CN111153996B - G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和g蛋白偶联受体试剂盒 - Google Patents
G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和g蛋白偶联受体试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测试剂技术领域，具体涉及G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和G蛋白偶联受体试剂盒。一种G蛋白偶联受体的抗体由抗原决定簇多肽与血蓝蛋白偶联形成全抗原，再经多克隆抗体技术制备而成；所述抗原决定簇多肽包括多个多肽免疫原，所述多肽免疫原分别经半胱氨酸和精氨酸修饰。本发明所提供的G蛋白偶联受体的抗体可同时识别同源性相近的G蛋白偶联受体，使用该抗体生产的G蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平G蛋白偶联受体信号快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂技术领域，具体涉及G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和G蛋白偶联受体试剂盒。
背景技术
G蛋白偶联受体（GPCRs）是已知的数量最多的膜受体家族，在生理病理过程中起重要生物作用，是主要的药物靶点超级家族。主要功能是介导胞外信号进入细胞内部，参与自分泌，旁分泌，内分泌系统信号一系列细胞内部重要的反应。大约50%的小分子治疗的靶位是GPCRs，GPCRs的配体包含很广，包括蛋白质，多肽，糖类，脂类等等。对于大多数GPCRs，外部的配体结合与膜内受体上，引起结构改变，使得膜内几个或上百个鸟苷酸三聚体活化而去结合G蛋白，实现分子构象意义上的信号传导。目前，人们对GPCR的结构与功能、信号通路及其调控机制等的了解还十分有限，仍有一半以上的GPCRs为配体未知的孤儿受体，其生物学功能仍不明确，因此，生产能够在分子水平上检测GPCRs的抗体有十分广阔的科研价值和经济前景。现有检测GPCRs的方法一般是使用多肽作为免疫原的抗体生产工艺，针对某个具体一个GPCR的含量变化检测，检测结果具有局限性，往往需要购买大量抗体或试剂盒检测GPCR的变化，才能开展下游实验。本试剂盒采用GPCR蛋白中高度同源序列，为了保证特定应用均采取预测多个抗原决定簇，合成多个多肽序列做试验，最终采用混合免疫原的多克隆抗体制备试剂盒，可快速鉴定对应信号通路的变化，为药物筛选，靶点研究提供方便快捷的工具。
发明内容
为了克服上述技术缺陷的不足，本发明设计了G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和G蛋白偶联受体试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供一种G蛋白偶联受体的抗体，关键在于：抗原决定簇多肽与血蓝蛋白偶联形成全抗原，再经多克隆抗体技术制备而成；
所述抗原决定簇多肽包括多个多肽免疫原，所述多肽免疫原分别采用半胱氨酸和精氨酸修饰。
优选的，所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
FZD8/FZD5 CNHDTQDEAGLEVHQFWR；
GPR109/HCAR2 CLQRKMTGEPDNNRSTR；
OR10C1/OR10C1 CHLLTGRRHISRSR；
OR2A5/2A14 CKSRHPEEQQKVLR；
OR2AG1/2 CADFLRRENTISFR；
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR；
OR4A4/47 CYTLRNSEMTSAMKKLR；
OR8B2/B3 CHIKSTQGRSKAFR；
OR11H1/11H2/11H12 CSLQNKEIKAALRKR；
OR13C2/13C9 CMKPKSKETLNSDR；
OR2T5/2T29 VNKVSAPECGMQMR；
OR10H3/10H4 CYLKPKGLHSMYSDR；
OR10K1/10K2 CDLLSQKKTISFLR；
OR1D4/5 CQMPSASKKYKTFR；
OR1D4/5 CLQMPSASKKYKTFSR；
OR3A2/3 CRLLSHKSTISYDR；
OR5M1/5M10 CMYVRPPSEKSVER；
OR10X1/OR10R3P CSAEGKQKAFR。
一种G蛋白偶联受体的抗体制备方法，关键在于包括以下步骤：
步骤一、选择多个多肽免疫原作为同源性相近的两个或以上G蛋白偶联受体的抗原多肽组，采用半胱氨酸和精氨酸分别修饰各多肽免疫原，纯化，得到抗原决定簇多肽；
步骤二、将质量比为（3-8）：（3-8）：1的抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC偶联，纯化，加入弗氏佐剂进行乳化，形成全抗原；
