CN111088290B - 一种杜鹃素在基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杜鹃素在基因编辑中的应用。所述杜鹃素能够靶向促进DNA双链断裂中同源重组修复(Homologous recombination,HR)效率但对非同源末端连接修复(Non‑homologous end joint,NHEJ)效率没有影响，进而为基因编辑中提高目的片段靶向整合效率提供更加便捷的依据。与当前多种小分子化合物在基因编辑中促进同源重组打靶的方式相比，本发明涉及的小分子化合物能够更有效及稳定地在基因编辑中实现靶向整合目的，在不同类型细胞以及小鼠胚胎水平均能够适用，其促进靶向整合效率最高达3倍。同时本发明所应用的筛选系统也更为简便有效，为多种天然小分子化合物在DNA双链断裂修复方面提供了合理的筛选方式。

Description

一种杜鹃素在基因编辑中的应用

技术领域

本发明涉及一种天然的小分子化合物在基因编辑中的用途，尤其是涉及一种杜鹃素在基因编辑中的应用。

背景技术

在各种不同的有机体和细胞中，II型的CRISPR/Cas9系统是相对简单，有效，通用的靶向基因编辑工具。它作为一种强有力的工具目前受到许多研究者们的青睐，它的原理是由单链向导RNA结合Cas9蛋白在靶位点进行切割并产生双链断裂，在该断裂位点处通过两种经典的修复途径：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR)，从而永久性的修饰或替换目的基因的靶位点。这些靶位点包括病毒基因位点，单个突变遗传疾病，大范围疾病状态的多变化位点，这一基因编辑技术为治疗一直威胁于人类的生物医学相关的疾病提供了潜在的可能性。

在CRISPR/Cas9介导的基因编辑过程中，双链断裂处更倾向于发生非同源连接末端(NHEJ)，而发生同源重组介导的定点整合的效率相对很低，导致在一些原代细胞和动物疾病模型的构建方面存在很多局限性，因此，提高靶向整合的效率是很有必要的。

当前很多研究通过不同的方式对不同细胞类型的靶向整合效率进行了改进，例如，有研究通过使用调控细胞周期的小分子化合物和控制Cas9核糖核蛋白复合体转染时间从而提高特定位点的整合效率；也有通过抑制非同源末端连接通路中的蛋白的表达和功能进而促进由同源重组介导的靶向整合效率。与此同时，各种各样的小分子化合物也被阐明能够调控NHEJ和HR通路从而调控CRISPR/Cas9的定点整合效率。但是在不同小分子化合物促进定点整合效率的研究结果表明细胞类型实用的范围较为单一，且促进的程度还不足以在小鼠的水平上得以应用。

杜鹃素作为一种天然的小分子化合物，其应用于祛痰的疾病治疗功能已被广泛知晓，而探索小分子化合物的多方面功能，挖掘其不同的潜能，发挥更多的应用价值是当前的一大热点。

发明内容

本发明的目的就是提供一种杜鹃素在基因编辑中的应用。具体而言是，提供杜鹃素在CRISPR/Cas9中促进靶向整合效率的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种杜鹃素(Farrerol，其分子式为C₁₇H₁₆O₅)的应用，所述杜鹃素用于制备提高CRISPR/Cas9基因编辑中定点整合效率的药物的应用。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备有效促进DNA双链断裂修复通路中的同源重组修复的药物的应用，所述杜鹃素同时对非同源末端连接修复无影响。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备能够在人胚胎肾293细胞中的AAVS1位点有效促进供体片段的准确插入的药物的应用。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备能够在小鼠ES细胞的Actb位点提高供体片段的高效整合效率的药物的应用。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备能够在小鼠的囊胚期的Cdx2和Actb位点有效促进靶向整合效率的药物的应用。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备能够促进靶向整合效率在小鼠子代中稳定遗传的药物的应用。

进一步地，本发明提供所述杜鹃素作为制备靶向小鼠模型的药物的应用，能够实现在构建小鼠疾病模型方面的高效性。

本发明发现杜鹃素分别在人的胚胎肾293细胞，小鼠ES细胞，小鼠囊胚中的不同位点均可有效提高目的片段的靶向整合效率，且这种经小分子化合物处理的靶向整合效率能够稳定至小鼠子代。

与现有技术相比，本发明提供的是基于DNA双链断裂修复的两条通路——同源重组和非同源末端连接筛选出的倾向于同源重组修复方式一种天然小分子化合物，利用这一特性，将其应用于提高靶向重组效率，进而为构建靶向小鼠模型提供有效的方式。

