CN111088173B - 一株黑曲霉基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株黑曲霉基因工程菌，它是敲除葡聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉菌。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法，进一步公开了基因工程菌在生产固定化发酵生产柠檬酸中的应用。本发明通过构建基因敲除聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉基因工程菌，使黑曲霉在固定化发酵生产柠檬酸过程中疏水性降低并且生物膜产量降低，减轻了载体的抱团现象，提高了柠檬酸产量和糖转化效率，适宜于工业生产。

Description

一株黑曲霉基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种敲除葡聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

柠檬酸作为全世界需求量最大的有机酸之一，被广泛用于食品、医药、日化等行业。其中，75％的柠檬酸被用于食品工业，主要用于食品添加剂中的酸味剂、抗氧剂、pH调节剂，同时由于柠檬酸具有温和爽快的酸味，普遍用于饮料、糕点、葡萄酒、乳制品等食品的制造。另外有15％是用于化工和纺织业，可以用作缓冲液、络合剂、掩蔽剂、金属助洗剂、媒染剂等等。还有10％的柠檬酸被用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品以及饲料添加剂等等，被广泛应用于医药工业以及畜牧业中。近些年来，由于我国粮食价格普遍上涨，随之而来的就是柠檬酸生产原料成本的大幅上涨。因此如何改进柠檬酸发酵方法并且进一步降低成本就成了我国整个柠檬酸产业最为关心的问题。

黑曲霉发酵产柠檬酸是当前工业发酵生产柠檬酸的主要途径之一，通过细胞固定化的方法可以大幅提升黑曲霉的发酵效率。目前，细胞固定化的方法主要有四种：包埋法、交联法、共价结合法以及吸附法。对于丝状真菌来说，吸附法操作简单，固定过程不需要化学结构的改变，而且理论上适用于所有丝状真菌，更利于在工业上的推广和应用。吸附法的原理主要是依靠载体表面的基团和细胞表面的相互作用力，进而促使细胞吸附在载体表面进行生长。并且当细胞衰亡之后会从载体上脱落，同时有活性的细胞再吸附上去，形成一个动态平衡，使整个微环境形成一个高效的转化系统，整体发酵效率与游离发酵相比有明显的提升。在人们对固定化发酵机理的研究过程中发现，微生物普遍会在载体上形成生物膜，并且所形成的生物膜不同会导致固定化发酵的性能发生很大的差异。

发明内容

发明目的：为解决现有工业上黑曲霉发酵生产柠檬酸时产量低、发酵周期长的问题，本发明提供了一株葡聚糖合成调控基因VosA缺陷型的黑曲霉基因工程菌，并提供了该黑曲霉基因工程菌的构建方法及其在发酵制备柠檬酸中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供一株黑曲霉基因工程菌，该菌株中葡聚糖合成调控基因VosA失活。

该黑曲霉基因工程菌通过双交换方法，利用hyg抗性基因(潮霉素抗性基因)替换掉基因VosA部分序列的基因工程菌，基因VosA可以识别Fks(葡聚糖合酶)家族基因启动子中的VRE区域(CTTATCCGGCC)并与之结合，从而调控Fks家族基因的表达。该基因对Fks家族基因是负调控，与启动子结合后会抑制Fks的转录，从而抑制β-1,3葡聚糖的合成，继而影响了细胞壁厚度以及胞外完整性，导致疏水层的缺失，降低黑曲霉的疏水性，大大减弱了吸附性能和生物膜的形成，从而影响固定化发酵效果和柠檬酸的产量。

优选地，原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC12846。

优选地，所述葡聚糖合成调控基因VosA失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，未失活的葡聚糖合成调控基因VosA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第二方面提供该黑曲霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取原始黑曲霉的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，扩增得到基因VosA的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PAN7-1为模板，扩增得到潮霉素抗性基因；以基因VosA的上游同源臂、下游同源臂和潮霉素抗性基因为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到基因敲除片段；

(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段导入黑曲霉原生质体中进行同源重组，即得葡聚糖合成调控基因VosA失活的黑曲霉基因工程菌。

优选地，步骤(1)中原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC 12846；

优选地，步骤(2)中扩增基因VosA的上游同源臂时以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为引物；扩增基因VosA的下游同源臂时以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为引物；扩增潮霉素抗性基因时以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为引物；重叠延伸PCR扩增基因敲除片段时以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为引物。

优选地，所述基因VosA的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，基因VosA的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

本发明第三方面提供该黑曲霉基因工程菌在发酵制备柠檬酸中的应用。

优选地，以所述黑曲霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备柠檬酸。

优选地，所述固定化发酵以多孔纤维材料作为固定化介质。

更优选地，所述多孔纤维材料为碳黑纤维。

利用该葡聚糖合成调控基因VosA失活的黑曲霉基因工程菌固定化发酵生产柠檬酸的方法，具体包括如下步骤：

(1)载体制备：将多孔纤维材料用无水乙醇浸泡1～1.5h，再用水冲洗至无明显乙醇味道，烘干至恒重，得到改性多孔纤维材料；剪成大小相同，体积为0.5cm³的正方体块状载体。

