病、障碍和/或病症的受试者。在一些实施方式中，治疗可以针对已知具有一种或多种易感因素的受试者，所述易感因素在统计学上与相关疾病、障碍和/或病症发展的风险增加相关。
如本文所用，术语“药物”包括在人和兽医学中用于人和动物的药物。另外，本文所用的术语“药物”是指提供治疗性和/或有益效果的任何物质。如本文所用的术语“药物”不一定限于需要获得市场批准的物质，而是可以包括可用于化妆品、营养食品、食品(例如包括饲料和饮料)、益生菌培养物、营养补品和自然疗法的物质。另外，本文所用的术语“药物”包括设计用于掺入动物饲料(例如家畜饲料和/或宠物食品)中的产品。
“药学的”表示组合物、微生物、试剂和方法等能够具有药物效果，并且该组合物能够安全地施用于受试者。“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在《美国药典》或其它公认的药典中列出的用于动物的安全使用方法，尤其是用于人的安全使用方法。“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指与本文所述的微生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。根据本公开，药物组合物或另外的活性成分的制备将是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，马克印刷公司，1990所例示，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
本文教导的治疗性药物组合物可以包含一种或多种天然产物，然而，在某些实施方式中，治疗性药物组合物本身不是天然存在的。此外，在某些实施方式中，与自然界中可能存在的任何单独的天然存在的对应物或组合物组分相比，治疗性药物组合物具有明显不同的特征。也就是说，在某些实施方式中，本文教导的药物组合物(其包含治疗有效量的至少一种分离的微生物)具有至少一种结构和/或功能性质，与任何可能天然存在的组合物的任何单个单独成分相比，该结构和/或功能性质赋予组合物整体明显不同的特征。法院已确定，包含天然产物的组合物是法定主题，这些天然产物与任何可能存在的天然组分相比具有明显不同的特征。因此，所教导的治疗性药物组合物总体上具有明显不同的特征。这些特征在本文教导的数据和实施例中已说明。
在此阐述本公开的细节。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述说明性的方法和材料。根据说明书和权利要求书，本公开的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
有益于代谢健康的胃肠道细菌
肠道微生物组的组成已被证明与人和动物(包括动物模型)的多种疾病和障碍密切有关，包括代谢疾病和障碍(Eid等人，2017，Front Pharmacol，8：387)、心血管疾病(Tang等人，2017，Circ Res，120：1183-1196)和肝病(Henao-Mejia等人，2013，J Autoimmun，46：66-73)，并与血糖控制的变化有关(Palau-Rodriguez，2015，Front Microbiol，6：1151)。
葡萄糖稳态是将葡萄糖耐量维持在稍微狭窄的生理极限内。无法维持葡萄糖耐量可能导致许多有害的下游效果，包括但不限于胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是肌肉、脂肪或肝细胞适当使用已被胰腺细胞分泌到血液中的胰岛素的能力下降。因此，可能产生更多的胰岛素来处理相同量的葡萄糖，从而导致高胰岛素血症。不良的葡萄糖稳态与胰岛素抵抗组合可导致高血糖症和高胰岛素血症，导致2型糖尿病(T2DM)的风险。高血糖水平的短期并发症包括酮症酸中毒(血液中酮的有害积累)和高渗性非酮症综合症。T2DM的长期并发症包括糖尿病性视网膜病变、肾脏疾病、糖尿病性神经病变和大血管问题。
已经进行了许多研究来分析患有代谢障碍的人的肠道微生物组，包括将这些人的肠道微生物组与健康人的肠道微生物组进行比较。为了进行这样的研究，收集并分析来自感兴趣受试者的粪便，以确定粪便中细菌的类型，有时是相对数量。结果数据表明每个受试者的肠道微生物组。样品中存在的特定和单个细菌可以通过多种方法来确定，这些方法涉及分子和计算元素的组合。具体而言，可通过鉴定独特的微生物16S核糖体RNA(rRNA)序列(通过核苷酸微阵列或通过测序)或通过可采用全基因组鸟枪测序和组装的宏基因组学分析来鉴定细菌。每种方法的结果取决于许多变量，从样品制备和PCR扩增到用于分析实验室数据的软件程序和为每个程序选择的参数。
为了鉴定在受试者的代谢健康中具有功能重要性的细菌菌株，对包括代谢障碍的受试者的肠道微生物组的收集和表征在内的研究进行了分析。此类研究包括比较诊断患有2型糖尿病的受试者与健康患者的肠道菌群(Qin等人，2012，Nature 490：55-60；Forslund等人，2015，Nature，528：262-266)、比较受试者接受Roux-en-Y胃旁路手术前后的肠道菌群(Sweeney和Morton，2013，JAMA Surg，148：563-569；Tremaroli等人，2015，Cell Metab，22：228-238)、以及比较确定为健康或患有与各种代谢疾病标记(例如BMI、HbA1c、胆固醇水平或葡萄糖耐量)相关的亚临床疾病的受试者的肠道菌群(Karlsson等人，2013，Nature 498：99-103；Zeevi等人，2015，Cell，163：1079-1094；Yassour等人，2016，Genome Med，8：17)。根据多样性和丰度两者来表征微生物的存在。对来自所选研究的16s rRNA和宏基因组序列数据进行独立分析以鉴定与在患病受试者的肠道中更可能发现的细菌种类相比，在健康受试者的肠道中更可能发现的细菌种类。
获得、培养和分析被鉴定为与健康个体潜在显著有关的细菌菌株，以测试其改善代谢障碍特征的生理参数的能力。通过这些实验室研究，确定了当对ob/ob小鼠(所建立的肥胖症模型)施用时，以组合的组合物形式施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌可导致血糖水平降低(参见下面的实施例1)。ob/ob小鼠缺乏瘦素(leptin)且进食过多。因此，小鼠变得肥胖并表现出其它症状，例如表现出食欲亢进、高血糖的糖尿病样综合征，葡萄糖耐受不良、血浆胰岛素升高、不育性、伤口愈合不良以及垂体和肾上腺的激素生成增加。此外，在葡萄糖耐量测试(GTT)中，葡萄糖水平相对于未处理的对照降低。因此，数据表明了包含活的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌组合的组合物有效地改善了葡萄糖稳态，并降低了治疗受试者血液中的葡萄糖。
研究治疗对代谢综合征相关障碍的影响的另一种常用方法是使用高脂饮食诱导的小鼠模型，例如饲喂约60％脂肪和20％碳水化合物饮食的C57BL/6J小鼠。当维持这种高脂肪饮食时，C57BL/6J小鼠易患肥胖症、2型糖尿病和动脉粥样硬化(Collins等人，2004，Physiol Behav，81：243-248)。
另外，进行了实验以评估用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌进行治疗对肠上皮屏障功能的影响。具体而言，用已知降低肠上皮屏障完整性的试剂葡聚糖硫酸钠(DSS)处理的小鼠和ob/ob小鼠被施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌(分别参见实施例4和5)。虽然当用于治疗ob/ob小鼠时未观察到人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的作用，但对用DSS处理的小鼠施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌导致由于DSS的有害影响的肠道上皮屏障通透性降低、脂多糖结合蛋白(LBP)降低、体重减轻降低以及临床评分降低-在此结肠炎小鼠模型中，人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的有益效果的所有证据。因此，本文提供了用于治疗患有炎性肠病的受试者的方法，所述炎性肠病包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，并且还提供了包含向受试者施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物的方法。
治疗有效的活细菌
可用于治疗患有代谢障碍或炎性肠病的受试者的细菌组合物可包含活的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌，每个将在下文中进一步描述。
在一些实施方式中，利用16S rRNA基因序列鉴定本文教导的微生物。主要rRNA亚基16S的一级结构包含保守区、可变区和高变区的特定组合，它们以不同的速率进化，并能够解析非常古老的谱系(例如结构域)和更现代的谱系(例如属)。16S亚基的二级结构包括大约50个螺旋，其导致大约67％的残基碱基配对。高变区可以提供用于细菌鉴定的物种/菌株特异性特征序列。在过去的几十年中，16S rRNA基因已成为最测序的生物分类标记，并且是当前细菌和古细菌的系统分类的基石(Yarza等人，2014，Nature Rev.Micro，12：635-645)。
基于多相分类法可将微生物区分为属，其将所有可用的表型和基因型数据合并到共有分类中(Vandamme等人，1996，Microbiol Rev，60：407-438)。在一些实施方式中，两个16S rRNA基因的序列同一性为94.5％或更低是不同属的有力证据，86.5％或更低是不同科的有力证据，82％或更低是不同目的有力证据，78.5％是不同纲的有力证据，并且75％或更低是不同门的有力证据。同样，共享超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性的群体可以被视为相同物种的变体。定义物种的另一种公认的基因型方法是从多个分离物或变体中分离本公开的标记基因、对这些基因进行测序并比对这些测序的基因。
定义物种的另一种公认的基因型方法是基于总体基因组相关性，使得在标准条件下使用DNA-DNA杂交(其具有5℃或更低的ΔTm(同源和异源杂种之间的解链温度的差异))共享大约70％或更多相关性的菌株被认为是相同物种的成员。
本文中公开的细菌菌株(人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌)及其变体可以通过比较至少一个16S rRNA序列与参考菌株基因组序列的相应16S rRNA序列来部分或整体表征。通常，细菌菌株基因组序列将含有多个拷贝的16S rRNA序列。已经确定了大量菌株的16SrRNA基因序列。GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)具有超过2000万个保藏序列，其中90000个是16S rRNA基因。细菌16S rRNA基因序列的比较已作为一种优选的遗传技术出现，并允许通过使用例如BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与已知细菌DNA序列进行比较来鉴定新菌株。简而言之，除了可以在多个水平(包括物种和亚种水平)对菌株进行分类之外，比较16S rRNA序列还可以允许在细菌的所有主要门类的属水平上区分生物体。
人罗斯拜瑞氏菌
人罗斯拜瑞氏菌是一种在Fimanticutes phylum内系统发育簇XIVa的共生肠道厌氧菌，属于人肠道中的优势细菌群，并且也是主要的丁酸盐生产者。研究表明，人罗斯拜瑞氏菌物种的一些重要基因组非常不同，表明了其功能多样性。梭菌簇XIVa的细菌(包括肠道罗斯拜瑞氏菌(R.intestinalis)、人罗斯拜瑞氏菌和直肠真杆菌(E.rectale))(所有都是丁酸盐生产者)可以对肠道细胞产生非常不同的作用，但也可以具有协同的积极作用。
在一些实施方式中，人罗斯拜瑞氏菌包含与来自GenBank登录号CP003040(还有GenBank RefSeq登录号NC_015977)的人罗斯拜瑞氏菌16S rRNA基因序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的16S rRNA基因序列。CP003040含有可从莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心以登录号DSM 16839获得的人罗斯拜瑞氏菌菌株A2-183(aka A2-183T)的基因组序列。人罗斯拜瑞氏菌16S RNA基因序列位于GenBank登录号CP003040内，其位置为25,465-26,999(SEQ ID NO：1)；625,894-627,428(SEQ ID NO：2)；1,035,384-1,036,918(SEQ ID NO：3)和3,095,887-3,097,421(SEQ IDNO：4)的互补序列。在本公开的实施例1-5中使用的细菌物种是人罗斯拜瑞氏菌菌株A2-183。
在本文中还考虑了挑剔真杆菌与如Duncan等人(2006,Int.J.Syst.Evol.Microbiol,56:2437-2441)所述的细菌物种人罗斯拜瑞氏菌和/或Travis等人(2015,Genome Announcements 3(6))所述的人罗斯拜瑞氏菌的组合。