步骤三、将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清；
步骤四、将抗血清进行预处理后，与抗原决定簇多肽、偶联树脂进行拌样混合后装入层析柱，采用pH3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。
优选的，所述步骤四中抗血清预处理具体为：将待处理的各批次血清混合后，依次加入1mol/L pH7.5的Tris•HCl缓冲液，0.2 mol/L正钒酸钠溶液、0.1 mol/L氟化钠溶液，在室温下混匀静置，过滤待用。
优选的，所述步骤四中偶联树脂为Sulfolink Gel，所述抗原决定簇多肽和偶联树脂的质量比为0.5:1。
一种G蛋白偶联受体试剂盒，关键在于：包括以上任一项G蛋白偶联受体的抗体和抗体稀释液。
本发明的有益效果是：本发明所提供的G蛋白偶联受体的抗体可同时识别同源性相近的G蛋白偶联受体，使用该抗体生产的G蛋白偶联受体试剂盒针对细胞水平G蛋白偶联受体信号快速检测。
附图说明
图1为紫外照射刺激Hela细胞所产生GPCR信号变化趋势图；
图2为肿瘤坏死因子刺激Hela细胞所产生GPCR信号变化趋势图；
具体实施方法
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1 一种G蛋白偶联受体的抗体I的制备
步骤一、选择以下多肽免疫原作为同源性相近的两个或以上G蛋白偶联受体的抗原多肽组，采用半胱氨酸和精氨酸分别修饰各多肽免疫原，纯化，得到抗原决定簇多肽；
所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
FZD8/FZD5 CNHDTQDEAGLEVHQFWR；
GPR109/HCAR2 CLQRKMTGEPDNNRSTR；
OR10C1/OR10C1 CHLLTGRRHISRSR；
OR2A5/2A14 CKSRHPEEQQKVLR；
OR2AG1/2 CADFLRRENTISFR；
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR。
步骤二、将抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC偶联，纯化，加入弗氏佐剂进行乳化，形成全抗原；
步骤三、将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清；
多克隆抗体技术包括以下步骤：1.取兔进行免疫，基础免疫皮下注射8-10个部位，每个部位0.1-0.2ml抗原。并按计划安排进行加强免疫；加强免疫时间为基础免疫后第21天加强第一次，第一次加强免疫应在兔子背部右侧剪毛进行，加强免疫除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.2－0.3ml抗原。再间隔21天加强第二次，再间隔21天加强第三次，再间隔21天加强第四次，再间隔35天静脉加强第五次；
2.阳性血清的采集一般进行九次，采集时间依次为第三次加强免疫后7天左右（C）、第四次加强免疫后7天左右（DI）、DI血采后14天（DII）、第五次加强免疫后7天左右（EI）、EI血采后14天（EII）、第六次加强免疫后7天左右（FI）、FI血采后14天（FII）、第六次加强免疫后7天左右（GI）,若为静脉免疫，则为免疫后第四天、GI血采后14天（GII）；
3.收集的血液做好批号标记，室温放置一小时，3000rpm离心15min，转移上层血清于另一只干净的离心管中，再3000rpm离心15min，转移上层血清于另一只干净的离心管中，贴好标签，将 2%wt叠氮钠溶液加入待纯化血清稀释至浓度为0.02%wt后，置于4℃冰箱保存；
步骤四、将待处理的各批次血清混合后，依次加入1mol/L pH7.5的Tris•HCl缓冲液，0.2 mol/L正钒酸钠溶液、0.1 mol/L氟化钠溶液，在室温下混匀静置，过滤后，与质量比为0.5:1的抗原决定簇多肽和Sulfolink Gel进行拌样混合后装入层析柱，采用pH3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。
实施例2 一种G蛋白偶联受体的抗体II的制备
制备方法同实施例1，不同在于步骤一制备的抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR；
OR4A4/47 CYTLRNSEMTSAMKKLR；
OR8B2/B3 CHIKSTQGRSKAFR；
OR11H1/11H2/11H12 CSLQNKEIKAALRKR；
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OR10H3/10H4 CYLKPKGLHSMYSDR；
OR10K1/10K2 CDLLSQKKTISFLR；
OR1D4/5 CQMPSASKKYKTFR；
OR1D4/5 CLQMPSASKKYKTFSR；
