CN111094547B - 用于纯化源自人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从源自多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞的细胞群中富集胰腺祖细胞的方法。本文公开了用于富集胰腺祖细胞的标志物CD51和CD177，以及用于富集或耗竭肝脏祖细胞的标志物CD275。

Description

用于纯化源自人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的 方法

背景技术

由自身免疫反应引起的胰岛中β-细胞破坏是I型糖尿病的病因，但在II型糖尿病中，尽管是由其它机制介导的，但是该种疾病的晚期也可能发生β-细胞破坏。然而，患有这些疾病(尤其是I型糖尿病)的患者需要外源性胰岛素输送，但是选择正确的胰岛素剂量仍然是一个挑战，并可能导致血糖控制不佳。

胰岛的再生能力是非常有限的，因此胰岛细胞的移植可以改善葡萄糖耐量和控制。然而，胰岛细胞移植具有不同的局限性，这种局限性包括对供体器官的依赖、自胰腺中分离胰岛的挑战及终身使用免疫抑制药物。多能干细胞为供体胰岛细胞的不足提供了一种可能的解决方案。

现有技术中已经描述了若干用于将多能干细胞或胚胎干细胞分化为胰腺祖细胞或β-细胞的方法。例如Rezania等2014、Pagliuca等2014、D’Amour等2006或Kroon等2008。尽管所有这些方法都得到了相当比例的β-细胞，但通过这些方法产生的β-细胞是不成熟的，并且还可能包含一些未分化的多能干细胞，这些未分化的多能干细胞可能带来畸胎瘤形成的风险。

因此，在分化过程中富集细胞亚群，从而得到更大比例的胰腺祖细胞是非常重要的。在胰腺和胰岛发育过程中，细胞会经历各种中间体。一个重要的中间体是前定形内胚层(anterior definitive endoderm,ADE)的阶段。在本文中可以区分发育为胰腺谱系或其他谱系(如肝脏)的已特化亚群。专利申请US2009/0263896A1和WO2016/170069A1公开了若干用于富集胰腺内胚层细胞的标志物。然而，这些专利申请在向胰腺β-细胞分化的后期阶段才对亚群进行分选。这些细胞使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂上调，并失去了扩增大量细胞以用于细胞替代疗法的潜力。在ADE阶段即细胞仍然高度增殖时对胰腺祖细胞进行分选将克服上述扩增难题并允许自多能干细胞的大量胰腺祖细胞的可扩展生产。

然而，仍然需要分化早期的具有胰腺命运(fate)的定形内胚层亚群的可靠且优选地是改善的标志物，由此理想地改善自异质细胞群中选择特化的胰腺祖细胞，所述胰腺祖细胞有利地在随后的制备过程中仍然具有增殖的能力。因此，本申请所基于的技术问题是满足上述需求。本发明的发明人惊讶地发现，可以将细胞表面标志物CD51和/或CD177用于在定形内胚层阶段富集未来的胰腺祖细胞，而可以将细胞表面标志物CD275用于富集未来的肝谱系细胞或用于耗竭此类细胞。肝谱系细胞的耗竭可以用于移除不发育为胰腺祖细胞的细胞，由此富集能够发育为胰腺祖细胞的细胞。此外，可以将畸胎瘤形成细胞分出并且CD177和CD275可作为评估不同细胞系和不同方案中分化过程的工具。CD177亚群还显示出增加的WNT/平面细胞极性(PCP)信号传导。CD177+细胞显示出β-连环蛋白向膜的易位，因此促进了胰腺命运而非肝脏命运(实施例2和4，图2C-E，图4D)。CD177+细胞有效地生成了背侧胰腺(dorsal pancreas)(实施例3和7，图3C、D)，产生更紧密的簇并且具有组织极性(实施例5，图5E)。这些细胞显示出胰腺转录因子如PDX1或NKX6.1的更高表达(实施例5和9，图5C)并产生单激素细胞(实施例5和9，图5B)。此外，如实施例2、6和7所示，与现有技术中已知的CXCR4阳性细胞(CD184)相比，CD177阳性细胞产生的细胞群具有成为胰腺祖细胞的更高可能性。

发明概述

本文描述的实施方案涉及用于纯化源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的胰腺祖细胞的方法，和包含所述纯化的胰腺祖细胞的组合物以及包含针对CD177的配体和用于将胰腺祖细胞分化为定形内胚层细胞群的手段的试剂盒。

因此，本发明涉及一种纯化胰腺祖细胞的方法，包括：

(a)将源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含胰腺祖细胞的细胞群暴露于结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD177，和

(b)使所述胰腺祖细胞与源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化所述胰腺祖细胞，

其中优选地，所述胰腺祖细胞在细胞表面包含CD177。

根据本发明的纯化(特化的)胰腺祖细胞的方法的另一优点可以是支持可扩展的生产系统。在分化过程中，如在DE、ADE或PGT阶段，(特化的)胰腺祖细胞的早期选择允许分选出小细胞群。然后将这些细胞扩增，并保存材料(包括培养基、细胞因子等)。相对地，现有技术在分化后期进行分选。此时，已经使用了很多材料。因此，这些材料的很大一部分被浪费掉。本发明因此提供一种用于制备胰腺谱系细胞的更经济的方法。

优选地，根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞表达FOXA2、SOX17、CER1和/或CXCR4，更优选地表达CER1。

优选地，本发明的方法包括另一步骤，即将所述细胞群暴露于结合CD51和/或CD275的配体的步骤。

优选地，根据本发明的方法用于纯化胰腺祖细胞的结合CD51、CD177和/或CD275的配体为抗体或其结合片段。

优选地，根据本发明的方法使用的结合CD51、CD177和/或CD275的抗体或抗体片段为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选地，根据本发明的方法结合CD51、CD177和/或CD275并用于纯化胰腺祖细胞的配体与标记缀合。

优选地，根据本文所述的纯化胰腺祖细胞的方法，通过定量聚合酶链反应(qPCR)和/或流式细胞术检测所述细胞表面标志物CD51、CD177和/或CD275的表达。

优选地，根据本发明的方法的分离步骤包括亲和色谱法和/或流式细胞术。

优选地，根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞为人的。

优选地，将根据本发明的方法中或本文所述的胰腺祖细胞的组合物中使用的配体固定在捕获介质上。优选地所述捕获介质包括珠子，和/或优选地将所述配体缀合至磁性试剂。

优选地，根据本发明的纯化胰腺祖细胞的方法得到一种细胞组合物，该细胞组合物包含至少50％的(特化的)胰腺祖细胞。

优选地，根据本发明的方法纯化的组合物包含至少50％的CD177阳性的胰腺祖细胞，其中优选地，所述胰腺祖细胞在其细胞表面包含CD177。优选地，本文所述的组合物的胰腺祖细胞被结合至配体，所述配体结合胰腺祖细胞上的CD177。根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞的组合物和/或结合至结合所述胰腺祖细胞上的CD177的配体的所述组合物的胰腺祖细胞优选地为人的。

此外，本发明涉及一种结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体用于从源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的细胞群中纯化胰腺祖细胞的用途，其中所述细胞表面标志物为CD177，其中优选地所述胰腺祖细胞在细胞表面包含CD177。

本发明还涉及一种试剂盒，包含结合CD177的配体和用于将多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为定形内胚层细胞群的手段。

优选地，所述胰腺祖细胞优选地在细胞表面包含CD177。

应理解，上述方法和组合物涉及体外培养的细胞。然而，上述体外分化的细胞组合物可以用于体内应用。

附图说明

图1：用于识别富集不同定形内胚层(DE)的新型表面标志物抗体的筛选设置。

A)hESC向DE分化的示意图

B)用于识别新型表面标志物的设置，相对于已知DE标志物FOXA2和CXCR4，所述新型表面标志物可以富集不同DE亚群

C-D)CD275和CD177富集FOXA2/SOX17和CXCR4+DE中不同的DE亚群

E)在D4分选的DE亚群的PCA分析，表明CD177和CD275 DE与CXCR4(CD184)DE不同。

F)GO语义的基因本体论分析，GO语义由分化后第4天上调>1.5倍的基因引起。

图2：非经典WNT/PCP通路在CD177+亚群中受差异化调节。

A)hESC向DE分化和使用MACS进行分选的示意图

B)mRNA定量，表明在所有亚群中FOXA2和SOX17的表达相似，但就前定形内胚层(ADE)标志物CER1和HHEX而言则显示出不同的情况(profile)

C)微阵列谱图，显示与CXCR4和CD275亚群相比，CD177+DE亚群中WNT/PCP靶基因上调。

D-E)qPCR分析，证实CD177+DE中WNT/PCP靶基因(DVL2、ROR2、CELSR1)和配体(WNT5A和WNT4)上调。

F-G)蛋白质印迹分析，示出与CD275和CXCR4+DE相比，CD177中WNT/PCP靶基因p-JNK磷酸化。

图3：亚群的富集可以区分腹侧和背侧胰腺祖细胞

A)hESC向DE分化并使用MACS进行分选，然后进一步向后肠管(posterior guttube)分化的示意图

B)CD177+、CXCR4+和CD275+细胞中腹侧胰腺祖细胞标志物SOX17的表达。显示PDX1的表达表明胰腺祖细胞形成。

C)mRNA定量，示出与CD177+DE相比，CD275+DE中腹侧胰腺祖细胞标志物SOX17的表达更高。

D)qPCR分析，证实与CD275+和CXCR4+相比，CD177+中的背侧胰腺祖细胞基因(NOGGIN、MNX1、PTCH1)上调

E)代表性FACS图，示出与CD177+相比，CD275+细胞中的SOX17表达更高。

图4：CD177+亚群是特化的胰腺祖细胞，而CD275+是肝源性祖细胞。

A)hESC向DE分化并使用MACS进行分选，然后进一步向胰腺祖细胞分化的示意图

B)qPCR定量，示出肝祖细胞标志物(HHEX、AFP、TTR)和胰腺祖细胞标志物(PDX1)的表达

C)CD177+和CD275+细胞中PDX1的免疫荧光染色的代表性图像

D)免疫细胞化学染色的代表性图像，示出β-连环蛋白定位于CD177+(膜)，CD275+(细胞质和细胞核)和CXCR4+(膜)中。

E-F)CD275+和CD177+细胞的代表性FACS图和图形分析，所述细胞进行PI染色以显示细胞周期状态。

图5：CD177+DE在体外产生致密、成熟的单激素β细胞

A)hESC向胰腺β-细胞分化的示意图。

B)显示通过采用CD177+和CXCR4+细胞产生的INS+(胰岛素)、GCG+(胰高血糖素)和INS/GCG双阳性细胞百分比的图形表示。

C)代表性FACS图，示出胰腺转录因子PDX1和NKX6.1以及激素INS和GLU阳性细胞百分比

D)qPCR分析，示出由CD177+和CXCR4+细胞生成的β细胞中如PDX1、NKX6.1和NKX2.2的胰腺转录因子的表达。mRNA定量，示出与CXCR4+细胞相比，在CD177+细胞中更多的INS和更少的GCG表达。与CXCR4+细胞相比，CD177+细胞中的成熟标记物MAFA也被上调。

E)CD177+亚群的代表性图像，示出与CXCR4+亚群相比的小型致密结构。

图6：新型CD177+和CD275+ADE亚群的识别

A)显示添加了生长因子和小分子的hESC向DE分化的示意图。

B-C)显示异质群的CXCR4+/CD117+细胞(b)和表观同质FOXA2+/SOX17+(c)DE的代表性FACS图。

D-E)CXCR4+/CD117^高、CXCR4+/CD117^中和CXCR4+/CD117^低细胞的FOXA2和SOX17的基因表达谱(n＝全部基因的3次生物学重复，n＝每点的2次技术重复)。