挑剔真杆菌
挑剔真杆菌是一种在厚壁菌门内系统发育簇XIVa的共生肠道厌氧菌，属于人肠道中的优势细菌群，并且也是丁酸盐生产者。
来自梭菌簇XIVa的细菌(包括细菌物种肠道罗斯拜瑞氏菌、惰性真杆菌和直肠真杆菌)可以对肠道细胞产生非常不同的作用，但也可以具有协同的积极作用。
在一些实施方式中，挑剔真杆菌包含与来自GenBank登录号NC_012778的挑剔真杆菌16S rRNA基因序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的挑剔真杆菌16S rRNA基因序列。NC_012778含有挑剔真杆菌的完整基因组序列(菌株C15-B4，可从莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心以登录号DSM 3376获得)。
可在GenBank登录号NZ_CZBU00000000和NZ_CZBV00000000处找到另外的挑剔真杆菌菌株的基因组序列。在其它实施方式中，细菌物种是如Mahowald等人所述的挑剔真杆菌(2009,Proc Natl Acad Sci USA 106:5859-5864)。
本公开还包括本文所述细菌物种或菌株的变体的用途，包括通过基因工程技术以改变本公开的菌株的遗传物质或将本公开的菌株的遗传物质与其它多核苷酸重组获得的那些变体。为了获得此类变异菌株，本领域技术人员可以使用标准诱变技术，例如UV辐射或暴露于诱变化学产物。本公开进一步包含具有与GenBank登录号CP003040或NC_012778的序列共享上述序列同一性的合成衍生基因组的任何微生物。因此，本公开包括天然分离的、重组产生的和合成衍生的微生物。
在一些实施方式中，变体包括具有与参考菌株(例如挑剔真杆菌GenBank登录号NC_012778和/或人罗斯拜瑞氏菌GenBank登录号CP003040)的多核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或99.999％相同的基因组序列的突变体或衍生细菌菌株。可以进行序列比较的软件示例包括但不限于例如BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999Short Protocols in Molecular Biology，第四版第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbial Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS MicrobialLett 1999 177(1)：187-8)、FASTA(Altschul等人，1990J Mol Biol 403-410)和AlignX。
因此，本公开的微生物包含与GenBank登录号CP003040或NC_012778中描述的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或99.999％相同的基因组序列，并且具有如下文更详细描述的改善有此需要的受试者健康的功能能力。
在一些实施方式中，本公开的微生物包含与GenBank登录号CP003040或NC_012778中描述的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或99.999％相同的基因组序列，并且当施用于受试者时还具有降低血糖水平、降低肠上皮屏障通透性(即增加受试者胃肠道上皮细胞屏障功能(或在体外细胞测定中))和/或降低促炎细胞因子的功能能力。在一些方面，当施用于受试者时，本公开的微生物能够降低TNF-α和/或IL-23。在另外或替代的实施方式中，当施用于受试者时，包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌或其变体的组合物还具有增加抗炎细胞因子的功能能力。例如，当施用于受试者时，根据本公开的组合物能够增加血液中的IL-10。
当用于治疗患有炎性肠障碍或疾病的受试者时，例如，与未施用该组合物的患有IBD的受试者相比，施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌或其变体的组合物也可以或替代地防止体重减轻。在一些实施方式中，组合物的施用增加了受试者中胃肠道粘液屏障的功能。在结肠中，外粘液层是共生细菌的栖息地。内粘液层不渗透细菌，且每小时由表面杯状细胞更新。因此，粘液层的增加是益生菌或活生物疗法产品(LBP)治疗的益处，例如包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌或其变体的产品。
在一些实施方式中，本公开的微生物包含与GenBank登录号CP003040或NC_012778中描述的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或99.999％相同的基因组序列，当施用于有此需要的患者时还具有改善炎性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)的至少一种副作用或改善至少一种症状的功能能力。
在一些实施方式中，本公开的微生物包含与GenBank登录号CP003040或NC_012778中描述的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或99.999％相同的基因组序列，当施用于有此需要的患者时还具有改善至少一种副作用或改善至少一种症状或改善和/或调节葡萄糖稳态和/或血糖控制的功能能力。
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的治疗性用途
越来越多的研究表明，受试者的微生物组可以影响代谢障碍的易感性或发生率或与其有关(综述，参见例如Eid等人，2017，Front Pharmacol，8：第387条；Johnson等人，2017，J Mol Med，95：1-8；Yang和Kweon，2016，BMB Rep，49：536-541)。本文提供了通过向患有所述代谢障碍的受试者施用含有人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌作为活细菌的组合物来治疗代谢障碍的方法。下文提供的实施例表明，这些细菌的施用可以降低动物的血糖水平以及增加葡萄糖耐量。葡萄糖稳态的这种改善表明该组合物可用于治疗许多代谢疾病或障碍，因为这些疾病和障碍与功能失调的葡萄糖稳态有关。下文将更详细地描述可以用本文公开的包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物治疗的此类代谢疾病和障碍。由此得出结论，本文所公开的包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物还能够减轻、改善或逆转这些疾病和障碍的一种或多种症状。
因此，提供了用于治疗、预防或改善疾病或病症的至少一种症状的方法，包括：向有此需要的受试者(即患有或有风险患有疾病或病症、或疾病或病症的至少一种症状的受试者)施用治疗或预防有效量的本文所述的微生物。
代谢综合症是一个用于指一系列病症的术语，包括血压升高，高血糖(高血糖症)，包括腰部多余脂肪的肥胖症和异常的胆固醇或甘油三酸酯水平。这些疾病往往同时发生，并可能增加患心脏病、中风和糖尿病的风险。任何一种病症都可能表明容易患上严重的疾病，例如2型糖尿病或动脉粥样硬化。
高血糖症是高血糖水平的病症，是代谢改变的标志。高血糖症的影响在多个水平上都是灾难性的，因为它破坏了细胞水平上的许多关键过程，并且以组织特异性的方式(例如眼盲)对整个器官产生了不利影响(例如肾脏疾病)，甚至包括全身性宿主效应(例如酮症酸中毒、昏迷、死亡等)方式。
患有或易患T2DM和/或肥胖症的受试者可以表现出高于正常的空腹葡萄糖水平，例如大于约125mg/dL或130mg/dL(参见例如Pippitt等人(2016)，Amer Fam Physic，93：103-109)。空腹血糖水平是至少八小时未进食的受试者的血糖测定。可能受益于人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌疗法的受试者包括被确定空腹血糖水平大于约125mg/dL、130mg/dL、140mg/dL、150mg/dL、160mg/dL、170mg/dL、180mg/dL、190mg/dL或200mg/dL的受试者。因此，本文设想了降低有此需要的受试者的高血糖症或血糖水平的方法，其中施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物将受试者的空腹葡萄糖水平降低至低于125mg/dL、低于130mg/dL、低于140mg/dL或低于150mg/dL的水平。
这些受试者还可以具有受损的葡萄糖耐量，例如75g口服葡萄糖耐量试验中的两小时血浆葡萄糖为约140-199mg/dL(7.8至11.0mmol/L)。空腹血糖水平的测定可以在向受试者首次施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物之前1-7天或1-4周进行。可能受益于人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌疗法的受试者包括那些被确定75g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时值大于约140mg/dL、150mg/dL、160mg/dL、170mg/dL、180mg/dL、190mg/dL或200mg/dL的受试者。
替代地，患有高血糖症的受试者可以具有进食后发生的餐后或反应性高血糖症。餐后或反应性高血糖症是指在进食后1-2小时时间的血糖水平高于约180mg/dL。因此，本文设想了降低有此需要的受试者的高血糖症或血糖水平的方法，其中施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物将进食1或2小时后测量的餐后血糖降低至低于180mg/dL、低于190mg/dL、低于200mg/dL或低于210mg/dL的水平。
高血糖症的症状可以是头痛、排尿增加、口渴、恶心、视力模糊、体重减轻、疲劳和昏迷。高血糖症可由低胰岛素症引起，胰腺中产生胰岛素的β细胞无法制造胰岛素或制造并分泌少量胰岛素到血液中的病症。在这种情况下，血液中糖的含量会急剧增加，从而导致高血糖症。高血糖症还可能是由于血液中某些或全部可用胰岛素无法结合到人体细胞受体和/或细胞中胰岛素的内在化减少而引起的。因此，本文提供了减轻、改善或逆转一种或多种高血糖症症状的方法。
糖尿病是人体的一种代谢化学障碍，主要涉及人体不能适当利用糖，即葡萄糖和参与人体代谢的其它化合物。其特征在于血液中糖浓度的升高和尿液中糖的出现。据估计，世界人口的1.5％至2％患有某种类型的糖尿病。一般而言，糖尿病分为三种主要类型，即1型糖尿病、受损的葡萄糖耐量(IGT)和2型糖尿病(T2DM)。在大多数1型糖尿病病例中，胰腺中的β细胞可能通过自身免疫反应而停止在人的血液中产生胰岛素。胰岛素至关重要，因为它作为代谢过程的一部分能够正确地利用并吸收血液中的糖。
在受损的葡萄糖耐量和T2DM情况下，胰腺继续产生胰岛素，但是胰岛素可能无法与适当的细胞受体结合和/或减少了细胞中胰岛素的内在化。在这种情况下，血液中可能有足够水平的胰岛素，但是由于内在胰岛素减少，细胞摄取葡萄糖的能力降低或不存在。
T2DM是高血糖症的最常见原因之一。DCCT的大规模研究(参见《糖尿病控制与并发症试验研究小组》(1993年，N.Engl.J.Med.329，977-986))得出结论，血糖水平慢性升高是许多糖尿病病症下并发症发展的主要原因。美国的DCCT研究可以清楚地表明，血糖水平慢性升高是糖尿病并发症发展的主要原因，从而导致预期寿命缩短。例如，在该人群中，具有冠心病风险的心血管死亡增加了2到4倍。糖尿病并发症的实例包括但不限于可能在视网膜病变中自身表现出的微血管和大血管损伤，可能导致或可能不会导致失明、肾衰竭和四肢丧失的肾病，并伴有心血管疾病的风险增加。
人中1型、IGT或2型糖尿病的存在通常通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)确定。OGTT是一项测试，其中给空腹个体口服已知量的葡萄糖(糖)，然后每隔一段时间对血液进行测试以记录血液中糖的含量。然后构造从中可以得出有关个人重要信息的曲线。葡萄糖耐量测试曲线通常将表明该个体是否是高血糖(糖尿病)或该个体的血液中糖是否过少，因此是否为低血糖。下面的实施例2表明，对ob/ob小鼠施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌增加了葡萄糖耐量，如葡萄糖AUC的减少(曲线下的面积)所见。
鉴于人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用对降低受试者血液中的葡萄糖水平和增加葡萄糖耐量(和体内稳态)的能力，本文提供了包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物以及这些组合物在治疗患有高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、胰岛素抵抗、胰岛素不敏感性、受损的葡萄糖代谢、受损的葡萄糖耐量、2型糖尿病、肥胖症、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、足溃疡、代谢酸中毒、白内障、糖尿病性肾病、肾小球硬化、糖尿病性神经病、勃起功能障碍、经前期综合征、血管再狭窄、冠心病、高血压、心绞痛、心肌梗塞、中风、皮肤和结缔组织疾病、关节炎、骨质疏松症及其组合的受试者中的用途。还提供了减轻、改善和/或逆转任何上述障碍的一种或多种症状的方法。这样的症状包括例如头痛、视力模糊、排尿增加、口渴、恶心、体重减轻，疲劳和昏迷。
