CN111116826B

CN111116826B - 双响应性聚合物及纳米粒的制法及其在原花青素中的应用

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Publication number: CN111116826B
Application number: CN201911386725.8A
Authority: CN
Inventors: 熊春华; 钟贻馨; 王小青; 张建勇; 姚兰英; 陆海霞; 姚彩萍
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2019-12-29
Filing date: 2019-12-29
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-12-29
Also published as: CN111116826A

Abstract

本发明公开了一种双响应性聚合物的合成方法，包括以下步骤：1)、通过透明质酸的羧基与组氨酸的氨基进行酰胺反应，得到透明质酸—组氨酸接枝物；将透明质酸—组氨酸接枝物溶于去离子水中，然后加入作为引发剂的过硫酸钾和作为交联剂的N’N‑双丙烯酰胱胺，于惰性气体的保护下进行反应，反应所得物于去离子水中透析后冷冻干燥，所得的胱胺‑透明质酸‑组氨酸聚合物为双响应性聚合物。该双响应性聚合物能制备用于负载原花青素(OPC)的纳米粒。

Description

双响应性聚合物及纳米粒的制法及其在原花青素中的应用

技术领域

本发明属于食品工程领域；具体涉及一种双响应性聚合物的制备法及其在原花青素纳米粒中的应用。

背景技术

原花青素存在于各种植物的花粉、坚果、果实、树皮和种子中，作为抵御生物和非生物胁迫的防御剂；基本成分包括儿茶素和表儿茶素。

原花青素作为一类在多种植物食品中发现的低聚类黄酮，具有多种生物活性，例如抗氧化剂，清除自由基，抗癌剂，抗微生物，抗病毒和神经保护能力。人类饮食中原花青素的摄入与各种慢性疾病的发生率降低相关，在减少心肌梗塞和心血管疾病死亡的可能性方面具有巨大潜力，对结肠癌、肝癌、乳腺癌有一定程度的治疗和预防效果，因此引起了人们的极大关注。然而，原花青素极强的生物活性对pH、温度和光敏感，容易导致原花青素被氧化。

透明质酸作为天然多糖具备较好的生物相容性，但未经修饰的透明质酸难以应对酸、碱、热等不利环境。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种双响应性聚合物的制备法及其在原花青素纳米粒中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种双响应性聚合物的合成方法，包括以下步骤：

1)、透明质酸-组氨酸接枝物(HA-His)的合成：

通过透明质酸的羧基与组氨酸(L-组氨酸)的氨基进行酰胺反应，得到透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)；

2)、胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)的合成：

将透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)溶于去离子水中，然后加入作为引发剂的过硫酸钾和作为交联剂的N’N-双丙烯酰胱胺，于惰性气体(例如氮气)的保护下，于(50±5)℃反应(1±0.2)h；

反应所得物装入透析袋(Mr＝8,000～14,000D)中，于去离子水中透析22～26h，将位于透析袋中的截留液冷冻干燥(于-50℃干燥24h)，得到胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物(BAC-HA-His)，所述胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物为双响应性聚合物；

过硫酸钾：透明质酸—组氨酸接枝物＝(5±0.5)：1的质量比；

N’N-双丙烯酰胱胺：透明质酸—组氨酸接枝物＝(1.2±0.1)：1的质量比。

说明：于去离子水中透析的目的是：从而除去未反应的单体等其他杂质(即，未反应的过硫酸钾、N’N-双丙烯酰胱胺)。

作为本发明的双响应性聚合物的合成方法的改进：所述步骤1)包括以下步骤：

S1.1、将透明质酸(MW＝90000)溶于去离子水中，再加入EDC、NHS后磁力搅拌混合(1±0.2)h，从而活化透明质酸的羧基；

透明质酸：EDC、NHS＝1:(1.2±0.1):(1.2±0.1)的摩尔比；

EDC，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；

S1.2、按照组氨酸(L-组氨酸)：透明质酸＝0.5～4:1的质量比(优选3:1的质量比)，在S1.1所得物中加入组氨酸，磁力搅拌混合(2±0.2)h后，于20～60℃(优选50℃)、200～400W(优选250W)超声处理20～60min(优选40min)；