F-G)CXCR4+/CD117^高、CXCR4+/CD117^中和CXCR4+/CD117^低细胞的CER1和HHEX的基因表达谱(n＝全部基因的3次生物学重复，n＝个每点的2次技术重复)。*代表样本之间的显著性。平均值±SDV，**P＜0.05。

图7：CD177+、CD275+和CXCR4+ADE亚群的分子谱图显示独特特征

A-C)在CD177+相对于(versus)CD275+(B)、CD177+相对于CXCR4+(C)和CD275+相对于CXCR4+(A)DE群中所选择的和显著富集的基因本体论(GO)语义的条形图。

D)描绘CXCR4+、CD177+和CD275+中差异化表达的基因的热图

E-F)富集的ADE亚群的细胞质(C)和细胞核(N)中β-连环蛋白的核组分分析(Nuclear fractionation)(E)和定量(F)。

图8：CD177+ADE有效分化为PDX1+胰腺祖细胞

A-B)对源自CD177+-、CD275+-和CXCR4+-ADE的PP的PDX1细胞内FACS分析(A)和定量(B)，显示PDX1^高和PDX1^低细胞的百分比。

C-D)源自CD177+-、CD275+-和CXCR4+-ADE的PP中PDX1^高和PDX1^低细胞的免疫荧光染色(D)和分析(C)。比例尺50μm。

E)在hESC向胰腺β-样细胞分化的过程中，CD177+-、CD275+-和CXCR4+的表达。

F)肝分化方案。

G)在富集的ADE亚群中早期肝祖细胞标志物HHEX、TTR和AFP的表达的qPCR定量。

图9：源自CD177+、CD275+和CXCR4+ADE细胞的基于GATA6和SOX2表达的胰腺祖细胞的表征

A)源自富集的ADE亚群的胰腺祖细胞的后前肠标志物GATA6和PDX1共表达的免疫荧光染色。比例尺50μm。

图10：源自CD177+、CD275+和CXCR4+ADE细胞的胰腺祖细胞的基于CDX2和PTF1A表达的表征

A)源自富集的ADE亚群的胰腺祖细胞的肠标志物CDX2和PDX1共表达的免疫荧光染色。比例尺50μm。

B)源自富集的ADE亚群的胰腺祖细胞的外分泌胰腺标志物PTF1A和PDX1共表达的免疫荧光染色。比例尺50μm。

图11：WNT分泌的抑制促进胰腺分化

A)向胰腺祖细胞分化的方案概述，其中在S2阶段使用IWP2实施WNT分泌的抑制。

B-D)在用IWP2处理之前(B、C)(比例尺50μm)和之后(B、D)(比例尺20μm)，由CD177+-、CD275+-和CXCR4+-ADE产生的表达PDX1+/NKX6.1+的细胞的百分比的FACS定量(B)和免疫细胞化学(C-D)。

E-F)在揭示细胞自细胞周期退场(exit)的不同ADE亚组中的EdU+细胞的EdU染色(E)和定量(F)。比例尺80μm。(G)不同ADE亚群中S4和S5阶段的NGN3的mRNA分析。(n＝3，生物学重复)。误差线表示+/-S.D；*P<0.05，**P<0.01，双侧(two-sided)未配对t-检验。数据相对于18S标准化。

图12：CD177+-富集的DE细胞有效产生NKX6.1+/INS+β-样细胞

A)由CD177+-和CXCR4+-ADE产生的S6细胞的PDX1、NKX6.1和NEUROD1表达的qPCR基因表达。误差线表示+/-S.D；*P<0.05，**P<0.01，双侧未配对t-检验。数据相对于18S标准化。

B-C)源自CD177+-和CXCR4+-ADE的β-细胞的PDX1和NKX6.1(B)以及NKX6.1和INS(C)表达的代表性FACS图。

D)S6阶段的细胞的表达各种转录因子和胰腺激素的细胞百分比的FACS定量。

E-F)源自富集的CD177+和CXCR4+DE的S6细胞的代表性免疫荧光染色：(E)PDX1和C-肽及(F)NKX6.1和INS。还示出细胞核DAPI染色。比例尺50μm。

G)与人胰岛相比，源自分选的亚群的β-样细胞的胰腺内分泌腺转录因子(如PDX1、NKX6.1和NKX2.2)的mRNA定量。

H)由富集的亚群产生的β-样细胞中的胰腺激素INS和GCG的mRNA转录物的定量。

I)第6阶段细胞的标记多激素细胞的INS和GCG表达的代表性FACS图，所述第6阶段细胞由富集的ADE亚群产生。

图13：C D177+富集的ADE在体外产生更多的β-样细胞。

A)比较2D与3D的分化方案的概述。

B)在2D和3D设置中由CD177+-、CD275+-和CXCR4+-ADE产生的PDX1+/NKX6.1+的比较

C)在来自CD177+-和CXCR4+-ADE的簇中生成β-样细胞的分化方案的图解。

D)源自CD177和CXCR4的β-样细胞的形态；DAPI(蓝色)和E-CAD(绿色)。比例尺20μm。图表代表聚集体的尺寸，单位为μm。

E)β-样细胞的成熟标志物MAFA、GLUT1和UCN3的基因表达谱。数据表示为相对于hiPSC的倍数变化。误差线表示+/-S.D；*P<0.05，**P<0.01，双侧未配对t-检验。数据相对于18S标准化。

F、H-I)MAFA(左)、INS(中)的表达的FACS定量(F)和免疫组织化学。插图显示更高倍的放大图像。(H)和NKX6.1(绿色，核)和GLUT1(绿色，膜)(I)。DAPI用蓝色显示。在低倍放大图像中比例尺为50μm，在高倍放大图像中比例尺为5μm。

G)源自CD177+和CXCR4+ADE的β-样细胞的静态葡萄糖刺激的人胰岛素分泌(n＝4，包括每个批次5次技术重复)。数据表示为相对于基础胰岛素水平的倍数变化，并相对于细胞数标准化。

J-K)由CD177+和CXCR4+ADE细胞产生的S7细胞中的β细胞成熟标志物MAFA(J)和GLUT1(K)的代表性FACS图。

图14：通过改变参数的诱导效率

A-B)从hESC向DE/ADE的内胚层分化方案。FACS图(A)代表DE/ADE阶段hH1、hMEL1-NKX6.1和hiPSC中CXCR4+/CD177+和CXCR4+/CD275亚群的百分比(B)。

C-E)先前公开的从hESC开始的内胚层分化方案的调整。

F)使用3种不同的内胚层诱导方案，对源自iPSC细胞的DE细胞中表达CXCR4的总群百分比进行FACS定量(n＝3次生物学复制)。

G)使用先前公开的方案产生的DE中表达CXCR4+/CD177+和CXCR4+/CD275+的细胞的百分比的FACS定量。

H)在DE诱导期间TGF-β和BMP信号传导的剂量依赖性抑制的示意图。

I-K)代表使用无通路抑制(I，条件1)、使用BMP抑制剂DMH1对BMP信号传导的高抑制(J，条件2)以及使用中等BMP抑制和低TGF-β抑制(K，条件3)产生的CD177+和CD275+ADE亚群的百分比的饼状图。

发明详述

以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文所提供的任何信息为现有技术或与请求保护的本发明相关或者任何明确或隐含引用的出版物为现有技术。

定义

应理解，本文表述的数值范围包括示出的端点，并描述所述数值范围的端点之间的所有整数。除非有明确的相反意图，否则单数请求的术语在范围上包括复数。

如本文所用，“多能干细胞”为可以产生形成三个胚层的三个胚胎细胞谱系中的每一个以及胚外细胞的细胞。这些胚层为内胚层、中胚层和外胚层。在本发明的上下文中，优选形成胰腺祖细胞和/或肝祖细胞的内胚层谱系的细胞。然而，多能细胞可能无法产生完整生物体。

在一些实施方案中，用作起始材料的多能细胞为干细胞，包括人胚胎干细胞。如本文所用，所述胚胎干细胞为H1 hESC细胞系、H9 hESC细胞系、Mel1-NKX6.1-GFP细胞系或Mel1-INS-GFP细胞系。

如本文所述，“诱导多能干细胞”(iPSC)为可以直接从分化或成体细胞转化为一类多能干细胞的细胞。iPSC的产生由Takahashi等2006开创并产生了一种非常类似于ESC或PSC的细胞类型。

图5A示出了从干细胞向β细胞分化的概况。以下将定义不同的阶段和应答细胞群：

如本文所用，“胰腺祖细胞”(PP)通常为能够分化为内分泌腺前体细胞并进一步分化为胰腺β细胞的细胞，参见如图5A。因此，PP包括ADE、PGT、PP1、PP2、EN和SC-β。如本文所用，“定形内胚层”(DE)是指多能细胞，其可以分化成肠管的细胞或源自肠管的器官，比如胰腺或肝脏。根据一些实施方案，定形内胚层细胞以及源自其的细胞为哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，定形内胚层和/或前定形细胞为人细胞。如本文所用，短语“前定形内胚层”(ADE)描述了一种DE的亚群，该亚群尤其能够发育成胰腺谱系的细胞(参见实施例2)，并且如实施例2所示该亚群的特征在于增加的Wnt和非经典平面细胞极性(PCP)信号传导。定义ADE的标志物包括FOXA2、SOX17和CER1。ADE的细胞优选用在根据本发明的纯化胰腺祖细胞的方法中。优选地，所述胰腺祖细胞为ADE、DE、PGT和/或VFG的细胞。更优选地，所述胰腺祖细胞为ADE的细胞。优选地，所述胰腺祖细胞优选在细胞表面包含CD177。

如本文所用，“后肠管”(PGT)是指中间细胞群。PGT的特征在于表达标志物FOXA2、HNF1α(HNF1A)、HNF4α(HNF4A)。

如本文所用，另外两个细胞群为“胰腺祖细胞阶段1”(PP1)和“胰腺祖细胞阶段2”(PP2)。两个细胞群代表了胰腺谱系发育中的中间细胞群。PP1的典型标志物包括FOXA2和PDX1，以及PP2的典型标志物包括FOXA2、PDX1和NKX6.1。

胰腺祖细胞(PP)可进一步分化为表达神经元3(NGN3)的胰腺谱系细胞，所述细胞在本文中称为“内分泌腺细胞”(EN)。该细胞类型的典型标志物包括FOXA2、NGN3和NKX2.2。

如本文所用，术语“胰腺β细胞”(SC-β)是指内分泌腺细胞，其能够分泌激素并且还响应于在体外或体内刺激或影响此类激素分泌的多种试剂。例如，本文所述的“成熟”内分泌腺细胞是这样一种细胞，该种细胞是例如葡萄糖响应的并且以生理上合适的方式释放胰岛素。如本文所用，术语“未成熟的”是指一种细胞，该种细胞不能完全分泌激素，或者在其他实施方案中该种细胞不能由于体外的各种刺激而完全分泌激素。