(2)发酵：将活化的黑曲霉基因工程菌平板用刮孢液刮下，制成孢子液。以0.4％(v/v)的接种量接种到已经灭过菌的多孔纤维材料的发酵培养基中，发酵得到柠檬酸。

优选地，所述固定化发酵的发酵培养基配制步骤如下：称取玉米粉加水配制成浓度为200g/L-300g/L的玉米粉液；每1L发酵液加入0.5mL-1mL的液化酶，在60℃-75℃下保温35min-45min；再将玉米粉液加热至85℃-105℃，每1L发酵液加入0.5mL-1mL的液化酶，酶解45min-60min直至碘液不变蓝，过滤玉米粉液得玉米清液；向玉米清液中加入未过滤的玉米粉液，所述未过滤的玉米粉液和玉米清液的体积比为2-10:100，混匀得到固定化发酵培养基。所述液化酶中含有α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的酶活为70000-80000U/mL(1mL的酶液在pH5.5、温度85℃条件下，1min水解1mg可溶性淀粉所需要的酶量即为1个酶活单位，U/mL)。

优选地，所述固定化发酵的发酵条件如下：发酵温度为30℃-37℃，发酵时间为72h-115h，发酵转速为200rpm-330rpm。

优选地，所述多孔纤维材料为改性多孔纤维材料，改性步骤如下：将多孔纤维材料用无水乙醇浸泡1～1.5h，再用水冲洗至无明显乙醇味道(3-5次)，烘干至恒重，即得改性多孔纤维材料。浸泡时对多孔纤维材料和无水乙醇的量没有特别要求，达到浸泡目的即可。

有益效果：本发明通过基因敲除手段构建了一株葡聚糖合成调控基因VosA缺失的黑曲霉基因工程菌。该基因工程菌使黑曲霉在固定化发酵产柠檬酸过程中生物膜量减少，使载体孔径被堵死的现象得到有效缓解，增加了载体与外界的传氧传质效果，从而发挥出固定化发酵的优势，提高了柠檬酸的产量和糖转化率，缩短了发酵周期。

附图说明

图1为黑曲霉Aspergillus Niger ATCC 12846基因组的电泳图；

图2为PAN7-1质粒图谱；

图3为VosA基因上游同源臂、下游同源臂的PCR电泳图，其中，M为DL5000的DNAMarker，泳道1为VosA的上同源臂，泳道3为VosA的下同源臂，泳道5为hyg抗性表达元件；

图4为基因敲除片段的电泳图，其中M为marker泳道，1为基因敲除片段；

图5为结晶紫染色图；

图6为结晶紫染色OD值差异图；

图7为原始黑曲霉和黑曲霉基因工程菌的发酵结果。

图8为原始黑曲霉和黑曲霉基因工程菌8批次连续发酵后生产强度的差异结果

图9为原始黑曲霉的生物膜电镜图；

图10为黑曲霉基因工程菌的生物膜电镜图。

具体实施方式

实施例1黑曲霉葡聚糖合成调控基因VosA敲除菌的构建

(一)提取原始黑曲霉基因组

使用takara公司提取植物基因组的试剂盒(takara minibest plant genomicDNAextraction kit)，具体方法如下：

1.将刮取的黑曲霉孢子液取1mL接种于50mL DP培养基中，于35℃，200r/min培养24h；所述DP培养基的配方如下：10g/L糊精，5g/L蛋白胨，2.5g/L磷酸二氢钾，1g/L硝酸钠，0.5g/L硫酸镁，10g/L甘氨酸，用水再定容至100mL后分装成50mL。；

2.于8000r/min离心5min收集菌丝球，用生理盐水洗涤两次后，将收集的菌丝球用液氮研磨3次，称取100mg研磨好的粉末加入至事先加入500μL的Buffer HS II的tube管中混匀，然后加入10μL的RNase A，充分震荡混匀，于56℃水浴10min；

3.向步骤2中加入62.5μL Buffer KAC，充分混匀。冰上放置5min，12000rpm离心5min。取上清600μL，加入600μL的Buffer GB，充分混匀；

4.将Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；

5.将500μL的Buffer WA加入到Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；

6.将700μL的Buffer WB加入到Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；

7.重复步骤6一次；

8.将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2min；

9.将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入40μL的65℃灭菌水，室温静置1min。12000rpm离心2min，洗脱DNA。通过琼脂糖凝胶电泳测定黑曲霉基因组浓度如图1所示。

图1显示，M为DL15000的DNA marker，1号为提取的黑曲霉基因组。

(二)运用PCR技术扩增基因VosA上下游同源臂

以步骤(一)提取的原始黑曲霉基因组为模板，以VosA-up-F为上引物，以VosA-up-R为下引物(VosA-up-F核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，VosA-up-R核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示)扩增上游同源臂；以VosA-down-F为上引物，以VosA-down-R为下引物(VosA-down-F核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，VosA-down-R核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)扩增下游同源臂。反应体系见表1，PCR反应条件如下：(1)98℃变性10s；(2)55～65℃退火30s；(3)68℃延伸2min，步骤(1)至步骤(3)重复30次。

表1 PCR反应体系及反应条件

反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。基因VosA的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，基因VosA的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

(三)扩增hyg抗性表达元件

以PAN7-1质粒(优宝生物，PAN7-1质粒图谱见图2，核苷酸序列见SEQ ID NO:17)为模板，以VosA-hyg-F为上引物，以VosA-hyg-R为下引物(VosA-hyg-F核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，VosA-hyg-R核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)扩增hyg抗性表达元件。反应体系见表1，PCR反应条件如下：(1)98℃变性10s；(2)55～65℃退火30s；(3)68℃延伸3min，步骤(1)至步骤(3)重复30次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。其中hyg抗性表达元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