将所得的反应液装入透析袋(Mr＝8000～14000D)中，于去离子水中透析22～26h，将位于透析袋中的截留液进行冷冻干燥(于-50℃干燥24h)，得到透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)。

说明：上述超声时，将超声仪探头插入液面下2cm，于去离子水中透析的目的是从而除去未反应的组氨酸、EDC、NHS。

作为本发明的双响应性聚合物的合成方法的进一步改进：

所述步骤S1.1中，每0.32mmol透明质酸配用(75±25)ml的去离子水；

所述步骤2)中，每20mg透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)配用(20±5)mL去离子水。

作为本发明的双响应性聚合物的合成方法的进一步改进：步骤S1.2中，组氨酸：透明质酸＝3:1的质量比；于50℃、250W超声处理40min。

本发明还同时公开了一种双响应性聚合物纳米粒的制备，包括以下步骤：

将胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物(BAC-HA-His)溶于去离子水中，配成浓度为(1±0.2)mg/mL的溶液；

将溶液(约20ml～100ml)于(25±5)℃磁力搅拌(8±2)小时，从而使得胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物充分溶胀；然后于(4±1)℃放置10～12小时；再在冰浴的条件下，于140～200W(优选180W)的超声功率超声6～15min(优选10min)，得到双响应性聚合物纳米粒。即，得到胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒。

本发明还同时提供了上述双响应性聚合物的用途：制备用于负载原花青素(OPC)的纳米粒。

作为本发明的用途的改进，包括以下步骤：

1)、将原花青素溶解于pH 6.5磷酸缓冲溶液中，配成(1±0.2)mg/mL的原花青素溶液；

2)、将4mg胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)聚合物中加入至(4±1)mL去离子水，磁力搅拌(8±2)小时，然后加入原花青素溶液80～150μL(优选130μL)，于冰浴条件下(180±20)W超声(10±2)min，得包埋有OPC的超声纳米粒。

由于原花青素容易被外界环境所破坏，因此通过制备纳米载体对它进行包埋保护，使其进入生物体内达到靶向释放的目的，提高其生物活性和利用率。本发明通过对透明质酸进行改性后制备成具有双响应性的聚合物纳米粒对原花青素进行负载保护。

本发明具有如下技术优势：

1、本发明以透明质酸作为大分子载体，通过酰胺反应利用组氨酸对透明质酸进行改性赋予其pH响应特性，并采用优选工艺来提高透明质酸的接枝度。

2、制备具有热稳定性、肠胃稳定性、生物相容性的自组装聚合物纳米粒。

3、通过制备纳米粒子对OPC进行负载保护，本发明对原花青素的包封率较高，由于纳米粒对OPC的保护作用，可以延缓OPC在热处理和储藏过程中抗氧化性能的降低，一定程度下还能防止食品防腐剂等环境对OPC的破坏，提高了OPC的稳定性从而确保其生物活性。

4、本发明的制备方法简单，没有有机溶剂或有毒溶剂的加入，通过超声分散法制备负载原花青素的纳米粒，通过受体介导的靶向作用将芯材输送到特定部位，再利用载体的响应性，能够进一步提高其主动靶向性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为HA、His、HA-His的红外图谱；

图2为HA、BAC、和BAC-HA-His的红外图谱；

图3为HA、HA-His和BAC-HA-His的热重分析曲线；

图4为超声功率对HA-His接枝度的影响；

图5为反应时间对HA-His接枝度的影响；

图6为质量配比对HA-His接枝度的影响；

图7为反应温度对HA-His接枝度的影响；

图8为浊度测试来验证聚合物的还原降解性的对比；

图9为透明质酸-组氨酸、胱胺-透明质酸-组氨酸复合物、氯化钠、透明质酸的酸碱滴定曲线；

图10为超声前后纳米粒粒径分布变化；

图11为超声功率对纳米粒平均粒径和PDI的影响；

图12超声时间对对纳米粒平均粒径和PDI的影响；

图13为pH对纳米粒平均粒径(A)以及电位(B)的影响；

图14为GSH浓度对纳米粒平均粒径和PDI的影响；

图15为温度对纳米粒平均粒径和PDI的影响；

图16为纳米粒在模拟胃液及肠液下的粒径分布情况；

图17为CMT93细胞经BAC-HA-His纳米粒处理24h、48h和72h后的存活率

图18为OPC添加量对包封率和装载量的影响；

图19为不同加热温度对负载OPC纳米粒的抗氧化活性研究；

图20为食品添加剂对负载OPC纳米粒保留率的影响；

图21为负载OPC纳米粒的体外释放研究；

图22为CMT93细胞经游离OPC和负载OPC纳米粒处理24h(a)、48h(b)和72h(c)后的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、双响应性聚合物的合成方法，依次进行以下步骤：

