CN111051847A

CN111051847A - 将样品直接沉积到用于液基细胞学的载玻片上的手动方法

Info

Publication number: CN111051847A
Application number: CN201880057988.1A
Authority: CN
Inventors: R·卡拉汉; C·M·怀特海德; W·A·福克斯
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2017-07-20
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2020-04-21
Also published as: AU2018302151A1; US20200150008A1; US12181385B2; WO2019018527A1; AU2018302151B2

Abstract

制备用于染色的细胞学样品的有效手动方法。根据该方法，提供生物样品，其中生物样品是液基细胞学样品。载玻片被放置在适于接收载玻片的保持件中。载玻片被预涂覆有将使细胞粘附至载玻片的组合物。沉降室被放置在所述载玻片上方，并且沉降室被锁定在保持件上。沉降室在近端和远端均具有开口。沉降室的远端的开口被定位在载玻片上，使得载玻片被插入在保持件和沉降室之间，并且载玻片与沉降室流体连通。然后将密度试剂分配到沉降室中。然后将液基细胞学样品分配到试剂上方的沉降室中。由保持件、载玻片和沉降室(及其液体内容物)形成的组件被放置在离心机中。组件在小于500g的旋转力下离心少于5分钟。从沉降室倾析密度试剂和其上的液体。从载玻片上移除沉降室。从保持件移除载玻片以进行染色。

Description

将样品直接沉积到用于液基细胞学的载玻片上的手动方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月20日提交并且通过引用并入本文的题为“Manual Methodfor Depositing a Sample Directly Onto a Slide for Liquid Based Cytology”的美国临时申请号62/534,841的优先权。

技术领域

本发明涉及在用于液基细胞学(liquid-based cytology)(LBC)的载玻片上沉积样品。

背景技术

癌症每年杀死超过800万人，占全球死亡人数的大约13％，多数来自亚太地区。细胞学已经是用于检测癌症的快速和微创的形式；筛查是快速、微创和广为接受的方法，并且在有组织筛查的国家中降低了子宫颈癌的发病率。在过去的十年中，已引入若干方法，即LBC和分子测试。例如，目前的宫颈癌筛查细胞学处理方法需要昂贵的仪器和支持的基础设施。因此，细胞学结果的成本问题、质量、敏感性和可重复性是发展中世界的重大关切。开发/发现简单、成本效益高的细胞学制备方法是实质未得到满足的临床需要。

自动筛查的挑战之一是在载玻片上制备细胞涂片。如授予Carrico,C.,Jr.等人的美国专利号5,436,831中所述，为自动筛查细胞学样品，光学透明、带阳离子电荷的基底上的单层细胞学材料是期望的。可变厚度或细胞重叠的细胞学样品在需要标准化且良好控制的样本制备程序的自动化过程中是有问题的。Carrico等人描述了通过在密度梯度上离心来分离细胞学材料，从而产生细胞学材料的堆积颗粒(packed pellet)。然后将堆积颗粒与稀释剂混合，并将等分的悬浮液置于粘附在显微镜载玻片上的沉淀容器(sedimentationvessel)中。悬浮液中带负电荷的细胞被吸引到带阳离子的载玻片上，且细胞无需离心即可沉降到下面的载玻片上。吸出多余的悬浮液，在载玻片上留下单层悬浮液。授予Carrico,C.,Jr.等人的美国专利号5,419,279描述了用于在显微镜载玻片上沉积和染色细胞学材料的沉淀容器。沉淀容器示例于图1中。附图标记12表示细长的中空管10的侧壁，该侧壁12限定内室14。要放置在显微镜载玻片上的管10的内径小于显微镜载玻片的宽度。管10还包括向外延伸的连接件凸缘16对，其与设置在侧壁12的底端处的基部元件20一体地形成。基部元件20为盘状。基部元件20为管10提供结构支撑。显然盘状或任何其它形状的基部对于实践本发明的设备不是必需的。如图1中所示，基部元件20的直径大于圆柱形侧壁12的直径。图1还显示向外延伸的连接件凸缘16各自提供有定位在凸缘16的末端处的引导凸缘18。每个引导凸缘18基本上垂直于连接件凸缘16设置，由此形成类似于字母“L”的形状。诸如O形环的密封元件22设置在管10的底端，在该底端管邻接显微镜载玻片24的表面。