图3表示，M为DL5000的DNA Marker，1号为VosA的上同源臂，3号为VosA的下同源臂，5号为hyg抗性表达元件。

(四)扩增基因敲除片段

以VosA上游同源臂、下游同源臂及hyg抗性表达元件为模板，以VosA-F为上引物，以VosA-R为下引物(VosA-F核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，VosA-R核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示)，利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术扩增VosA基因敲除片段。反应体系见表1，PCR反应条件如下：(1)98℃变性10s；(2)55～65℃退火30s；(3)68℃延伸7min，步骤(1)至步骤(3)重复30次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图4。基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

图4表示，M为DL10000的DNA Marker，1号为基因敲除片段。

(五)黑曲霉原生质体的制备及转化

1.将黑曲霉接种到PDA平板，待长满孢子，加3mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌的5mL离心管中。

所述PDA平板的培养基配方如下：自制，称取大约200g土豆，削皮，切成1cm³大小的小块，加入600mL水，煮沸30min，然后用4层纱布过滤，得到的土豆汁用量筒定容到1L，分装成5瓶200mL。再加入20g/L的葡萄糖和15g/L的琼脂粉，115℃灭菌20min。

2.接种0.5mL孢子液到50mL DP培养基，35℃，200rpm培养13-16h。

3.孢子萌发完毕后，用神奇滤布(Miracloth)过滤，留下菌丝。

配制酶解液(裂解酶Lysing enzyme，崩溃酶，蜗牛酶各0.1g/10mL，纤维素酶400μL/10mL)，用无菌注射器过滤除菌。

4.取2g菌丝至酶液中，30℃，220rpm酶解30min；然后将转速降低至150rpm酶解3h。

5.酶解完成后，用滤纸过滤，取滤液，4℃，5000rpm离心10min。去上清，加入1mL 1M山梨醇水溶液(冰水浴)，用枪吹吸混匀，再加入15mL 1M山梨醇水溶液，离心，去上清。然后再重复一次。去掉上清，加入1mL Solution5，用枪吹吸混匀，得到原生质体。其中Solution5自制，配方：KCl 4.47g，CaCl₂ 0.735g，MOP 0.2093g，KOH调pH至6.0，用水定容至100mL。

6.吸100μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(四)中构建的基因敲除片段与之混匀。再加入50μL的Solution 4，混匀，置于冰上并计时15-30min。其中Solution4自制，配方：PEG8000 25g，CaCl2 1.47g，KCl 4.47g，10mM Tris，用盐酸调pH至7.5，用水定容至100mL。

7.20min后加入900μL的Solution4，上下颠倒几次，放置在室温并计时15-30min。15-30min后，6000rpm离心5min，弃900μL上清液，剩余菌体涂布于蔗糖浓度为1mol/L,潮霉素浓度为60mmol/L的PDA培养基中，正置培养，得到转化子。

8.挑取转化子进行菌落PCR验证。其具体方法如下：取适量转化子加入到50μL的菌落PCR缓冲液(100mM/L Tris-HCl、10mM/L EDTA、1M/L KCl)中，95℃水浴10min，取0.5μL加入PCR反应体系。PCR引物为hyg-F和hyg-R(hyg-F核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，hyg-R核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)，琼脂糖电泳显示扩增条带，表示转化成功，得到ΔVosA菌株。

实施例2结晶紫染色实验

将原始黑曲霉(Aspergillus Niger ATCC 12846)和基因工程菌分别接种到PDA平板，待长满孢子，加3mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌的5mL离心管中，用刮孢缓冲液定容到2mL，得到孢子液。用血球计数板定量并稀释至10⁶个/mL，随后继续稀释至10⁵/mL，10⁴/mL。

在24孔板中预先加入1mL的合成培养基，然后将不同浓度的孢子液取2μL接种到培养基中。35℃下静置培养36h，使黑曲霉在孔板底部成膜。之后倒掉培养基，用PBS冲洗2遍后，加入0.1％的结晶紫染色15min。之后倒掉结晶紫，用PBS冲洗2遍后，加入冰醋酸在震荡仪中放置30min，使结晶紫脱色。然后进行观察以及酶标仪检测OD570。结晶紫染色图和OD值差异图见图5和图6。

所述合成培养基的配方如下：6g/L硝酸钠，0.52g/L氯化钾，0.52g/L硫酸镁，1.52g/L磷酸二氢钾，10g/L葡萄糖，0.4mg/L生物素。

表2生物膜结晶紫染色实验在不同孢子浓度下的OD值

图5和图6结果显示，ΔVosA菌株在脱色后，紫色颜色明显比原始菌淡，在10³浓度下ΔVosA菌株的颜色已经被脱除干净，用酶标仪检测的OD值，数据结果与颜色相符。表明葡聚糖合成调控基因VosA失活后，生物膜是减少的。

实施例3基因工程菌固定化发酵实验

1.多孔纤维材料固定化介质的制备

将多孔纤维材料(孔径1mm)用无水乙醇浸泡1h，再用水冲洗至无明显乙醇味道，在65℃烘箱中烘干至恒重。剪成0.5cm³左右大小相同的载体。

2.发酵培养基的制备

称取250g/L的玉米粉放置在75℃水浴锅中，待玉米粉液达到65℃，加1mL的液化酶(60000U/L)，液化40min，之后水浴锅加热到95℃，待玉米粉液达到85℃，加1mL的液化酶，液化60min，直至碘液不变蓝，过滤玉米粉液得玉米粉清液，并加入未过滤的玉米粉液做回料[未过滤的玉米粉液和玉米清液的体积比为8％]，混匀。每100mL分装到含有2g/L载体的500mL锥形瓶中。灭菌，冷却待用。