OR3A2/3 CRLLSHKSTISYDR；
OR5M1/5M10 CMYVRPPSEKSVER；
OR10X1/OR10R3P CSAEGKQKAFR。
步骤二中抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC的质量比为8： 8：1。
实施例3 一种G蛋白偶联受体的抗体III的制备
制备方法同实施例1，不同在于步骤一制备的抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
OR2A5/2A14 CKSRHPEEQQKVLR；
OR2AG1/2 CADFLRRENTISFR；
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR；
OR4A4/47 CYTLRNSEMTSAMKKLR；
OR8B2/B3 CHIKSTQGRSKAFR；
OR11H1/11H2/11H12 CSLQNKEIKAALRKR；
OR13C2/13C9 CMKPKSKETLNSDR；
OR2T5/2T29 VNKVSAPECGMQMR；
OR10H3/10H4 CYLKPKGLHSMYSDR；
OR10K1/10K2 CDLLSQKKTISFLR；
OR1D4/5 CQMPSASKKYKTFR；
OR1D4/5 CLQMPSASKKYKTFSR；
OR3A2/3 CRLLSHKSTISYDR；
OR5M1/5M10 CMYVRPPSEKSVER；
OR10X1/OR10R3P CSAEGKQKAFR。
步骤二中抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC的质量比为5： 5：1。
实施例4 一种G蛋白偶联受体的抗体IV的制备
制备方法同实施例1，不同在于步骤一制备的抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
FZD8/FZD5 CNHDTQDEAGLEVHQFWR；
GPR109/HCAR2 CLQRKMTGEPDNNRSTR；
OR10C1/OR10C1 CHLLTGRRHISRSR；
OR2A5/2A14 CKSRHPEEQQKVLR；
OR2AG1/2 CADFLRRENTISFR；
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR；
OR4A4/47 CYTLRNSEMTSAMKKLR；
OR8B2/B3 CHIKSTQGRSKAFR；
OR11H1/11H2/11H12 CSLQNKEIKAALRKR；
OR13C2/13C9 CMKPKSKETLNSDR；
OR2T5/2T29 VNKVSAPECGMQMR；
OR10H3/10H4 CYLKPKGLHSMYSDR；
OR10K1/10K2 CDLLSQKKTISFLR；
OR1D4/5 CQMPSASKKYKTFR；
OR1D4/5 CLQMPSASKKYKTFSR；
OR3A2/3 CRLLSHKSTISYDR；
OR5M1/5M10 CMYVRPPSEKSVER；
OR10X1/OR10R3P CSAEGKQKAFR。
步骤二中抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC的质量比为4： 4：1。
实施例5一种G蛋白偶联受体试剂盒I
包括G蛋白偶联受体的抗体I、抗体稀释剂I、清洗液、淬火液、固定液、穿膜液、封闭液，所述抗体稀释液以质量分数计的以下组分： 0.5%牛血清白蛋白(BSA)，0.1% Triton X-100， 0.05% 叠氮钠溶液和99.35%PBS。
清洗液配方：NaCl 8g、KCL 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2PO4.12H2O 2.85g、H2O 1L；
淬火液配方：1mL 30% H202、29mL PBS；
固定液配方：10ug/mL PBS；
穿膜液配方： 4%wt甲醛、96%wtPBS，适用贴壁细胞；8%wt甲醛、92%wtPBS，适用悬浮细胞；
封闭液配方：2%BSA、96%wtPBS。
实施例6一种G蛋白偶联受体试剂盒II
与实施例5相同，不同在于包括G蛋白偶联受体的抗体II和抗体稀释剂II，所述抗体稀释液II以质量分数计的以下组分： 2%牛血清白蛋白(BSA)，1% Triton X-100， 0.2%叠氮钠溶液和96.8%PBS。
实施例7一种G蛋白偶联受体试剂盒III
与实施例5相同，不同在于包括G蛋白偶联受体的抗体III和抗体稀释剂III，所述抗体稀释液III以质量分数计的以下组分： 1.5%牛血清白蛋白(BSA)，1% Triton X-100，0.1% 叠氮钠溶液和97.4%PBS。
实施例8一种G蛋白偶联受体试剂盒IV
与实施例5相同，不同在于包括G蛋白偶联受体的抗体IV和抗体稀释剂IV，所述抗体稀释液IV以质量分数计的以下组分： 1%牛血清白蛋白(BSA)，0.5% Triton X-100，0.05% 叠氮钠溶液和98.45%PBS。