如图1中所示，基部板26包括接收和限制显微镜载玻片24的凹入区域29。凹入区域29被配置和尺寸设计成与显微镜载玻片的形状相符，使得当载玻片被放置在凹入区域29中的平坦表面上时，防止载玻片基本上从一侧到另一层(side-to-side)或一端到另一端(end-to-end)移动。这促进一系列载玻片上的细胞沉积和染色，这些载玻片具有位于载玻片上大约相同位置的细胞收集，其然后促进在自动载玻片分析装备上使用载玻片。基部板26还包括从凹入区域29向外延伸的槽28a、28b，并且该槽28a、28b接收向外延伸的连接件凸缘16。在每个槽28a、28b内形成有通路30，该通路30优选地基本上平行于凹入区域29的平坦表面形成。每个槽28a、28b和通路30被配置和尺寸设计成当管10在设置于基部板26中时旋转时，接收并可释放地牢固地保持连接件凸缘16和引导凸缘18。沉淀容器在顶部打开以接收悬浮液，并在其与载玻片邻接的底部处打开。

授予Fox等人的美国专利号8,617,895描述使用预涂覆的载玻片以将样品固定在其上。基底涂覆有具有长保质期的聚阳离子聚合物涂层。聚阳离子涂层有助于将具有净负电荷的生物样品(例如组织样品)固定在涂覆的基底上。

现代技术已允许开发用于制备LBC样品的先进且高度自动化的方法。然而，在世界某些地区，由于自动化方法实施和开发的成本较高，因此不可行。因此，一直在寻求高效、可重复、低成本的制备LBC样品的方法，这些方法在可靠性和准确性方面可以与自动化方法相媲美。

发明内容

本文描述了使用简单的一步过程直接将液基细胞学样品富集并沉积在载玻片上的手动方法。根据该方法，首先搅拌样品瓶。使用常规样品涡旋仪进行搅拌。提供了被定位到载玻片保持件中的预涂覆的载玻片。然后将沉降室固定至载玻片，载玻片通过载玻片保持件被保持在适当位置。然后将密度试剂添加至沉降室中。然后将样品施加在密度试剂上。然后将载玻片、载玻片保持件和载有密度试剂和样品的沉降室的完整组件置于离心机中。离心后，将组件从离心机中移除并倒置。从载玻片倾析(decanted)不需要的材料和密度试剂。载玻片被预涂覆有在细胞学样品沉积到载玻片上时引起细胞学样品粘附到载玻片的材料。适用于本方法中的预涂覆的载玻片的一个实例是来自Becton Dickinson的

PreCoat载玻片。然后根据已知的细胞学染色方案准备对载玻片进行染色。本文描述的方法考虑可通过任何接受的染色方案对制备的载玻片进行染色。

本文描述了制备用于染色的细胞学样品的方法。手动方法包括：i)提供生物样品，其中生物样品是液基细胞学(LBC)样品；ii)将预涂覆的载玻片设置在适于接收预涂覆的载玻片的保持件中，载玻片被预涂覆有将使细胞粘附至预涂覆的载玻片的组合物；iii)将沉降室放置在预涂覆的载玻片上，并将沉降室锁定到保持件上，其中沉降室在近端和远端均具有开口。远端的开口被定位在预涂覆的载玻片上，使得预涂覆的载玻片被插入在保持件和沉降室之间，并且预涂覆的载玻片与沉降室流体连通。然后将沉降室锁定在保持件中的适当位置，从而形成保持件、预涂覆的载玻片和沉降室的组件。然后将密度试剂分配到沉降室中，其后将液基细胞学样品分配到密度试剂上方的沉降室中。被放置在沉降室中的液基细胞学样品的为约1mL至约2mL。密度试剂的量为约1至约4ml。然后将组件放置在离心机中。方法还包括以约500g或更小的旋转力将组件离心约5分钟或更短。方法的实施方式包括从沉降室上方倾析密度试剂和其上的液基细胞学样品，其后从预涂覆的载玻片上方移除沉降室，并在预涂覆的载玻片上对样品进行染色。