对于本文描述的实施方案的其他方面，本文所述的源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型可以如实施例中进一步描述的进行富集、耗竭、分离、隔离、分选和/或纯化。如本文所用，术语“富集的”或“纯化的”，或由于其他已知细胞群的耗竭而富集的或纯化的，表示该细胞群已经经受了某个选择过程，使得该群被富集和/或纯化。同样，还认为受试细胞是相对富集的和/或纯化的，即与源自PSC/iPSC/ESC的另一类型群相比，或与原始或初始细胞培养物相比，存在显著更多的源自PSC/iPSC/ESC的特定细胞类型群。也就是说，有时源自PSC/iPSC/ESC的特定细胞类型的富集或纯化可能涉及从另一种源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型中“耗竭”或“隔离”或“分选”一种或多种已知的源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型。例如，在一些实施方案中，一些源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型被富集或纯化，因为它们不与配体和/或试剂和/或抗体和/或结合至固体或半固体基质的抗体结合或交叉反应。此类富集或纯化的群可以称为是从PSC/iPSC/ESC细胞培养物中“耗竭的”或“隔离的”或“分选的”。作为进一步的实例，可以通过标准亲和色谱法在流出级分中发现或分离出此类耗竭的或隔离的或分选的PSC/iPSC/ESC群；或换言之，未结合的级分。因此，在某些实施方案中，有利的是通过耗竭已知或未知细胞类型的培养物来富集和纯化源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型。由此，所述富集或纯化的细胞群不具有结合或附着的抗体。因为不需要从纯化的群中移除抗体，所以将富集或纯化的细胞用于细胞疗法的用途得到了改善。

在一些实施方案中，术语“富集”、“分离”、“隔离”、“分选”、“纯化”或它们的等同术语是指细胞培养物或细胞群或细胞样品，其含有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的所需细胞谱系或具有某个细胞表型的所需细胞，所需细胞如表达某个细胞标志物或不表达该细胞表型特征性的某个细胞标志物基因。

如本文所用，“配体”是指与细胞上的标志物或靶标或受体或膜蛋白或与样品或溶液中的可溶性分析物特异性结合或交叉反应的部分或结合配偶体。

如本文所用，“标志物”、“表位”、“靶标”、“受体”或它们的等同术语可以指能够观察或检测到的任何分子。例如，标志物包括核酸(比如特定基因的转录物)、基因的多肽产物(比如膜蛋白)或非基因产物。“细胞表面标志物”是存在于细胞表面的标志物。

如本文所用，“捕获介质”是指允许其与细胞群样品相分离的任何基质或介质，例如生理相容的珠子。此类介质的特征包括折光率、尺寸、光散射强度、磁性或携带荧光检测染料以提供独特的荧光特征。例如，固相捕获介质的一个子集包括稳定的胶体颗粒，比如直径范围在约0.05至约10μm之间的珠子(即，胶体大小)。此类珠子可以含有葡聚糖、氨基葡聚糖、醛和/或硫酸盐官能团。优选地，捕获介质包括珠子。

CD51(也称为整合蛋白αV和玻连蛋白受体α亚基)是整合蛋白的成员，整合蛋白是参与细胞间粘附以及参与和基底膜与细胞外基质配体的结合的异二聚体糖蛋白家族。CD51是纤连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原和其他蛋白的受体的一部分。CD51的UniProt登录号为P06756，其HUGO号为HGNC:6150。

CD177(也称为人类嗜中性粒细胞同种异体抗原2a(HNA-2a)、NB1糖蛋白(NB1GP)或真性红细胞增多症蛋白1(PRV-1))是在嗜中性粒细胞活化中起作用的与糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接的细胞表面糖蛋白。该种蛋白可以结合血小板内皮细胞粘附分子-1，并在嗜中性粒细胞迁移中起作用。CD177的UniProt登录号为Q8N6Q3，其HUGO号为HGNC:30072。

CD275(也称为诱导性T细胞共刺激因子配体(ICOS配体)、B7同系物2(B7-H2)、B7样蛋白Gl50或B7相关蛋白1(B7RP-1))是T细胞特异性细胞表面受体ICOS的配体。CD275充当T细胞增殖和细胞因子分泌的共刺激信号；还诱导B细胞增殖并分化为浆细胞。CD275的UniProt登录号为O75144，其HUGO号为HGNC:17087。

实施方案详述

本文描述了采用与细胞表面标志物交叉反应的配体来识别并表征源自多能干细胞(PSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和/或胚胎干细胞(ESC)的不同细胞类型的方法和试剂盒。细胞表面标志物可以是受体、膜蛋白和/或表位。优选的细胞表面标志物是CD51、CD177和CD275。优选地，所识别和/或表征的细胞类型是胰腺祖细胞，优选使用细胞表面标志物CD51和/或CD177识别。本文进一步描述了自根据本发明的方法或试剂盒得到的胰腺祖细胞的组合物。在优选的实施方案中，ESC为人胚胎干细胞(hESC)。D'Amour 2005、D'Amour 2006、Rezania 2014、Pagliuca 2014和Kroon 2008中描述了用于产生源自PSC/iPSC/ESC的细胞的一般方法。本发明的优选方案是Rezania 2014的方案。在图5A中也简短地总结了该种方案。

因此，本发明涉及一种纯化胰腺祖细胞的方法，包括

(a)将源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含胰腺祖细胞的细胞群暴露于结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD177，和

(b)使所述胰腺祖细胞与源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化所述胰腺祖细胞。

还可将本发明的方法理解为一种纯化胰腺祖细胞亚群、比如朝着胰腺谱系的特化的(A)DE亚群的方法。该种纯化胰腺祖细胞亚群、比如朝着胰腺谱系的特化的(A)DE亚群的方法，可包括：(a)将源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含特化的(A)DE细胞的细胞群暴露于结合特化的(A)DE细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD177，和(b)使所述特化的(A)DE细胞与源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化特化的(A)DE细胞。朝着胰腺谱系的特化亚群是优选发育为胰腺谱系细胞的亚群。

为了方便读者，将描述采用细胞表面标志物CD177分离定形内胚层(DE)的亚群以有效产生胰腺细胞的示例性非限制性程序。在图5A中描绘了该程序的概况：首先，使用Rezania 2014的方案使PSC向DE分化。第二，然后例如通过MACS对所得的DE进行CD177阳性细胞分选。第三，然后将这些CD177阳性细胞(也可以描述为ADE细胞的亚群)用于进一步向胰腺β-细胞的分化。

对于本发明的方法中的胰腺祖细胞的纯化，所述胰腺祖细胞，其也可以是向胰腺谱系特化的ADE细胞，应在表面上表达CD177。本发明不涵盖在表面不表达CD177的胰腺祖细胞。如图8E所示，处于DE/ADE、PGT或VFG阶段的胰腺祖细胞表达CD177。因此优选地，所述胰腺祖细胞的纯化在DE/ADE、PGT或VFG阶段进行，更优选地在DE/ADE阶段或最优选地在ADE阶段进行。这允许在非常早的时候，即在可以通过现有技术中已知的标志物确定细胞命运之前，对倾向于分化成胰腺谱系细胞的相关亚群进行分选。

因此，在一个优选的实施方案中，所述胰腺祖细胞是ADE细胞。在另一个实施方案中，所述胰腺祖细胞是ADE和/或PGT细胞。在再一个优选的实施方案中，所述胰腺祖细胞是DE、ADE、PGT和/或VFG(腹侧前肠)细胞。

当在DE或ADE阶段分离胰腺祖细胞时，本发明特别有用。因此，倾向于分化成胰腺谱系的(A)DE亚群与倾向于分化成其他细胞类型(例如分化成肝谱系)的其他亚群之间的CD177表达差异最大(还参见图8E)。然而，PGT或VFG的细胞也表达CD177和CD275。因此，源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的细胞为ADE、DE、PGT和/或VFG细胞。在一个优选的实施方案中，源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的细胞为ADE细胞。

可以将纯化胰腺祖细胞(或更确切而言，对于胰腺谱系特化的ADE亚群)看作本发明的目的。因此优选地，根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞表达FOXA2、SOX17、CXCR4和/或CER1。更优选地，根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞表达CER1。可选地，根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞可以表达FOXA2、SOX17和/或CXCR4。在ADE亚群进一步分化后，观察到与CXCR4⁺(CD184)(现有技术中已知的标志物)细胞相比，CD177⁺细胞的PDX1表达增加(实施例5，图5C)。根据本发明的方法纯化的胰腺祖细胞可以表达胰腺和十二指肠的同源盒基因1(PDX1)。

在一个实施方案中，使源自PSC/iPSC/ESC的细胞群另外与结合CD51和/或CD275的配体接触。根据分离细胞的方式，用于分化的配体的顺序是变化的。在优选的环境中，可以使倾向于成为肝谱系细胞的表达CD275的细胞从源自PSC/iPSC/ESC的细胞群中耗竭(参见实施例4和7)。在本文中，耗竭是指从细胞群中移除这些细胞，所述细胞群仅能够以不需要的细胞类型分化。由此，胰腺谱系的细胞被富集。在另一个优选的环境中，除采用CD177外，还采用细胞表面标志物CD51来富集胰腺谱系的细胞。在流式细胞术中，可以同时应用全部三个标志物，其中在如磁珠分选(磁性细胞分离(MACS))的其它纯化方法中，耗竭和富集必须在两个或更多个分开的步骤中进行。

在本发明的优选实施方案中，所述配体是抗体或抗体片段。抗体或抗体片段包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与之发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。此类抗体或片段包括来自任何天然来源的多克隆抗体，和IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类的天然或重组单克隆抗体，杂合衍生物以及包括Fab、Fab'和F(ab')₂的抗体片段，人源化或人抗体，包含抗体互补决定区的重组或合成构建体，其Fc抗体片段，单链Fv抗体片段(scFv)，具有足够互补性决定区(CDR)以保留与所需细胞表面受体结合的抗体的功能等效结合特征的合成抗体或嵌合抗体构建体，以及通过噬菌体展示产生的结合片段。某些类别也具有子类别，例如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。单克隆抗体是通过相同免疫细胞(均为唯一亲本细胞的克隆)制备的抗体。由于单克隆抗体与相同表位结合，因此它们具有单价亲和力。相对地，多克隆抗体与多个表位结合，并通常由若干不同的浆细胞谱系制备。在本发明的一个优选的实施方案中，抗体是单克隆和/或多克隆抗体。

优选地，本发明的配体(优选为抗体)与标记缀合或偶联以便于这些配体的检测。在一个实施方案中，所述标记包括本领域规范使用的放射性、荧光、磁性、发光、化学发光、生物或酶标签或标记。在一些实施方案中，所述标记可以是小化学分子，其单独起作用或与其他分子或蛋白质协同作用，能够提供直接或间接可检测的信号。特别优选的实施方案是配体与磁珠偶联。可以与比如抗体的多肽缀合或偶联的可检测标记的非限制性实例包括但不限于：比如³H、¹¹C、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、⁶⁴Cu、⁷⁶Br、⁸⁶Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I或¹⁷⁷Lu的放射性标记、比如辣根过氧化物酶的酶、荧光团、生色团、化学发光剂、螯合复合物、染料、胶体金或乳胶颗粒。

除抗体外，配体还可以是突变蛋白或其它结合分子，比如DARPin、核酸适体、affimer、affibody、affilin、affitin(nanofitin)、α体(alphabody)、anticalin、avimer、fynomer、Kunitz结构域肽或单体。

在本发明的另一个实施方案中，标记也可以是与底物相互作用以产生可检测信号的酶；或可通过抗体结合或通过结合合适标记的配体可检测的蛋白质。多种酶系统在分析中显示比色信号，例如葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)以及与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶接合的己糖激酶。可以使用的其他标记系统包括纳米颗粒或量子点。

