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CN111051525A - 包封单细胞的方法、包封的单细胞及其用途 - Google Patents

包封单细胞的方法、包封的单细胞及其用途 Download PDF

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CN111051525A
CN111051525A CN201980003311.4A CN201980003311A CN111051525A CN 111051525 A CN111051525 A CN 111051525A CN 201980003311 A CN201980003311 A CN 201980003311A CN 111051525 A CN111051525 A CN 111051525A
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nucleic acid
cell
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Application number
CN201980003311.4A
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F·J·斯特梅斯
R·兰吉
S·诺贝格
L·克里斯琴森
D·K·波霍洛克
张帆
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Original Assignee
Illumina Inc
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Abstract

本文提供的系统、方法和组合物的实施方案涉及包封单细胞的空心珠。一些实施方案包括对包封在空心珠内的单细胞进行多次共分析，包括核酸测序、制备核酸文库、测定甲基化状态、识别基因组变体或蛋白质分析。

Description

包封单细胞的方法、包封的单细胞及其用途
技术领域
本文提供的系统、方法和组合物涉及包封单细胞的空心珠、制备空心珠的方法以及使用空心珠在包封的细胞上进行多个共分析的方法，包括例如空间索引测序和核酸文库制备。
背景技术
生物样品中存在的特定核酸序列的检测已被用作例如用于鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症有关的遗传变化、研究对疾病的遗传易感性以及测量对各种类型的治疗的反应的方法。用于检测生物样品中的特定核酸序列的常用技术是核酸测序。
下一代测序仪是功能强大的工具，其每次测序运行都会生成大量的基因组数据。解释和分析该大量数据可能具有挑战性。单细胞DNA测序正在成为用于研究基因组异质性的一种工具。具体而言，可以通过仅从单细胞获得的DNA序列来对携带多个重复基因组区域的微生物组进行测序。由于在多个分析中限制和访问单细胞内的细胞内生物分子中存在的挑战，在单细胞上进行多个酶反应是不可靠的。例如，许多基于细胞的分析不能固定细胞内分子，从而导致在分析进行的过程中生物分子的损失。
发明内容
本公开涉及用于在单细胞上执行多个共分析(co-assay)的系统、方法和组合物，其中所述单细胞被包封在空心珠内，使得该单细胞被限制以便执行多个共分析，包括例如裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签化(tagmentation)、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质的分析(ATAC-seq)、邻近性保持转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增，或者在单细胞上顺序执行的其任何组合。
本文提供的一些实施方案涉及包封单细胞的空心珠。在一些实施方案中，空心珠包含聚合物壳和布置在聚合物壳内的单细胞。在一些实施方案中，聚合物壳包含允许试剂扩散通过该聚合物壳而同时保留该单细胞的孔隙。
进一步的实施方案涉及对包封在空心珠内的单细胞进行多个顺序共分析的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得如本文所述的空心珠(其中该空心珠包封单细胞)，和使该单细胞与试剂顺序接触以进行多个顺序的共分析。
本文提供的一些实施方案涉及将单细胞包封在空心珠内的方法。在一些实施方案中，该方法包括将单细胞与聚合物混合以形成混合物，将该混合物与交联油混合以形成包封该单细胞的聚合物壳，其中该聚合物壳包含允许试剂扩散通过该聚合物壳则同时保留该单细胞的孔隙。
附图说明
图1是可用于制备包封细胞的空心珠的微流体液滴发生器系统的实施方案的示意图。