在进一步的实施方式中，组件在约50g至约500g的旋转力下离心约0.5至约5min。在又进一步的实施方式中，组件在约50g至约250g的旋转力下离心约0.5分钟至约5分钟。在进一步的实施方式中，组件在约200g的旋转力下离心约2至约3分钟。在进一步的实施方式中，组件在约50g的旋转力下离心约5分钟。在进一步的实施方式中，组件在约100g的旋转力下离心约2至约5分钟。在进一步的实施方式中，组件在约200g的力下离心约2至5分钟。在进一步的实施方式中，组件在约250g的力下离心约1分钟至约3分钟。合适的预涂覆的载玻片的实例是预涂覆有聚阳离子涂层的载玻片。这种聚阳离子涂层的实例是非肽、季铵聚合物涂层。非肽、季铵聚合物的一个实例是聚二烯丙基二甲基铵(PDDA)。

附图说明

图1示例了用于制备细胞学样品的现有技术组件。

图2示例了用于制备细胞学样品的现有技术方法。

图3示例了本文描述的方法的一个实施方式。

图4示例了根据方法使载玻片与沉降室耦接的载玻片保持件的个体构件。

图5示例了在保持件中耦接在一起的载玻片和沉降室。

图6示例了接种之前的沉降室。

图7示例了向沉降室添加密度试剂。

图8示例了在样品中涡旋样品。

图9示例了将样品添加到密度室。

图10示例了将组件放置在离心机中。

图11示例了离心后漂洗样品。

图12示例了在染色之前在酒精漂洗液中洗涤载玻片。

图13示例了耦接在一起的多个保持件组件。

图14比较了用图3中概述的方法制备的载玻片上的染色样品和用图2的方法制备的载玻片上的染色样品。

具体实施方式

本文参考附图详细描述实施方式，其中相同的附图标记指示相似或相同的元件。应理解，公开的实施方式仅是可以各种形式体现的本公开的实例。未详细描述公知的功能或构造，以避免在不必要的细节上使本公开模糊。因此，本文公开的具体结构和功能性细节不应被解释为限制性的，而仅作为权利要求的基础以及作为教导本领域技术人员以实际上任何适当的详细结构来不同地采用本公开的代表性基础。

授予C.Carrico,Jr.等人的美国专利号5,419,279(其通过引用并入本文)中描述了用于在显微镜载玻片上对细胞学材料进行染色的现有技术方法和设备。美国专利号5,419,279中描述的设备包括中空管，该中空管具有从其基部延伸的啮合基部元件的凸缘。基部元件具有接收载玻片的基部板。

授予C.Carrico Jr.等人的美国专利号5,346,831(其通过引用并入本文)中描述了在光学透明、带阳离子电荷的基底上产生单层细胞学材料的方法。图2中示例了现有技术方法的一个实例。示例的方法被示例为具有十个步骤。在步骤10中，将含有样品的样品瓶放置到涡旋仪中，以确保样品均质。样品通常被携带在与防腐剂、转运试剂等组合的收集装置中。在步骤20中，将密度试剂(4mL)分配到离心管中。在步骤30中，从样品瓶中吸出样品(8mL)，并将样品分配到含有密度试剂的离心管中。在步骤40中，使离心管进行“软(soft)”旋转(例如200g持续2分钟)。在步骤50中，不需要的样品部分(即非细胞构成)保持在密度梯度的顶部，并被吸出或以其他方式从离心管除去。在步骤60中，离心管被放回离心机中，并以比用于软旋转的离心速度更快的速度和比用于软旋转的时间更长的时间离心(例如，800g持续十(10)分钟)。这种离心条件被称为硬旋转。除去多余流体(即上清液)，并且离心管和剩余的样品为细胞颗粒的形式。在步骤70中，细胞颗粒被重悬于去DI水(4mL)中并混合八次。在步骤80中，样品被沉积在载玻片架携带的载玻片排中的每个载玻片上。载玻片被预涂覆有将使细胞材料粘附至载玻片的材料。本文描述了这种载玻片的实例。在步骤90中，用酒精溶液(例如95％的酒精)漂洗载玻片。在步骤100中，然后根据本领域技术人员公知的并且未在本文详细描述的常规实践从载玻片架移除载玻片并染色。