3.发酵

(1)将冻存的黑曲霉基因工程菌和原始黑曲霉孢子接种到PDA平板上，恒温培养箱35℃培养4-5天，待其上满孢子。

(2)用刮孢子缓冲液将孢子刮下得到孢子悬浮液，取适量转接到装有100mL固定化培养基的500mL锥形瓶中，于35℃，250rpm摇床中培养96h，发酵过程中每12h取样，12000rpm离心5min，将上清液与沉淀分离，测定上清中的残糖浓度和柠檬酸产量。当残糖浓度低于5g/L时，发酵结束。其中利用NaOH滴定法测柠檬酸，用DNS法测定总糖。

其中NaOH滴定法为：取样品1mL(稀释一定浓度)加入250mL锥形瓶中，同时加入50mL纯水，用0.1429M的NaOH滴定，所消耗NaOH的量就是柠檬酸的产量。

DNS法为：

DNS的配制：称取3,5-二硝基水杨酸10g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中磁力搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用纯水定容至1000mL。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

标曲的制作方法：配制一系列浓度为0.0-1.0g/L的糖标准溶液，各浓度分别取0.5mL加入15mL离心管中，然后在每个离心管中加入0.5mL DNS溶液，

将离心管置于沸水浴中反应5min后，置于冰水中冷却，之后每个离心管中加入8mL纯水，混匀后测定波长540nm下的吸光值OD540，以0.0g/L为对照。标准溶液的浓度为纵坐标，吸光值OD₅₄₀为横坐标绘制标准曲线。

样品测量方法：样品适当稀释之后，取1mL浓硫酸加入10mL样品中于沸水浴反应15min后，置于冰水中冷却，调pH至中性，并定容到100mL，之后在稀释至适当浓度，测量方法同上。不同的糖对应不同的标曲。

图7表示ΔVosA菌株和原始菌株在发酵条件下的差异，结果显示发酵96h后，ΔVosA菌株发酵产柠檬酸的产量平均为172.1g/L，原始菌发酵产柠檬酸的产量平均为160.4g/L。转化率上，ΔVosA菌株转化率达到98.9％，与原始菌相比提高6.6％，周期也从84h减少到72h。图8表示ΔVosA菌株和原始菌株在连续发酵8批次后的生产强度的差异。从图中可以看出，ΔVosA菌株在8批次连续发酵后，发酵强度无明显下降，而原始菌株8批次后发酵强度下降了41.4％，说明ΔVosA菌株的连续发酵性能明显优于原始菌株。黑曲霉(Aspergillus Niger ATCC 12846)是一株高产柠檬酸菌株，在此基础上产量能有所提高，周期明显缩短，连续发酵效果也明显增强，可以说是在黑曲霉固定化发酵成产柠檬酸的基础上取得了很大的进步，适宜于工业生产。

实施例4 SEM观察生物膜

将固定化发酵72h后的载体取出，用PBS冲洗3遍洗掉吸附的菌丝。在-80℃冰箱放置过夜后置于冻干机中冻干。再将载体通过导电胶粘在点镜台上，20mA 30s进行喷金。然后拿到TM3000中进行观察。生物膜电镜图见图9和图10。图9表示黑曲霉原始菌株的固定化情况，图10表示ΔVosA菌株的固定化情况。可以发现，黑曲霉原始菌在载体上形成了多个球状物，这些球状物连结成膜，同时将载体的孔径堵住，影响了内部菌体的传氧传质。而ΔVosA菌株，在载体的拐角处和表面形成了少量的生物膜，没有影响内部菌体的传氧传质，有利于固定化发酵产柠檬酸。

序列表

<110> 南京高新工大生物技术研究院有限公司

<120> 一株黑曲霉基因工程菌及其构建方法和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2131

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

atgagtgcgt cgacgtttcc ggacgcttcc cttgcccgcg atactcagag gtttgtcctc 60

ccagtttgct ggaccttgtt aaaataactt ccaactctta ctcagctacc cagggcatcc 120

aactgactat gattaccagc tccgactttg acctgatcgt tcgccagcag cccaacaggg 180

cgcgcgtggc gggtgggaag gagaaaggta tgtggaatca ccggctttgc tagtctcttc 240

ggtttttctt cctgagaagc aacgccccta cggacgagca gaggttgact tgggacccgt 300

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acggtcgatc cagccaacag gccacgatgc agtccttagg aatggtcaac gcgcctggta 1680

ctcctgtatg gactccgcct accacccgtc gttaaggtcg agaagctaag aaccgtatat 1740

tattctggat agacagcgga ctcgacggga gcaatgatgc cacaaagcta ccctcgttcg 1800

caataccaga ctgggtccac aatccttcct cctttgcaac aacggaatcg aaattttgct 1860

caaggcacca acggtgcagc ggcacgaggc tactttgatc aatcttccca agcggcgaca 1920

ccgatccttc catcacaacc tattcctacc aatgaagtgg acaggtacgg ttctactcct 1980

ggccaggcgt cttttgagca tcctgcttca gcgaatggga ccccgcgatg agtggtttcg 2040

gagtgctcag ccactgtggc tcggttgctt gtggtcttga tcgatggtcg aatttgctct 2100

ggttgttctt tctctctctc tctttgcttt t 2131

<210> 2

<211> 1021

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgagacag caaacggcct gtaccccggc cagaggagta tccgcagccg attccgcgct 60

