CN111084900A - 一种脱细胞鱼皮基质的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的脱细胞鱼皮基质的制备方法，该方法包括如下步骤：1)对罗非鱼皮洗涤除杂等前处理；2)酸处理后刮除鳞衣；3)表面活性剂洗涤进行脱细胞；4)碱液洗涤；5)化学漂白剂处理；6)干燥与灭菌等后处理。本发明所制备的脱细胞鱼皮基质除了具有生产成本低、热稳定性高、无人畜共患病毒传播风险等优势外，还创新性的提出鳞衣去除技术，大大提升了产品的临床实用性；并综合应用多种技术进行病毒灭活，提高了产品的生物安全性。本发明同时公开了该脱细胞鱼皮基质作为创面敷料的应用，它可促进伤口愈合和新生组织上皮化。

Description

一种脱细胞鱼皮基质的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种新型的脱细胞鱼皮基质材料的制备方法，以及其作为创面敷料的应用。

背景技术

外科创面的正确处理是外科手术治疗成败的关键之一，而创面良好的愈合是创伤后机体功能康复的前提，因此，加快创面愈合的研究非常重要，其中对创面敷料的研制是研究的热点之一。随着对伤口愈合研究的深入，人们认识到使用敷料的目的远远不止是为了覆盖创面，敷料还必须能帮助伤口愈合。因此开发具有伤口促愈合或止血活性的功能性敷料成为当前研究的热点。目前国内临床使用的伤口敷料品牌较多，但据临床反馈，止血效果较好的全国公认的是强生的“速即纱”，但没有促愈合的功能活性；而促愈合效果较好的包括一些脱细胞真皮基质或胶原海绵敷料，因其具有止血、组织修复和促愈合等功效，在临床上有广泛的应用，比如牛源的胶原海绵、猪源的脱细胞真皮基质等。

大量研究和临床实践表明胶原蛋白具有良好的生物相容性和伤口促愈合活性。然而，哺乳动物的胶原蛋白仍然有传播动物疾病的风险，如牛海绵状脑病和口蹄疫。此外，由于宗教原因，哺乳动物胶原蛋白的应用受到限制。近年来，水产胶原蛋白因其丰富而低廉的价格逐渐引起人们的关注。

目前已用于临床的鱼胶原医疗产品并不多，2013年FDA批准的脱细胞鱼皮基质Kerecis^TM是以大西洋鳕鱼为原材料、采用WO 2011/042794所述专利技术研制而成，主要用作慢性溃疡创面的敷料。在专利WO 2011/042794中，首先将鱼皮去除杂洗净，用50mM抗坏血酸、500ppm链霉素的无菌PBS充分浸润以稳定基质内部的三维结构，再经脱氧胆酸(或者SDS与Triton X-100)脱细胞处理、Tris-HCl/胰蛋白酶混合溶液消化、预冻液处理后冷冻干燥，再经环氧乙烷灭菌而得。

然而，目前鳕鱼尚未实现大规模的人工养殖，而野生鳕鱼的原料可溯源性较差，因此以鳕鱼为原材料制备医疗产品的原料来源十分有限，加之鳕鱼作为一种深海鱼类，其胶原蛋白的热稳定性较差。另外专利WO 2011/042794所述生产流程繁琐、未设置病毒灭活工艺步骤，因此研制一种既有大量的原料供应、热稳定性又接近哺乳动物的清洁型鱼胶原产品，成为目前鱼胶原产业化亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是以罗非鱼皮为原材料，研究一种新型的脱细胞鱼皮基质制备方法，并验证了其作为创面敷料的性能。

本发明公开了一种制备罗非鱼皮脱细胞真皮基质的方法，具体而言，包括如下步骤：

1)对罗非鱼皮洗涤除杂等前处理；

2)酸处理后刮除鳞衣；

3)表面活性剂洗涤进行脱细胞；

4)碱液洗涤；

5)化学漂白剂处理；

6)干燥与灭菌等后处理。

在上述方法中，具体在步骤1)中，所述前处理包括机械除杂、和盐水浸泡的操作单元。所述盐水为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，浸泡时间0.5-12小时。