用于在载玻片上形成液基细胞学样品的其他现有技术方法使用注射器/过滤器组件或双流盒(dual flow cassette)。这些方法不需要离心。然而，这些方法采用具有过滤器的设备，其在将细胞沉积到载玻片上时可丢失细胞。

图3中示例了本文描述的新和有用方法的流程图。在本文描述的新和有用的方法的一个实施方式中，在步骤101中，恰如在现有技术方法中描述，将样品瓶涡旋。然而，在涡旋之后，在步骤102中，样品(2mL)被放置于设置在由保持件携带的载玻片上方的沉降室中。载玻片被预涂覆有使细胞材料粘附至载玻片的物质。这种物质是本领域技术人员已知的并且未在本文详细描述。沉降室中含有密度试剂(1mL)。密度试剂是本领域技术人员公知的并且未在本文详细描述。在步骤103中，沉降室(样品和密度试剂设置在其中)、载玻片和保持件的组件被放置在离心机中并进行软旋转(200g持续2分钟)。在步骤104中，沉降室中的液体内容物被倾析，然后用酒精溶液(例如95％乙醇或等效的酒精掺混物)漂洗载玻片，然后根据常规实践染色，使得可评估样品。上述方法将现有技术方法中的步骤减少了一半，并且可以用较少的处理步骤来实践，因此与现有技术方法相比，更容易以手动方式实践。

参考图4和图5，在一个实施方式中，沉降室110与保持件130中的载玻片120组装以形成组件140。载玻片是从Becton Dickinson商业获得的BD PreCoat^TM载玻片。用于将样品固定在载玻片上的预涂覆的载玻片是本领域技术人员已知的，并因此未在本文详细描述。授予W.Fox等人的美国专利号8,617,895(其通过引用并入本文)中描述了这种载玻片的实例。根据本发明的另一实施方式，用于涂覆预涂覆的基底的非肽聚合物材料包括烯丙基聚合物、乙烯基聚合物、或其组合，其优选地具有选自伯胺、仲胺、叔胺和季胺的阳离子基团。在‘895专利中描述的聚阳离子涂层的实例中有非肽、季铵聚合物，如例如，聚二烯丙基二甲基铵(PDDA)。合适的非肽聚合物材料的另一实例是聚烯丙基胺(PAA)。携带阳离子基团以将带负电荷的样品吸引到载玻片上的合适的载玻片预涂层是本领域技术人员公知的并且未在本文详细描述。

这种载玻片携带使细胞样品粘附至载玻片的涂层。载玻片保持件130适于在载玻片平台132上接收载玻片120。载玻片保持件130具有槽134，槽134将在沉降室110上接收突片(tabs)112。旋转沉降室将使突片112旋转到通道136中，从而将沉降室110固定在保持件130中。图4中示例了被锁定成与保持件130啮合的突片112。图13示例了可以接收三个载玻片/沉降室的组件140。图13中示例的组件与标准微量滴定板离心机保持件兼容。

在本文描述的涉及载玻片方法的一个实施方式中，用与已在实验室中登记的样本相关的样本编号来标记预涂覆的载玻片。在载玻片被标记之后，其被插入到载玻片保持件中，如图4和5所示例。

在本文描述的方法的一个实施方式中，样品被接收在实验室中并被指定了登记号。样品以适合LBC的格式被接收。一种这种格式是SurePath^TM防腐液收集瓶中携带的样品。用登记号标记载玻片(例如BD PreCoat^TM载玻片)。然后将载玻片放置到诸如图4中示例的保持件的保持件中。如图5中所示例，沉降室被锁定到每个载玻片上。SurePath^TM、PreCoat^TM、