cgcccgatcg ttcttcgatc cagatgccaa gcaacgcgtt cagcgcttac ccgacaacga 120

gtagagacta tgggtactat ggacagcaga cacaccccag taagcggccg cgaatgtcgt 180

ctatagacct tgggacccga gggatgtatg acgcagatgg gcggatgcgt cagatggata 240

cgtaccctca aacggcgatc tacaatcagc cagggggcta cgcaactcct atgatgcaag 300

gctatcctgc cggacacacg gcggttccag attatgcggt tcgtctgcct gattcattac 360

ttcaaagacc ggcttgggag gacagcaatg ctcccacgaa gcgccgtctc cagaggccgg 420

atgtttctag caggatgcta acaatatagc agatgtctta cggaatccca tcctccactc 480

aggtacccca gatgcaagac cctggggcac acggtcgatc cagccaacag gccacgatgc 540

agtccttagg aatggtcaac gcgcctggta ctcctgtatg gactccgcct accacccgtc 600

gttaaggtcg agaagctaag aaccgtatat tattctggat agacagcgga ctcgacggga 660

gcaatgatgc cacaaagcta ccctcgttcg caataccaga ctgggtccac aatccttcct 720

cctttgcaac aacggaatcg aaattttgct caaggcacca acggtgcagc ggcacgaggc 780

tactttgatc aatcttccca agcggcgaca ccgatccttc catcacaacc tattcctacc 840

aatgaagtgg acaggtacgg ttctactcct ggccaggcgt cttttgagca tcctgcttca 900

gcgaatggga ccccgcgatg agtggtttcg gagtgctcag ccactgtggc tcggttgctt 960

gtggtcttga tcgatggtcg aatttgctct ggttgttctt tctctctctc tctttgcttt 1020

t 1021

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagtcttg cgcaggtggc 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaggcg gcggatttta aggacagaca gctgcgaacc 40

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccactccac atctccactc gaagtgagac agcaaacggc ct 42

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggctgaagc cgaaccaact 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggttcgcagc tgtctgtcct taaaatccgc cgcctccacc 40

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggccgtttg ctgtctcact tcgagtggag atgtggagtg gg 42

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggttcaccc ttcagctggc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctctggaga agcctggagc 20

<210> 11

<211> 1806

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcagtcttg cgcaggtggc cgcagtttgg atgcgacttt ttgtcatttc ccctccctcg 60

ctttttttcc tcgggacttg ccaatgtgcg catcatctcc atgtcgctgc ggttcctgtc 120

ggatcgtcaa ggctgataca acaccctagc ccgcatgccc aaccgtggtt gacctgactg 180

ggaacgatac cattcgacgg ccgaacagtg gccggcgttg ctctgcgatt tccggtacag 240

ctccactagg ccatttgtct ggttcaccct tcagctggct gtcctcttga ttaccagtaa 300

atttttaccc tagacttcct aattttgaca caccacgggc accacgcatt tcttttcgtg 360

gatttttgtg cgtcagagac ctgtcagagg cgactttgtt gacccatcgt tcagctaccg 420

tctgatcgct gggcggtgtt caatcccgcc acacctagtg ctcgctcgct tcaaactact 480

attgctgctg ctgctactat tattattcat ttgacttttg ggcaaatttt gttttgaagg 540

aggggcgcga aaattatttt gttttccgct tgagttggtc tgtgatttcc ctcaattatt 600

attttttttt tctctcttta ctcggccgcg cgatctgtga tgtctagacc cgggcgtcca 660

tttgaatgac ccaaacacca cggtcgcagc agagcaccat ttggattccc ggaattttct 720

tcaggtgaag gtgccaaaag aaagattggc caggcaccca cgacgtttca tcctcacgtg 780

aagaatatcc ctccaagggt gttgaaaaaa aatattactg ggaagacttc gaaagagcca 840

aagggtgaag ggaaaaaaat tttttttttt tttctttaag ggaaaggaag tctttgaata 900

acacgcaaaa acaagtgaaa taaaacaaga ccgacacata aagagagggg aggaaaaaaa 960

aaaaaaagga agcgaaaaaa gagaaaacca aaagagttta attggagaaa gaaaaaagga 1020

aaaagaaaaa agaaaaaaaa aagaaagaaa attaacaaga ggaaaataaa gaaaagttga 1080

cgaacacgct tctactacat tattttcgaa tcagagccgc agcaacaaca gcaacagcag 1140

cagcagcagc cgcaaaaccc aagcagcttt actcccctat aagagccaaa agaaagcagc 1200

ccagtcacaa gtgagaagag gtggaaaagg aagcaaagca acttagttag caatccactt 1260

gggtcgaatt ggctggttaa ggtttgtctg gaaccgtgct cggctggctc ttgccgcttg 1320

cattctgacg acaccatcca tctttttctt ccttctcggc gccgttttcg taccgcattc 1380

gcctcattgc agctcaaaaa ctacttgacg gtgctactgc aatttcggcc atccttccca 1440

gcgtcccgac gcaagtggca gcccagacgg tgttttccta cggattctcc actccggaag 1500

ttgggtcgaa ggtccagctc cagctgctac ggactgacta actagtcaat cataccgtcg 1560

tgtcccatct ttaaccaacc ccaactcccc tctttcaccc ccaccgtgta tcattctctc 1620

ttctagtgct tcgtcgaacc acaagtcgct ggctgctagg ttccagagac ccgaactctt 1680

cttccctgct gttaatccat cggttcattc tttgtttctt catcatatct cacttttccc 1740

ctggccacct tctgttgttc agacgtggtt cgcagctgtc tgtccttaaa atccgccgcc 1800

tccacc 1806

<210> 12

<211> 1972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccactccac atctccactc gaagtgagac agcaaacggc ctgtaccccg gccagaggag 60

