CN111088227A

CN111088227A - 一种细胞分离培养液和t细胞分离培养的方法

Info

Publication number: CN111088227A
Application number: CN201911415731.1A
Authority: CN
Inventors: 马玉国
Original assignee: Guangzhou Hanghua Biology Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Hanghua Biology Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法。本发明公开了一种细胞分离培养液。本发明中，培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高淋巴细胞数量。最终培养后细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。

Description

一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法。

背景技术

T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。

过继性免疫细胞治疗是指从人体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向人体回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性T细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、TCR-T、CAR-T等几大类。

目前体外培养T细胞通常包括以下4个步骤：分离单个核细胞、激活诱导、扩增、收集。目前分离单个核细胞通常是使用Ficoll实现，常规的T细胞培养方法是将分离的单个核细胞用因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的T细胞。

在使用Ficoll提取单个核细胞进行T细胞的培养时，由于部分血液供体机体状态原因，分离出的单个核细胞中还夹杂着大量红细胞。若直接进行培养，不仅在培养周期中难以观察T细胞的生长情况，且影响T细胞的培养环境，并影响后续对T细胞性能的检测和T细胞性能。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法，该细胞分离培养液使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高T细胞数量，提高检测的准确性，最终培养后T细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种细胞分离培养液，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；

所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；

所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；

所述培养液C为：IL-2和基础培养基。

本发明中，通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高淋巴细胞数量。最终培养后细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。

本发明细胞分离液中的细胞优选为T细胞。

本发明将培养液B中IL-2、IL-1α和CD3单克隆抗体进行复配，结合培养液A和培养液C共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。本发明所述细胞优选为CIK细胞。

本发明中，所述培养液A中IFN-γ的终浓度为2500～5000IU/ml，更优选为5000IU/ml；

所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的终浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml，更优选分别为1000IU/ml、5ng/ml、500ng/ml；

所述培养液C中的IL-2终浓度为500～1000IU/ml，更优选为1000IU/ml。

本发明中，细胞培养液还包括自体血浆。将自体血浆作为营养物质，避免了胎牛血清的使用，减少外源致热源，致敏污染，且降低了培养成本。

本发明基础培养基优选为淋巴细胞无血清培养基。

本发明还提供了一种T细胞的培养试剂盒，包括上述细胞分离培养液。

本发明还提供了一种T细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

步骤1：向外周血或全血中分离单个核细胞；

步骤2：向所述单个核细胞中加入红细胞裂解液裂解红细胞，得到纯化的单个核细胞；

步骤3：第0天，将所述纯化的单个核细胞接种于培养液A中进行培养；

步骤4：培养至第1天，加入培养液B进行培养；

步骤5：培养至第4、8、11天，分别加入培养液C进行培养，继续培养至第14天，得到T细胞；

所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；

所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；

所述培养液C为：IL-2和基础培养基。

本发明培养液A和培养液B均为T细胞刺激培养液，培养液C为T细胞扩增培养液。

本发明步骤3中，所述纯化的单个核细胞的接种量为1×10⁶～2×10⁷,个/ml，优选为2×10⁶～4×10⁶个/ml。

本发明提供的分离培养方法中，对含有不同细胞因子的培养液在不同时间段加入，共同作用刺激T细胞的高效转化。

本发明提供的分离培养方法中，培养液A、培养液B和培养液C中各细胞因子的浓度与上述细胞分离培养液中的各细胞因子的浓度相同，此处不再赘述。

本发明步骤1具体为：对所述全血或外周血进行第一离心，得到血细胞悬液，然后加入中性粒细胞分离液进行第二离心，分层后，吸取单个核细胞层，得到单个核细胞；

所述第一离心的速率为2000rpm-2500rpm，时间为10min-15min，优选为2500rpm离心10min；进行第一离心后，取上层自体血浆保留。

所述第二离心的速率为500g-550g，时间为20min-30min，优选为550g离心30min。

所述中性粒细胞分离液与所述血细胞悬液的体积比为2：1；所述得到血细胞后，加入中性粒细胞分离液之前，还包括：按血细胞悬液体积比为1：1加入生理盐水稀释，得到血细胞稀释液。