在上述方法中，具体在步骤2)中，所述刮除鳞衣之前进行酸处理，即将滤纸用酸溶液充分浸润，然后将鱼皮铺展于所述滤纸上，使含有鳞衣的一侧与滤纸充分接触1-30分钟。所述酸溶液是0.1％-3％浓度的醋酸溶液，或0.1％-3％浓度的柠檬酸溶液，或0.1％-3％浓度的磷酸溶液，或三者的任意组合。优选地，采用0.1％-3％浓度的醋酸溶液处理5-10分钟。在所述刮除鳞衣之后，要将鱼皮保存于酸碱度为pH6.0-pH8.0的缓冲液中，优选地，采用pH7.4的磷酸盐缓冲液。

在上述方法中，具体在步骤3)中，所述表面活性剂溶液为质量百分含量为0.1％-1％的Triton×100、0.1％-1％的吐温80或者0.1％-1％的脱氧胆酸钠的水溶液，优选地，采用0.1％-1％的Triton×100；所述洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间2-48小时。

在上述方法中，具体在步骤4)中，所述碱液为摩尔浓度为0.05M-0.2M的NaOH、0.05M-0.2M KOH或0.05M-0.2M氨水溶液，优选地采用0.05M-0.2M的NaOH；所述碱液洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间2-24小时。

在上述方法中，具体在步骤5)中，所述化学漂白剂为质量百分含量0.5-5％过氧化氢的水溶液，或质量百分含量0.5-5％过氧乙酸的乙醇溶液，化学漂白剂处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度0-250rpm，处理时间1-5小时。优选地，采用0.5-5％过氧化氢的水溶液处理3小时。

在上述方法中，具体在步骤6)中，所述灭菌方法为环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌或低温等离子辐照灭菌。优选地，为了减小辐照对产品的破坏采用环氧乙烷灭菌。

此外，使用本发明所生产的脱细胞鱼皮基质，以及作为创面敷料的应用也在本发明的保护范围内。所述创面敷料具有促进伤口愈合和新生组织上皮化的功能活性。

总之，本发明提供的一种罗非鱼皮的脱细胞鱼皮基质的制备方法，具有以下技术优势：

(1)与鳕鱼等冷水鱼相比，罗非鱼皮来源更广泛，原材料可溯源，且热稳定性较高，具有更佳优异的机械性能与质量可控性；

(2)与陆生动物来源的生物材料相比，罗非鱼皮无人畜共患病毒传播的风险，无宗教禁忌的限制，生产成本更低，可大大降低患者的医疗成本；

(3)创新性的鳞衣去除技术，综合酸液浸泡、机械刮除和化学漂白处理，在保持鱼皮原有机械性能的前提下，较彻底地除去黑色鳞衣以及残留鱼肉和脂肪，提高了产品的临床实用性和安全性；

(4)综合采用表面活性剂、强碱和双氧水进行病毒灭活处理，降低动物源性医用材料的残存病毒的风险。

附图说明

图1为脱细胞鱼皮基质的实物照片，为正面照。

图2为脱细胞鱼皮基质的正面的扫描电镜照片。

图3为脱细胞鱼皮基质的横截面的扫描电镜照片，呈现多层纤维结构。

图4为脱细胞鱼皮基质的H&E染色照片，放大倍数为40倍。胶原纤维成束排列，未观察到细胞核残留其中。

图5为脱细胞鱼皮基质植入大鼠皮下2周时的H&E染色照片，放大倍数为40倍，有一些炎症细胞和新生毛细血管浸润其中。

图6为脱细胞鱼皮基质植入大鼠皮下4周时的H&E染色照片，放大倍数为40倍，有一些成纤维细胞长入到样品的内部。

图7为脱细胞鱼皮基质的大鼠背部皮肤急性创面实验的大体观察图，显示鱼皮脱细胞基质敷料、市售的猪皮敷料和纱布敷料在术后1周、2周和3周的伤口愈合情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。除非有特殊说明，用液体制备的溶液浓度用体积比表示(v/v)，用固体制备的溶液浓度用重量体积比表示(w/v)，此处所述质量体积比的单位形式为g/mL。

实施例1一种脱细胞鱼皮基质的制备方法

1、前处理

取新鲜罗非鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，15℃下用1％NaCl浸泡6小时，料液比1:10(w/v)，并重复一次，沥干。此步骤主要是机械法去除鱼皮表面的污渍，有利于后续的操作。