tatccgcagc cgattccgcg ctcgcccgat cgttcttcga tccagatgcc aagcaacgcg 120

ttcagcgctt acccgacaac gagtagagac tatgggtact atggacagca gacacacccc 180

agtaagcggc cgcgaatgtc gtctatagac cttgggaccc gagggatgta tgacgcagat 240

gggcggatgc gtcagatgga tacgtaccct caaacggcga tctacaatca gccagggggc 300

tacgcaactc ctatgatgca aggctatcct gccggacaca cggcggttcc agattatgcg 360

gttcgtctgc ctgattcatt acttcaaaga ccggcttggg aggacagcaa tgctcccacg 420

aagcgccgtc tccagaggcc ggatgtttct agcaggatgc taacaatata gcagatgtct 480

tacggaatcc catcctccac tcaggtaccc cagatgcaag accctggggc acacggtcga 540

tccagccaac aggccacgat gcagtcctta ggaatggtca acgcgcctgg tactcctgta 600

tggactccgc ctaccacccg tcgttaaggt cgagaagcta agaaccgtat attattctgg 660

atagacagcg gactcgacgg gagcaatgat gccacaaagc taccctcgtt cgcaatacca 720

gactgggtcc acaatccttc ctcctttgca acaacggaat cgaaattttg ctcaaggcac 780

caacggtgca gcggcacgag gctactttga tcaatcttcc caagcggcga caccgatcct 840

tccatcacaa cctattccta ccaatgaagt ggacaggtac ggttctactc ctggccaggc 900

gtcttttgag catcctgctt cagcgaatgg gaccccgcga tgagtggttt cggagtgctc 960

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tttctctctc tctctttgct tttacctcct tggatagaca gttggacggg tgttttgctt 1080

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taaccatact acaggtgttt gattgttatt tctattcccc gttattatgt tatggttacg 1200

gctttggatc gagtgatgac ggatgatggc tggacggttg acttcattgt acatattaac 1260

ttgaaacaga atttgacatg agatgggtag cttaatggct atgctgccac ttctcgttat 1320

tattaagttg aactagcccg aagcaaatca actggtgttt gtaaggttcc ttccagcacc 1380

gaaactatat acgcggacta aggctggctg cctgaggtta ggccggatgt tgccttcctt 1440

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ctcgccttca cttctcactc cacagttgct agcattcact ctttcggcct tgctccccac 1560

tttgctctta cgatcatttt gcctacacgc agctgtgttg tctctgttgt cgtccatccg 1620

cgtctgctct gatattctta ccccaacgca tcgtcaaacc accactgtcc taatcatggc 1680

ttcctacaaa gacggaagcc gtcaagtacc tctgctccag gcttctccag aggtttcaaa 1740

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tatggtggtg agctgctaca tccccattac tgtactctgt ccgctgctca tcgagaattt 1860

ctccccttct tcggactagg tccattgtat tccgagcacg cagctatcta tcttgaacat 1920

ccgatctgcc ggggtttcta tcgtcaatac acagttggtt cggcttcagc ct 1972

<210> 13

<211> 2780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttcgcagc tgtctgtcct taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa aaatgtgacg 60

aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga gacggacgga 120

cgcagagaga agggctgagt aataagccac tggccagaca gctctggcgg ctctgaggtg 180

cagtggatga ttattaatcc gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg aaaggctggt 240

gtgcccctcg ttgaccaaga atctattgca tcatcggaga atatggagct tcatcgaatc 300

accggcagta agcgaaggag aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg cgaaatagca 360

tgccattaac ctaggtacag aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga ttcacgagat 420

agtaccttct ccgaagtagg tagagcgagt acccggcgcg taagctccct aattggccca 480

tccggcatct gtagggcgtc caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg tgtatgaaac 540

cggaaaggcc gctcaggagc tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc tggcagtcga 600

cccatccggt gctctgcact cgacctgctg aggtccctca gtccctggta ggcagctttg 660

ccccgtctgt ccgcccggtg tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc agtccaacat 720

ttgttgccat attttcctgc tctccccacc agctgctctt ttcttttctc tttcttttcc 780

catcttcagt atattcatct tcccatccaa gaacctttat ttcccctaag taagtacttt 840

gctacatcca tactccatcc ttcccatccc ttattccttt gaacctttca gttcgagctt 900

tcccacttca tcgcagcttg actaacagct accccgcttg agcagacatc accatgcctg 960

aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc 1020

tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg 1080

gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc 1140

ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg 1200

agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg 1260

aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg 1320

ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca 1380

ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg 1440

tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg 1500

ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc 1560

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cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc 1680

agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt 1740

atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg 1800

atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg 1860

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tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat 1980

gccgaccgcg ggatccactt aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat 2040

ataagatcgt tggtgtcgat gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg 2100

ataagatacg ttcatttgtc caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca 2160

tgtcaacaag aataaaacgc gttttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa 2220

tgcattaatg cattgactgc aacctagtaa cgccttncag gctccggcga agagaagaat 2280

agcttagcag agctattttc attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa 2340