①、透明质酸-组氨酸接枝物(HA-His)的合成：

通过透明质酸(HA)的羧基与组氨酸(L-组氨酸，His)的氨基进行酰胺反应，得到透明质酸—组氨酸接枝物；具体如下：

S1.1、将0.32mmol透明质酸(MW＝90000，约250mg)溶于75ml去离子水中，加入0.384mmol的EDC、0.384mmol的NHS后磁力搅拌混合1h，从而活化透明质酸的羧基；

即，透明质酸：EDC、NHS＝1:1.2:1.2的摩尔比。

EDC，即，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

NHS，即，N-羟基琥珀酰亚胺；

S1.2、按照组氨酸(即，L-组氨酸)：透明质酸＝3:1的质量比，在S1.1所得物中加入组氨酸，磁力搅拌混合2h后，将超声仪探头插入液面下2cm，于50℃、250W超声处理40min；

将所得的反应液装入透析袋(Mr＝8000～14000D)中，于去离子水中透析24h，从而除去未反应的组氨酸、EDC、NHS；将位于透析袋中的截留液进行冷冻干燥(于-50℃干燥24h)，得到透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)。

对HA、His、HA-His用傅里叶红外光谱仪进行检测，红外图如图1所示，透明质酸在3415cm^-1处显示出与羟基和氨基的伸缩振动相关的宽峰，此外，在1615cm^-1出现一个尖峰，表示为N-乙酰基(-COCH₃)和羧酸盐(-COO-)基团中所含的羰基(C＝O)基团的对称伸缩振动吸收峰。在1411cm^-1处出现的峰为羧酸盐(-COO-)基团的不对称伸缩振动吸收峰。HA-His接枝物在1642cm^-1处出现的吸收峰为仲酰胺C＝O基团的伸缩振动，仲酰胺吸收峰的出现是因为透明质酸的羧基与组氨酸的氨基发生酰胺反应生成了一个酰胺键。1570cm^-1处的峰为酰胺Ⅱ带N-H的伸缩振动峰，在1463cm^-1处的吸收峰为酰胺Ⅲ带C-N伸展，HA-His接枝物在1079cm^-1和1042cm^-1处出现两个吸收峰分别为组氨酸咪唑环上的N-H和C-H伸缩振动峰。组氨酸在1095cm^-1和1075cm^-1处的两个峰为伯胺-NH₂的特征吸收峰，与透明质酸的羧基进行反应后，伯胺变为仲胺，双峰转变为尖尖的单峰。

②、胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)的合成：

称取20mg透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)溶于20mL去离子水中，然后加入作为引发剂的过硫酸钾0.1g和作为交联剂的N’N-双丙烯酰胱胺24mg，于惰性气体(例如氮气)的保护下，于50℃反应1h；

反应所得物装入透析袋(Mr＝8,000～14,000D)中，于去离子水中透析24h，从而除去未反应的单体等其他杂质(即，未反应的过硫酸钾、N’N-双丙烯酰胱胺)，将位于透析袋中的截留液冷冻干燥(于-50℃干燥24h)，得到胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物(BAC-HA-His)；于干燥器中保存备用。

