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CN111088214A - 干细胞源的肝样细胞外泌体、其制备方法及其应用 - Google Patents

干细胞源的肝样细胞外泌体、其制备方法及其应用 Download PDF

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CN111088214A CN201911219571.3A CN201911219571A CN111088214A CN 111088214 A CN111088214 A CN 111088214A CN 201911219571 A CN201911219571 A CN 201911219571A CN 111088214 A CN111088214 A CN 111088214A
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Abstract

本发明涉及一种制备外泌体的方法，通过使用离体干细胞诱导分化成的肝样细胞分泌得到所述外泌体，还涉及通过该方法制备得到的肝样外泌体，还涉及所述肝样细胞外泌体在制备用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用以及在防止离体细胞低氧损伤中的应用。本发明通过诱导干细胞分化成肝样细胞并获得肝样细胞外泌体，该外泌体可以减轻体内肝I/R损伤和体外低氧培养引起的肝细胞损伤，其保护效果优于肝细胞外泌体。同时，由BMSCs诱导的肝细胞样细胞的外泌体导致体内肝组织和体外肝细胞的自噬增加。因此，本发明的肝样细胞外泌体可作为肝I/R损伤的治疗药物，以及防止离体细胞低氧损伤的试剂。

Description

干细胞源的肝样细胞外泌体、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，更特别地，涉及一种制备外泌体的方法，通过该方法制备得到的肝样外泌体，还涉及所述肝样细胞外泌体在制备用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用以及在防止离体细胞低氧损伤中的应用。
背景技术
肝缺血/再灌注(I/R)损伤是外科手术过程中的严重并发症，例如肝切除术和原位肝移植(OLT)，会对患者和移植物的结局产生不利影响。自噬受损，线粒体功能障碍以及随之而来的细胞稳态破坏是肝I/R损伤的特征。尽管对肝I/R损伤的机制已有深入研究，但仍没有有效的方法可减少或预防肝I/R损伤。因此，迫切需要开发有效的治疗剂，以治疗I/R引起的肝损伤。
外泌体(外泌体)是膜衍生的纳米囊泡(30-150nm)，在正常和病理条件下，包括肝细胞在内，许多类型的细胞都会释放这种囊泡。外泌体对细胞功能的影响与多种生理过程有关，这些过程包括：细胞间通讯，癌症转移，免疫调节活性以及传染原的扩散。最近的研究表明，外泌体在组织缺血-再灌注损伤中具有保护作用。外泌体可通过抑制炎症反应，减少氧化应激，抑制纤维化和促进血管生成，从而减少心肌梗塞的程度并改善肾脏缺血再灌注损伤。最近的研究还发现，肝细胞可以分泌外泌体，并在肝细胞的再生和修复中起重要作用。与细胞疗法相比，外泌体的临床应用优势是巨大的。通过静脉内输注细胞，大多数细胞粘附在肺泡毛细血管上，宿主的存活率很低。但是，外泌体不存在诸如细胞栓塞或干细胞分化的问题。另外，通过富集一些蛋白质和RNA，外泌体比细胞疗法可以得到更好的保护。
最近的研究表明，肝细胞衍生的外泌体在肝细胞中形成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，导致I/R损伤或部分肝切除术后细胞增殖和肝脏再生。更重要的是，已证明肝细胞分泌的外泌体对急性和慢性肝病的新治疗方法具有重要意义。然而，在原代肝细胞的获取和体外培养中仍然存在许多限制。因此，需要一种新的用于治疗I/R损伤的药物。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种制备外泌体的方法，通过使用离体干细胞诱导分化成的肝样细胞分泌得到所述外泌体。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：将所述离体干细胞诱导成肝样细胞；
S2：使所述肝样细胞分泌外泌体；
S3：收集所述外泌体。
在一个具体实施方案中，所述离体干细胞为骨髓间充质干细胞。
在一个优选实施方案中，S1通过在所述离体干细胞的培养环境中加入成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素M、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和地塞米松孵育，使所述离体干细胞分化为所述肝样细胞。