2、刮除鳞衣

首先取一张滤纸使其充分浸润0.1％乙酸溶液，然后将鱼皮铺展于该滤纸上，使含有鳞衣的一侧与该滤纸充分接触，15分钟后取出，用刀刮除黑色的鳞衣，直至鳞衣基本刮除干净，纯水漂洗3次后暂存于pH7.4的磷酸盐缓冲液中。

3、表面活性剂洗涤

将上一步骤的鱼皮沥干，加入0.1％Triton×100(w/w)溶液，料液比1:10(w/v)，15℃，100rpm振荡24小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。此步骤可起到脱细胞作用。

4、碱液洗涤

向鱼皮中加入0.05M NaOH溶液，料液比1:10(w/v)，15℃，200rpm振荡24小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。此步骤可起到脱细胞、去除杂蛋白等抗原物质和灭活病毒等作用。

5、漂白

向鱼皮中加入0.5％过氧化氢溶液，料液比1:10(w/v)，15℃,100rpm振荡3小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干。此步骤除了漂白功能之外，还起到一定的病毒灭活的作用。

6、后处理

将鱼皮于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，最后经环氧乙烷灭菌即得。

实施例2一种脱细胞鱼皮基质的制备方法

1、前处理

取冷冻罗非鱼皮100g化冻，10℃下用5％NaCl浸泡0.5小时，料液比1:30(w/v)，并重复一次，沥干。

2、刮除鳞衣

首先取一张滤纸使其充分浸润3％柠檬酸溶液，然后将鱼皮铺展于该滤纸上，使含有鳞衣的一侧与该滤纸充分接触，1分钟后取出，用刀刮除黑色的鳞衣，直至鳞衣基本刮除干净，纯水漂洗3次后暂存于pH6.0的MES缓冲液中。

3、表面活性剂洗涤

向鱼皮中加入1％吐温80(w/w)溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡2小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。

4、碱液洗涤

向鱼皮中加入0.2M KOH溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡2小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。

5、漂白

向鱼皮中加入5％过氧化氢溶液，料液比1:30(w/v)，10℃静置处理1小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干。

6、后处理

将鱼皮于真空冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，最后经钴60辐照灭菌即得。

实施例3一种脱细胞鱼皮基质的制备方法

1、前处理

取新罗非鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，20℃下用3％KCl浸泡12小时，料液比1:20(w/v)，并重复一次，沥干。

2、刮除鳞衣

首先取一张滤纸使其充分浸润0.6％乙酸溶液，然后将鱼皮铺展于该滤纸上，使含有鳞衣的一侧与该滤纸充分接触，5分钟后取出，用刀刮除黑色的鳞衣，直至鳞衣基本刮除干净，纯水漂洗3次后暂存于pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中。

3、表面活性剂洗涤

向鱼皮中加入0.3％脱氧胆酸钠溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡48小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。

4、碱液洗涤

向鱼皮中加入0.1M氨水溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡12小时，沥干；然后用纯水漂洗3次，沥干。

5、漂白

向鱼皮中加入含1％过氧乙酸的乙醇溶液，料液比1:20(w/v)，20℃处理5小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干。

6、后处理

将鱼皮于真空冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，最后经低温等离子辐照灭菌即得。

实施例4脱细胞鱼皮基质的基本性能检测

本发明所制备的脱细胞鱼皮基质为无臭、无味、白色薄片状(图1)，表明经过酸处理刮除鳞衣和化学漂白之后，样品的黑色鳞衣和污渍已被彻底清除；样品横截面的扫描电镜照片显示具有多层纤维构造(图2)；样品经石蜡包埋、切片、H&E染色，可观察其样品中疏松有序的胶原纤维排列，且无残留的细胞核(图3)；按照YY/T 0606.25-2014规定的方法检测DNA残留，结果为每毫克干燥样品仅含有1.39±0.69ng的残留DNA。

实施例5不同的脱细胞真皮基质的热稳定性与力学性能比较

将罗非鱼皮替换为鳕鱼皮，采用实施例1所述方法制备脱细胞的鳕鱼皮基质，并以临床使用的猪皮敷料上市产品做对照，考察实施例1所制备的罗非鱼皮脱细胞基质的性能优势：

1、变性温度：用差示扫描量热分析仪进行测定，准确称取5mg样品并用生理盐水充分润湿，置于铝坩埚中加盖密封，以空坩埚作为参比，从20℃加热至80℃，温速率2℃/mi n，样品室的氮气流量20mL/mi n。