可以用不同的方法检测细胞CD51、CD177和/或CD275的表达。在本发明的一个实施方案中，将流式细胞术、蛋白质印迹、RNA印迹、微阵列、聚合酶链反应和/或定量聚合酶链反应(qPCR)用于检测。在本发明的优选实施方案中，将流式细胞术用于CD51、CD177和/或CD275表达的检测，和在本发明的另一个优选实施方案中，将qPCR用于CD51、CD177和/或CD275表达的检测。

如本文所用，“定量聚合酶链反应”(qPCR)或“实时聚合酶链反应”(实时PCR)是指基于聚合酶链反应的实验室技术。与常规PCR一样，实时PCR在PCR期间，即实时而非在结束时监控靶标DNA分子的扩增。实时PCR可以用于定量(定量实时PCR)和半定量，即在一定数量的DNA分子之上/之下(半定量实时PCR)。两种用于在实时PCR中检测PCR产物的常规方法是技术人员已知的：插入任何双链DNA的非特异性荧光染料或由用荧光报告基因标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，所述荧光报告基因仅在探针与其互补序列杂交后才允许检测。

组织特异性基因产物的表达还可以通过RNA印迹分析、dot-blot杂交分析或通过逆转录酶引发的聚合酶链反应(RT-PCR)在标准扩增方法中使用序列特异性引物在mRNA水平进行检测。

可以通过流式细胞术监测细胞表面标志物的表达，即细胞的染色强度，其中激光检测荧光染料的定量水平(其与被特定试剂(如抗体)结合的细胞表面标志物的量成比例)。尽管染色的绝对水平可能因特定的荧光染料和试剂制备而不同，但可以将数据相对于对照标准化。所选参数的读数能够同时或在单次分析中依次读取，例如通过使用针对细胞表面分子的荧光抗体。举例而言，这些抗体可以用不同的荧光染料、荧光珠子、标签如量子点等标记。

在一些实施方案中，与标准化或归一化对照标志物相比，在任何源自PSC/iPSC/ESC的细胞类型或源自PSC/iPSC/ESC的细胞群中的任何标志物的表达水平为至少约4倍高、至少约6倍高、至少约8倍高、至少约10倍高、至少约15倍高、至少约20倍高、至少约40倍高、至少约80倍高、至少约100倍高、至少约150倍高、至少约200倍高、至少约500倍高、至少约750倍高、至少约1000倍高、至少约2500倍高、至少约5000倍高、至少约7500倍高或至少约10,000倍高。在本文的上下文中，标志物不仅包括CD51、CD177和/或CD275，而且还包括本文定义的细胞群的细胞表面标志物。

根据本发明的方法使用的细胞，PSC/iPSC/ESC或源自PSC/iPSC/ESC的细胞，可以从任何哺乳动物获得。在一些实施方案中，细胞源自猫、狗、牛、猪、马和/或生产动物(production animal)。在优选的实施方案中，细胞源自人。

根据本发明的用于分离步骤的实施方案包括本文所述的那些，比如涂布抗体的磁珠(MACS)、亲和色谱法和通过附着在固体基质或固相捕获介质(如板、色谱柱)的抗体的“淘选(panning)”或其它方便可用的技术。提供精确分离的技术包括流式细胞术方法，其可用于测量细胞表面和细胞内参数以及形状变化和粒度并用于分析用作抗体或探针连接试剂的珠子。采用通过流式细胞术获得的那些数据，本领域技术人员可以识别亚群，然后可以分离特定的亚群。优选地，基于CD51、CD177和/或CD275表达，这些数据可用于从源自PSC/iPSC/ESC的亚群中分选出胰腺祖细胞。在实施例中举例说明了MACS和流式细胞术的使用。

在本文描述的本发明的一个实施方案中，将亲和色谱法用于纯化源自PSC/iPSC/ESC的细胞。亲和色谱法是一种基于高度特异性相互作用分离生化混合物的方法，所述高度特异性相互作用比如抗原与抗体、酶与底物或受体与配体之间的高度特异性相互作用。亲和色谱法是一种色谱实验室技术，其用于通过利用分子特性(例如细胞表面标志物的表达)来纯化混合物中的生物分子或细胞亚群。配体，如比如抗体或其片段、酶和/或其他蛋白质的生物大分子，通过若干不同类型的键和相互作用以高特异性与其他分子相互作用。此类相互作用包括氢键合、离子相互作用、二硫键、疏水相互作用等等。亲和色谱法的高选择性是通过使所需分子与固相相互作用并被捕获在色谱柱内以便与不需要的物质相分离而产生的，所述不需要的物质不会相互作用并被最先洗脱。在本发明的优选实施方案中，所述分离步骤包括亲和色谱法。

在本发明进一步的实施方案中，将流式细胞术用于纯化源自PSC/iPSC/ESC的细胞群。在本发明的优选实施方案中，所述分离步骤包括流式细胞术。除了将流式细胞术用于如表面标志物的表达的检测，还可以将其与允许分离某些亚群的装置组合并通常被称为荧光激活细胞分选(FACS)。FACS提供了一种根据每个细胞的特定光散射和荧光特性将生物细胞的异质混合物一次一个细胞地分选至两个或更多个容器中的方法。由于FACS提供了快速、客观和定量的来自单个细胞的荧光信号的记录以及对特定目标细胞的物理分离，因此是一种有用的科学仪器。

细胞悬液被夹带在狭窄、快速流动的液体流的中心。该流动被布置成使细胞之间相对于它们的直径而言具有很大的间隔。振动机制使细胞流分裂成单个液滴。调整系统以使每个液滴有一个以上细胞的可能性很小。就在流分裂成液滴之前，流通过荧光测量站，在该处测量每个目标细胞的荧光特性。将充电环恰好定位于流分裂成液滴的位置。在测量荧光强度之前，立即将电荷置于环上，当液滴从流中破裂时，相反的电荷会被捕获在液滴上。然后，带电的液滴下落通过静电偏转系统，该静电偏转系统根据液滴的电荷将液滴转移到容器中。在一些系统中，将电荷直接施加到流中，并且破裂的液滴会保留与流相同符号的电荷。然后，在液滴破裂后，流返回为中性。为了检测特定亚群，配体(优选抗体)包含标记，优选地包含如本文所述的荧光标记。如果每个细胞表面标志物用不同的标记来标记，则可以将本文所述的不同细胞群进行区分，由此富集所需的亚群。

为了分离细胞群的特定亚群，可以采用总结于以下实施方案中的磁性细胞分选(MACS)：在一个实施方案中，将配体固定在捕获介质上。优选地，所述捕获介质包括珠子，在特别优选的实施方案中，所述珠子是磁性的。在优选的实施方案中，配体与磁珠缀合。

在一个实施方案中，本文所述的配体、试剂和/或抗体直接或间接地与磁性试剂缀合。“磁性试剂”是能够通过直接/共价或间接偶联与配体反应的颗粒。如本文所用，“磁性试剂”中的术语“磁性”是指可以用本领域技术人员熟知的方法制备的磁性颗粒的所有亚型，所述磁性颗粒特别是铁磁性颗粒、超顺磁性颗粒和顺磁性颗粒。优选地，磁性试剂为磁珠。如本领域已知的，通过使用各种化学连接基团实现与磁性试剂的直接缀合。在一些实施方案中，通过侧链氨基或巯基基团和杂官能交联剂(heterofunctional cross-linkingreagent)将抗体与磁性试剂偶联。大量杂官能化合物可用于与实体连接。例如，至少可以将3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)与抗体上的反应性巯基和磁性颗粒上的反应性氨基一起使用。磁分离装置的实例在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438520中进行了描述。可以将纯化的细胞群收集在任何合适的培养基中，优选地是StemMACS IPS Brew(Miltenyi-Biotec)。然后可以将胰腺祖细胞接种在StemMACS IPS-Brew培养基中以进行进一步分化。

在本发明的一个实施方案中，将磁性细胞分选用于分离细胞群的亚群。磁性地分离细胞的方法可从如Invitrogen、Stem cell Technologies、西雅图的Cellpro或波士顿的Advanced Magnetics商购获得。例如，单克隆抗体可以直接偶联至如Dynal M 450的磁性聚苯乙烯颗粒或类似的磁性颗粒，并用于如细胞分离。Dynabeads技术并不基于色谱柱，而是这些带有附着细胞的磁珠在样品管中具有液相动力学，并且通过将样品管放在磁性架上来分离细胞。但是，在用于从样品中富集、分选和/或检测细胞的优选实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与具有如多糖的有机涂层的胶体超顺磁性微粒结合使用(磁激活细胞分选技术(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach))。这些颗粒(纳米珠或微珠)可以直接与单克隆抗体或其抗原结合片段缀合，也可以与抗免疫球蛋白、抗生物素蛋白或抗-半抗原特异性微珠结合使用。技术允许通过将细胞与涂布了针对特定表面抗原的抗体或其抗原结合片段的磁性纳米颗粒一起温育来分离所述细胞。从而表达该抗原的细胞附着在磁性纳米颗粒上。之后，将细胞溶液转移到置于强磁场中的色谱柱上。在此步骤中，(表达抗原的)细胞附着在纳米颗粒上并停留在色谱柱上，而(不表达抗原的)其他细胞则流出。采用这种方法，可以相对于特定抗原阳性地或阴性地分离细胞。在阳性选择的情况下，在将色谱柱从磁场中移出之后，将表达目标抗原的细胞(附着在磁柱上)洗出至另一个容器中。在阴性选择的情况下，所使用的抗体针对已知存在于非目标细胞上的表面抗原。在将细胞/磁性纳米颗粒溶液施加到色谱柱上之后，表达这些抗原的细胞会结合到色谱柱上，并收集流出的级份，因为该级份中含有目标细胞。由于这些细胞没有被偶联至纳米颗粒的抗体标记，因此它们是“未受影响的(untouched)”。该过程可以使用直接磁性标记或间接磁性标记来实施。对于直接标记，将特异性抗体直接偶联至磁性颗粒。当无法或无需直接磁性标记时，间接标记是一种方便的选择。可以将针对任何细胞表面标志物的一抗、特异性单克隆或多克隆抗体、一抗的组合用于该标记策略。所述一抗可以是未缀合的、生物素化的或荧光团缀合的。然后采用抗-免疫球蛋白微珠、抗-生物素微珠或抗-荧光微珠实现磁性标记。上述过程也可以在比如(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)或Prodigy(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)的封闭系统中进行。

如本文所用，术语“封闭系统”是指在实施比如新材料的引入的培养过程以及实施比如细胞增殖、分化、活化、遗传修饰和/或分离的细胞培养步骤的同时降低细胞培养污染风险的任何封闭系统。此类系统允许在GMP或类GMP条件(“无菌”)下操作，从而产生可应用于临床的细胞组合物。封闭系统的一个实例是CliniMACS(Miltenyi BiotecGmbH,Germany,WO2009/072003)。

如本文所用，术语“自动化方法”或“自动化过程”是指通过使用设备和/或计算机和计算机软件实现自动化的任何过程，而所述设备和/或计算机和计算机软件将由或可以由操作员手动实施。已经自动化的方法(过程)需要付出更少人工干预和更少人工时间。在一些情况下，如果方法的至少一个步骤是在没有任何人工支持或干预的情况下实施的，则该方法是自动化的。优选地，如果所述方法的所有步骤均是在没有人工支持或干预的情况下实施的，则该方法是自动化的。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的纯化胰腺祖细胞的方法得到细胞组合物，包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的胰腺祖细胞，所述胰腺祖细胞为CD51和/或CD177阳性。在优选的实施方案中，所述组合物包含至少50％的CD177-阳性细胞。随后可将该种组合物用于产生胰腺β细胞。优选地，包含在组合物中的细胞(优选胰腺祖细胞)为人的。在进一步的实施方案中，所述组合物包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的CD275-阴性胰腺祖细胞。在优选的实施方案中，所述组合物包含至少50％的胰腺祖细胞，所述胰腺祖细胞为CD275阴性。优选地，包含在组合物中的细胞为人的。