即，过硫酸钾：透明质酸—组氨酸接枝物＝5：1的质量比；

N’N-双丙烯酰胱胺：透明质酸—组氨酸接枝物＝1.2：1的质量比。

对HA、BAC(N’N-双丙烯酰胱胺)、BAC-HA-His用傅里叶红外光谱仪进行检测，红外图如图2所示；

由图2可知，BAC在3251cm^-1处的峰为烯烃的C-H伸缩振动峰，在1657cm^-1、1555cm^-1处的吸收峰分别为伯酰胺基和仲酰胺基的特征吸收峰。由于透明质酸的-OH和-NH基团的伸缩振动，BAC-HA-His在3413cm^-1处显示出宽的吸收峰，并且该伸缩振动峰是向低频移动的，HA和BAC之间的氢键相互作用，使得这个峰比HA中的峰略宽。此外，BAC-HA-His在3079cm^-1和2927cm^-1处出现的新的吸收峰分别为咪唑环中SP²烯烃(＝C-H)和主链中SP³(-C-H-)键的伸缩振动，在2080cm^-1处出现一个较钝的吸收峰，这个峰为二硫键的特征红外吸收峰。可以看出，BAC-HA-His合成物质中含有组氨酸和二硫键。BAC-HA-His在1735cm^-1处出现的一个新的吸收峰，可能是由于BAC酰胺键断裂C＝O的伸缩吸收峰，另外，在1298cm^-1出现一个尖锐的吸收峰与咪唑环内部和透明质酸糖苷键中C-H键的面内弯曲振动有关，分析结果表明，在过硫酸钾的催化作用下，含有二硫键的BAC被成功引入到聚合物中。

此外，BAC-HA-His在2080cm^-1处出现一个较钝的吸收峰，这个峰为二硫键的特征红外吸收峰。

图3是HA、HA-His和BAC-HA-His的热重分析曲线；

由图3可知：第一阶段，从温度25℃到150℃，HA，HA-His和BAC-HA-His的重量损失分别约为12.1％、3.1％、2.5％，这一阶段主要是结合水的丢失所导致的重量降低。透明质酸出现一个很明显的热分解阶段，其初始分解温度为230℃，随着温度的增加其重量不断的下降，温度达到300℃时，其重量损失约为52％，在600℃时，重量损失约为66％。HA-His和BAC-HA-His的热降解主要分为三个阶段，HA-His接枝物热降解的第一阶段为25～223℃，这一阶段的失重曲线比较平缓，主要是结合水和挥发性单体的脱离导致的重量损失。第二阶段为223～367℃，这一阶段失重速率有所加快，初始分解温度比透明质酸原样降低，这是因为组氨酸的接入破坏了透明质酸的结晶度，使得非结晶区转变为无定形状态，无定形区因此增加，再加上反应生成的酰胺键相比于透明质酸的醚键较弱，所以稳定性稍有下降。第三阶段为367～600℃，这一阶段为透明质酸主链的降解和碳化。BAC-HA-His合成物质热降解的第一阶段为25～217℃，这一阶段是结合水和未反应以及挥发性单体的损失，其降解速率小于透明质酸原样。第二阶段为217～343℃，这一阶段的失重主要是含氧基团从体系的脱离以及侧链的降解。第三阶段为343～600℃，当热分解基本处于平衡状态时剩下的物质可能是一些灰分成分了。

即，经热重分析表明，聚合物在220℃以下有一个良好的热稳定性，不影响其具体的实际应用。XRD结果表明，组氨酸和BAC的接入并不会破透明质酸原有的重复单元结构。

对比例1-1、将实施例1步骤S1.2中超声功率由250W分别改成200W、300W、350W、400W，其余等同于实施例1的步骤①。

所得透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)的接枝度的对比如图4所述；在功率达到250W时，接枝度达到最大。

说明：接枝度的检测法可按照常规的OPA检测法。

对比例1-2、将实施例1步骤S1.2中反应时间由40min分别改成20min、30min、50min、60min，其余等同于实施例1的步骤①。

所得透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)的接枝度的对比如图5所述；当反应时间达到40min时，接枝度达到最大。

对比例1-3、将实施例1步骤S1.2中组氨酸与透明质酸的质量比为3:1分别改成：1:2、1:1、2:1、4:1；其余等同于实施例1的步骤①。

所得透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)的接枝度的对比如图6所述；当组氨酸与透明质酸的质量比为3:1时，接枝度达到最大。