2、拉伸强度：将样品裁剪成哑铃状试样，用生理盐水充分润湿，在电子万能试验机上测定拉伸强度，拉伸速度设定为15mm/mi n。

结果显示(表1)罗非鱼样品的变性温度和力学强度显著高于鳕鱼样品，且与猪皮敷料十分接近，这表明在众多的水产当中罗非鱼皮作为脱细胞真皮基质的原材料具有一定的优势，有望替代猪皮敷料产品。

表1罗非鱼与鳕鱼的脱细胞鱼皮基质性能对比

实施例6脱细胞鱼皮基质的生物相容性评价

按照GB/T16886所述方法评价脱细胞鱼皮基质对于L929成纤维细胞的细胞毒性、对于兔耳动脉血的溶血性，以及对于SD大鼠背部皮下植入的局部反应；结果显示，其细胞毒性为0级，溶血率为1.2％，大鼠皮下植入2周时炎症反应较轻微，有大量新生血管形成(图5)，植入4周时有大量成纤维细胞浸润到样品的内部(图6)，植入12周时已被完全吸收。因此本发明所制备的脱细胞鱼皮基质具有良好的生物相容性，符合敷料类医疗器械的法规要求。

实施例7脱细胞鱼皮基质的大鼠背部皮肤急性创面修复创面动物实验

实验时预先将实施1所制脱细胞鱼皮基质以无菌生理盐水浸泡10min，植入时切割为2cm×2cm片状物使用。并以猪皮敷料上市产品做阳性对照、无菌纱布敷料作为阴性对照。

具体操作如下：SD大鼠18只，雄性，体重200-250g，麻醉后在背部剪出3个1.8cm×1.8cm全层皮肤缺损的圆形创面，分别将脱细胞鱼皮基质敷料、猪皮敷料和纱布敷料分别覆盖于三个创面，医用胶带捆绑固定。术后先后于三个时间点(1周、2周、3周)处死相应组别的6只动物，测量创面面积计算创面愈合率，并取伤口区域皮肤组织，H&E染色测量新生上皮长度。

实验结果显示，与猪皮敷料和纱布敷料相比，脱细胞鱼皮基质敷料组的炎症反应较轻微，胶原纤维排列较有序，第1周时肉芽组织肿胀程度最低，第2周时新生的上皮最多，第3周时伤口愈合率97.72％，明显优于纱布敷料组的86.65％，与猪皮敷料组的97.27％相当，在创伤末期呈现了非常显著的促进创伤愈合的作用(图7)，具有较高的临床开发价值。

上文中描述了本发明的具体实施方式，但在本领域中的普通技术人员能够理解、不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都属于本发明权利要求书限定的范围内。

Claims (12)

1.一种制备罗非鱼皮脱细胞真皮基质的方法，具体包括如下步骤：

1)对罗非鱼皮洗涤除杂等前处理；

2)酸处理后刮除鳞衣；

3)表面活性剂洗涤进行脱细胞；

4)碱液洗涤；

5)化学漂白剂处理；

6)干燥与灭菌等后处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述前处理包括机械除杂、和盐水浸泡的操作单元。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述盐水为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，浸泡时间0.5-12小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述刮除鳞衣之前进行酸处理，即将可吸水的材料用酸溶液充分浸润，然后将鱼皮铺展于所述吸水材料上，使含有鳞衣的一侧与滤纸充分接触1-30分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述可吸水的材料为滤纸；所述酸溶液是0.1％-3％浓度的醋酸溶液、柠檬酸溶液或磷酸溶液，或三者的任意组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，刮除鳞衣之后将鱼皮保存于酸碱度为pH6.0-pH8.0的缓冲液中。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述表面活性剂溶液为质量百分含量为0.1％-1％的Triton×100、吐温80或脱氧胆酸钠的水溶液，洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间2-48小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述碱液为摩尔浓度为0.05M-0.2M的NaOH、KOH或氨水溶液，碱液洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间2-24小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述化学漂白剂为质量百分含量0.5-5％过氧化氢的水溶液，或质量百分含量0.5-5％过氧乙酸的乙醇溶液，化学漂白剂处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度0-250rpm，处理时间1-5小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)中，所述灭菌方法为环氧乙烷灭菌。

11.根据权利要求1所述方法所制备的脱细胞鱼皮基质在创面敷料中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述创面敷料具有促进创面愈合和新生上皮化的功能。

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