gagacctacg agactgagga atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa 2400

ttgtactttg acatgctcct cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac 2460

cagcncctgg gttcgcaaag ataattgcat gtttcttcct tgaactctca agcctacagg 2520

acacacattc atcgtaggta taaacctcga aatcanttcc tactaagatg gtatacaata 2580

gtaaccatgc atggttgcct agtgaatgct ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt 2640

ttttacaact ctcctatgag tcgtttaccc agaatgcaca ggtacacttg tttagaggta 2700

atccttcttt ctagaagtcc tcgtgtactg tgtaagcgcc cactccacat ctccactcga 2760

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<210> 14

<211> 5978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggttcaccc ttcagctggc tgtcctcttg attaccagta aatttttacc ctagacttcc 60

taattttgac acaccacggg caccacgcat ttcttttcgt ggatttttgt gcgtcagaga 120

cctgtcagag gcgactttgt tgacccatcg ttcagctacc gtctgatcgc tgggcggtgt 180

tcaatcccgc cacacctagt gctcgctcgc ttcaaactac tattgctgct gctgctacta 240

ttattattca tttgactttt gggcaaattt tgttttgaag gaggggcgcg aaaattattt 300

tgttttccgc ttgagttggt ctgtgatttc cctcaattat tatttttttt ttctctcttt 360

actcggccgc gcgatctgtg atgtctagac ccgggcgtcc atttgaatga cccaaacacc 420

acggtcgcag cagagcacca tttggattcc cggaattttc ttcaggtgaa ggtgccaaaa 480

gaaagattgg ccaggcaccc acgacgtttc atcctcacgt gaagaatatc cctccaaggg 540

tgttgaaaaa aaatattact gggaagactt cgaaagagcc aaagggtgaa gggaaaaaaa 600

tttttttttt ttttctttaa gggaaaggaa gtctttgaat aacacgcaaa aacaagtgaa 660

ataaaacaag accgacacat aaagagaggg gaggaaaaaa aaaaaaaagg aagcgaaaaa 720

agagaaaacc aaaagagttt aattggagaa agaaaaaagg aaaaagaaaa aagaaaaaaa 780

aaagaaagaa aattaacaag aggaaaataa agaaaagttg acgaacacgc ttctactaca 840

ttattttcga atcagagccg cagcaacaac agcaacagca gcagcagcag ccgcaaaacc 900

caagcagctt tactccccta taagagccaa aagaaagcag cccagtcaca agtgagaaga 960

ggtggaaaag gaagcaaagc aacttagtta gcaatccact tgggtcgaat tggctggtta 1020

aggtttgtct ggaaccgtgc tcggctggct cttgccgctt gcattctgac gacaccatcc 1080

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actacttgac ggtgctactg caatttcggc catccttccc agcgtcccga cgcaagtggc 1200

agcccagacg gtgttttcct acggattctc cactccggaa gttgggtcga aggtccagct 1260

ccagctgcta cggactgact aactagtcaa tcataccgtc gtgtcccatc tttaaccaac 1320

cccaactccc ctctttcacc cccaccgtgt atcattctct cttctagtgc ttcgtcgaac 1380

cacaagtcgc tggctgctag gttccagaga cccgaactct tcttccctgc tgttaatcca 1440

tcggttcatt ctttgtttct tcatcatatc tcacttttcc cctggccacc ttctgttgtt 1500

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ggacggacgc agagagaagg gctgagtaat aagccactgg ccagacagct ctggcggctc 1680

tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg accggccgcc cctccgcccc gaagtggaaa 1740

ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc tattgcatca tcggagaata tggagcttca 1800

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aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct tccgatctgg taaaagattc 1920

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tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa atatcgtgcc tctcctgctt tgcccggtgt 2040

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ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct ccccaccagc tgctcttttc ttttctcttt 2280

cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc catccaagaa cctttatttc ccctaagtaa 2340

gtactttgct acatccatac tccatccttc ccatccctta ttcctttgaa cctttcagtt 2400

cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact aacagctacc ccgcttgagc agacatcacc 2460

atgcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 2520

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cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 3300

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tctctaattg tactttgaca tgctcctctt ctttactctg atagcttgac tatgaaaatt 3960

ccgtcaccag cncctgggtt cgcaaagata attgcatgtt tcttccttga actctcaagc 4020

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gaaacttttt tacaactctc ctatgagtcg tttacccaga atgcacaggt acacttgttt 4200

agaggtaatc cttctttcta gaagtcctcg tgtactgtgt aagcgcccac tccacatctc 4260

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gttgcttgtg gtcttgatcg atggtcgaat ttgctctggt tgttctttct ctctctctct 5280

ttgcttttac ctccttggat agacagttgg acgggtgttt tgcttttact gggaacaaga 5340

atcgggctct ggggataaat ggcgcctcgg ggatttaaaa tgggataacc atactacagg 5400

tgtttgattg ttatttctat tccccgttat tatgttatgg ttacggcttt ggatcgagtg 5460

atgacggatg atggctggac ggttgacttc attgtacata ttaacttgaa acagaatttg 5520

acatgagatg ggtagcttaa tggctatgct gccacttctc gttattatta agttgaacta 5580

gcccgaagca aatcaactgg tgtttgtaag gttccttcca gcaccgaaac tatatacgcg 5640

gactaaggct ggctgcctga ggttaggccg gatgttgcct tcctttttgg gggaaaatcc 5700

caactggagg tgggattcaa ccggcttctt cccctcgttg acagcctcgc cttcacttct 5760

cactccacag ttgctagcat tcactctttc ggccttgctc cccactttgc tcttacgatc 5820

attttgccta cacgcagctg tgttgtctct gttgtcgtcc atccgcgtct gctctgatat 5880

tcttacccca acgcatcgtc aaaccaccac tgtcctaatc atggcttcct acaaagacgg 5940

aagccgtcaa gtacctctgc tccaggcttc tccagagg 5978

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcgacagcg tctccgacct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acacagccat cggtccagac 20