在另一实施方案中，所述胰腺祖细胞的组合物包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的CD275-阳性细胞。在针对肝脏特异性细胞表面标志物CD275进行分类的该特定实施方案中，胰腺祖细胞不得不被视为肝祖细胞。因此，可以将此类组合物用于产生肝谱系细胞。因此，本发明还涉及一种纯化肝祖细胞的方法，包括：

(a)将源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含肝祖细胞的细胞群暴露于结合肝祖细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD275，和

(b)使所述肝祖细胞与源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化所述肝祖细胞。

优选地，所述纯化肝祖细胞的方法包括另一步骤，即将所述细胞群暴露于结合CD51和/或CD177的配体的步骤。

优选地，根据本发明的方法用于纯化肝祖细胞的结合CD51、CD177和/或CD275的配体为抗体或其结合片段。

优选地，用于根据本发明的纯化肝细胞的方法中的结合CD51、CD177和/或CD275的抗体或抗体片段为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选地，根据本发明的方法结合CD51、CD177和/或CD275并用于纯化肝祖细胞的配体与标记缀合。

优选地，根据本文所述的纯化肝祖细胞的方法，通过定量聚合酶链反应(qPCR)和/或流式细胞术检测所述细胞表面标志物CD51、CD177和/或CD275的表达。

优选地，纯化肝祖细胞的方法的分离步骤包括亲和色谱法和/或流式细胞术。

优选地，根据本发明的方法纯化的肝祖细胞为人的。

优选地，将根据纯化肝祖细胞的方法中或本文所述的肝祖细胞的组合物中使用的配体固定在捕获介质上。优选地所述捕获介质包括珠子，和/或优选地将所述配体缀合至磁性试剂。

优选地，根据本发明的纯化肝祖细胞的方法得到一种细胞组合物，该细胞组合物包含至少50％的肝祖细胞。

优选地，根据纯化肝祖细胞的方法纯化的组合物包含至少50％的CD275阳性的肝祖细胞。优选地，本文所述的组合物的肝祖细胞被结合至配体，所述配体结合肝祖细胞上的CD275。根据本发明的方法纯化的肝祖细胞的组合物和/或结合至结合所述肝祖细胞上的CD275的配体的所述组合物的肝祖细胞优选地为人的。

此外，本发明涉及一种结合肝祖细胞上的细胞表面标志物的配体用于从源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的细胞群中纯化肝祖细胞的用途，其中所述细胞表面标志物为CD275。

本发明还涉及一种试剂盒，包含结合CD275的配体和用于将多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为肝祖细胞群的手段。

在本发明的优选实施方案中，包含在通过本发明的方法产生的组合物中的胰腺祖细胞被结合至结合所述细胞表面上的CD51、CD177和/或CD275的配体。优选地，所述组合物的胰腺祖细胞被结合至结合所述细胞表面上的CD177的配体。在更优选的实施方案中，包含在所述组合物中的细胞为人的。

在另一实施方案中，本发明涉及一种结合细胞表面标志物的配体用于从源自PSC/iPSC/ESC的群和/或组合物中纯化胰腺祖细胞的用途。优选地，所述表面标志物为CD51、CD177和/或CD275。可以存在一种或多种表面标志物。更优选的表面标志物是CD177。一个优选的实施方案涉及一种结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体用于从源自PSC/iPSC/ESC的细胞群中纯化胰腺祖细胞的用途，其中所述细胞表面标志物为CD177。

在又一实施方案中，本发明涉及一种结合细胞表面标志物的配体用于纯化胰腺祖细胞的用途，其中所述细胞表面标志物为CD51、CD177和/或CD275，优选地为CD177，包括以下步骤：

(a)将源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含胰腺祖细胞的细胞群暴露于结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD177，和

(b)使所述胰腺祖细胞与源自多能干细胞、诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化所述胰腺祖细胞，

其中优选地所述胰腺祖细胞在表面包含CD177。

试剂盒

本发明还涉及一种试剂盒，包含结合CD177的配体和用于将多能干细胞(PSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和/或胚胎干细胞(ESC)分化为能够以葡萄糖浓度依赖的方式产生胰岛素的定形内胚层(DE)、胰腺祖细胞(PP1和/或PP2)和/或胰腺β-细胞群的手段。

如本文所用，“用于将…分化的手段”或“用于分化的手段”包括能够诱导多能干细胞(PSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和/或胚胎干细胞(ESC)向能够以葡萄糖浓度依赖的方式产生胰岛素的DE、PP和/或胰腺β-细胞群分化的不同细胞培养基——基础培养基或补充培养基。

在本文中，“基础培养基”是指有效地支持培养物中细胞生长的氨基酸、维生素、盐和营养物的溶液，尽管通常情况下需要补充其他化合物，否则这些化合物将不支持细胞生长。所述营养物包括可以被细胞代谢的碳源(优选地为糖，更优选地为葡萄糖)以及细胞存活所必需的其他化合物。这些是细胞本身无法合成的化合物。技术人员已知许多不同的基础培养基。本发明提及的优选的基础培养基为MCDB 131培养基、IPS-Brew培养基和/或BLAR培养基。

在优选的实施方案中，基础培养基补充有不同的生长和分化刺激因子以形成“补充培养基”。技术人员已知各种补充剂。优选的补充剂列于下表1：

表1：优选的补充剂组和所述组的优选成员

通过将基础培养基与技术人员已知的一种和/或多种补充剂(优选地为表1中的那些)组合可以产生补充培养基。在另外的实施方案中，可以使用用于添加到基础培养基中的预混合的补充剂。另一实施方案包括干粉形式的便利混合物或补充成分，其可以通过添加液体(优选为水)而形成补充培养基。在一些实施方案中，根据本发明的试剂盒可以包含基础培养基、补充培养基和/或预混合的补充剂。

在优选的实施方案中，试剂盒含有以上教导的组分，如，至少一种结合样品中的细胞靶标的可溶性配体；至少一种结合样品中可溶性分析物的或至少一种竞争可溶性分析物(优选地为标记的)的可溶性配体；和直接与可溶性分析物结合的、间接与可溶性分析物结合的或与结合所述可溶性分析物的配体结合的固相捕获介质。所述试剂盒还包括用于实施特定分析的说明书、各种稀释剂和缓冲液以及产生信号的试剂，比如荧光团、酶底物、辅因子和色原体。其他组分可以包括用于比色比较的指示图、一次性手套、去污说明、涂抹棒或容器以及样品制备杯。

在另一个实施方案中，能够诱导多能干细胞(PSC)、诱导多能干细胞(iPSC)和/或胚胎干细胞(ESC)向能够以葡萄糖浓度依赖的方式产生胰岛素的DE、PP和/或胰腺β-细胞群分化的细胞培养基为StemMACS IPS-Brew培养基(Miltenyi-Biotec)。采用该种补充了用于胰腺β-细胞分化的细胞因子的细胞培养基，可以使用胚状体形式来使PSC/iPSC/ESC分化。

在一个实施方案中，可用于进行上述免疫分析的试剂盒包括，作为一个组件，与多个结合细胞标志物或靶标的第一配体关联的固体基质或固相捕获介质，所述第一配体与第一可检测标记关联。所述试剂盒进一步包括能够结合第二、第三和/或第四细胞标志物或靶标和/或可溶性分析物的第二、第三和/或第四配体。所述第二、第三和/或第四配体与所述第二、第三和/或第四可检测标记关联。

此类试剂盒可用于评估PSC/iPSC/ESC群和/或源自PSC/iPSC/ESC的细胞群样品，以富集、分离、耗竭、隔离、分选、纯化和/或测定某些细胞类型或其结合的组分或可溶性抗原或分析物的水平。此类诊断试剂盒包含本文所述实施方案的染料、配体、捕获介质和其他组分。此类试剂盒还包含标记，如上所示，该标记预先附着于将进行的特定分析的其他组分上，或单独提供以附着于所选组分如底物上。可选地，此类试剂盒可包含此类组合物的简单混合物或用于制备简单混合物的手段。

参考文献

本文所引用的全部文件和专利文本的内容通过引用的方式全文并入本文。

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实施例

下列实施例阐释了本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。包括所述实施例用于说明性目的，本发明的范围仅由权利要求限定。

材料和方法

除非另有说明，否则使用以下方法和材料：

细胞来源

在知情同意下，从Rudbecklaboratoriet C11(瑞典乌普萨拉)获得了人胰岛。从WiCell Research Institute，Inc.(Madison,WI)获得了H9 hESC系。自澳大利亚干细胞中心(维多利亚州克莱顿)获得了Mel1-NKX6.1-GFP和Mel1-INS-GFP。在实验室中从MODY-4患者的对照组中生成了附加型(episomal)重编程的iPSC系(Gibco Human Episomal iPSC,Cat#A18945,Life Technologies,CA)。两种细胞系均已通过细胞系遗传学(Madison,WI)进行了鉴定，并通过使用Lonza MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza,Cat#LT07-418)确认不含支原体。在Robert Koch Institute的许可下使用hES细胞系。

人多能干细胞向胰腺β-样细胞的体外分化。

在StemMACS iPS-Brew培养基(Miltenyi Biotech，德国，Cat#130-104-368)中于1:30稀释的Geltrex(Invitogen,U.K,Cat#A1413302)上培养H9、Mel1-NKX6.1-GFP和iPSC。在～70-80％汇合时，将培养物用不含Mg²⁺和Ca²⁺的1x DPBS(Invitrogen,Cat#14190)冲洗，然后用0.5mM EDTA(Applichem,Cat#12604-021)在37℃下温育2-3min。将单个细胞用iPS-Brew冲洗并在1,300r.p.m.下旋转3min。将得到的细胞沉淀物悬浮在补充有Y-27632(10μM；Sigma-Aldrich；MO,Cat#Y0503)的iPS-Brew培养基中，并将单个细胞悬液以～1.5-2×10⁵个细胞/cm²的浓度接种在涂布Geltrex的表面。每天用iPS-Brew培养基饲养培养物，并在接种后24小时开始分化，从而得到～90％的起始汇合。在第一天，采用补充有0.5％ BSA(Sigma,Cat#10775835001)、100ng/ml激活素A(Peprotech,Cat#120-14-300)和25ng/mlWNT3A(Peprotech,Cat#315-20)的MCDB131培养基，将细胞分化为定形内胚层。在随后的两天，将细胞用补充有0.5％ BSA、100ng/ml激活素A的MCDB131处理。对于向β细胞的分化，使用了Rezania等2014的β-细胞分化方案¹⁴。简言之，采用补充有0.5％ BSA、50ng/ml的FGF7(Peprotech,Cat#100-19-100)和0.25mM Vit.C(Sigma,Cat#120-14-300)的MCDB131将细胞向原始肠管分化2天。对于向后前肠的分化，将所述细胞进一步暴露于补充有1xGlutamax(Gibco,Cat#A12860-01)、2％ BSA(Cat#10775835001)、0.25mM Vit.C(Sigma,Cat#A4544-25G)、50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1(Sigma,Cat#S4572-5MG)、1μM视黄酸(Sigma,Cat#R2625-50MG)、100nM LDN193189(Sigma,Cat#04-0074)、1:200ITS-X(Gibco,Cat#51500-056)和200nM TPB(Merk Millipore,Cat#565740-1MG)的MCDB131培养基达2天。仅对于WNT抑制实验，将1.25μM IWP2(Tocris,Cat#3533-10)添加到培养物中。然后采用补充有1xGlutamax、10mM葡萄糖终浓度、2％ BSA、0.25mM Vit.C、2ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1、0.1μM视黄酸、200nM LDN193189、1:200ITS-X和100nM TPB的MCDB131将所述细胞进一步向胰腺内胚层分化3天。对于胰腺内分泌腺前体的诱导，将细胞随后暴露于补充有1xGlutamax、20mM葡萄糖终浓度、2％BSA、0.25μM SANT-1、0.05μM视黄酸、100nMLDN193189、1:200ITS-X、1μM T3(Sigma,Cat#T6397-100MG)、10μM ALK5抑制剂II(Enzolife sciences,Cat#ALX-270-445-M005)、10μM硫酸锌(Sigma,Cat#SI Z0251-100G)和10μg/ml肝素(Sigma,Cat#H3149)的MCDB131培养基达3天。通过将最后一步的内分泌腺祖细胞暴露于仅在前7天补充有1xGlutamax、20mM葡萄糖终浓度、2％ BSA、100nM LDN193189、1:200ITS-X、1μM T3、10mM ALK5抑制剂II、10μM硫酸锌、100nMγ分泌酶抑制剂XX(Merck,Cat#565789)的MCDB131和在7-15天补充有10μg/ml肝素的MCDB131来产生激素阳性细胞。对于β-样细胞的成熟，将来自前一阶段的细胞用2％ BSA、1:200ITS-X、1μM T3、10μM ALK5抑制剂II、10μM硫酸锌、1mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma,Cat#A9165)、10μM Trolox(EMD,Cat#648471)、2μM R428(SelleckChem,Cat#S2841)和10mg/ml肝素处理15天。