所述吸取单个核细胞之后，还包括：第三离心；所述第三离心的速率为250g-300g，时间为5min-10min，优选为250g离心10min。

本发明步骤2具体为：将步骤1所述单个核细胞中加入红细胞裂解液裂解红细胞，得到纯化的单个核细胞。

所述单个核细胞与所述红细胞裂解液的的体积比为(1：5)～(1：8)，优选为1：8。本发明中，加入所述红细胞裂解液的体积不低于2mL。

所述加入红细胞裂解液之后，还包括：进行第四离心，弃上清，加生理盐水重悬，进行第五离心，弃上清，得到纯化的单个核细胞。

所述第四离心的速率为，时间为，优选为10min；所述第五离心的速率为，时间为，优选为5min。

本发明步骤3具体为：第0天，第0天，使用培养液A重悬所述单个核细胞，转移至培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h。

本发明步骤4中，培养至第1天，加入培养液B，并补充自体血浆，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养72h。

本发明步骤5具体为：培养至第4、8、11天，加入培养液C进行培养，细胞浓度超过1×10⁷个/ml时转移至更大的培养容器中，并补充自体血浆。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种细胞分离培养液，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；培养液A为：IFN-γ和基础培养基；培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL-2和基础培养基。

本发明中，培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单核细胞向T细胞进行转化。通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高T细胞数量，提高检测的准确性。最终培养后T细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，IFN-γ购自上海热创生物技术有限公司；IL-2购自山东泉港药业有限公司；IL-1α购自广州东锐科技有限公司；CD3单克隆抗体购自宝日医生物技术(北京)有限公司；淋巴细胞无血清培养基购自广州市海进生物科技有限公司；A549肿瘤细胞和HUH-7肿瘤细胞均为广州航华医药科技有限公司保存。

实施例1

(1)分离全血的单个核细胞：

采集5ml人体外周静脉血，2500rpm离心10min，取上层自体血浆保留，56℃水浴30min后放4℃冰箱保存。按下层血细胞悬液体积比为1：1加入3ml生理盐水稀释，混匀，得到血细胞稀释液。取一新的离心管，按血细胞稀释液体积比为1：1加入5ml中性粒细胞分离液，缓慢加入血细胞悬液至中性粒细胞分离液上层，550g离心30min。离心后分层，吸取单个核细胞层，250g离心10min，收集得单个核细胞。

(2)裂解红细胞：向小于1mL的单个核细胞中加入5ml红细胞裂解液混匀，4℃放置裂解2min。300g离心10min，弃上清液，加10ml生理盐水重悬,取1ml悬液检测活率，并使用血常规仪检测，结果如表1所示。取1×10⁶个细胞至新的离心管，300g离心5min，弃上清液，即得纯化的单个核细胞。

(3)T细胞激活诱导扩增：

(3.1)Day0：

添加5000IU/ml IFN-γ到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液A，取2.5ml培养液A重悬步骤(2)得到的纯化的单个核细胞(纯化的单个核细胞的接种量为4.40×10⁶个/ml)，转移至T25m²培养瓶中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h；

(3.2)Day1：

添加1000IU/ml IL-2、5ng/ml IL-1α及500ng/ml CD3单克隆抗体(OKT3)到淋巴细胞无血清培养基配制成培养液B。添加1.5ml到(3.1)步的培养瓶中。补充0.5ml自体血浆，置于37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养72h。

(3.3)Day4：

添加1000IU/ml IL-2到淋巴细胞无血清培养基配置成培养液C。将(3.2)的培养瓶中的细胞转移至T75m²培养瓶，补充12.5ml扩增培养基，补充2ml自体血浆。