是Becton Dickinson and Company(BD)的所有商标。

密度试剂(例如，BD密度

1mL)被添加到至少一个沉降室中。如本领域技术人员所知，密度试剂的量可以变化。技术人员将选择适合其特定应用的密度试剂的量。考虑约1mL至约2mL范围内的密度试剂的量是合适的。然后将样品添加到沉降室，但是在将样品添加到沉降室之前，每个样品容器被涡旋约10至约15秒(以3000rpm)。移除样品容器上的盖子，并使用标准移液器从容器吸出样品(例如，2mL)。在本文描述的方法中，样品体积为约1mL至约2mL。通过将样品牢固地抵靠沉降室的内侧放置并仅在密度试剂上方来从移液管吸头分配样品。以这种方式分配时，样品层在沉降室中的密度试剂的顶部上轻轻形成。在这方面，以角度(例如45度角)倾斜沉降室/保持件组件允许将样品轻轻分配到密度试剂上。

然后将沉降室/保持件组件装载到离心机中，并以200g进行离心2分钟，其中“g”是地球重力的量度(即g＝(1.118×10^-5)R S²，其中g是相对离心力，R是转子的半径(以厘米为单位)，且S是离心机的速度(以每分钟转数为单位))。本文描述的方法中的离心力可在约50g至500g变化，持续约0.5至约5min。在一个实施方式中，离心力为约50g至250g，持续约0.5分钟至约5分钟。在另一实施方式中，离心力为约200g，持续约2至约3分钟。在又一实施方式中，离心力为约50g，持续约5分钟。在另一实施方式中，离心力为约100g，持续约2至约5分钟。在另一实施方式中，离心速度为约200g，持续约2至5分钟。在另一实施方式中，离心力为约250g，持续约1分钟至约3分钟。离心力的其它范围包括60g至490g、70g至480g、80g至470g、90g至460g、100g至450g、110g至440g、120g至430g、130g至420g、140g至410g、150g至410g、160g至400g、170g至390g、180g至380g、190g至370g、和200g至360g。其它时间范围包括约0.6min至约4.9min、约0.7min至约4.8min、约0.8min至约4.7min、约0.9min至约4.6min、约1min至约4.5min、约1.1min至约4.4min、约1.2min至约4.3min、约1.3min至约4.3min、约1.4min至约4.2min、约1.5min至约4.1min、约1.6min至约4min、约1.7min至约3.9min、约1.8min至约3.8min、约1.9min至约3.7min、约2min至约3.6min、约2.1min至约3.6min、约2.2min至约3.5min、约2.3min至约3.4min、约2.4min至约3.3min、约2.5min至约3.4min、约2.6min至约3.3min、约2.7min至约3.2min、约2.8min至约3.1min、以及约2.9min至约3min。然而，观察到离心0.5min或更短时间导致载玻片上缺乏细胞性(例如在载玻片上形成很少的细胞)。观察到在较低的力(约50g)离心较长时间(约5分钟)，产生具有良好保存且均匀分布的细胞的载玻片。较高的力持续较长时间也提供良好细胞性。然而，大于200g的力持续大于2到3分钟的时间量，或等于或小于50g的力持续约5分钟的时间提供增加数量的炎症细胞。在100g至200g的离心速度下，对于约3至约5分钟的离心时间获得了良好的饱和度，而炎症少。在一个实施方式中，使用200g至250g的离心力，以及2至3分钟的离心时间。

在一个实施方式中，图5和13中示例的沉降室组件被放置在离心机桶中，桶适于将被离心机接收。离心机桶是本领域技术人员公知的并且未在本文详细描述。在一个实施方式中，离心机桶是设计用于96孔微量滴定板的离心机桶。这种桶非常适合于接收图13中示例的沉降室保持件。在另一实施方式中，离心机桶具有约9cm的最小直径。最小直径为约9cm的桶将接收图5的沉降室组件。