应理解，所述受试者可以是人、非人灵长类动物或其它动物，包括但不限于宠物(例如狗和猫)，家畜(例如牛、马、猪、山羊、兔子)和其它动物，例如啮齿动物(小鼠和大鼠)或任何其它有此需要的动物。
已知营养不良对其它生理学(例如炎症和免疫)具有有害作用。因此，极有可能使用益生菌或活生物疗法产品进行治疗的有益效果将超出单一障碍。例如，施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物以治疗与代谢障碍有关的症状也可能对其它障碍(例如炎性障碍(包括例如克罗恩病或溃疡性结肠炎的炎性肠病))具有有益效果。在一些实施方式中，提供了一种方法，该方法包括向已经诊断出患有炎性疾病的受试者施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物。炎性疾病的一个实例是炎性肠病(IBD)。IBD包括例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。因此，在一些实施方式中，该方法包括向诊断为IBD的受试者施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物。在其它实施方式中，IBD是UC或CD。
一种用于测试根据本公开的组合物有效治疗IBD的功效的方法是肠上皮屏障疾病的体外测定。可以在体外实验系统中使用跨上皮/跨内皮电阻(TEER)测定法测量胃肠道上皮屏障的完整性，该测定法可测量整个细胞单层的电阻。这种非常灵敏和可靠的方法确定了单层的完整性和渗透性。关于TEER测定法的背景信息可在例如Dewi等人(2004)J.Virol.Methods.121：171-180中以及在Mandic等人(2004)Clin.Exp.Metast 21：699-704中获得。关于跨内皮细胞白蛋白通透性测定的指南可在例如Dewi等人(2008)J.Gen.Virol.89：642-652中获得。星形孢菌素是可以用作TEER测定法的对照的试剂。因此，在一些实施方式中，提供了一种用于用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物增加肠上皮屏障功能完整性的方法，其中，与不存在人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌下进行的TEER测定法相比，该方法在TEER测定法中将电阻增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
本文公开的组合物和方法的治疗性功效可以包括与所治疗的适应症有关的症状的减轻。例如，可以看到被诊断患有2型糖尿病并正在接受2型糖尿病治疗的受试者一种或多种症状的减轻，这些症状选自由以下组成的组：口干和皮肤瘙痒、视力模糊、酵母菌感染的发作以及脚或腿的疼痛或麻木。症状减轻可以是受试者在24小时时间段内经历症状的次数减少。可以在例如开始治疗后约1-2个月、1-5个月或6-12个月的时间段内观察到一种或多种症状的减轻。
包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物
本公开的微生物组合物可以施用于有此需要的受试者以增强总体健康和福利和/或治疗或预防疾病或障碍，例如如本文所述的代谢障碍或与肠上皮屏障功能减少有关的障碍。在一些实施方式中，微生物组合物是活生物疗法产品(LBP)，而在其它实施方式中，微生物组合物是益生菌。在一些实施方式中，一种或两种微生物(人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌)被分离并且已经在受试者外部培养以增加微生物的数量或浓度，从而增强了包含微生物种群的组合物的治疗功效。
在一些实施方式中，微生物组合物为活细菌种群的形式。活种群可以是例如冷冻的、冷冻保护的或冻干的。在其它实施方式中，微生物组合物包含非活细菌制剂或其细胞组分。在一些实施方式中，当微生物组合物为非活细菌制剂的形式时，其选自例如热灭活细菌、辐照细菌和裂解细菌。
在一些实施方式中，细菌物种是生物学纯的形式，基本上不含其它生物体物种。在一些实施方式中，细菌物种为单一生物体物种培养物的形式。
根据本公开的包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物可以是适合于施用于受试者的许多公认的益生菌或活生物疗法产品(LBP)递送系统中的任何一种。重要的是，必须配制用于递送人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌活种群的组合物以维持微生物的活力。在一些实施方式中，组合物包含保护细菌免受胃的酸性环境影响的元素。在一些实施方式中，该组合物包括肠溶衣。
在一些实施方式中，该组合物是食品类产品。食品类产品可以是例如酸奶、奶酪、乳、肉、奶油或巧克力。此类食品类产品可被视为可食用，这意味着它已被批准用于人或动物消费。
本公开的一个方面涉及一种包含以上定义的细菌物种的食品。术语“食品”旨在涵盖所有消耗品，该消耗品可以是固体、果冻或液体。合适的食品可以包括例如功能性食品、食品组合物、宠物食品、家畜饲料、保健食品和饲料等。在一些实施方式中，食品是配制的保健食品。
如本文所用，术语“功能性食品”是指不仅能够提供营养作用，而且还能够向消费者递送进一步有益效果的食物。因此，功能性食品是具有掺入到其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食品，其赋予食品以特定功能-例如医学或生理上的益处-除了单纯的营养作用。
适用于本公开的特定食品的实例包括旨在用于人的乳类产品、即食甜品、与例如乳或水重构的粉末、巧克力乳饮料、麦芽饮料、即食菜肴、速食菜肴或饮料、或代表旨在用于人、宠物或家畜的完全或部分饮食的食品组合物。
在一个实施方式中，根据本公开的组合物是旨在用于人、宠物或家畜的食品。该组合物可以用于选自由非人灵长类动物、狗、猫、猪、牛、马、山羊、绵羊或家禽组成的组的动物。在另一个实施方式中，该组合物是旨在用于成年物种，特别是成年人的食品。
本公开的另一个方面涉及含有上述细菌物种的食品、膳食补充剂、营养食品、营养制剂、饮料和药物及其用途。
在本公开中，“乳类产品”是指具有变化的脂肪含量的任何液体或半固体乳或乳清类产品。乳类产品可以是例如牛乳，山羊乳，绵羊乳，脱脂乳，全脂乳，由奶粉和乳清复合而成的未经加工的乳，或经过加工的产品(例如酸奶、凝固乳、凝乳、酸乳、酸全脂乳、黄油乳和其它酸乳产品)。另一个重要的类别包括乳饮料(例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴儿或宝宝乳)；调味乳，冰淇淋；含乳的食品(例如糖果)。
微生物组合物可以是片剂、可咀嚼片剂、胶囊、棒状包装、粉末或泡腾粉。该组合物可以包含含有细菌的包被珠。可以将粉末悬浮或溶解在用于施用的可饮用液体(例如水)中。
在一些实施方式中，微生物组合物包含分离的微生物。分离的微生物可以与一种或多种其它物质一起包括在组合物中。例如，分离的微生物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起包括在药物组合物中。
在一些实施方式中，微生物组合物可以用于促进或改善人类健康。在一些方面，微生物组合物可以用于改善肠道健康。在一些方面，微生物组合物可用于调节食欲。在一些方面，微生物组合物可以用于调节血糖水平。在一些方面，微生物组合物可以用于调节胰岛素敏感性。在一些实施方式中，所公开的微生物组合物用于调节受试者的食欲。
本文所述的微生物也可以用于预防性应用中。在预防性应用中，以足以至少部分降低患病风险的量将根据本公开的细菌物种或组合物施用于易患特定疾病或以其它方式处于患特定疾病风险的患者。精确量取决于许多患者特定因素，例如患者的健康状况和体重。
在一些实施方式中，本公开提供了多种快速和控释制剂，其包含所教导的微生物及其组合。控释制剂有时涉及置于细菌上的控释包衣。在特定的实施方式中，控释包衣可以是所需的肠溶衣、半肠溶衣、延迟释放包衣或脉冲释放包衣。特别地，如果包衣在活性释放(即治疗性微生物及其组合的释放)中提供适当的滞后，则它将是合适的。可以理解的是，在一些实施方式中，人们不希望将治疗性微生物及其组合释放到胃的酸性环境中，这可能在其到达肠中的期望靶标之前降解和/或破坏所教导的微生物。
在一些实施方式中，本公开的微生物组合物包括人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌及其任何如上所述的变体。
在一些实施方式中，本公开的微生物组合物还包含益生元，其量相对于组合物总重量为约1至约30重量％，优选为5至20重量％。优选的碳水化合物选自：果糖寡糖(或FOS)、短链果糖寡糖、菊粉、异麦芽糖寡糖、果胶、木糖寡糖(或XOS)、壳聚糖-寡糖(或COS)、β-葡聚糖、可耕胶改性和抗性的淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶、角豆、燕麦和柑橘纤维。特别优选的益生元是短链果糖寡糖(为简单起见，在下文中显示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c不是可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化而获得，并且包括与三个葡萄糖分子键合的蔗糖分子。
在一个实施方式中，所述组合物还包含至少一种其它种类的其它食品级细菌，其中，所述食品级细菌优选选自由乳酸菌、双歧杆菌、丙酸杆菌或其混合物组成的组。
在一些实施方式中，微生物组合物包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌各自106-1012个CFU(菌落形成单位)、108-1012个CFU、1010-1012个CFU、108-1010个CFU或108-1011个CFU。在其它实施方式中，微生物组合包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌各自约106、约107、约108、约109、约1010、约1011或约1012个CFU。
可以配制根据本公开的包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物以递送至所施用的个体内所需的作用位点。例如，可以将组合物配制成用于口服和/或直肠施用。另外，该组合物可以是用于胃肠道腔施用或在肠、回肠末端或结肠中延迟释放的制剂。
当用作药物时，即用于治疗或预防疾病、障碍或病症时，本文所述的组合物通常以药物组合物的形式施用。这样的组合物可以以药学领域众所周知的方式制备，并且包括至少一种活性化合物，即如本文所述的活菌株。通常，以药物有效量(即治疗或预防有效量)施用组合物。活性剂(即本文所述的微生物)的施用量通常将由医师根据相关情况确定，包括要治疗的病症、选择的施用途径，微生物的活性，施用的微生物，个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度等。
组合物可以通过多种途径施用，包括口服、直肠和鼻内。取决于预期的递送途径，将组合物配制成可注射或口服组合物，或配制成药膏、洗剂或贴剂。
用于口服施用的组合物可以采取散装液体溶液或悬浮液或散装粉末的形式。然而，更通常地，组合物以单位剂型存在以促进精确给药。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充的、预测量的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下为丸剂、片剂、胶囊等。用于口服施用或注射施用组合物的上述组分仅是代表性的。其它材料以及加工技术等在Remington的《科学与实践药学》(第21版，2005年，出版者：Lippincott Williams&Wilkins)的第8部分中进行了阐述，该文献通过引用并入本文。
对于口服施用，特别使用压缩片剂、丸剂、片剂、凝胶、滴剂和胶囊。
组合物可以配制成单位剂型，即以含单位剂量或单位剂量的多个或亚单位的离散部分的形式。
在另一个实施方式中，本公开的组合物与一种或多种其它活性试剂组合施用。在这种情况下，本公开的组合物可以与一种或多种其它活性试剂连续、同时或顺序地施用。
剂量和施用时间表
本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，在个别情况下，需要较高或较低的剂量范围，并且这些都在本公开的范围内。术语“单位剂型”是指适合作为被施用个体的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗或预防作用的预定量的活性物质，并且可以与合适的药物赋形剂联合。