在一个优选实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：在诱导第0天加入成纤维细胞生长因子4；
S12：第3天加入肝细胞生长因子；
S13：第6天加入肝细胞生长因子、抑瘤素M、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和地塞米松，培养至所述干细胞分化成肝样细胞。
在一个优选实施方案中，S2中，将所述肝样细胞在无外泌体的血清环境中培养24小时，使所述肝样细胞分泌外泌体。
本发明还提供了一种肝样细胞外泌体，通过上述方法制备得到。
本发明还提供了上述肝样细胞外泌体在制备用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
本发明还提供了上述肝样细胞外泌体在防止离体细胞缺氧损伤中的应用。
优选地，所述离体细胞为离体肝细胞。
本发明通过诱导干细胞分化成肝样细胞并获得肝样细胞外泌体，该外泌体可以减轻体内肝I/R损伤和体外低氧培养引起的肝细胞损伤，其保护效果优于肝细胞外泌体。同时，由BMSCs诱导的肝细胞样细胞的外泌体导致体内肝组织和体外肝细胞的自噬增加。因此，本发明的肝样细胞外泌体可作为肝I/R损伤的治疗药物，以及防止离体细胞低氧损伤的试剂。
附图说明
图1为分离的BMSC细胞表面CD29、CD44、CD105、Sca-1、CD11b、CD31、CD45和CD117的表达情况；
图2为BMSC被诱导培养21天后的肝样细胞的光镜照片，可见上皮样分化；
图3为诱导后的肝样细胞分别用AFP抗体和ALB抗体染色的荧光照片；
图4为诱导后的肝样细胞的HNF-3β表达水平统计图；
图5为肝样细胞外泌体的电镜照片；
图6为肝样细胞外泌体的粒径分布统计图；
图7为I/R对照组、MSC-Heps-Exo组和Heps-Exo组小鼠的血清ALT和AST含量统计图；
图8为I/R对照组、MSC-Heps-Exo组和Heps-Exo组小鼠肝脏切片的HE染色照片和TUNEL染色照片；
图9为离体细胞低氧实验中，对照组、MSC-Heps-Exo组和Heps-Exo组的细胞活力统计图；
图10为离体细胞低氧实验中，对照组、MSC-Heps-Exo组和Heps-Exo组的细胞凋亡流式分布图；
图11为根据图10统计的凋亡率；
图12为I/R对照组和MSC-Heps-Exo组小鼠肝脏组织中检测LC3-II和Beclin-1的免疫印迹照片(左)以及根据免疫印迹照片转换得到的的LC3-II和Beclin-1表达量统计图(右)；
图13为I/R对照组和MSC-Heps-Exo组小鼠肝脏切片的电镜照片(下)和根据电镜结果得到的自噬小体计数结果(上)，箭头标示了部分自噬小体。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重22±2g，从北京HFK生物科学有限公司(中国北京)购买，该小鼠饲养于华中大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所动物房。本研究中涉及动物使用的所有程序均按照中国动物保护委员会的指导原则进行并进行了监控，并经华中科技大学同济医学院附属机构动物保护和使用委员会批准。
2、间充质干细胞的分离、培养与肝分化
从C57BL/6小鼠获得BMSC进行传代培养。获得的BMSC具有典型的间充质干细胞表型，其CD29、CD44、CD105和Sca-1呈阳性，CD11b、CD31、CD45和CD117呈阴性，同种型对照表示为阴影曲线(图1)，可见我们获得了典型的BMSC细胞。
第三代的BMSC在第0天加入终浓度10ng/ml成纤维细胞生长因子4(FGF-4)，第三天加入肝细胞生长因子(HGF)，第6天加入HGF(终浓度20ng/ml)、终浓度10ng/ml抑瘤素M(OSM)，1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)处理和终浓度20μg/l地塞米松(Dex)诱导分化成肝样细胞。培养21天后，形态学上类似肝细胞的上皮样细胞(图2)。
检测胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)表达情况，结果如图3所示，BMSC诱导得到的细胞中观察到更高的AFP和ALB表达水平。通过qPCR测定HNF-3β基因表达情况，结果如图4所示，诱导后的细胞的HNF-3β水平低于AML12肝细胞，但是显著高于BMSC(**P<0.01)。可认为所诱导的细胞为肝样细胞。
3、分离外泌体
诱导得到的肝样细胞更换为无外泌体血清的细胞培养环境，培养24小时后收集细胞上清液提取外泌体，使用Total Exosome Isolation Kit(Invitrogen，California，USA)从BMSC衍生的肝样细胞中分离出外泌体：