分选ADE亚群

在分化的第4天(DE/ADE)，收集分化的样品并进行表面标志物染色。对于表面标志物染色，向在100μl体积的MCDB1+0.5％ BSA中的每1x10⁶个细胞添加10μl(与APC缀合的)Ab。将细胞在冰上于黑暗中染色15分钟。对于抗体的磁性标记，将染色的细胞用3x PBS洗涤以移除抗体，然后悬浮在80ml MCDB131+0.5％ BSA培养基中，该培养基具有每10Mio总细胞的20μL抗APC微珠。将细胞在37℃下温育15分钟。将细胞用1-2ml PBS洗涤，然后将多达20x10⁶个细胞悬浮在500μL MCDB131+0.5％ BSA中，并进行磁性分选。对于ADE亚群的磁性分选，将LS色谱柱放在磁性分选机中。用3ml PBS冲洗所述色谱柱。将细胞悬液施加于所述色谱柱并将含有未标记细胞的流出液弃去。然后将色谱柱用3ml PBS洗涤3次。通过将色谱柱从分离器中移出并用5ml培养基冲洗来收集抗体阳性细胞。然后将细胞以在超低附着圆底96孔板的1个孔中2-10x10³个细胞的接种密度接种到补充有10μMY-化合物的iPS-Brew培养基中，以在IBID室的1个孔中形成聚集体或4x10⁵个细胞用于进一步分化和染色。

定量qPCR分析和基因谱

通过Taqman阵列(Applied Biosystems)评估分化细胞中的基因表达。将数据用Expression Suite软件(Applied Biosystems)分析，并用ΔΔCt方法相对于未分化的hESC标准化。

免疫荧光染色和蛋白质印迹

对于免疫细胞化学，将细胞或聚集体固定在4％ PFA中。然后用在封闭缓冲液中的0.5％皂苷使细胞透化。对于蛋白质印迹，在分选后将细胞直接在RIPA缓冲液中解离。将细胞裂解物通过SDS-PAGE分辨，转移至PVDF膜(Biorad)，并与抗体一起温育。使用与HRP缀合的抗体和化学发光试剂(Millipore)使蛋白条带可视化。用ImageJ将所述条带量化。

流式细胞术分析

将hESC和分化的细胞解离并制备单个细胞悬液。将细胞固定、透化并对DE、胰腺内胚层、胰腺祖细胞和激素阳性标志物染色。使用同种型抗体确定FACS门控。

静态葡萄糖刺激胰岛素分泌

基于先前描述的方案^14,56实施生成的β-样细胞的静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。简言之，挑选5个聚集体(总共1,00,000个细胞)并用KRBH缓冲液(在去离子水中并无菌过滤的129mM NaCl、4.8mM KCl、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₂、1mM Na₂HPO₄、1.2mMKH₂PO₄、5mM NaHCO₃、10mM HEPES和0.1％ BSA)冲洗三次，然后在KRBH缓冲液中于37℃下平衡1小时。然后将聚集体在掺有2.8mM葡萄糖的KRBH缓冲液中于室温下温育60min。收集上清液并将聚集体转移至掺有16.7mM葡萄糖的KRBH缓冲液中达60分钟。再次收集上清液。在实验结束时，将细胞聚集体解离为单个细胞，并计细胞数量以使GSIS标准化。采用Mercodia人胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia,Cat#10-1113-01)按照制造商的方案测量上清液样品中的胰岛素含量。

Affymetrix微阵列分析

对于基因谱，使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Cat#217004)提取总RNA，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent RNA6000Pico试剂盒)检查RNA完整性并仅将高质量RNA(RIN>7)用于微阵列分析。采用Ovation Pico WTA V2系统与Encore生物素模块(Nugen)组合扩增总RNA(5ng)。将扩增的cDNA在Affymetrix人基因ST 2.0阵列(Affymetrix,902113)上杂交。根据包括Encore Biotion方案中建议的少量修饰的Affymetrix表达方案进行染色和扫描(GeneChip Scanner 3000 7G)。将表达控制台(v.1.4.1.46,Affymetrix)用于质量控制。使用Bioconductor软件包在R中执行全部后续计算分析。使用oligo软件包(版本1.42.0)对表达数据进行RMA标准化，并使用软件包hugene20sttranscriptcluster.db(版本8.7.0)对探针集进行注释。使用limma软件包(版本3.34.9)实施差异表达分析，并通过Benjamini-Hochberg校正对P值进行多项测试调整。如果原始p值在阈值0.01以下，且倍数变化大于或等于1.5，则认为基因差异表达。使用HOMER⁵⁷进行功能富集。所有微阵列数据均可依据登录号GSE113791在GEO获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE113791)。

图像分析

用Leica SP5共聚焦显微镜和Zeiss LSM 880Airy Scan共聚焦显微镜采集图像。使用Leica LAS AF Lite分析由Leica共聚焦拍摄的图像。使用Zeiss Zen Blue软件分析由Zeiss共聚焦显微镜拍摄的图像。

统计分析

所有值均以平均值±S.D表示。除非另有规定，否则进行三次独立的实验。将统计显著性定义为P<0.05。图例中提供了样本量。全部统计均采用GraphPad Prism软件7(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)进行。如每个实验所示，使用未配对或配对的t-检验来比较值。简言之，使用未配对的t-检验对整个分化过程中(S1-S7)的基因表达进行分析。使用未配对的双尾t-检验比较源自CD177的β-样细胞和源自CXCR4的β-样细胞之间的激素含量。所有qPCR数据均通过未配对的双尾t-检验进行比较。使用单因素方差分析(oneway ANOVA)来比较源自CXCR4、CD177和CD275 ADE细胞的PDX1⁺细胞的表达水平。在研究中，研究人员没有对治疗组采取盲法，也没有使用统计检验来确定样本量。

实施例1：富集不同定形内胚层的新型表面标志物抗体的识别

本方案的主要假设是寻找可以富集定形内胚层(DE)中不同亚群的新型表面标志物。已知在体内DE是采用TGFβ和Wnt3A的梯度信号进行模式化(patterned)的，然后该模式化(patterning)又产生了各种器官。第一个目的是研究这种模式化效应是否也存在于体外。对于首次实验，将FOXA2和CXCR4、两个已知的DE标志物用于评估分化过程。

对于在体外产生DE，将hESC在IPS-Brew培养基(全能培养基)中在无加料条件下的geltrex上培养直至汇合。随后，在第1天将培养基更换为补充有20ng/ml Wnt3a和100ng/mlAA的分化培养基(MCDB1+1x glutamax+0.5％ BSA)。从第2天至第4天，将细胞用补充有100ng/ml AA的分化培养基处理。分化的示意图示于图1A。

次日，将细胞用EDTA胰蛋白酶消化，并以200,000个细胞/孔的接种密度铺在Miltenyi板上从而采用表面抗体和CXCR4于室温下在黑暗中进行第一次染色达15分钟。15分钟后，将细胞用PBS洗涤，然后用4％ PFA固定以进行细胞内FOXA2染色。然后在30分钟内用0.5％ TritonX连同封闭溶液对细胞进行透化，随后向细胞中加入FOXA2一抗达1小时。随后进行第二抗体染色30分钟，然后洗涤细胞，并使用Miltenyi Biotec的MACS Quant进行FACS分析。图1B示出了用于识别新型表面标志物的筛选设置，相对于已知DE标志物FOXA2和CXCR4，所述新型表面标志物可以富集不同DE亚群。将两个标志物——CD177和CD275——识别为不同DE亚群的标志物(图1C)。

为了检查新型抗体在DE中的分布，使用上述方案使hESC首先向DE分化，然后对细胞进行CD177或CD275以及FOXA2和SOX17或CXCR4的染色(FOXA2、SOX17和CXCR4均标记DE)。使用FACS对DE中CD177或CD275标记的细胞进行定量。结果表明，在CXCR4⁺和FOXA2⁺/SOX17⁺DE群中，CD177和CD275为不同的ADE亚群(图1D)。

对于PCA(主成分分析)，使用上述分化方案使hESC首先向DE分化4天，然后将细胞用CD177、CD275和CXCR4(对照)染色并采用磁性标记(Miltenyi Biotech)进行分选，使用制造商的方案从细胞中分离RNA。采用Affymetrix阵列在Helmholtz Zentrum上进行了微阵列分析。PCA分析显示CD177、CXCR4和CD275亚群之间存在显著的分子差异(图1E)。这在GO分析中更为明显：在GO分析中这些亚群还显示了信号传导通路的差异表达(图1F)。

实施例2：非经典WNT/PCP通路在CD177⁺亚群中受差异化调节

为了进一步表征DE亚群，使hESC细胞向DE分化，然后在将细胞用CD177、CD275和CXCR4染色后，用MACS对细胞进行分选。然后将这些细胞进行微阵列、qPCR定量和蛋白质印迹，以找出亚群中的特异性差异。图2A示出了示出分化和分选的示意图。

首先检查了定形内胚层标志物FOXA2和SOX17的总RNA水平。在亚群之间未观察到FOXA2和SOX17水平的差异。随后，分析了比如Cerberus1(CER1)和HHEX(造血表达的同源盒蛋白)的前定形内胚层标志物(ADE)。在体内，所形成的DE内胚层随后模式化为前(anterior)侧和后(posterior)侧。前侧产生诸如肺、肝和胰腺的器官，而后侧产生肠。由于本发明的上下文中更关注胰腺，因此仅检查了ADE标志物CER1和HHEX。观察到，CD177⁺DE富集了CER1亚群，而CD275⁺DE富集了HHEX亚群，而CXCR4⁺DE标记了整个DE(图2B)。