对本发明制备的G蛋白偶联受体试剂盒进行产品性能测试，以G蛋白偶联受体试剂盒IV为例：
（1）检测紫外照射刺激Hela细胞所产生GPCR信号变化趋势
Hela细胞常规培养，紫外照射细胞培养孔，每十分钟接种细胞培养，接种7次，得到紫外照射0-70分钟细胞培养孔。舍弃培养基，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入淬火液100ul每孔，室温20分钟。舍弃淬火液使用清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入固定液100ul每孔，室温1.5小时。舍弃固定液，使用清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入穿膜液100ul每孔，室温反应20分钟。舍弃固定液清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入封闭液室温反应1.5小时。舍弃封闭液，加入1:500稀释的GPCR抗体四度过夜。舍弃GPCR抗体抗体，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入HRP标记的羊抗兔二抗室温反应45分钟。舍弃HRP标记的羊抗兔二抗，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入二抗底物显色液100ul每孔室温15分钟，加入终止液50ul终止反应，上酶标仪读数，结果如图1所示。
图1中可以看到，紫外照射Hela细胞70分钟后，信号大量激活。
（2）使用试剂盒检测肿瘤坏死因子刺激Hela细胞所产生GPCR信号变化趋势
Hela细胞常规培养，每十分钟加入TNF 20ng/ml细胞培养孔中，接种7次，得到TNF刺激的0-70分钟细胞。舍弃培养基，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入淬火液100ul每孔，室温20分钟。舍弃淬火液使用清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入固定液100ul每孔，室温1.5小时。舍弃固定液，使用清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入穿膜液100ul每孔，室温反应20分钟。舍弃固定液清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入封闭液室温反应1.5小时。舍弃封闭液，加入1:500稀释的GPCR抗体四度过夜。舍弃GPCR抗体抗体，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入HRP标记的羊抗兔二抗室温反应45分钟。舍弃HRP标记的羊抗兔二抗，清洗液200ul每孔清洗细胞培养孔三次，每次5分钟。加入二抗底物显色液100ul每孔室温15分钟，加入终止液50ul终止反应，上酶标仪读数，结果如图2所示。
图2中可以看到肿瘤坏死因子刺激Hela细胞30分钟后信号开始激活，40分钟后达到顶峰，之后信号逐渐慢慢降低。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州睿瀛生物技术有限公司
<120> G蛋白偶联受体的抗体及其制备方法和G蛋白偶联受体试剂盒
<140> 2020100274280
<141> 2020-01-10
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<211> 14
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
Cys Gln Asp Leu Leu Ser Lys Asp Lys Thr Ile Ser Phe Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Cys Leu Arg Ser Met Met Gln Ser Arg Met Asn Gln Glu Lys Arg
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
Cys Tyr Thr Leu Arg Asn Ser Glu Met Thr Ser Ala Met Lys Lys Leu
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Arg
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<211> 14
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
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<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