对比例1-4、将实施例1步骤S1.2中的反应温度由50℃、分别改成20℃、30℃、40℃、60℃；其余等同于实施例1的步骤①。

所得透明质酸—组氨酸接枝物(HA-His)的接枝度的对比如图7所述；当温度达到50℃时，接枝物的接枝度达到最高。

说明：接枝度高代表接入的组氨酸量多，从而赋予接枝物pH响应特性，能够响应生物体内pH的变化从而达到原花青素靶向释放的目的。

将实施例1制备所得的胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)进行如下的性能实验：

性能实验1、胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物(BAC-HA-His)的还原降解实验

称取15mg胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物溶于30mL 10mmol/mL谷胱甘肽溶液中，通过超声使得聚合物均匀分散，分别于0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、12h定时取出2mL溶液，用紫外可见分光光度计在500nm处测溶液的吸光度，每组样品做三次平行，以聚合物在0h的吸光度记为浊度100％，计算其相对浊度；从而获得聚合物在还原性谷胱甘肽的作用下被还原的程度。

所得结果如图8所示，由图8可知，胱胺-透明质酸-组氨酸合成物质在谷胱甘肽的作用下会被还原降解破坏其结构，具有谷胱甘肽敏感性。

说明：聚合物的谷胱甘肽敏感性能够响应病理细胞内谷胱甘肽含量的变化，从而达到原花青素靶向释放的目的。

性能实验2、质子缓冲能力测试

通过酸碱滴定的方法来检测透明质酸-组氨酸、胱胺-透明质酸-组氨酸复合物、氯化钠、透明质酸在不同pH条件下的质子缓冲能力，用pH计来进行测试。将氯化钠、透明质酸、HA-His和BAC-HA-His四种样品都配制成浓度为2mg/mL的溶液。每组样品用1mol/L NaOH溶液将其调为pH＝10.0，接着缓慢往溶液滴加0.01mol/L HCl，HCl每次的滴加量为20μL，滴加后样品静置2min，进行pH值的测量，直至样品的pH值降为3.0。

所得结果如图9所示，由图9可知，Nacl没有质子缓冲能力，随着盐酸添加量的增加，其pH值很快10.0降到3.0。与透明质酸相比，HA-His和BAC-HA-His合成物质具有一定的质子缓冲能力，在pH＝5.0～7.5范围内出现明显的缓冲平台，表现为较强的缓冲能力。

说明：较强的缓冲能力说明聚合物具有较好的pH响应特性，能够响应生物体内pH的变化。

实施例2、BAC-HA-His纳米粒的制备

称取胱胺-透明质酸-组氨酸合成物质(即，胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物，BAC-HA-His)20mg，将其溶于去离子水中，配成浓度为1mg/mL的溶液。将配制好的溶液放在25℃磁力搅拌器中，磁力搅拌8小时，使其充分溶胀后，置于4℃的冰箱放置过夜(10～12小时)；放置过夜后再在冰浴的条件下，设置超声功率为180W，超声时间为10min，则得到胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒。

胱胺-透明质酸-组氨酸合成物、胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒粒径分布图如图10所述，即，超声前后胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物纳米粒粒径分布图如图10所述。

从图10中可以看出，BAC-HA-His聚合物在未超声前粒径分布较宽，在大于1微米处出现很多明显的小峰，平均粒径较大。通过超声作用之后，能够加速体系中溶剂的扩散，固-液表面产生的空化效应能够使得溶液中的许多大颗粒分散开来，尺寸变小，聚合物的结构变得比较规则，分布也变得更加均一。

对比例2-1、不同超声功率对BAC-HA-His纳米粒的影响

将实施例2中的超声功率由180W分别改成140W、160W、200W，其余等同于实施例2。用马尔文粒度仪测量所得BAC-HA-His纳米粒的平均粒径与多分散系数。

所得结果如图11所述；从图11中可以看出在功率180W和200W的条件下，粒径分布比较均匀，与超声功率为140W、160W的条件相比，平均粒径都有不同程度的减少。当超声功率为140W时，平均粒径为202nm，PDI比功率为180W的条件下大0.109，说明超声功率较小时，粒子与粒子之间的撞击不够剧烈，此时纳米粒的分布还不够均匀。当超声功率过高时，空化作用会使得粒子之间会产生剧烈的相互作用，使伸展在粒子表面的不规则结构断裂。因此，本实验的最佳超声功率为180W，在此条件下平均粒径为162nm，PDI值为0.254，形成的自组装纳米粒粒径较小，分布最为均一。