离心后，将沉降室/保持件组件从离心机中移除，并倒置在水槽(sink)或箱(bin)或其他合适的容器上，以倾析密度试剂上方的任何剩余流体。倾析后，组件可被倒置约一分钟，以确保移除所有多余的材料。通过将大约1mL的100％酒精或酒精掺混物(例如来自Becton Dickinson的BD酒精掺混漂洗液(BD Alcohol Blend Rinse))移取到沉降室中并进一步从水槽或箱或合适的容器上方倾析而从载玻片移除密度试剂和任何其它剩余的材料。乙醇是合适酒精的实例。可重复此步骤。在一些实施方式中，然后使用吸水纸从载玻片上擦干多余的液体。为避免干扰粘附到载玻片的细胞，移液管吸头被牢固地按压抵靠在沉降室内侧，并从移液管轻轻排出漂洗液。

然后从载玻片和保持件移除沉降室，并将携带有粘附细胞的载玻片放置到载玻片架中，并浸入设置在用于接收和浸入载玻片的合适容器中的100％酒精或酒精掺混漂洗液中。

制备样品后，样品被染色并使用常规技术进行评估。合适染色剂的非限制性实例包括来自Becton Dickinson的含有苏木精染色剂0.75和EA/OG染色剂的细胞学染色剂试剂盒。非妇科染色剂试剂盒的实例包括来自BD

试剂盒的苏木精染色剂0.5和EA/OrangeG染色剂。

在一个实施方式中，使用以下染色方案。普通技术人员将理解，多种不同的染色方案与本文描述的方法兼容。对于此示例性的染色方案，如上描述制备载玻片。制备的载玻片被放置在酒精(例如，BD

载玻片处理机中使用的酒精)中。载玻片在DI水中被漂洗约1分钟，然后在染色剂(例如苏木精替代物)中漂洗约90秒。用DI水进行两次漂洗，每次约30秒，随后进行两次酒精漂洗，每次约30秒。然后将载玻片上的样品染色(例如BD

EA/OrangeG Combo染色剂)。此后进行两次酒精漂洗，每次约30秒。然后将载玻片放置到有机溶剂(例如二甲苯)中约30秒，此后将染色的载玻片放置到二甲苯中直至其被使用。

参考图6至12，根据用于实践方法的各种消耗品和装备来描述方法。在一个实施方式中，使用

或等效的采样装置收集样品。刷头被直接漂洗到流体中。刷头被移除并被掉入含有例如BD SurePath^TM的收集瓶中，得到LBC样品。参考图6，携带BD PreCoat^TM的标记的载玻片220被放置在保持件230中，此后沉降室210被固定至保持件230以形成保持件组件240。如图7中所示例，约1mL的密度试剂被移取到沉降室210中。密度试剂是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于通过引用并入本文的美国专利号5,346,831中描述的herastarch、O-(2-羟乙基)-氨基果胶-氢磺酸盐(O-(2-hydroxyethyl)-aminopectin-hydrosylate)、或Percoil。参考图8，收集瓶250在涡旋仪260中被涡旋约15秒。收集瓶中有足够的体积，以允许移除上至0.5mL的细胞和流体的均质混合物以进行测试，但仍允许足够的体积用于巴氏测试(Pap testing)。如图9中所示例，在涡旋之后将样品等分到载玻片上。查看图9，约2mL的涡旋样品被移取到沉降室210中。移液管吸头280的边缘被保持抵靠在沉降室210的边缘，并且注意不破坏密度试剂的表面。图10示例了被放置在离心机290中的载玻片套件保持件组件240。在本文其它部分描述的条件下离心之后，从离心机移除保持件组件240，此后将密度室的内容物倾析，并且如图11中所示例，通过将1mL酒精掺混漂洗液移取到沉降室210中来洗涤载玻片上剩余的样品。再次，在此漂洗期间，保持移液器抵靠沉降室210的侧面，以避免从载玻片的表面逐出细胞，如图11中所示例。通过倒置将溶液倾析，并重复此步骤。然后将载玻片保持件230倒置约一分钟，此后从保持件移除沉降室210。如图12中所示例，然后将载玻片220放置在酒精漂洗液300中，此后将载玻片染色。