在一些实施方式中，受试者的有效日剂量为约1×106至约1×1012个菌落形成单位(CFU)、1×107至1×1012个CFU、1×108至1×1012个CFU、1×108至1×1011个CFU、1×108至1×1010个CFU、1×108至1×109个CFU、1×109至1×1012个CFU、1×1010至1×1012个CFU或1×1010至1×1011个CFU。受试者可以是人或非人灵长类动物。替代地，受试者可以是另一种哺乳动物，例如大鼠、小鼠、兔子等。
在一些实施方式中，每天向受试者施用日剂量达约1-2周、1-4周、1-2个月、1-6个月、1-12个月。
替代地，剂量范围为每隔一天一次，每周一次，每周三次，每周五次，每月一次，每月两次，每月三次，每两月一次，或每年三次，每年四次或每年六次将约1×106至约1×1012个菌落形成单位(CFU)、1×107至1×1012个CFU、1×108至1×1012个CFU、1×108至1×1011个CFU、1×108至1×1010个CFU、1×108至1×109个CFU、1×109至1×1012个CFU、1×1010至1×1012个CFU或1×1010至1×1011个CFU施用于受试者。在这些实施方式中，可以向受试者施用剂量达约1至2周、1至4周、1至2个月、1至6个月、1至12个月。
施用于受试者的剂量应足以治疗疾病和/或病症、部分逆转疾病和/或病症、完全逆转疾病和/或病症或建立健康状态的微生物组。在一些方面，施用于受试者的剂量应足以防止与代谢障碍(例如高血糖症、2型糖尿病或肥胖症)有关的症状发作。在其它实施方式中，该剂量可有效治疗或缓解炎性障碍的症状。在一些实施方式中，炎性为炎性肠病，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
例如每天、每两天、每周，每月或者根据临床医生或医生的判断并考虑例如年龄、体重、疾病严重程度以及每次施用的剂量，给药可以是一次施用，也可以是两次或更多次施用的组合。
在另一个实施方式中，可以提供有效量的1-500ml或1-500g细菌组合物，该细菌组合物具有每毫升或每克107至1011个细菌，或胶囊、片剂或栓剂具有1mg至1000mg细菌冻干粉末，该细菌冻干粉末具有107至1011个细菌。接受急性治疗的人比接受慢性施用的人(例如医院工作人员或入住长期护理机构的人)可以接受更高的剂量。
如上所述的有效剂量可以例如口服、直肠、静脉内、经皮下注射或经皮施用。有效剂量可以固体或液体形式提供，并且可以以一种或多种剂型单位(例如片剂或胶囊剂)存在。
组合疗法
本文所教导的包含治疗性微生物的组合物可以与其它治疗疗法和/或药物组合物组合。例如，患有代谢综合征或障碍(例如高血糖症、肥胖症或2型糖尿病)的患者可能已经在服用其医生开的处方药来治疗该病症。在实施方式中，本文所教导的组合物能够与患者现有的药物联合施用。
在一些实施方式中，当将所公开的治疗性微生物或微生物与一种或多种其它治疗性试剂组合时，可获得协同作用。例如，在一些实施方式中，在降低空腹血糖水平、降低餐后血糖水平、增加葡萄糖耐量，降低胰岛素抵抗、通过体外TEER分析或体内分析增加肠道上皮屏障的完整性或减少肠道炎症方面，施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的协同作用比单独使用任一种细菌更有效。
具有或不具有一种或多种益生元的组合物可以与其它试剂以组合疗法方式一起施用，包括抗微生物试剂。施用可以是连续的，也可以是数小时或数天的时间段，也可以是同时的。
在一个实施方式中，具有或不具有一种或多种益生元的微生物组合物与一种或多种抗微生物试剂包括在组合疗法中，所述抗微生物试剂包括抗菌试剂、抗真菌试剂、抗病毒试剂和抗寄生虫试剂。在一些实施方式中，抗微生物试剂不杀死或抑制人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌的功能或生长。
基于微生物组的患者选择
在一些实施方式中，受试者是人。在其它实施方式中，受试者是其它动物，包括但不限于非人灵长类动物、猪、山羊、狗、牛、马、鸡、小鼠、大鼠和猫。
除了通过确定例如血糖水平、葡萄糖耐量和/或BMI来鉴定可受益于包含施用人罗斯拜瑞氏菌和/或挑剔真杆菌的疗法的受试者之外，还可根据其肠道微生物组的图谱鉴定受试者。可以为个体受试者或具有特定图谱的受试者选择特定的细菌组合物。例如，可以对给定的受试者进行16S rRNA测序以鉴定其微生物群中存在的细菌。16S rRNA测序可与其它方法(例如微谱分析)一起使用用于确定受试者的微生物组图谱。测序可以使用16S测序(到科、属或种)对受试者的整个微生物组进行概述，或者使用16S测序对受试者的微生物组的一部分进行概述，或者可以用于检测是否存在作为健康或特定疾病状态的生物标记物的特定候选细菌，例如所关注的耐多药生物体或特定属的标记物。基于生物标记物数据，可以选择特定的组合物以施用于受试者而补充或补偿受试者的微生物群，以便恢复健康或治疗或预防疾病。在另一个实施方式中，可以筛选受试者以确定其微生物群的组成而确定成功治疗的可能性。
试剂盒
在某些方面，本公开涉及用于治疗代谢或炎性障碍或疾病的试剂盒。该试剂盒包含根据本公开的微生物组合物。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包含益生元(本文所述的第二种治疗性试剂)或其组合。
提供的试剂盒可包含一个或多个容器。所述容器可包含具有一种或多种微生物的单独分离的微生物组合物和/或具有一种或多种碳水化合物的单独分离的益生元组合物。在不同容器中的具有或不具有一种或多种益生元的微生物组合物可以同时或在不同时间施用，并且可以以特定顺序施用。
具有或不具有一种或多种益生元的微生物组合物可以包含活微生物，被冻干、冷冻干燥和/或基本上脱水的微生物，或者该组合物可以包含细菌孢子。
以下实施例旨在说明而非限制本公开。
实施例
以下实验利用体内实验的强大混合物，所述体内实验利用肥胖症/糖尿病的模型来证明所教导的微生物单独和组合使用的治疗能力及其方法。模仿人肥胖症、高血糖症、2型糖尿病以及有关病症和疾病的常用动物模型是使用ob/ob小鼠模型(参见例如
Figure BDA0002379887360000151
P.(2007)Scientific World Journal.7：666-685以供查阅)。此外，可以使用高脂饮食诱导的小鼠模型，例如饲喂约60％脂肪和20％碳水化合物饮食的C57BL/6J小鼠(Collins等人，2004，Physiol Behav，81：243-248)。
为了研究活菌株对IBD和其它结肠炎性障碍的影响，有许多可变的与IBD的几个特征类似的动物模型。可以在例如Westbrook等人，(2016)Arch Toxicol 90:2109-2130和Valatas等人，(2013)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 305:G763-G785中找到这些模型的评论。结肠炎的动物模型包括自发于某些物种(同类系)易感菌株或通过杂交的那些模型、通过基因敲除和转基因技术产生的基因工程模型、其中将淋巴细胞转移至淋巴细胞减少的小鼠的转移模型以及化学诱导的模型。需要施用特定浓度的诱导结肠炎的化学药品(例如葡聚糖硫酸钠(DSS))的那些模型。化学诱导的肠道炎症模型是IBD最常用和描述最充分的模型。
以下实验利用体内实验的强大混合物，所述体内实验利用肥胖症/糖尿病和IBD动物模型来证明所教导的微生物单独和组合使用的治疗能力及其方法。
实施例1
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌改善ob/ob小鼠的高血糖症
以下实验涉及体内模型(ob/ob小鼠)的使用以证明包含本文所公开的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的微生物组合物治疗代谢障碍的治疗能力。ob/ob小鼠模型发展为严重的胰岛素抵抗并可用于模拟人代谢障碍病症(例如肥胖症)、2型糖尿病以及与糖尿病有关的疾病和病症(例如高血糖症)。
进行实验以显示治疗对血糖水平的影响。如下治疗ob/ob小鼠：
程序 天数
驯化 -7至-1
粪便样品收集 -2
开始治疗 0
FITC-葡聚糖 15
粪便样品收集 18
OGTT(口服葡萄糖耐量试验) 20
结束治疗 22
从第0天开始，口服(p.o.)治疗小鼠，其总体积为：1)0.1ml含有2×107个菌落形成单位(CFU)的人罗斯拜瑞氏菌菌株A2-183(DSM/DSMZ号16839)和1×108个CFU的挑剔真杆菌菌株C15-B4(DSM/DSMZ号3376)的PBS；2)0.1ml含嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)(ATCC保藏号BAA-835)的PBS，在整个本公开中，该菌也被称作嗜粘蛋白艾克曼菌(A.muciniphila或Akkermansia)；3)0.1ml含有载体作为阴性对照的PBS；或4)二甲双胍作为阳性治疗对照。治疗两天一次持续直到第22天，在第20天进行口服葡萄糖耐量测试，治疗22天后，将小鼠安乐死。
已知用作对照菌株的嗜粘蛋白艾克曼菌可改善葡萄糖代谢。参见例如Liu等人，Oncotarget,Jan.172017,8(3):37987-3810和Greer等人，Nat Commun.,Nov.14,2016,7:13329。
二甲双胍(N,N-二甲基亚氨基二碳二酰亚胺基二酰胺)是用于治疗患有2型糖尿病的个体的最处方的药物疗法。参见例如Sharma等人(2016)BJM Open 6:e010210。二甲双胍通过降低肝脏葡萄糖的产生和葡萄糖的肠道吸收以及增加外周葡萄糖的摄取和利用来降低基础和餐后血浆葡萄糖的功能。二甲双胍可改善T2D患者的葡萄糖耐量。使用二甲双胍疗法时，胰岛素分泌保持不变，而空腹胰岛素水平和全天血浆胰岛素反应可能降低。二甲双胍已显示与肠道中嗜粘蛋白艾克曼菌相对较高的丰度有关。参见例如de la Cuesta-Zuluaga,Jan.2017,40(1):54-62。
在整个治疗过程中测量进食血糖水平。结果示于图1A中且表示为平均值±SEM。还确定了每只小鼠的血糖水平变化百分比。这些结果示于图1B中且也表示为平均值±SEM。
与用载体或二甲双胍治疗相比，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗可导致显著降低葡萄糖水平且降低葡萄糖水平的百分比。与人用二甲双胍治疗后相比，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗后葡萄糖水平也较早降低。也就是说，在第7天收集的第一个治疗后数据点中，葡萄糖水平的下降(以及葡萄糖水平的下降百分比)明显更大。
例如，来自第7天的数据显示了载体、嗜粘蛋白艾克曼菌、人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌以及二甲双胍组中的平均进食葡萄糖水平分别为416、489、371和477mg/dL。在治疗后第14天，如由双因素方差分析(n＝8-10)所确定的，与载体治疗的小鼠相比，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的小鼠显示出显著变化的葡萄糖。
实施例2
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌改善ob/ob小鼠的高血糖症和血糖稳态
通过进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)和测量胰岛素水平进行了实验以显示治疗对ob/ob小鼠葡萄糖稳态的影响。ob/ob小鼠是如上述实施例1所述处理的那些小鼠。
用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗导致ob/ob小鼠葡萄糖稳态显著改善。结果示于图2A-2D。空腹5小时后进行OGTT。通过口服管饲法给小鼠1g/kg葡萄糖，并从尾巴修剪开始2小时内测量循环葡萄糖水平。通过双因素方差分析和费舍尔氏LSD检验来测试确定统计数据。使用GraphPad Prism确定曲线下面积(AUC)。
用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗导致通过OGTT测量的葡萄糖耐量的显著改善。结果示于图2A(OGTT)和图2B(归一化的OGTT)，并显示了用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗导致葡萄糖施用后血糖水平更快地降低。此外，与载体组相比，30分钟后人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的小鼠的循环葡萄糖水平显著降低。因此，与载体治疗的小鼠相比，AUC显著降低(参见图2C)。其它任何治疗均未显著改善AUC。图2D显示了空腹5小时后并且在给每只动物给药葡萄糖之前动物中的血糖水平。与载体治疗的小鼠相比，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌进行治疗的小鼠显示了血糖水平显著降低。
该研究进一步检验了用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌进行治疗对ob/ob小鼠的胰岛素水平的影响。ob/ob小鼠是如上述实施例1所述治疗的那些小鼠。通过费舍尔氏LSD检验确定统计数据。