将0.5ml总外泌体分离试剂加入到每1ml过滤的条件培养基中，并通过倒置充分混合。在4℃孵育过夜后，将混合物在4℃以12,000×g离心70分钟。然后通过抽吸除去所有上清液，并用方便量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬外泌体沉淀。使用Zetasizer Nano(MalvernInstruments，Malvern，UK)和电子显微镜确定外泌体的大小和浓度。
外泌体的电子显微照片如图5所示，其形态呈杯状，使用Zetasizer Nano确定外泌体的大小和浓度，结果如图6所示，平均囊泡直径为144nm，并且浓度为4.9×108颗粒/mL。
4、肝损伤模型造模与外泌体治疗
4.1、肝I/R损伤造模
根据以下方法建立70％肝I/R动物模型：通过腹膜内注射用戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉小鼠。然后用无创伤性夹子将动脉和门静脉阻断60分钟，以阻止血液流向肝脏的左叶和中叶。在手术过程中，用加热垫和保温箱将小鼠的温度保持在37℃。再灌注6小时后，处死小鼠以收集血液和肝组织。处理组组的小鼠在通过尾静脉手术前后分别注射了100μg来源于间充质干细胞的肝样细胞外泌体(MSC-Heps-Exo组)或肝细胞外泌体(Heps-Exo组)。在同一时间点，对照组(I/R)组注射等体积的生理盐水。对照组仅进行剖腹手术，不夹闭血管。
4.2、肝细胞缺氧造模
细胞缺氧模型是通过氯化钴(CoCl2，Sigma，圣路易斯，密苏里州)处理建立的。在该实验中使用小鼠肝细胞系AML12。为了进行细胞繁殖，将细胞系在Dulbecco改良的Eagle's培养基/F-12(DMEM/F12，Hyclone，Logan City，UT，美国)中培养，并补充10％的胎牛血清(FBS，Gibco，Grand Island，NY，美国)，ITS液体培养基补充剂和40ng/mL Dex。将细胞保持在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中。在细胞缺氧模型中，当融合度达到60％-70％时，将AML12细胞在无FBS的DMEM/F12中与200μM CoCl2培养24小时。
5、肝样细胞外泌体(MSC-Heps-Exo)治疗情况分析
5.1、血清ALT/AST水平以及组织结构观察
用华中科技大学同济医学院附属同济医院临床实验室的标准临床自动分析仪测量血清ALT和AST水平。结果如图7所示，与I/R对照组相比，MSC-Heps-Exo组和Heps-Exo组的血清ALT和AST水平均显著降低，并且，MSC-Heps-Exo组的血清ALT和AST水平仅为I/R组的约1/5，显著低于Heps-Exo组。
组织病理分析通过以下方法进行：采集肝脏后，将新鲜的肝脏组织固定在4％多聚甲醛中进行石蜡包埋。然后将包埋的组织切成5μm的切片，并用苏木精-曙红(H&E)染色。通过TUNEL测定法检测肝石蜡切片中的细胞死亡。根据制造商的原位细胞死亡检测试剂盒(瑞士巴塞尔罗氏)的使用说明进行检测。使用光学显微镜采集染色照片。
图8示出了肝组织切片的HE染色照片和TUNEL染色照片。肝组织切片HE染色显示，I/R对照组的肝脏组织出现大量出血和坏死，肝叶的结构严重受损，TUNEL染色显示，I/R对照组的肝脏组织发现大面积的凋亡区域。外泌体处理组的肝损伤明显减轻，其中MSC-Heps-Exo组的治疗效果明显好于Heps-Exo组，不仅凋亡区域面积最小，而且，肝叶结构也更完整。
5.2、肝细胞保护的体外验证
通过CCK-8试剂盒(日本Dojindo)检测细胞活力。简而言之，将细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并孵育24小时。之后，对细胞进行上述的缺氧处理，然后将10μl的CCK8溶液添加至每个孔中，并在37℃下再孵育100分钟。最后，使用酶标仪测定波长450nm处的吸光度值。结果如图9所示，外泌体治疗组的AML12细胞生存率显着高于I/R对照组，而MSC-Heps-Exo组的AML12细胞生存率是对照组的约两倍，显著高于Heps-Exo组。
用Annexin V-FITC和碘化丙锭(PI)染色试剂盒分析细胞凋亡。简而言之，将AML12细胞消化并在300×g下离心5分钟，然后与膜联蛋白V-FITC和PI在黑暗中孵育5分钟。通过在FACSCalibur(BD Biosciences)上进行的流式细胞术定量凋亡细胞的百分比。使用FlowJo软件(美国俄勒冈州)进行数据分析。结果如图10和11所示，外泌体治疗组的细胞凋亡低于对照组，尤其是晚期凋亡细胞(Annexin-V+/PI+)，后者MSC-Heps-Exo治疗后凋亡细胞显着降低。这些结果还证明，MSC-Heps-Exo比Heps-Exo可以更高的提升肝细胞对缺氧的耐受性。
5.3、MSC-Heps-Exo增强肝脏I/R损伤过程中自噬