与其它方法的比较

将上述方法与若干其它方法进行比较。发现上述方法在图像质量、工作流程的便利性、完成方法的时间、试剂和消耗品的成本以及实施的便利性方面是优越的。为进行比较，评估了以下方法：1)用于液基细胞学(LBC)的简化步骤方法；2)用于LBC的简化试剂方法；3)注射器方法最优值系统(optimal value system)(OVS)；和4)双流盒方法。

在简化步骤方法中，涡旋含有8mL样品的瓶。将

密度试剂(DR)(4mL)移取到离心管中。移除瓶盖，并将8mL样品移取到含有密度试剂的离心管中。以200g的力将管离心2分钟，此后用巴斯德移液管从离心管吸出8mL的上层流体。然后以800g的力将管离心10分钟。将多余的流体倾析，但细胞颗粒留在管中。去离子水(4mL)被添加到含有颗粒的每个管中，并涡旋管以形成悬浮液。SurePath^TM PreCoat载玻片被放置在载玻片架中，并将

沉降室被锁定到每个载玻片上。重悬颗粒(800μl)被添加到在下面具有SurePath^TM PreCoat载玻片的沉降室。在沉降室中具有悬浮液的组件被允许静置10分钟，用于重力沉降。从沉降室倾析剩余的流体。然后用1mL的100％酒精漂洗沉降室，此后倾析沉降室。重复倾析步骤，擦干多余的液体，并使载玻片保持倒置至少1分钟。移除载玻片并保存在酒精中直至其被染色。所用的染色方案在本文其它部分描述。

在简化试剂方法中，将样品和密度试剂按以下比例添加到每个管：

使用巴斯德移液管，从瓶移除该量的样品，并缓慢地被分配到含有所述量的密度试剂的离心管中。以200g的力将管离心2分钟。使用巴斯德移液管移除密度试剂上方的流体。然后以800g的力将管离心10分钟。架被保持倒置以移除多余的流体，并使用吸水纸将管擦干。细胞颗粒保留在管中。将去离子水(4mL)添加到含有颗粒的每个管，并通过涡旋混合颗粒和水。SurePath^TM PreCoat载玻片被放置到载玻片架中，并将

沉降室锁定到每个载玻片上。将样品(800μl)添加到沉降室/预涂覆的载玻片组件中。允许悬浮液重力沉降到载玻片上10分钟。倒置组件以倾析来自沉降室的剩余流体，并使用吸水纸从沉降室擦干多余的液体。用1mL的100％乙醇漂洗沉降室，并从沉降室倾析溶液。重复此过程。从沉降室移除载玻片并允许风干。干燥后，将载玻片放置在完全浸入在含有酒精的容器中的载玻片架中。

对于注射器方法，将SurePath^TM PreCoat载玻片放置在载玻片架中。将

沉降室锁定到每个载玻片上。涡旋含有样品的瓶。将样品(3mL)转移到注射器。注射器配备有过滤器。通过过滤器从注射器排出样品，在注射器中留下0.5mL。通过抽取并分配3mL的DI水来洗涤样品，在每个分配周期结束时留下约0.5mL。重复洗涤3次。对于最后一次洗涤，将1mL样品留在注射器中，并移除过滤器。对于每个样品，将样品(1000μl)放置在沉降室/PreCoat载玻片组件中。允许样品沉降到载玻片上10分钟。倒置沉降室以倾析来自沉降室的剩余流体。使用吸水纸将多余的液体擦干。用1mL的100％酒精漂洗沉降室。从沉降室中倾析漂洗溶液。重复漂洗，并将载玻片倒置至少1分钟。允许载玻片风干，然后被放置在完全浸入在酒精中的载玻片架中。根据本文其它部分描述的方案将载玻片染色。

双流盒是不使用沉降室而将细胞学样品递送到疏水载玻片上的方法。使用小体积的样品(2mL)，并且不对样品进行离心。双流盒将样品直接过滤到载玻片上。沉积在载玻片上的洗脱液的量为约0.5mL。样品被分配到载玻片上后，根据本文描述的染色方案将载玻片染色。