对比例2-2、不同超声时间对BAC-HA-His纳米粒的影响

将实施例2中的超声时间由10min分别改成6min、8min、15min，其余等同于实施例2。用马尔文粒度仪测量所得BAC-HA-His纳米粒的平均粒径与多分散系数。

所得结果如图12所述；从图12中可以看出：超声波的空化作用和产生的热能能够促使纳米粒在溶液中均一分散，从而提高其稳定性，但是超声时间过长，会使得纳米粒聚合，体系中可能会产生聚集物，粒径分布变宽，降低纳米粒的稳定性。而超声功率较小超声时间过短时，无法使纳米粒粒子分散较小。

性能试验3、不同pH对BAC-HA-His纳米粒粒径与电位的影响

将实施例2中的去离子水改成不同pH值的磷酸缓冲溶液(pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0)；其余等同于实施例2。用马尔文粒度仪测量所得BAC-HA-His纳米粒的平均粒径，用纳米粒度分析仪(Zetasizer NanoZS-90型)检测Zeta电位；

pH对纳米粒平均粒径如图13的(A)，对电位影响如图13的(B)，因此可得知：该纳米粒具有pH响应性。

性能试验4、不同GSH浓度对BAC-HA-His纳米粒的影响

将实施例2所得的胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒过0.45μm的滤膜，所得滤液取出6mL置于烧杯中，再将GSH(谷胱甘肽)加入到上述6mL的滤液中，至GSH浓度为0μM、10μM、5mM、10mM，磁力搅拌24h后用马尔文粒度仪探究GSH浓度对BAC-HA-His纳米粒的平均粒径与多分散系数的影响。

所得结果如图14所述；因此可得知：该纳米粒具有GSH响应性。

性能试验5、不同温度对BAC-HA-His纳米粒的影响

将实施例2所得的胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒分别置于4℃、25℃、40℃、60℃、80℃的恒温水浴锅中保温10min后，用马尔文粒度仪测量BAC-HA-His纳米粒的平均粒径与多分散系数。

所得结果如图15所述；因此可得知：该纳米粒具有较好的热稳定性。

性能试验6、纳米粒在模拟肠胃液中的稳定性研究

模拟胃液的配制：取浓盐酸7mL，3.2g胃蛋白酶，2.0g氯化钠溶解至250mL去离子水中，再用1mol/L HCL将溶液的pH调整为1.2，再用容量瓶定容至1000mL。

模拟肠液的配制：称取磷酸二氢钾6.8g，用250mL去离子水溶解后，加入0.2mol/LNaOH190mL，再加入胰蛋白酶10g，充分混匀后，用0.2mol/L NaOH将溶液的pH调整为7.0，再用容量瓶定容至1000mL。充分溶解后，于离心机中高速离心15min，转速为4000rpm，上清液则为模拟肠液。

将实施例2所得的胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)自组装纳米粒，分别与模拟胃液和模拟肠液以1:1的体积混合后，用马尔文粒度仪测量其平均粒径与多分散系数。

所得结果如图16所述；因此可得知：该纳米粒具有较好的肠胃稳定性。

性能试验7、生物相容性

取对数生长期的CMT93细胞，用0.25％胰酶消化后，将细胞悬液稀释成浓度为5.0×10⁴/mL，再将细胞接种到96孔细胞培养板上，每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于二氧化碳培养箱中培养24h后，分别加入含有不同浓度的BAC-HA-His纳米粒的DMEM培养液，设置不含细胞的培养液为空白孔，对照孔为不含纳米粒溶液正常培养的细胞孔，每一组设值5个平行孔，于5％CO₂，37℃培养箱中继续孵育24h、48h、72h。

所得结果如图17：在浓度较高为1mg/mL的BAC-HA-His纳米粒对细胞处理72h后，CMT93细胞依然能够达到85％的存活率，可能由于透明质酸和组氨酸都具有良好的生物降解性，基本可以说明该纳米粒载体无毒，具有良好的生物相容性。

实施例3、利用实施例1制备而得的胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物进行的制备负载原花青素(OPC)纳米粒的方法，依次进行以下步骤：