自噬是最近的研究热点之一，机体通过自噬消除受损的线粒体并抑制过量的ROS产生，成为抵抗I/R损伤的重要保障。老年肝脏由于自噬受损而难以耐受I/R损伤，这反过来又促进了线粒体通透性转变(MPT)的发作和细胞死亡。
1)自噬指标蛋白LC3-II和Beclin-1的检测
使用免疫印迹的方法检测肝脏组织中LC3-II的表达情况：使用针对牛血清白蛋白标准化的Bradford测定法(Sigma，美国)确定蛋白质含量，通过SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品，然后电转移到PVDF膜上(美国密理博)。非特异性结合位点在室温下用5％牛血清白蛋白的TBST封闭1小时。将膜与以100000稀释度使用的抗β-肌动蛋白的一抗(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA，USA)在4℃过夜孵育，LC3，Beclin-1(Cell SignalingTechnology)以1：1000稀释度稀释孵育。然后洗涤膜，并与二抗在室温下孵育1小时，然后洗涤并检测信号。用Image-Pro Plus软件(Media Cyber netics)定量蛋白质表达水平。
结果如图12所示，与I/R小鼠相比，在MSC-Heps-Exo治疗的I/R小鼠中，LC3-II(自噬活性的标准指标)的水平增加，自噬所需的PI3K复合体成分Beclin-1也呈现出于LC3-II相似的现象。
2)MSC-Heps-Exo对自噬小体数量的影响
使用电镜观察，将PBS中的外泌体固定在1.5M椰油酸钠中缓冲液(pH7.4)吸收到铜网formvar网格(Electron microscopy Sciences，Hatfield，PA)上，并用2％乙酸铀酰负染。肝组织用2.5％戊二醛超薄切片切开，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。观察样品并使用H7700透射电子显微镜(日立，日本东京)拍摄图像以进行数据采集。从每个样品以相同的放大倍数随机计数外泌体和自噬体的数目。
结果如图13所示，与I/R对照小鼠相比，MSC-Heps-Exo组小鼠的肝脏中自噬体的数量显著增加。
以上结果表明，MSC-Heps-Exo治疗可增强肝I/R损伤期间的自噬小体形成和自噬作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备外泌体的方法，其特征在于，通过使用离体干细胞诱导分化成的肝样细胞分泌得到所述外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将所述离体干细胞诱导成肝样细胞；
S2：使所述肝样细胞分泌外泌体；
S3：收集所述外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离体干细胞为骨髓间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1通过在所述离体干细胞的培养环境中加入成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素M、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和地塞米松孵育，使所述离体干细胞分化为所述肝样细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：
S11：在诱导第0天加入成纤维细胞生长因子4；
S12：第3天加入肝细胞生长因子；
S13：第6天加入肝细胞生长因子、抑瘤素M、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和地塞米松，培养至所述干细胞分化成肝样细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，将所述肝样细胞在无外泌体的血清环境中培养24小时，使所述肝样细胞分泌外泌体。
7.一种肝样细胞外泌体，其特征在于，通过权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的肝样细胞外泌体在制备用于治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
9.权利要求7所述的肝样细胞外泌体在防止离体细胞低氧损伤中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述离体细胞为离体肝细胞。
CN201911219571.3A 2019-12-03 2019-12-03 干细胞源的肝样细胞外泌体、其制备方法及其应用 Pending CN111088214A (zh)

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