然后，基于微阵列分析了在这些亚群中受差异化调节的不同信号传导通路。发现，与CD275⁺DE和CXCR4⁺DE亚群相比，在微阵列中CD177⁺DE亚群中WNT/PCP通路的靶基因(比如DVL2、ROR2和JNK)均高度表达(图2C)。在由MACS富集的CD177、CD275+和CXCR4+群的三向比较中的基因本体论(GO)和差异化基因表达分析表明，富集的基因与参与调控内胚层模式化的通路和增殖以及胰腺细胞命运特化(specification)有关(图7A-D)。这些包括活化的FGFR1通路的TGF-β下游信号传导的正向调节、MAPK级联的正向调节、视黄酸(RA)介导的信号传导以及经典和非经典WNT/平面细胞极性(PCP)信号传导的调节。这些基因的qPCR定量显示，与CXCR4+DE和CD275+DE相比，CD177+DE中的所有WNT/PCP信号传导组分(比如DVL2、ROR2、WNT5a和WNT4)均显著表达，表明了CD177+DE中有活跃的WNT/PCP信号传导(图2D、2E)。CD177+DE中WNT/PCP信号传导的靶标JNK的磷酸化证实了这些细胞中WNT/PCP通路的活化(图2F和图2G)。相对而言，在CD275+ADE亚群中经典配体WNT3A及其靶基因AXIN2的表达上调(图7E)。β-连环蛋白的核易位是经典WNT活化的标志，因此，本发明人通过分离的亚群中免疫荧光和核组分分析，测试了β-连环蛋白在细胞核和细胞质中的分布。在CD275+和CXCR4+群的核组分中观察到了β-连环蛋白的积累(图7F)，其中在CD275+ADE亚群的免疫荧光染色中核积累的迹象明显(图4D)。这些结果表明，CD275+ADE祖细胞接受经典WNT-β-连环蛋白信号传导并可能特化为肝命运，而CD177+ADE祖细胞接受非经典的WNT/PCP信号传导，并且可能特化为胰腺命运。

实施例3：亚群的富集可以区分腹侧和背侧胰腺祖细胞

由于已知WNT/PCP通路在胰腺发育过程中起主要作用，因此决定在体外胰腺发育的各个阶段寻找这些不同的DE亚群的潜力差异。为此，将hESC向DE分化，然后使用新型抗体分选CD177⁺、CD275⁺和CXCR4⁺DE亚群。然后采用Rezania等2014的方案将这些亚群先进一步分化为原始肠管，然后分化为胰腺祖细胞(PP)。图3A示出了实验示意图。

在体内，在胰腺发育过程中，原始肠管产生腹侧前肠内胚层和背侧前肠内胚层。所述腹侧前肠内胚层产生肝和胰腺祖细胞，而背侧前肠内胚层仅产生胰腺祖细胞。SOX17是腹侧前肠内胚层的标志物。观察到，在CD177⁺细胞中，SOX17的表达在DE阶段达到峰值，并随着细胞进入原始肠管而下降。有趣的是，在CD177⁺细胞中，随着分化向胰腺祖细胞阶段进展，SOX17的表达逐步下降。然而，在DE阶段最初达到峰值后的CD275⁺和CXCR4⁺细胞中，SOX17的表达在原始肠管中下降，然后在胰腺祖细胞形成过程中得以维持，这表明与CD177⁺细胞相比，CD275⁺和CXCR4⁺细胞产生更多腹侧前肠内胚层细胞(图3B)。将PDX1表达用作对照以评估胰腺祖细胞的分化。图3E中的FACS数据证明与CD275⁺和CDCR4⁺细胞相比，CD177⁺细胞中的SOX17表达更低。

为了区分CD177⁺细胞是否产生更多的背侧胰腺祖细胞，采用qPCR评估了腹侧(图3C)和背侧胰腺基因(图3D)。与CD275⁺和CXCR4⁺细胞相比，在CD177⁺细胞中观察到了显著更高的背侧胰腺标志物水平，所述标志物比如运动神经元和胰腺同源盒1(MNX1)、Patched 1(PTCH1)和Noggin(NOG)——表明CD177⁺细胞产生背侧胰腺组细胞，而CD275⁺和CXCR4⁺细胞产生腹侧胰腺祖细胞。

实施例4：CD177⁺亚群是特化的胰腺祖细胞，而CD275+亚群是肝源性祖细胞

如上图所示，CD275⁺和CXCR4⁺细胞产生了腹侧胰腺祖细胞，而CD177⁺细胞产生了背侧胰腺祖细胞，由此决定检查这些亚群中的肝脏特征(signature)。为此，将细胞首先向DE分化，然后根据抗体进行分选，然后采用Rezania等2014的方案将这些细胞进一步向胰腺祖细胞阶段分化。图4A中描绘了该实验设置的概况。

在向胰腺祖细胞阶段的分化后，将总RNA分离并转录为cDNA，以进行qPCR分析。mRNA定量显示，与CD177⁺(图4B)相比，在CD275⁺和CXCR4⁺细胞中比如HHEX、TTR和AFP的肝祖细胞标志物基因显著上调，而胰腺祖细胞标志物PDX1在CD177⁺细胞中表达更多(图4B、C)，从而使我们相信CD275⁺和CXCR4⁺细胞产生腹侧前肠内胚层，然后产生腹侧胰腺和肝脏，而CD177⁺细胞产生背侧前肠内胚层和背侧胰腺祖细胞。

由于与脱离细胞周期的胰腺祖细胞相比肝细胞是高度增殖的，因此我们分析了β-连环蛋白或WNT3A特征的表达以及这些特定亚群的细胞周期概况。WNT3A信号传导通路增强了细胞的增殖。对于肝脏祖细胞尤其如此。β-连环蛋白的代表性免疫荧光染色显示β-连环蛋白在CD177⁺细胞中向膜易位，而在CD275⁺中则更多地定位于细胞核和细胞质中(图4D)。图4E中示出了CD275⁺和CD177⁺细胞的代表性FACS图和图形分析，所述细胞进行PI染色以显示细胞周期状态。通常，观察到产生肝脏祖细胞的CD275⁺细胞是高度增殖的亚群，其大部分细胞处于周期S阶段，而产生胰腺祖细胞的CD177⁺细胞则脱离细胞周期，其大多数细胞处于G1阶段(图4F)，这支持了我们的假设。

实施例5：CD177⁺DE在体外产生致密、成熟的单激素β细胞

已知在DE的CD177⁺亚群中WNT/PCP通路是活化的，因此进一步检查了这些细胞向胰腺β-细胞的分化潜力。已经证明，活化的WNT/PCP通路有助于体内胰腺β-细胞的形成和成熟。因此，使hESC向DE分化，采用CD177和CXCR4(CD184)进行分选，然后采用Rezania等2014的方案使这些细胞进一步向胰腺β-细胞分化。图5A示出了该实验设置的概况。

在第6阶段，收集细胞用于mRNA定量和FACS。对于FACS，将细胞用胰腺转录因子PDX1和NKX6.1染色。观察到，与CXCR4⁺细胞相比，CD177⁺细胞产生更多的PDX1⁺/NKX6.1⁺细胞(图5C)。更有趣的是，当对激素胰岛素(INS)和胰高血糖素(GLU或GCG)染色时，发现大多数CD177⁺细胞为INS⁺，而大多数CXCR4⁺细胞则显示为INS⁺/GLU⁺，这表明CXCR4⁺细胞产生了大多数的多激素细胞，而CD177⁺细胞产生单激素β细胞(图5B)。

比如PDX1、NKX6.1、NKX2.2的胰腺转录基因的mRNA定量表明，这些基因在CD177⁺细胞中比在CXCR4⁺细胞中的表达更高。与CXCR4⁺细胞相比，CD177⁺细胞还显示出更高的INS表达和更低水平的GCG基因。最有趣的事实是，与CXCR4⁺β细胞相比，CD177⁺β细胞中的成熟标志物MAFA(MAF BZIP转录因子A)的表达更高。MAFA的该种表达与其在人胰岛中的表达水平相当，表明CD177⁺细胞中活化的WNT/PCP信号传导可以产生成熟的β-细胞(图5D)。

分选出的CD177⁺亚群的另一显著特征是，该亚群与CXCR4⁺细胞相比产生了小型致密结构。该种致密性还可以归因于CD177⁺细胞中活化的非经典WNT信号传导，该信号传导可以在细胞中建立顶-基底极性，由此有助于CD177⁺β细胞的成熟和自组织(图5E)。

实施例6：新型CD177⁺和CD275⁺ADE亚群的进一步分析

近来采用hESC研究了自组织和空间模式化。当在分化的第4天(D4)通过一种或两种标志物基因(即CXCR4或FOXA2/SOX17)进行测量时，当前的hESC分化方案诱导出定形内胚层(DE)的看起来同质的群(图6a-c)。为了研究内胚层分化是否为同质的，发明人使用了基于CXCR4(CD184)和c-KIT(CD117)标志物表达的荧光激活细胞分选(FACS)，并通过定量PCR(qPCR)分析了诱导的内胚层(图6b和6d-g)。令人惊讶地，发明人发现CD117仅标记CXCR4⁺内胚层的子集(63.3％)，并发现可以将CXCR4⁺/CD117⁺双阳性群分为CXCR4⁺/CD117高(21.3％)、CXCR4⁺/CD117中(15.4％)、CXCR4⁺/CD117低(26.6％)和CXCR4⁺/CD177-(15.3％)(图6b)。有趣的是，在分选的CXCR4+/CD117高至CXCR4+/CD117低亚群中，发明人发现了FOXA2与SOX17的相反表达水平(图6d、e)，并且在某些亚群中ADE标记物CERBERUS1(CER1)和HHEX的表达增加(图6f、g)。FoxA2和Sox17在小鼠原肠胚形成过程中沿内胚层中相反的A-P梯度表达。这些结果表明，内胚层是分子异质的，并且通过邻近细胞类型的相互作用在培养中获得某种模式信息，这与体内内胚层类似。

在XM001 hiPSC、H1 hESC和Mel1-NKX6.1-eGFP细胞系中，CXCR4⁺内胚层诱导效率达到90％，从中可以诱导多达1/3的CD275⁺或2/3的CD177⁺ADE细胞(图14A、B)。由于hiPSC细胞系优越的胰腺分化能力，因此将其用于进一步分析。当我们比较三个之前建立的内胚层诱导方案时，发明人观察到在几乎相同的CXCR4⁺DE诱导水平下，两个ADE亚群的诱导效率差异很大(图14C-G)。综上所述，这些结果表明发明人发现了两种新型表面标志物，其识别CXCR4⁺整体(bulk)内胚层群中的不同ADE亚群。值得注意的是，ADE分化效率取决于细胞系的化学诱导方案和遗传背景，这暗示了在分化的早期步骤中的质量控制保证提高分化效率，这可以通过采用本发明来完成。

为了进一步测试ADE分化效率是否可以在体外由形态发生素调节，发明人进行了抑制剂实验，其中他们在第一天通过WNT3A和激活素A(AA)诱导内胚层，然后分别采用小分子抑制剂DMH1和SB431542在内胚层分化期间调节BMP和/或TGF-β信号传导强度直至D4(图14H)。在标准分化期间，20ng/ml的WNT3A和100ng/ml的AA在整体CXCR4⁺DE群中诱导了35.5％ CD177⁺ADE和21％ CD275⁺ADE(图14I)。高水平的TGF-β信号传导(100ng/ml AA)和BMP抑制(4μM DMH1)使CD177⁺ADE从35％显著增加到80.5％，而CD275⁺ADE诱导则略有降低(14％)(图14J)。另一方面，低水平的BMP抑制剂(2.5μM DMH1)和TGF-β的抑制(1μMSB431542)有利于CD275⁺DE分化(54.0％)(图14K)，这表明在体外可以诱导不同数量和质量的ADE。