在治疗2周后(第15天)和研究结束时(3周；第22天)测量胰岛素水平。通过ELISA测量血清中的胰岛素。结果示于图3A(第15天)和图3B(第22天)。尽管在第2周时未观察到治疗对胰岛素的显著影响，但在研究结束时，与载体治疗的小鼠相比，嗜粘蛋白艾克曼菌治疗的小鼠的胰岛素水平显著更高。二甲双胍和人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌组中的胰岛素水平与载体组无显著差异，这表明在用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的动物中观察到的葡萄糖耐量增加并不是由于胰岛素水平增加。
实施例3
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对ob/ob小鼠体重减轻的影响
实施例3显示了治疗对ob/ob小鼠模型中体重变化的影响。ob/ob小鼠是如上述实施例1所述治疗的那些小鼠。
在整个治疗过程中测量每只小鼠的体重，结果作为平均值±SEM提供于图4A中。还确定了每只小鼠从第0天开始重量的变化百分比。这些结果示于图4B中且表示为平均值±SEM。
用嗜粘蛋白艾克曼菌治疗通常导致总体体重增加和体重增加百分比降低。人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的施用在该模型中未导致体重或体重增加百分比显著下降。观察到用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌与仅使用二甲双胍和载体进行治疗的小鼠的体重减轻类似。通过重复量数双因素方差分析(n＝8)确定组间的统计学差异。
实施例4
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌(改善炎性肠病DSS模型中的上皮中心屏障功能读数
以下实验证明了如本文所公开的包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的微生物组合物在体内模型(用葡聚糖硫酸钠(DSS)处理的C57BL/6小鼠)中治疗上皮屏障功能障碍或相关代谢障碍的治疗能力。
为了模拟与体内上皮屏障功能降低有关的炎性肠病，将C57BL/6小鼠在其饮用水中用2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)处理六天(参见例如Chassaign等人，2014,Curr ProtocImunol,104:Unit-15.25；Kiesler等人，2015,Cell Mol Gastroenterol Hepatol)。在第0天：1)口服(p.o.)治疗小鼠，其总体积为0.2ml含有4.7×107个菌落形成单位(CFU)的人罗斯拜瑞氏菌菌株A2-183(DSM/DSMZ号16839)和2.2×108个CFU的挑剔真杆菌菌株C15-B4(DSM/DSMZ号3376)的PBS；2)Gly2-GLP处理的小鼠腹膜内(i.p.)接受了在0.1ml PBS+10％甘油中重构的50nmol/kg Gly2-GLP2；和3)载体处理的小鼠腹膜内接受了0.1ml PBS+10％甘油。6小时后，开始进行DSS处理，接下来的6天，小鼠的饮用水中接受了2.5％DSS。在DSS暴露期间，人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌、Gly2-GLP2和载体治疗继续每两天一次。未经治疗的小鼠保持正常饮用水，并且在整个实验过程中均未接受任何治疗。在第六天，使小鼠空腹四小时，然后口服管饲600mg/kg用异硫氰酸荧光素标记的4KDa葡聚糖(4KDa-FITC)。4KDa-FITC后1小时，将管饲小鼠实施安乐死，收集血液，并在血清中测量FITC信号。
A.人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对肠上皮屏障功能的影响
结果示于图5中且表示为平均值±SEM。与未经治疗的小鼠相比，在用载体治疗的DSS小鼠中观察到跨越上皮屏障的4KDa-FITC葡聚糖转运的显著增加(p＜0.0001)。与仅用载体治疗的DSS小鼠相比，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗导致4KDa-FITC葡聚糖转运显著减少(p＝0.03)。观察到的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的4KDa-FITC葡聚糖转运的幅度与胰高血糖素样肽2的稳定类似物的阳性对照类似(Gly2-GLP2；p＝0.48)，已知这可以降低结肠损伤的严重程度(参见例如Drucker D.J.,等人(1999)Am J Physiol 276；G79-91)，并且最近已显示可改善血糖控制(参见例如Amato等人(2016)J Endocrinol 229:R57-R66)。结果表示为平均值±SEM，并通过单因素方差分析(n＝10)进行统计分析。
B.人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对血清LBP水平的影响
还评估了如实施例4中所述处理的动物，测量了其血清中脂多糖结合蛋白(LBP)的水平。DSS处理的动物的血清中LBP的降低可能是上皮屏障修复的标志。处理6天后，将小鼠安乐死，收集血液，并通过ELISA测量血清中的LBP。LBP在激活对细菌攻击的先天免疫应答中起关键作用(参见例如Ding P.H.and Jin L.J.(2014)J Periodontal Res.49:1-9；
Figure BDA0002379887360000171
N.W.,等人(2004)J immunol 173:2683-91)。
结果示于图6中且表示为平均值±SEM。观察到，LBP浓度响应于DSS而显著增加(p<0.0001)。与用载体治疗的DSS小鼠相比，在接受DSS的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的小鼠中观察到LBP降低(p＝0.07)。结果表示为平均值±SEM，并通过单因素方差分析(n＝10)进行统计分析。因此，通过施用包含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物可以降低LBP报道的炎症反应。
C.人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对体重的影响
上皮屏障功能障碍和有关的炎性肠病可导致体重的有害减轻。还评估了用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗如实施例4所述处理的小鼠对体重的影响。
每天测量该DSS模型研究中包括的小鼠的体重。结果示于图7中且表示为平均值±SEM。确定每只小鼠从第0天(“0”)开始体重的变化百分比。与载体处理的DSS小鼠相比，对DSS处理的小鼠施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌显著改善了体重(p＝0.05)。在第6天，用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的小鼠的体重减轻与用Gly2-GLP2观察到的体重减轻类似(p＝0.51)。通过重复量数双因素方差分析(n＝10)确定各组之间的统计学差异。
D.人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对总体病理的影响
还评估了用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的治疗如实施例4中所述处理的小鼠对肠道总体病理的影响。结果示于图8中且表示为平均值±SEM。
与载体治疗的DSS小鼠相比，对DSS处理的小鼠施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌显著改善总体病理(p＝0.008)。然而，在给予DSS并用Gly2-GLP2或人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗的小鼠之间未观察到临床评分的差异(p＝0.54)。使用的临床评分系统为：(0)＝无总体病理，(1)＝粪便中可见血液条纹，(2)＝完全血性粪便颗粒，(3)＝盲肠中可见血性粪便，(4)＝盲肠中血性粪便且大便稀溏，(5)＝直肠出血。通过单因素方差分析(n＝10)确定各组之间的统计学差异。
E.人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对结肠重量/长度比的影响
DSS治疗诱导结肠组织的缩短，同时引起水肿，从而导致结肠重量增加。因此，DSS治疗导致结肠组织的重量与长度(Wt./Ln.)比的增加。因此，关于结肠的Wt./Ln.比，评估如实施例4所述治疗的小鼠。在这些小鼠中测量结肠长度和重量，结果示于图9中且表示为平均值±SEM。
尽管统计学上差异不显著(p＝0.07)，对DSS治疗的小鼠施用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌阻止了由DSS引发的结肠Wt./Ln.比的增加。使用单因素方差分析(n＝10)进行统计分析。
实施例5
ob/ob小鼠中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对上皮屏障功能读数、炎症中心屏障功能读数以及保持小肠(SI)和结肠长度的影响。
进行实验以研究人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌对ob/ob小鼠中肠道健康和功能的影响。如上述实施例1所述处理ob/ob小鼠。
在用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗2周后，测试小鼠的肠通透性(参见上述实施例4的方法)。空腹4-5小时后，用200mg/kg FITC-葡聚糖(4kD)管饲小鼠。管饲1小时后，收集外周血。通过血清中的荧光强度测量肠道通透性。结果示于图10中并显示了用嗜粘蛋白艾克曼菌或用人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌治疗对肠道通透性没有影响，而与用载体治疗的动物相比，二甲双胍治疗导致肠道通透性显著增加。
在治疗2周后和研究结束时(3周)测量脂多糖(LPS)结合蛋白(LBP)。通过ELISA测量血清中的LBP(炎症标记和LPS暴露)。如图11A(第15天)和图11B(第22天)所示，所有治疗均不影响LBP。
在研究结束时(第22天)，测量每只小鼠的小肠长度和结肠长度以确定细菌治疗是否影响肠道健康。结果示于图12A(小肠)和图12B(结肠)中。与仅用载体治疗的动物相比，所有治疗均不影响结肠或小肠长度。
实施例6
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌用于治疗2型糖尿病
进行了一项研究含有人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的活生物疗法产品作用的临床试验以研究该组合物对治疗2型糖尿病的作用。该研究包括治疗前后粪便中人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的测定。
该研究是随机的、安慰剂对照的、双盲试验的。将二十四名诊断为2型糖尿病的成年人随机分为一个测试组(n＝12)和一个对照组(n＝12)。给测试组中的每个受试者口服施用含有等量的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌(每个约105个CFU)的胶囊，而对照组中的受试者则接受安慰剂胶囊。给测试组中的每个受试者口服施用包含的胶囊。给测试组中的每个受试者口服施用安慰剂片剂。早晨将胶囊一日一次(q.d)施用于每个受试者达4个星期周期。在治疗几周期间，指示受试者戒除发酵乳制品。口服葡萄糖耐量测试(OGTT)前48小时应避免剧烈运动。停用口服抗糖尿病药和他汀类药物1周，并且停用所有其它药物24小时。
在第一次施用胶囊之前和在施用的最后一天的24小时内收集粪便样品。样品在5℃下保存不超过24小时，并保存在-80℃下直到在实验室进行分析。从粪便样品中提取总细菌DNA和基因组DNA。
为了确定粪便样品中的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌水平，将对人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌特异性的基因序列进行PCR扩增，通过DNA测序确认，然后通过实时PCR进行分析，以确定人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌在每个受试者的粪便样本中的水平。
在研究的开始和结束时施用OGTT以确定葡萄糖耐量治疗的效果。在第一次口服胶囊的前一天和施用的最后一天，对每个受试者进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。受试者在5分钟内喝掉稀释在500ml水中的75g葡萄糖。在基线以及施用葡萄糖后1和2小时测量血浆葡萄糖。
使用高胰岛素-正常血糖钳夹技术来测量治疗对胰岛素抵抗的影响。通常，在空腹过夜后，受试者向实验室报告，并在肘前静脉中放置静脉导管以施用胰岛素、葡萄糖和电解质。将逆行导管插入到对侧手背的静脉中。