<210> 17

<211> 5388

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa aaatgtgacg aactcgtgag ctctgtacag 60

tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga gacggacgga cgcagagaga agggctgagt 120

aataagccac tggccagaca gctctggcgg ctctgaggtg cagtggatga ttattaatcc 180

gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg aaaggctggt gtgcccctcg ttgaccaaga 240

atctattgca tcatcggaga atatggagct tcatcgaatc accggcagta agcgaaggag 300

aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg cgaaatagca tgccattaac ctaggtacag 360

aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga ttcacgagat agtaccttct ccgaagtagg 420

tagagcgagt acccggcgcg taagctccct aattggccca tccggcatct gtagggcgtc 480

caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg tgtatgaaac cggaaaggcc gctcaggagc 540

tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc tggcagtcga cccatccggt gctctgcact 600

cgacctgctg aggtccctca gtccctggta ggcagctttg ccccgtctgt ccgcccggtg 660

tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc agtccaacat ttgttgccat attttcctgc 720

tctccccacc agctgctctt ttcttttctc tttcttttcc catcttcagt atattcatct 780

tcccatccaa gaacctttat ttcccctaag taagtacttt gctacatcca tactccatcc 840

ttcccatccc ttattccttt gaacctttca gttcgagctt tcccacttca tcgcagcttg 900

actaacagct accccgcttg agcagacatc accatgcctg aactcaccgc gacgtctgtc 960

gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc 1020

gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat 1080

agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg 1140

ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc 1200

tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt 1260

ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc 1320

gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata 1380

tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt 1440

gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc 1500

cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata 1560

acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 1620

atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg 1680

aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt 1740

gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt 1800

cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc 1860

agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga 1920

cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagat gccgaccgcg ggatccactt 1980

aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt tggtgtcgat 2040

gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg ttcatttgtc 2100

caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag aataaaacgc 2160

gttttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcattaatg cattgactgc 2220

aacctagtaa cgccttncag gctccggcga agagaagaat agcttagcag agctattttc 2280

attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga 2340

atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct 2400

cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac cagcncctgg gttcgcaaag 2460

ataattgcat gtttcttcct tgaactctca agcctacagg acacacattc atcgtaggta 2520

taaacctcga aatcanttcc tactaagatg gtatacaata gtaaccatgc atggttgcct 2580

agtgaatgct ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt ttttacaact ctcctatgag 2640

tcgtttaccc agaatgcaca ggtacacttg tttagaggta atccttcttt ctagaagtcc 2700

tcgtgtactg tgtaagcgcc cactccacat ctccactcga cctgcaggca tgcaagcttg 2760

gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 2820

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 2880

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 2940

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 3000

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 3060

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 3120

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 3180

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 3240

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 3300

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 3360

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 3420

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 3480

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 3540

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 3600

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 3660

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 3720

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 3780

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 3840

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 3900

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 3960

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 4020

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 4080

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 4140

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 4200

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 4260

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 4320

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 4380

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 4440

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 4500

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 4560

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 4620

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 4680

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 4740

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 4800

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 4860

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 4920

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 4980

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 5040

tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 5100

accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 5160

cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 5220

gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 5280

actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 5340

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattac 5388

Claims (6)

1.黑曲霉基因工程菌在发酵制备柠檬酸中的应用，其特征在于，以所述黑曲霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备柠檬酸；所述黑曲霉基因工程菌中葡聚糖合成调控基因VosA失活，原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC12846，所述葡聚糖合成调控基因VosA失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黑曲霉基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

(1)提取原始黑曲霉的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，扩增得到基因VosA的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PAN7-1为模板，扩增得到潮霉素抗性基因；以基因VosA的上游同源臂、下游同源臂和潮霉素抗性基因为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到基因敲除片段；

(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段导入黑曲霉原生质体中进行同源重组，即得葡聚糖合成调控基因VosA失活的黑曲霉基因工程菌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵以多孔纤维材料作为固定化介质。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的发酵培养基的配制步骤如下：称取玉米粉加水配制成浓度为200g/L-300g/L的玉米粉液；每1L发酵液加入0.5mL-1mL的液化酶，在60℃-75℃下保温35min-45min；再将玉米粉液加热至85℃-105℃，每1L发酵液加入0.5mL-1mL的液化酶，酶解45min-60min直至碘液不变蓝，过滤玉米粉液得玉米清液；向玉米清液中加入未过滤的玉米粉液，所述未过滤的玉米粉液和玉米清液的体积比为2-10:100，混匀得到固定化发酵培养基。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的发酵条件如下：发酵温度为30℃-37℃，发酵时间为72h-115h，发酵转速为200rpm-330rpm。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多孔纤维材料为改性多孔纤维材料，改性步骤如下：将多孔纤维材料用无水乙醇浸泡1h-1.5h，再用水冲洗，烘干至恒重，即得改性多孔纤维材料。

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