1)、称取5mg原花青素溶解于pH 6.5磷酸缓冲溶液中，配成1mg/mL的原花青素溶液。

2)、按照1mg/1mL的料液比，称取4mg胱胺-透明质酸-组氨酸(BAC-HA-His)聚合物于烧杯中并加入4mL去离子水，然后置于磁力搅拌器上，磁力搅拌8小时使得聚合物充分溶胀；然后加入原花青素溶液130μL，于冰浴条件下180W超声10min，得包埋有OPC的超声纳米粒。

对实施例3所得的包埋有OPC的超声纳米粒进行如下的检测：

1、OPC包埋率的测定

取4mL实施例3所得的包埋有OPC的超声纳米粒，放入15mL的超滤管中(美国Millipore公司，截留量3KD)，再放入离心机中，进行高速离心，离心转速为6000rpm，4℃下离心10min。最后用UNICO紫外-可见光分光光度计测定在301nm处上清液中游离的OPC吸光度值。

装载量(包载率)＝(W₂-W₁)/W₃×100％

包封率＝(W₂-W₁)/W₂×100％

W₂：总OPC质量；W₁：上清液中OPC质量；W₃：纳米粒总质量。

所得结果如图18所述。

对比例3、将实施例3中原花青素溶液由130μL分别改成80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、140μL、150μL，其余等同于实施例3。所得产物包封率的对比如图18所述。由图18可得知：原花青素的添加量为130μL时，装载量为10.8％，包封率88.5％；此为最佳条件，此时纳米粒的包封率高，装载量较佳。

2、通过图19可以看出在40～80℃的温度范围内，负载OPC纳米粒的DPPH清除率没有发生明显的变化，说明纳米粒载体对OPC的保护效果较好，使得OPC的抗氧化和抗热稳定性能有了一定的提高。即，纳米粒载体在40～80℃温度下可以很好的保护OPC与外界的接触，提高其抗氧化性能。

3、延缓食品防腐剂对OPC的破坏：

取2个相同容量的样品瓶，加入4mL负载OPC的纳米粒溶液(实施例3所得的包埋有OPC的超声纳米粒)，再分别加入0.1％的食品级防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾。在4℃避光的条件下贮藏，每隔5天测定BAC-HA-His纳米胶囊的OPC的含量，按照公式计算保留率。

保留率＝5天后测得纳米粒中残留OPC含量/原纳米粒中OPC含量；

所得结果如图20：保留率到第30天分别为71％和70％，纳米粒处于食品防腐剂存在的环境下一个月之后还能保持一个相对较高的保留率，说明其对芯材起到了一个保护作用。

4、缓释效果

取4mL负载有OPC的纳米粒溶液装入透析袋(MWCO:8000-12000)中，两端用透析夹封好；放入装有50mL含不同GSH浓度(0mM，10μM，10mM)和不同pH(pH 5.8、7.4)的PBS缓冲溶液的烧杯中，使其在37℃恒温震荡培养箱中进行透析释放(震荡速度为100rpm)，分别于1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h定时取出4mL溶液并补加相同体积的PBS缓冲溶液，通过测定取出溶液的吸光值，进一步计算OPC的释放率。

C：t时刻溶液中释放的OPC的浓度；

V：t时刻混合溶液体积；

M：初始时刻纳米胶囊中OPC的总量。

所得结果如图21：在pH＝5.8，GSH浓度为10mM的条件下OPC的释放率达到最高，在30h后OPC的累计释放率达到78.4％，因此，本发明所合成的纳米胶囊可以作为具有pH和GSH响应的载体，可应用于营养素的包埋。

5、提高抗结肠癌细胞活性

取对数生长期的CMT93细胞，用0.25％胰酶消化后，将细胞悬液稀释成浓度为5.0×10⁴/mL，再将细胞接种到96孔细胞培养板上，每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于二氧化碳培养箱中培养24h后，分别加入一系列含有不同药物浓度的OPC溶液、载OPC的纳米粒溶液的DMEM培养液，设置不含细胞的培养液为空白孔，阴性对照孔为不含药物正常培养的细胞孔，每一组设值5个平行孔，于5％CO₂，37℃培养箱中孵育24h、48h、72h后，取出96孔培养板，置于超净工作台上每孔加入20μL MTT溶液后，进一步孵育4小时。然后再小心吸去每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，低速震摇十分钟使得底部的紫色结晶全部溶解后，再用酶标仪测定各孔在490nm处的OD值，按照以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝(OD_实验孔-OD_空白孔)/(OD_对照孔-OD_空白孔)×100％；