钳夹的持续时间为180分钟。以每平方米0.120IU/min的速度连续输注胰岛素(100IU/ml)。在第1个小时期间以5分钟为间隔并且在第2个小时和第3个小时期间以10分钟间隔测量血浆葡萄糖和K。通过在计算机控制的输注泵上调节葡萄糖(200g/l)的输注速度，使血浆葡萄糖水平目标为5.0±0.2mmol/l。M(即全身葡萄糖的代谢率)是根据DeFronzo等人(1979，Am J Physiol 237：E214-E223)的方程以120分钟至180分钟之间间隔的葡萄糖输注速率计算得出的。持续输注含K的等渗盐水以避免低钾血症。每30分钟将用于分析胰岛素的血液抽入装有EDTA的试管中并立即离心。血浆保存在-80℃直至分析。
实施例7
人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌用于治疗溃疡性结肠炎
进行一项随机的安慰剂控制试验以确定当向诊断为中度至重度活动性溃疡性结肠炎(由内窥镜证据确定)的受试者口服施用时，含人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌的组合物的治疗效果；在进行研究组合物施用之前的2周内，Mayo评分≥6且Mayo内镜子评分≥2。选择了250名成年受试者，他们对口服氨基水杨酸酯、泼尼松、免疫抑制剂、静脉(IV)氢化可的松或抗TNF试剂中的一种或多种没有足够响应；对上述中的一种或多种不耐受；和/或目前正在接受口服氨基水杨酸酯、泼尼松或硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤。
将24名诊断为2型糖尿病的成年人随机分配到测试组(n＝12)和对照组(n＝12)。给测试组中的每个受试者口服施用含有等量的人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌(每个约105至108个CFU)的胶囊，而对照组中的受试者则接受安慰剂胶囊。给测试组中的每个受试者口服施用包含的胶囊。给测试组中的每个受试者口服施用安慰剂片剂。将胶囊一日一次(q.d)在早晨施用于每个受试者达12个星期的时间。
主要终点是治疗组中患者在临床缓解中的比例，定义为在第12周时Mayo得分<2分，没有单个子评分>1分，第12周时的次要关键终点是临床响应(相对于基线降低≥3分且Mayo得分降低≥30％、直肠出血子评分降低≥1或直肠出血子评分绝对值≤1)，粘膜愈合(内窥镜子评分≤1)以及炎性肠病问卷(IBDQ)响应(相对于基线变化≥16分)。
Mayo评分是4个疾病变量(粪便频率、直肠出血、内窥镜检查结果和医师整体评估)的综合指数，每个评分的范围为0至3，评分越高表明频率或严重程度越高(总评分：0至12)(Schroeder等人，1987,N Engl J Med,317:1625-1629；Rutgeerts等人，2005,N Engl JMed,353:2462-2476)。部分Mayo评分(省略内窥镜子评分)范围为0至9。在基线和第12周评估了Mayo评分(包括内窥镜评分)。在1、2、5、7和12周记录了部分Mayo评分。使用患者日记来协助Mayo评分计算。
IBDQ是一项自行管理的32个项目的问卷，该问卷评价了4个维度(肠、全身症状、情绪功能和社交功能)的生活质量，其响应范围为1(严重影响)至7(正常健康)。IBDQ的总评分为32至224，评分越高表明生活质量越好(Guyatt等人，1989,Gastroenterology,96:804-810；Mitchell等人，1988,J Clin Gastroenterol,10:306-310)。在基线和第12周施用IBDQ。IBDQ响应定义为IBDQ中增加≥16分。
在基线和第1、3、5、7、9和12周时抽取用于评估hsCRP的血液。在基线和第12周时，在粪便样品中评估粪便钙卫蛋白。在活组织检查后使用Geboes指数(七组分指数)进行肠道粘膜的组织学评估，其中，0(缺少架构变化或其它组织学异常)表示最不严重的损伤，而4(隐窝破坏)则表示最严重的损伤。
尽管已经通过图示和实施例的方式详细地描述了前述公开，其目的是为了清楚地理解，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的前提下可以进行某些改变和修改。本公开的精神和范围在所附权利要求中描述。因此，该描述不应被解释为限制本公开的范围。
序列表
<110> 第二基因组股份有限公司
<120> 作为生物疗法的人罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌及其组合
<130> SEGE-004/01WO 321077-2039
<150> US 62/541,387
<151> 2017-08-04
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1535
<212> DNA
<213> 人罗斯拜瑞氏菌
<400> 1
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acaccgcccg tcacaccatg ggagttggta atgcccgaag tcagtgaccc aaccgcaagg 1440
agggagctgc cgaaggcagg actgataact ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtatc 1500
ggaaggtgcg gctggatcac ctcctttcta aggaa 1535
<210> 5
<211> 1540
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<400> 5
tttttatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga agcatttaga acagattact tcggtttgaa gttctttatg actgagtggc 120
ggacgggtga gtaacgcgtg ggtaacctgc cttgtactgg gggatagcag ctggaaacgg 180
ctggtaatac cgcataagcg cacaatgttg catgacatgg tgtgaaaaac tccggtggta 240
taagatggac ccgcgtctga ttagctagtt ggtgagataa cagcccacca aggcgacgat 300
cagtagccga cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcgacgccgc 420
gtgagtgaag aagtaattcg ttatgtaaag ctctatcagc agggaagata gtgacggtac 480
ctgactaaga agctccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggagcaag 540
cgttatccgg atttactggg tgtaaaggga gtgtaggtgg ccatgcaagt cagaagtgaa 600
aatccggggc tcaaccccgg aactgctttt gaaactgtaa ggctggagtg caggaggggt 660
gagtggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctca ctggactgta actgacactg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta ggtgtcgggg cccataaggg 840
cttcggtgcc gcagcaaacg caataagtat tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga 900
aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga accttaccaa gtcttgacat cctcttgacc ggtcagtaat gtggcctttc 1020
cttcgggaca agagagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag ccagcagtaa gatgggcact 1140
ctagggagac tgccagggat aacctggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgact tgggctacac acgtgctaca atggcgtaaa caaagtgaag cgaagtcgtg 1260
aggccaagca aatcacaaaa ataacgtctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg cggtgaatac gttcccgggt 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtcgaaaatg cccgaagtcg gtgacctaac 1440
gtaagaagga gccgccgaag gcaggtttga taactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggaa 1540
<210> 6
<211> 1541
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<400> 6
tttttatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga agcatttaga acagattatt tcggtatgaa gttctttatg actgagtggc 120
ggacgggtga gtaacgcgtg ggtaacctgc cttgtactgg gggatagcag ctggaaacgg 180
ctggtaatac cgcataagcg cacaatgttg catgacatgg tgtgaaaaac tccggtggta 240
taagatggac ccgcgtctga ttagctagtt ggtgagataa cagcccacca aggcgacgat 300
cagtagccga cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcgacgccgc 420
gtgagtgaag aagtaattcg ttatgtaaag ctctatcagc agggaagata gtgacggtac 480
ctgactaaga agctccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggagcaag 540
cgttatccgg atttactggg tgtaaaggga gtgtaggtgg ccatgcaagt cagaagtgaa 600
aatccggggc tcaaccccgg aactgctttt gaaactgtaa ggctggagtg caggaggggt 660
gagtggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctca ctggactgta actgacactg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta ggtgtcgggg cccaaaaggg 840
cttcggtgcc gcagcaaacg caataagtat tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga 900
aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga aaccttacca agtcttgaca tcccactgac cggacagtaa tgtgtccttt 1020
ccttcgggac agtggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atccttagta gccagcagta agatgggcac 1140
tctagggaga ctgccaggga taacctggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200
cccttatgac ttgggctaca cacgtgctac aatggcgtaa acaaagtgaa gcgaagtcgt 1260
gaggccaagc aaatcacaaa aataacgtct cagttcggat tgtagtctgc aactcgacta 1320
catgaagctg gaatcgctag taatcgcaga tcagaatgct gcggtgaata cgttcccggg 1380
tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtcgaaaat gcccgaagtc ggtgacctaa 1440
cgtaagaagg agccgccgaa ggcaggtttg ataactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttctaagga a 1541