附图说明

图1：利用检测双链断裂修复报告系统检测出杜鹃素对同源重组修复(HR)具有促进作用，对非同源末端连接修复(NHEJ)没有影响。

图2：小分子化合物在胚胎肾293FT细胞中的AAVS1位点能够有效促进靶向整合目的片段的效率。

图3：小分子化合物对HEK293FT细胞的生长和细胞周期的影响。

图4：小分子化合物在小鼠ES细胞中Actb位点的靶向整合示意图及定点整合效率统计图。

图5：小分子化合物对小鼠ES细胞增殖和基因组稳定性的影响。

图6：小分子化合物在小鼠囊胚中Actb位点促进靶向整合效率比其他报道过的小分子化合物相比更高。

图7：经小分子化合物杜鹃素处理的胚胎移植至受体母鼠中得到的子代母鼠基因型鉴定结果以及子代能够稳定遗传靶向整合目的基因。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例所用细胞系如下：

MJT为人皮肤成纤维细胞系，HEK293FT为人胚胎肾细胞，E14为小鼠胚胎干细胞。

实施例1：杜鹃素影响DNA双链断裂修复通路

利用检测DSB修复的单报告系统进一步验证杜鹃素对其通路选择的影响，在核转染之前对细胞进行不同浓度杜鹃素(终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM)预处理24h，然后将5μg pCMV-I-SceI和15ng pDsRed2-N1质粒对应每盘1×10⁶细胞进行转染，此时培养基中持续维持杜鹃素处理，直至72h后利用流式细胞仪分析GFP+/DsRed+的比例来检测杜鹃素对HR和NHEJ的修复效率。

结果如图1所示，可以看出利用检测双链断裂修复报告系统检测出杜鹃素对同源重组修复(HR)具有促进作用，对非同源末端连接修复(NHEJ)没有影响。

实施例2：杜鹃素在人细胞中促进靶向整合基因编辑效率

1.杜鹃素能够有效促进由CRISPR/Cas9介导的靶向整合效率

将HEK293FT细胞铺于6孔细胞培养板中，采用梯度浓度活性小分子化合物(杜鹃素终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM)作用上述细胞处理24h，SCR7和RS-1均为当前已报道过的能够有效提高靶向整合效率的小分子化合物，本研究中所应用的终浓度：SCR7终浓度分别为0.1μM和1μM，RS-1终浓度为10μM。利用电转的方式将靶向AAVS1位点的sgRNA，Cas9和带有mCherry荧光的donor载体混合物转入细胞中，72h后通过流式细胞术分析mCherry阳性细胞所占比例为浓度梯度的活性小分子化合物在人细胞中的靶向整合效率，并对靶向整合的编辑产物进行基因组DNA提取，分别在整合至AAVS1位点的5’和3’端设计引物，通过PCR方法进一步进行基因型鉴定，深入确定靶向基因编辑的精确性。

结果参考图2，可以看出，不同浓度梯度的杜鹃素能够有效促进mCherry定点整合至AAVS1位点的效率，且促进的效率与之前报道的小分子化合物SCR7和RS-1相比促进同源重组靶向整合效率程度相似，甚至在部分浓度的效率高于阳性对照组。示意图中不同对箭头表示鉴定的5’和3’端引物，DNA凝胶电泳图表明目的片段正确插入至AAVS1位点。

2.杜鹃素对人细胞生长和细胞周期没有影响

为检测杜鹃素对细胞生长的影响，将HEK293FT细胞铺于6孔细胞培养板中，24h后采用梯度浓度活性小分子化合物(杜鹃素终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM)作用上述细胞12-96h，分别在小分子化合物处理细胞的24h，48h，72h，96h后对不同浓度梯度的细胞进行计数，检测活性小分子化合物对上述细胞的增殖影响，并绘制生长曲线。为检测杜鹃素对细胞周期的影响，用同样浓度梯度的杜鹃素处理HEK293FT细胞24-48h采用PI染色结合流式细胞术检测杜鹃素是否诱导HEK293FT细胞发生周期阻滞；在此基础上，之前有研究报道Brefeldin A小分子化合物能够应用于靶向整合的基因编辑技术中，因此采用细胞生长曲线深入比较杜鹃素与已报道的应用于基因编辑的小分子化合物的毒性区别，所用Brefeldin A终浓度为0.1μM。

结果参考图3，杜鹃素不影响人细胞的生长情况，也不影响细胞周期。与已报道的已应用于靶向整合基因编辑的小分子化合物相比，Brefeldin A会影响人细胞的生长，杜鹃素的初步应用更有优势。

实施例3：杜鹃素在小鼠干细胞(ES)水平上促进靶向整合效率

1.检测活性小分子化合物对靶向整合特定位点的基因编辑效率

将小鼠ES细胞铺于6孔细胞培养板中，培养24h后采用梯度浓度活性小分子化合物(杜鹃素终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM；SCR7终浓度分别为0.1μM和1μM；RS-1终浓度分别为1μM和10μM)作用上述细胞24h，利用电转的方式将靶向Actb位点的sgRNA，Cas9和带有Puromycin筛选的donor载体混合物转入细胞中，48h后利用1mg/ml Puromycin筛选不同浓度活性小分子化合物处理的基因编辑产物，96h后对筛选的克隆进行考马斯亮蓝染色并统计，不同处理组的筛选克隆数即为靶向整合的结果。