所得结果如下图22：与游离OPC相比，负载OPC纳米粒对细胞的毒性相对要高，这可能归因于细胞膜上的糖蛋白具有一定的免疫作用，阻止游离的OPC进入细胞，此时细胞内OPC的浓度比较低，细胞活性较高。对于负载OPC纳米粒而言，由于CMT93细胞表面有大量透明质酸的受体CD44，因此通过透明质酸修饰的纳米粒能够与CD44受体迅速发生特异性的结合，从而使得负载的OPC被CMT93细胞所摄取，负载OPC纳米粒在细胞中的内涵体聚集，内涵体中酸性环境以及二硫键响应的还原环境会导致载体结构破坏，OPC在细胞内大量快速的释放并发挥作用，从而使得细胞存活率降低，表现为抗结肠癌细胞活性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.双响应性聚合物的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、透明质酸-组氨酸接枝物的合成：

通过透明质酸的羧基与组氨酸的氨基进行酰胺反应，得到透明质酸—组氨酸接枝物；

2）、胱胺-透明质酸-组氨酸的合成：

将透明质酸—组氨酸接枝物溶于去离子水中，然后加入作为引发剂的过硫酸钾和作为交联剂的N’N-双丙烯酰胱胺，于惰性气体的保护下，于50±5℃反应1±0.2 h；

反应所得物装入Mr＝8,000～14,000D的透析袋中，于去离子水中透析22~26h，将位于透析袋中的截留液冷冻干燥，得到胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物，所述胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物为双响应性聚合物；

过硫酸钾：透明质酸—组氨酸接枝物=（5±0.5）：1的质量比；

N’N-双丙烯酰胱胺：透明质酸—组氨酸接枝物=（1.2±0.1）：1的质量比。

2.根据权利要求1所述的双响应性聚合物的合成方法，其特征在于：所述步骤1）包括以下步骤：

S1.1、将透明质酸溶于去离子水中，再加入EDC、NHS后磁力搅拌混合1±0.2h，从而活化透明质酸的羧基；

透明质酸：EDC、NHS= 1:（1.2±0.1）:（1.2±0.1）的摩尔比；

EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；

S1.2、按照组氨酸：透明质酸=0.5~4:1的质量比，在S1.1所得物中加入组氨酸，磁力搅拌混合2±0.2h后，于20~60℃、200~400W超声处理20~60 min；

将所得的反应液装入Mr＝8000～14000D的透析袋中，于去离子水中透析22~26h，将截留液进行冷冻干燥，得到透明质酸—组氨酸接枝物。

3.根据权利要求2所述的双响应性聚合物的合成方法，其特征在于：

所述步骤S1.1中，每0.32 mmol透明质酸配用75±25ml的去离子水；

所述步骤2）中，每20 mg透明质酸—组氨酸接枝物配用20±5 mL去离子水。

4.根据权利要求1~3任一所述的双响应性聚合物的合成方法，其特征在于步骤S1.2中，

组氨酸：透明质酸=3:1的质量比；

于50℃、250 W超声处理40 min。

5.双响应性聚合物纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将权利要求1所制备的胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物溶于去离子水中，配成浓度为1±0.2 mg/mL的溶液；

将溶液于25±5℃磁力搅拌8±2小时，从而使得胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物充分溶胀；再在冰浴的条件下，于140~200 W的超声功率超声6~15 min，得到双响应性聚合物纳米粒。

6.如权利要求1~4任一方法合成所得的双响应性聚合物的用途，其特征在于：制备用于负载原花青素的纳米粒。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于包括以下步骤：

1）、将原花青素溶解于pH 6.5磷酸缓冲溶液中，配成1±0.2 mg/mL的原花青素溶液；

2）、将4 mg胱胺-透明质酸-组氨酸聚合物中加入至4 ±1mL去离子水，磁力搅拌8±2小时，然后加入原花青素溶液80~150μL，于冰浴条件下180±20W超声10±2min，得包埋有OPC的超声纳米粒。