(3.4)Day8：

在(3.3)的培养瓶补充15ml培养液C，补充2ml血浆。

(3.5)Day11：

在(3.4)的培养瓶补充15ml培养液C，补充2ml血浆。

(3.6)Day15：

收集细胞并进行T细胞性能检测：

取1ml悬液检测使用血常规仪检测，结果如表2所示。

在(3.5)的培养瓶中取5mlT细胞悬液，其中取10μl添加CD3、CD8、CD56流式抗体孵育20min，洗涤2次后，使用ACEA NovoCyte 2060R进行流式检测，结果如表3。剩余T细胞稀释至2.5×10⁵/ml和1×10⁶/ml两个浓度，加入到已添加A549及HUH-7细胞孵育24h的E-Plate16PET中，使用xCElligence RTCA DP进行动态杀瘤实验，48h后处理数据，结果如表4、表5。

对比例1

(1)分离外周血的单个核细胞：

采集5ml人体外周静脉血，2500rpm离心10min，取上层血浆保留，56℃水浴30min后放4℃冰箱保存。下层血细胞悬液加入3ml生理盐水稀释，混匀，得到血细胞稀释液。取一新的离心管，按血细胞稀释液体积比为1：1加入5ml淋巴细胞分离液，缓慢加入血细胞悬液至淋巴细胞分离液分离液上层，2500rpm离心20min。

离心后取单个核细胞层，1800rpm离心10min，加50ml生理盐水重悬后，取1ml悬液检测活率，并使用血常规仪检测，结果如表1所示。取1×10⁶个细胞至新的离心管，1600rpm离心5min，收集得单个核细胞。

(2)T细胞激活诱导扩增与实施例1相同，其中本对比例中单个核细胞在培养液A中的接种量为4.42×10⁶个/ml。取1ml悬液检测使用血常规仪检测，结果如表2所示。流式检测结果见表3，杀瘤实验结果见表4和表5。

表1血常规结果

表2血常规结果

	红细胞数(个)	白细胞数(个)
			实施例1	0	6.03×10<sup>7</sup>
对比例1	1.52×10<sup>9</sup>	5.09×10<sup>7</sup>

表3流式检测结果

	CD3+CD8+	CD3+CD8-	CD3+CD56+	CD3+CD56-
					实施例1	58.91％	27.1％	10.71％	76.63％
对比例1	<1％	<1％	<1％	<1％

表4 A549杀瘤实验结果

表5 HUH-7杀瘤实验结果

由表1和表2结果可知，实施例1加入了红细胞裂解液后，红细胞数量较对比例1显著减少，白细胞数较对比例1多。

由表3结果可知，实施例1中加入了红细胞裂解液后效应细胞的比例均高于对比例1未加入细胞裂解液的效应细胞比例，说明红细胞的减少可以有效提高有效细胞的比例。另外，对比例1效应细胞均不足1％，说明红细胞的存在可能影响T细胞的检测。

由表4和表5结果可知，实施例1分离培养的T细胞对肿瘤的杀伤率显著高于对比例1分离培养的T细胞。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种细胞分离培养液，其特征在于，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；

所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；

所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；

所述培养液C为：IL-2和基础培养基。

2.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述培养液A中IFN-γ的浓度为2500～5000IU/ml；

所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml；

所述培养液C中的IL-2浓度为500～1000IU/ml。

3.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，还包括：自体血浆。

4.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。

5.一种T细胞培养试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任意一项所述的细胞分离培养液。

6.一种T细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：向外周血或全血中分离单个核细胞；

步骤4：培养至第1天，加入培养液B进行培养；

所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；

所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；

所述培养液C为：IL-2和基础培养基。

7.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述单个核细胞与所述红细胞裂解液的的体积比为(1：5)～(1：8)。

8.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，步骤1具体为：对所述外周血或全血进行第一离心，得到血细胞悬液，然后加入中性粒细胞分离液进行第二离心，分层后，吸取单个核细胞层，得到单个核细胞。

9.根据权利要求8所述的分离培养方法，其特征在于，所述中性粒细胞分离液与所述血细胞悬液的体积比为2：1。

10.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，加入所述培养液B和所述培养C时均需再加入自体血浆。