<210> 7
<211> 1540
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<400> 7
tttttatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga agcatttaga acagattatt tcggtatgaa gttctttatg actgagtggc 120
ggacgggtga gtaacgcgtg ggtaacctgc cttgtactgg gggatagcag ctggaaacgg 180
ctggtaatac cgcataagcg cacaatgttg catgacatag tgtgaaaaac tccggtggta 240
taagatggac ccgcgtctga ttagctagtt ggtgagataa cagcccacca aggcgacgat 300
cagtagccga cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcgacgccgc 420
gtgagtgaag aagtaattcg ttatgtaaag ctctatcagc agggaagata gtgacggtac 480
ctgactaaga agctccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggagcaag 540
cgttatccgg atttactggg tgtaaaggga gtgtaggtgg ccatgcaagt cagaagtgaa 600
aatccggggc ttaaccccgg aactgctttt gaaactgtaa ggctggagtg caggaggggt 660
gagtggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctca ctggactgta actgacactg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta ggtgtcgggg cccataaggg 840
cttcggtgcc gcagcaaacg caataagtat tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga 900
aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga accttaccaa gtcttgacat cccactgacc ggacagtaat gtgtcctttc 1020
cttcgggaca gtggtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag ccagcagtaa gatgggcact 1140
ctagggagac tgccagggat aacctggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgact tgggctacac acgtgctaca atggcgtaaa caaagtgaag cgaagtcgtg 1260
aggccaagca aatcacaaaa ataacgtctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg cggtgaatac gttcccgggt 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtcgaaaatg cccgaagtcg gtgacctaac 1440
gaaagaagga gccgccgaag gcaggtttga taactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggaa 1540
<210> 8
<211> 1540
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<400> 8
tttttatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga agcatttaga acagattatt tcggtatgaa gttctttatg actgagtggc 120
ggacgggtga gtaacgcgtg ggtaacctgc cttgtactgg gggatagcag ctggaaacgg 180
ctggtaatac cgcataagcg cacaatgttg catgacatgg tgtgaaaaac tccggtggta 240
taagatggac ccgcgtctga ttagctagtt ggtgagataa cagcccacca aggcgacgat 300
cagtagccga cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcgacgccgc 420
gtgagtgaag aagtaattcg ttatgtaaag ctctatcagc agggaagata gtgacggtac 480
ctgactaaga agctccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggagcaag 540
cgttatccgg atttactggg tgtaaaggga gtgtaggtgg ccatgcaagt cagaagtgaa 600
aatccggggc tcaaccccgg aactgctttt gaaactgtga ggctggagtg caggaggggt 660
gagtggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctca ctggactgta actgacactg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta ggtgtcgggg cccataaggg 840
cttcggtgcc gcagcaaacg caataagtat tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga 900
aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga accttaccaa gtcttgacat cccactgacc ggacagtaat gtgtcctttc 1020
cttcgggaca gtggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag ccagcagtaa gatgggcact 1140
ctagggagac tgccagggat aacctggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgact tgggctacac acgtgctaca atggcgtaaa caaagtgaag caaagtcgtg 1260
aggccaagca aatcacaaaa ataacgtctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg cggtgaatac gttcccgggt 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtcgaaaatg cccgaagtcg gtgacctaac 1440
gcaagaagga gccgccgaag gcaggtttga taactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggaa 1540
<210> 9
<211> 1540
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<400> 9
tttttatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga agcatttgcg acagattttt tcggaatgaa gttgcttatg actgagtggc 120
ggacgggtga gtaacgcgtg ggtaacctgc cttgtactgg gggatagcag ctggaaacgg 180
ctggtaatac cgcataagcg cacaatgttg catgacatgg tgtgaaaaac tccggtggta 240
taagatggac ccgcgtctga ttagctagtt ggtgagataa cagcccacca aggcgacgat 300
cagtagccga cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcgacgccgc 420
gtgagtgaag aagtaattcg ttatgtaaag ctctatcagc agggaagata gtgacggtac 480
ctgactaaga agctccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggagcaag 540
cgttatccgg atttactggg tgtaaaggga gtgtaggtgg ccatgcaagt cagaagtgaa 600
aatccggggc tcaaccccgg aactgctttt gaaactgtaa ggctggagtg caggaggggt 660
gagtggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga 720
aggcggctca ctggactgta actgacactg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatacta ggtgtcgggg cccataaggg 840
cttcggtgcc gcagcaaacg caataagtat tccacctggg gagtacgttc gcaagaatga 900
aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
aacgcgaaga accttaccaa gtcttgacat cccactgacc ggacagtaat gtgtcctttc 1020
cttcgggaca gtggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag ccagcagtaa gatgggcact 1140
ctagggagac tgccagggat aacctggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgact tgggctacac acgtgctaca atggcgtaaa caaagtgaag cgaagtcgtg 1260
aggccaagca aatcacaaaa ataacgtctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg cggtgaatac gttcccgggt 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtcgaaaatg cccgaagtcg gtgacctaac 1440
gtaagaagga gccgccgaag gcaggtttga taactggggt gaagtcgtaa caaggtagcc 1500
gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggaa 1540
<210> 10
<211> 1479
<212> DNA
<213> 挑剔真杆菌
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (539)..(539)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (606)..(606)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (620)..(622)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (926)..(926)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (960)..(961)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1188)..(1188)
<223> n is a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1394)..(1394)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1471)..(1471)
<223> n为a, c, g或t
<400> 10
ntttatgaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa 60