实施例7：CD177⁺亚群分化为胰腺祖细胞和CD275⁺亚群可以分化为肝脏祖细胞

发明人进一步详细研究了在源自iPSC的胰腺和内分泌腺的体外分化过程中表面标志物CXCR4、CD177和CD275的表达。CD177和CD275的表达在ADE启动和模式化期间达到峰值，并在肠管和胰腺祖细胞形成期间逐渐降低，在此期间CD177和CD275的表达几乎可忽略不计(图8E)。然而，在胰腺和内分泌腺分化期间直至源自iPSC的β-样细胞形成，发明人观察到了CXCR4的高表达。为了测试在CD177⁺和CD275⁺ADE亚群中细胞命运特化通路的差异活化是否会导致优先的谱系分配，发明人探索了向肝脏和胰腺命运的体外分化潜力。为了测试肝效力，发明人使分选的细胞向肝细胞³³分化，并测试了早期肝脏祖细胞基因AFP、TTR和HHEX的表达(图8G)。显著地，当与源自CD177⁺的祖细胞相比时，在源自CXCR4⁺和CD275⁺的早期肝脏祖细胞中HHEX、AFP和TTR的mRNA转录物的表达显著上调(图8G)。另一方面，当发明人测试胰腺分化效力时(图8A)，他们发现大约68.8％的CD177⁺ADE有效地分化为PP1阶段的PDX1⁺胰腺祖细胞，而只有50％的源自CXCR4⁺和42.3％的源自CD275⁺的内胚层细胞分化为PP1阶段(图8A)。此外，源自CD177⁺的PP1细胞在PP1阶段表达很高水平的PDX1(图8B、C)。免疫荧光分析证实了这些发现，表明对特化的ADE亚群的分选可以增强向胰腺命运的分化潜力(图8C、D)。发明人还分析了GATA6的表达，GATA6是富集细胞中胰腺发育的重要调节剂。与源自CXCR4⁺和CD275⁺的PP相比，源自CD177⁺的PP显示出GATA6和PDX1更加均匀(uniform)的表达(图9A)。为了排除其他10个源自内胚层的器官祖细胞的非定向产生，我们测试了肺(SOX2+)和肠(CDX2+)标志物，这些标志物在任何处于PP2阶段的分选亚群中均未表达(图10A)。此外，我们排除了将PTF1A作为标志物的胰腺外分泌分化(图10B)。综上，这些结果表明，CD177⁺ADE亚群更均匀且更有效地分化为胰腺谱系。

实施例8：在肠管模式化过程中抑制WNT3A分泌促进胰腺命运

为了测试抑制WNT分泌是否促进胰腺命运的诱导，我们富集了在DE阶段的CD275⁺、CD177⁺和CXCR4⁺亚群，并将它们以2D接种在涂布了Geltrex的培养皿中(图11A)。发明人采用了IWP2，其是一种选择性抑制棕榈酰化和Wnt配体分泌的Porcupine化学抑制剂。为了检查IWP2的添加是否影响ADE亚群向胰腺命运的总体分化，发明人在S2在原始肠管形成和模式化期间将IWP2添加到分选的ADE亚群中，然后在S4进一步向PP2分化(图11A)。在不含IWP2的标准分化条件下，PDX1⁺/NKX6.1⁺的FACS分析显示约75％的双阳性PP2细胞源自CD177⁺富集的ADE，而仅约30％是由源自CD275⁺的ADE产生的和约45％是由源自CXCR4⁺的DE产生的(图11B、C)。加入IWP2后，源自CXCR4⁺(75％)和CD275⁺(50％)的PDX1⁺/NKX6.1⁺PP2细胞的百分比急剧增加，这表明对WNT分泌的抑制促进了胰腺分化(图11B、D)。未观察到在源自CD177+的PP2中PDX1⁺/NKX6.1⁺双阳性PP2细胞的百分比差异，表明CD177⁺/CER1⁺ADE祖细胞不受经典WNT信号传导活化的影响，这与我们之前的结果一致。经典Wnt/β-连环蛋白通路的另一个标志是触发细胞增殖的细胞周期调节因子的活化。通过EdU脉冲标记在源自CD177⁺、CD275⁺和CXCR4⁺的PP中评估的细胞增殖表明，与50％的源自CD275⁺和60％的源自CXCR4⁺的PP相比，约15％的源自CD177⁺的PP是EdU⁺(图11E、F)。胰腺分化早期对NGN3的抑制对于降低表达胰岛素和胰高血糖素的多激素细胞的生成至关重要³⁹。因此，我们检查了S4时的源自CD177⁺、CD275⁺和CXCR4⁺的PP2中以及S5时的内分泌腺祖细胞(EP)中NGN3 mRNA的诱导。当与2D培养物中的源自CXCR4⁺和CD275⁺的PP2和的EP相比时，NGN3 mRNA在源自CD177⁺的PP2中受到严格调节，并在S5时的源自CD177⁺的EP中，NGN3 mRNA被非常有效地诱导(图11G)。

实施例9：CD177⁺ADE有效地产生源自SC的β-样细胞

为了确定CD177⁺富集的ADE是否更有效地产生源自SC的β-样细胞，发明人将MACS富集的DE和ADE向S6的INS⁺/NKX6.1⁺细胞进行了分化(图5A)。由于CXCR4⁺富集的DE和CD275⁺富集的ADE在S6时表达了相似的胰腺和内分泌腺标志物基因PDX1、NKX6.1和NEUROD1的低mRNA水平(图12A)，因此发明人决定将CD177⁺富集的ADE与CXCR4⁺富集的整体DE比较。在源自CD177⁺的β-样细胞中，比如PDX1、NKX6.1和NKX2.2的关键β细胞标志物基因的mRNA转录物相对更高(图12A、G)。约有65％的源自CD177⁺和CXCR4⁺的β-样细胞合成了PDX1和NKX6.1蛋白(图12B、D)。尽管PDX1和NKX6.1的蛋白质水平没有差异，但是发明人注意到激素INS和GCG的mRNA转录物具有显著差异(图12H)。尽管在源自CXCR4⁺和CD177⁺的β-样细胞之间观察到了相当效力的PDX1和NKX6.1，但在源自CXCR4⁺的β-样细胞中C肽⁺/PDX1⁺和INS⁺/NKX6.1⁺细胞的表达下降(图12C-F)。在S6，约13.2％的源自CD177⁺和10.1％的源自CXCR4⁺的β-样细胞为多激素细胞(图12D、I)。

实施例10：在体外CD177⁺富集的ADE产生更多β-样细胞

随后，发明人确定了在分化早期阶段ADE祖细胞的富集是否改善了分化、成熟和功能性。由于极性和致密性的建立在β-样细胞的成熟过程中起着重要作用，因此发明人决定测试分选细胞的2D和3D培养是否会影响胰腺分化期间的关键转录因子PDX1和NKX6.1的诱导和表达。因此，发明人分选了CD177⁺和CXCR4⁺DE/ADE细胞并在2D贴壁培养中或在重新聚集后在3D簇中将它们分化为胰腺祖细胞(图13A)。在由分选的和分化的DE/ADE亚群诱导的PDX1⁺/NKX6.1⁺PP2的数量之间没有记录到明显差异，但是，发明人观察到在3D培养中PDX1+/NKX6.1+双阳性PP2的数量略有增加(图13B)。因此，发明人决定在S7使富集的DE/ADE亚群在3D中向源自SC的β-样细胞分化。为此，发明人富集了CD177⁺和CXCR4⁺内胚层群，并将细胞铺在低附着皿上以重新聚集并形成3D簇。根据修改后的方案，在聚集的3D簇上实施了向S7的分化(图13C)。有趣的是，观察到在源自CD177+的β-样3D簇中形成了具有所定义的ECAD+粘附连接的密实且致密的聚集体(图13D)，这与CD177+ADE祖细胞中β-连环蛋白的富集一致(图4D)。首先，证实了源自CD177+的β-样细胞表达成熟的β细胞转录因子MAFA。几乎60％的源自CD177+的β-样细胞表达了INS和MAFA(图13F、H、J)。在源自CD177+的β-样细胞中，发明人还发现MAFA、GLUT1和UCN3 mRNA转录物的水平升高(图13E)。值得注意的是，与源自CXCR4+的β-样细胞相比，源自CD177+的β-样细胞中的葡萄糖转运蛋白GLUT1和UCN3的mRNA表达显著更高，这表明当与异质CXCR4⁺整体DE相比时，胰腺特化ADE的分离促进了更同质的向β-样细胞的分化(图13Ee)。通过FACS的蛋白质定量确证了约70％的源自CD177+的β-样细胞表达GLUT1和INS(图13F、K)。免疫细胞化学数据证明源自CD177的β-样细胞的膜中存在GLUT1，而在源自CXCR4+的β-样细胞中观察到了GLUT1的极低表达，表明源自CD177的β-样细胞的成熟和功能状态得到改善(图13F、J)。最后，我们通过静态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)测试了源自CD177+和CXCR4+的β-样细胞的功能性。源自CD177+的β-样细胞在采用16.7mM葡萄糖的1h静态葡萄糖刺激后表现出明显改进的应答(图13G)。

Claims (18)

1.一种纯化胰腺祖细胞的方法，包括：

(a)将源自诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的包含胰腺祖细胞的细胞群暴露于结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体，其中所述细胞表面标志物为CD177，并且所述胚胎干细胞为H1 hESC细胞系、H9 hESC细胞系、Mel1-NKX6.1-GFP细胞系或Mel1-INS-GFP细胞系；和

(b)使结合所述配体的所述胰腺祖细胞与源自所述诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的不结合所述配体的细胞相分离，由此纯化所述胰腺祖细胞，其中分离时所述胰腺祖细胞分化成定形内胚层(DE)阶段、前定形内胚层(ADE)阶段、后肠管(PGT)阶段和/或腹侧前肠(VFG)阶段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰腺祖细胞表达FOXA2、SOX17、CER1和/或CXCR4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括将所述细胞群暴露于结合CD275的配体的步骤。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述配体为抗体或其结合片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述配体与标记缀合。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测所述标志物的表达。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过流式细胞术检测所述标志物的表达。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离步骤包括亲和色谱法。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离步骤包括流式细胞术。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺祖细胞为人的。

12.一种纯化的组合物，包含至少50％的通过权利要求1或2所述的方法获得的胰腺祖细胞，所述胰腺祖细胞为CD177阳性的并且来自定形内胚层(DE)、前定形内胚层(ADE)、后肠管(PGT)和/或腹侧前肠(VFG)的阶段。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述胰腺祖细胞为人的。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述配体固定在捕获介质上。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述捕获介质包括珠子。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述配体缀合至磁性试剂。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过所述方法可获得的所述纯化的细胞组合物包含至少50％的胰腺祖细胞。

18.一种结合胰腺祖细胞上的细胞表面标志物的配体用于从源自诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞的细胞群中纯化胰腺祖细胞的用途，其中所述细胞表面标志物为CD177，并且其中所述胚胎干细胞为H1 hESC细胞系、H9hESC细胞系、Mel1-NKX6.1-GFP细胞系或Mel1-INS-GFP细胞系，并且在定形内胚层(DE)、前定形内胚层(ADE)、后肠管(PGT)和/或腹侧前肠(VFG)的阶段纯化所述胰腺祖细胞。