小分子化合物杜鹃素在小鼠ES细胞中Actb位点的靶向整合示意图及定点整合效率统计图如图4所示。

2.活性小分子化合物不影响小鼠胚胎干细胞增殖

采用EdU流式细胞术检测梯度浓度活性小分子化合物(杜鹃素终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM)对小鼠ES细胞的S期进行检测，确定活性小分子化合物是否影响其增殖。

结果参考图5所示，杜鹃素不影响小鼠ES细胞的增殖。

3.活性小分化合物在基因编辑中安全性评估

对经活性小分子化合物处理24h后的小鼠ES细胞进行彗星电泳实验，检测不同浓度条件下小分子化合物对ES细胞基因组稳定性的影响。同时利用之前已报道过的小分子化合物SCR7和RS-1作为参照，进一步证实杜鹃素应用的广泛性。所应用小分子化合物浓度如下：杜鹃素终浓度分别为0.1μM，1μM，5μM，10μM；SCR7终浓度分别为0.1μM和1μM；RS-1终浓度分别为1μM和10μM。

结果参考图5所示，杜鹃素和RS-1不影响小鼠ES细胞的基因组稳定性，而SCR7在相对高浓度条件下促进基因组不稳定。

实施例4：杜鹃素在小鼠囊胚阶段促进靶向整合基因编辑效率

1.杜鹃素在小鼠囊胚的Actb和Cdx2位点促进目的基因的定点整合效率

对于小鼠囊胚水平上的基因编辑，利用7-8周龄超排的雌鼠与雄鼠交配后，在雌鼠的输卵管中得到已受精的胚胎，将胚胎用浓度梯度的小分子化合物(杜鹃素终浓度分别为0.05μM，0.1μM；SCR7终浓度为20μM；RS-1终浓度为7.5μM)进行预处理后利用显微注射的技术将Cas9 mRNA，sgRNA和mCherry-donor载体的混合物注射入受精卵的细胞质中，待受精卵发育至囊胚阶段通过荧光显微镜检测donor载体靶向整合的结果，对红色荧光的囊胚进行统计。

结果如图6所示，可以看出小分子化合物杜鹃素在小鼠囊胚中Actb位点促进靶向整合效率比其他报道过的小分子化合物相比更高。

2.在基因组水平上进一步鉴定不同位点的基因编辑效率

将不同浓度处理(杜鹃素终浓度分别为0.05μM，0.1μM；SCR7终浓度为20μM；RS-1终浓度为7.5μM)的小鼠单个囊胚进行基因组DNA提取，通过在整合位点Actb的5’和3’端分别设计引物，利用巢式PCR的方式鉴定在5’端和3’端的整合情况，对两端的PCR产物进行统计分析，5’和3’同时具有目的条带的为精确整合产物，仅有5’或3’的目的条带为不完全插入，将5’和3’同时有阳性条带的编辑产物与样本总数的比例作为靶向整合效率的依据。

结果如图6所示，可以看出小分子化合物杜鹃素在小鼠囊胚中Actb位点促进靶向整合效率比其他报道过的小分子化合物相比更高。

实施例5：由杜鹃素介导的促进目的片段的靶向整合效率能够稳定遗传至子代。

为深入检测杜鹃素在靶向整合小鼠构建中的作用，将显微注射过靶向Cdx2位点混合质粒的受精卵用小分子化合物进行预处理(杜鹃素终浓度分别为0.05μM)，在培养箱中培养至2细胞期，取25-30个二细胞期的胚胎移植入交配后0.5天的假孕雌鼠中，从而得到靶向整合的小鼠。通过对子代小鼠的统计以及鉴定，并对得到的founder小鼠与野生型进行配种，随后得到的定点整合的纯合小鼠，取其囊胚在显微镜下观察mCherry的荧光结果。

结果如图7所示，可以看出，经小分子化合物杜鹃素处理的胚胎移植至受体母鼠中得到的子代母鼠基因型鉴定结果以及子代能够稳定遗传靶向整合目的基因。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于制备提高CRISPR/Cas9基因编辑中定点整合效率的药物的应用；

所述杜鹃素作为制备有效促进DNA双链断裂修复通路中的同源重组修复的药物的应用，所述杜鹃素同时对非同源末端连接修复无影响。

2.根据权利要求1所述杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素作为制备能够在人胚胎肾293细胞中的AAVS1位点有效促进供体片段的准确插入的药物的应用。

3.根据权利要求1所述杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素作为制备能够在小鼠ES细胞的Actb位点提高供体片段的高效整合效率的药物的应用。

4.根据权利要求1所述杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素作为制备能够在小鼠的囊胚期的Cdx2和Actb位点有效促进靶向整合效率的药物的应用。

5.根据权利要求1所述杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素作为制备能够促进靶向整合效率在小鼠子代中稳定遗传的药物的应用。

6.根据权利要求1所述杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素作为制备靶向小鼠模型的药物的应用。

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