gtcgaacgaa gcatttacga acagattayt tcggtatgaa gttcctttat gactgagtgg 120
cggacgggtg agtaacgcgt gggtaacctg ccttgtactg ggggatagca gctggaaacg 180
gctggtaata ccgcataagc gcacaatgtt gcatgacatg gtgtgaaaaa ctccggtggt 240
ataagatgga cccgcgtctg attagctagt tggtgagata acagcccacc aaggcgacga 300
tcagtagccg acctgagagg gtgaccggcc acattgggac tgagacacgg cccagactcc 360
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatggaggaa actctgatgc agcgacgccg 420
cgtgagtgaa gaagtaattc gttatgtaaa gctctatcag cagggaagat agtgacggta 480
cctgactaag aagctccggc taaatacgtg ccagcagccg cggtaatacg tatggagcna 540
gcgttatccg gatttactgg gtgtaaaggg agtgtaggtg gccatgcaag tcagaagtga 600
aaatcngggg ctyaaccccn nnactgcttt tgaaactgta aggctggagt gcaggagggg 660
tgagtggaat tcctagtgta gcggtgaaat gcgtagatat taggaggaac accagtggcg 720
aaggcggctc actggactgt aactgacact gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatact aggtgtcggg gcccataagg 840
gcttcggtgc cgcagcaaac gcaataagta ttccacctgg ggagtacgtt cgcaagaatg 900
aaactcaaag gaattgacgg ggaccngcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaan 960
naacgcgaag aaccttacca agtcttgaca tcccactgac cggacagtaa tgtgtccttt 1020
cttcgggaca rtrgagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttagtag ccagcagtaa gatgggcact 1140
ctagggagac tgccagggat aacctggagg aaggtgggga tgacgtcnaa tcatcatgcc 1200
ccttatgact tgggctacac acgtgctaca atggcgtaaa caaagtgaag cgaagtcgtg 1260
aggccaagca aatcacaaaa ataacgtctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg cggtgaatac gttcccgggt 1380
cttgtacaca ccgnccgtca caccatggga gtcgaaaatg cccgaagtcg gtgacctaac 1440
gtaagaagga gccgccgaag gcaggtttga naactgggg 1479

Claims (25)

1.一种用于治疗有需要的受试者的代谢障碍的方法，所述方法包括：
a.向所述受试者施用包含以下的组合物：
i.治疗有效量的分离的人罗斯拜瑞氏菌(R.hominis)细菌菌株；
ii.治疗有效量的分离的挑剔真杆菌(E.eligens)细菌菌株；和
iii.药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人罗斯拜瑞氏菌和挑剔真杆菌都是活的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述代谢障碍选自由高血糖症、2型糖尿病及其组合组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述代谢障碍不是1型糖尿病。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者已表现出空腹血糖水平大于约125mg/dL或大于约130mg/dL。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者已表现出对于75克口服葡萄糖耐量试验的2小时值大于约140mg/dL。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量的人罗斯拜瑞氏菌包含约1x107至1x1012个菌落形成单位(CFU)的人罗斯拜瑞氏菌。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量的挑剔真杆菌包含约1x107至1x1012个菌落形成单位(CFU)的挑剔真杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括在至少约1-52周的时间段内每天一次、两次或三次向所述受试者施用所述组合物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法导致所述受试者的空腹血糖水平降低所述受试者在第一次施用所述组合物之前的空腹血糖水平的至少约5％、10％、20％、30％或40％。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在第一次施用所述组合物后的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月时测量所述受试者的空腹血糖水平的降低。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株具有与SEQ IDNO：1至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：2至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQID NO：3至少97％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：4至少97％相同的16S rRNA序列。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述挑剔真杆菌细菌菌株具有与SEQ ID NO：5至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：6至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：7至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：8至少97％相同的16S rRNA序列、与SEQ IDNO：9至少97％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：10至少97％相同的16S rRNA序列。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株具有与SEQ IDNO：1至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：2至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQID NO：3至少98％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：4至少98％相同的16S rRNA序列。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述挑剔真杆菌细菌菌株具有与SEQ ID NO：5至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：6至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：7至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：8至少98％相同的16S rRNA序列、与SEQ IDNO：9至少98％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：10至少98％相同的16S rRNA序列。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株具有与SEQ IDNO：1至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：2至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQID NO：3至少99％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：4至少99％相同的16S rRNA序列。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述挑剔真杆菌细菌菌株具有与SEQ ID NO：5至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：6至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：7至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：8至少99％相同的16S rRNA序列、与SEQ IDNO：9至少99％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：10至少99％相同的16S rRNA序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株具有与SEQ IDNO：1为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：2为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ IDNO：3为100％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：4为100％相同的16S rRNA序列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述挑剔真杆菌细菌菌株具有与SEQ ID NO：5为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：6为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：7为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：8为100％相同的16S rRNA序列、与SEQ ID NO：9为100％相同的16S rRNA序列和/或与SEQ ID NO：10为100％相同的16S rRNA序列。
20.一种用于降低有需要的受试者血液中葡萄糖水平的方法，所述方法包含：向所述受试者施用包含以下的组合物：
i.治疗有效量的分离的人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株；
ii.治疗有效量的分离的挑剔真杆菌细菌菌株；和
iii.药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，在施用所述组合物之前，所述受试者的血液具有大于125mg/dL的葡萄糖水平。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物用于口服摄入。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物是可食用产品。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组合物被配制成片剂、胶囊、液体和液体悬浮液。
25.一种用于治疗有需要的受试者胃肠道障碍的方法，所述方法包括：
a.向所述受试者施用包含以下的组合物：
i.治疗有效量的分离的人罗斯拜瑞氏菌细菌菌株；
ii.治疗有效量的分离的挑剔真杆菌细菌菌株；和
iii.药学上可接受的载体。
CN201880050848.1A 2017-08-04 2018-08-03 作为生物疗法的人罗斯拜瑞氏菌、挑剔真杆菌及其组合 Pending CN111163785A (zh)

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