Cys Met Lys Pro Lys Ser Lys Glu Thr Leu Asn Ser Asp Arg
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
Val Asn Lys Val Ser Ala Pro Glu Cys Gly Met Gln Met Arg
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
Cys Tyr Leu Lys Pro Lys Gly Leu His Ser Met Tyr Ser Asp Arg
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Cys Arg Leu Leu Ser His Lys Ser Thr Ile Ser Tyr Asp Arg
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<400> 26
Cys Ser Ala Glu Gly Lys Gln Lys Ala Phe Arg
1 5 10
Claims (5)
1.一种G蛋白偶联受体的抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、选择多个多肽免疫原作为同源性相近的两个或以上G蛋白偶联受体的抗原多肽组，修饰各多肽免疫原，纯化，得到抗原决定簇多肽；
所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列为：
FZD8/FZD5 CNHDTQDEAGLEVHQFWR；
GPR109/HCAR2 CLQRKMTGEPDNNRSTR；
OR10C1/OR10C1 CHLLTGRRHISRSR；
OR2A5/2A14 CKSRHPEEQQKVLR；
OR2AG1/2 CADFLRRENTISFR；
OR2T2/2T35 CHRMNSAEGRRKAFR；
OR2T2/2T35 CLQDLLSKDKTISFR；
OR4F4/4F5/4F17 CDFFSQRKVISFKR；
OR5AU1/OR5AU1 CLKMSSAQGRFKAFR；
OR1S1/1S2 CPSSTHPEDTDKIGR；
OR2A4/7 CVGPRYGNPKEQKR；
OR2AG1/2 CLADFLRRENTISFR；
OR2T2/35 CQDLLSKDKTISFR；
OR2T3/34 CLRSMMQSRMNQEKR；
OR4A4/47 CYTLRNSEMTSAMKKLR；
OR8B2/B3 CHIKSTQGRSKAFR；
OR11H1/11H2/11H12 CSLQNKEIKAALRKR；
OR13C2/13C9 CMKPKSKETLNSDR；
OR2T5/2T29 VNKVSAPECGMQMR；
OR10H3/10H4 CYLKPKGLHSMYSDR；
OR10K1/10K2 CDLLSQKKTISFLR；
OR1D4/5 CQMPSASKKYKTFR；
OR1D4/5 CLQMPSASKKYKTFSR；
OR3A2/3 CRLLSHKSTISYDR；
OR5M1/5M10 CMYVRPPSEKSVER；
OR10X1/OR10R3P CSAEGKQKAFR；
步骤二、将质量比为（3-8）：（3-8）：1的抗原决定簇多肽、血蓝蛋白和Sulfo-SMCC偶联，纯化，加入弗氏佐剂进行乳化，形成全抗原；抗原决定簇多肽和血蓝蛋白的质量比为1:1；
步骤三、将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清；
步骤四、将抗血清进行预处理后，与抗原决定簇多肽、偶联树脂进行拌样混合后装入层析柱，采用pH3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。
2. 根据权利要求1所述G蛋白偶联受体的抗体制备方法，其特征在于所述步骤四中抗血清预处理具体为：将待处理的各批次血清混合后，依次加入1mol/L pH7.5的Tris•HCl缓冲液，0.2 mol/L正钒酸钠溶液、0.1 mol/L氟化钠溶液，在室温下混匀静置，过滤待用。
3.根据权利要求2所述G蛋白偶联受体的抗体制备方法，其特征在于所述步骤四中偶联树脂为Sulfolink Gel，所述抗原决定簇多肽和偶联树脂的质量比为0.5:1。
4.一种G蛋白偶联受体试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一项制备的G蛋白偶联受体的抗体和抗体稀释液。
5.根据权利要求4所述的G蛋白偶联受体试剂盒，其特征在于：所述抗体稀释液以质量分数计的以下组分： 0.5-2% BSA，0.1-1% Triton X-100， 0.05-0.2% 叠氮钠溶液和96.8-99.35%PBS。
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