令人惊讶地，在一致地产生令人满意的样品方面，本文描述的方法是对本文描述的其它方法的改进。现有技术方法被设计为避免在密度试剂和预涂覆的载玻片之间的直接接触。本方法允许在预涂覆的载玻片和密度试剂之间接触而没有不利影响。具体地，密度试剂与载玻片的直接接触不抑制样品中的细胞粘附至载玻片的能力。同样，令人惊讶地，以本文描述的体积通过密度试剂对样品进行直接离心，产生的载玻片具有与源自图2中所示传统多步程序的载玻片的诊断质量相当的诊断质量。具体地，使用这两种方法，炎症细胞、红细胞和随机细胞碎片显著减少，并随后富集诊断相关的细胞。而且，观察到细胞保留了临床诊断应用所需的足够细胞性。在这方面参考图14，利用图2的现有技术方法以及本文描述和图3中概述的方法制备载玻片。样品细胞被染色后，获得载玻片的图像。利用图3中描述方法的三张载玻片的图像为图14中的310、320和330。利用图2中描述方法的三张载玻片的图像为图14中的340、350和360。尽管图3中描述的方法比图2中描述的方法简单得多，但是通过两种方法制备的样品的外观实际上没有差异。

根据前述内容并参考各种附图，本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的范围的情况下，还可对本公开进行某些修改。尽管已在附图中显示了本公开的若干实施方式，但不旨在将本公开限制于此，因为本公开意图在范围上与本领域将允许的一样宽，并且同样地阅读说明书。因此，以上描述不应被解释为限制性的，而仅是实施方式的示例。本领域技术人员将预想在所附权利要求的范围和精神内的其它修改。

Claims

1.制备用于染色的细胞学样品的方法，所述方法包括：

提供生物样品，其中所述生物样品是液基细胞学(LBC)样品；

将预涂覆的载玻片设置在适于接收所述预涂覆的载玻片的保持件中，所述载玻片被预涂覆有将使细胞粘附至所述预涂覆的载玻片的组合物；

将沉降室放置在所述预涂覆的载玻片上，并将所述沉降室锁定到所述保持件上，其中所述沉降室在近端和远端均具有开口，其中所述远端的所述开口被定位在所述预涂覆的载玻片上，使得所述预涂覆的载玻片被插入在所述保持件和所述沉降室之间，并且所述预涂覆的载玻片与所述沉降室流体连通；

将所述沉降室锁定在所述保持件中的适当位置，从而形成所述保持件、所述预涂覆的载玻片和所述沉降室的组件；

将密度试剂放置到所述沉降室中；

将所述液基细胞学样品添加到所述密度试剂上方的所述沉降室中；

将所述组件放置到离心机中；

将所述组件在约500g或更小的旋转力下离心约5分钟或更短；

从所述沉降室倾析所述密度试剂和其上的所述液基细胞学样品；

从所述预涂覆的载玻片上移除所述沉降室；以及

在所述预涂覆的载玻片上对所述样品进行染色。

2.权利要求1所述的方法，其中所述组件在约50g至约500g的旋转力下离心约0.5至约5min。

3.权利要求2所述的方法，其中所述组件在约50g至约250g的旋转力下离心约0.5分钟至约5分钟。

4.权利要求3所述的方法，其中所述组件在约200g的旋转力下离心约2至约3分钟。

5.权利要求3所述的方法，其中所述组件在约50g的旋转力下离心约5分钟。

6.权利要求3所述的方法，其中所述组件在约100g的旋转力下离心约2至约5分钟。

7.权利要求3所述的方法，其中所述组件在约200g的力下离心约2至5分钟。

8.权利要求3所述的方法，其中所述组件在约250g的力下离心约1分钟至约3分钟。

9.权利要求1所述的方法，其中所述预涂覆的载玻片被预涂覆有聚阳离子涂层。

10.权利要求9所述的方法，其中所述聚阳离子涂层是非肽、季铵聚合物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述非肽、季铵聚合物包括聚二烯丙基二甲基铵(PDDA)。

12.权利要求1所述的方法，其中放置在所述沉降室中的所述液基细胞学样品的量为约1mL至约2mL。

13.权利要求1所述的方法，其中密度试剂的量为约1至约4mL。