图2描绘了空心珠的实施方案的显微图像和示意表示，所述空心珠在水性缓冲液的存在下能够扩大尺寸。显微图像描绘了处于各种状态的珠，包括(从左到右)：脱水珠；最初与水相接触的珠；开始溶胀的珠；和完全溶胀的珠。
图3是显示用于通过温度或化学手段来提高珠孔隙率的实施方案的示意图。如图3所示，提高珠孔隙率可以增加颗粒对珠的流入或流出，并且控制孔隙率提供了对流入或流出珠的颗粒(包含粒径)的控制。
图4是说明通过在单细胞上沉积聚合物的单体单元进行的无装置细胞包封的方法的实施方案的示意图。
图5是说明通过无装置方法形成的聚合物内包封的细胞的实施方案的示意图，其中聚合物壳通过与特定结合分子的特异性相互作用而附着于细胞。
图6描绘了用荧光染料染色的珠的显微图像，其描绘了包封在珠内的细胞。该显微图像描绘了(从左到右)：用巯基特异性的，靶向游离的PEG-马来酰亚胺的荧光团染色；用靶向游离-SH基团的德克萨斯红荧光团染色；和Hoechst染色的细胞核染色。
图7是显示对包封细胞的空心珠进行多个共分析的方法的实施方案的示意图。图7显示了进行标签化以产生ATAC-seq片段、反转录以启动cDNA合成以及产生索引文库的PCR反应的实施方案。
图8是显示对包封细胞的空心珠进行多个共分析的方法的实施方案的示意图。图8显示了进行标签化以产生ATAC-seq片段、反转录以启动cDNA合成以及具有用于全长RNA测序的随机延伸的PCR反应以产生索引文库的实施方案。
图9是显示对包封细胞的空心珠进行多个共分析的方法的实施方案的示意图。图9显示了使用两轮索引的分割连接和一轮索引PCR的三层组合索引方法。
图10是显示对包封细胞的空心珠进行多个共分析的方法的实施方案的示意图。图10显示了用于索引转座体的组合索引的多个共分析。
图11是显示对包封细胞的空心珠进行多个共分析的方法的实施方案的示意图。图11显示了用于单细胞全基因组扩增的多个共分析。
图12是流程图，其示出了用包封细胞的空心珠制备全基因组文库的方法的实施方案。
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了构成其部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相似的符号通常标识相似的组件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的和附图所示的，本公开的各方面可以以各种不同的配置进行布置、替换、组合、分离和设计，其中所有这些均在本文中明确考虑。
本文提供的实施方案涉及包封单细胞的空心珠，制备空心珠的方法以及对包封在空心珠内的单细胞进行多个共分析的方法。空心珠可以包含水凝胶聚合物和交联剂，它们在细胞的存在下混合，并形成包封细胞的空心珠。空心珠可以包含允许试剂扩散通过空心珠，同时将细胞保留在空心珠内的孔隙，从而允许反应在空心珠内发生。在一些实施方案中，空心珠使得能够在维持细胞邻近性(contiguity)的同时对同一单细胞进行共分析。特别地，本文提供的方法、系统和组合物允许限制和访问包封细胞内的细胞内生物分子。因此，在一些实施方案中，本文所述的空心珠在本文中称为邻近性颗粒。因此，本文所用的术语“邻近性颗粒”是指包封单细胞的空心珠。
本文所述的邻近性颗粒可用于下一代细胞区室化方法，并允许在单个细胞上进行多分析物测定。本文所述的邻近性颗粒和使用方法有效地允许单独地分析数百万个细胞，从而降低了样品制备的成本并保持了样品邻近性。本文所述的组合物和方法无需使用外部区室化策略(微流体)如乳化、固定或其他微隔室来维持细胞邻近性。
在一些实施方案中，如本文所述的邻近性颗粒可以用于分析中以分析单细胞。可以在单细胞上进行的分析可包括，例如，细胞裂解、DNA分析、RNA分析、核酸测序、蛋白质分析、标签化、核酸扩增、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质的分析(ATAC-seq)、邻近性保持转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增，或者顺序执行的其任何组合。
邻近性颗粒用于在单细胞上执行一个或多个测定的用途可以在多个邻近性颗粒上同时进行，以便在多个单细胞上同时进行共分析，例如从10,000到1百万个单细胞，例如10,000、50,000、100,000、500,000或1百万个单细胞。
可以工程设计邻近性颗粒的孔径以允许诸如酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bp)的试剂扩散，同时在进行一个或多个分析过程中保留单细胞本身或保留其他较大的颗粒(例如较大的核酸(>300bp))在空心珠内部。
如本文所用，术语“试剂”描述了可用于与样品反应、相互作用、稀释或添加至样品的药剂或两种或更多种药剂的混合物，并且可包括用于本文所述分析中的药剂，包括用于裂解、核酸分析、核酸扩增反应、蛋白质分析、标签化反应、ATAC-seq、CPT-seq或SCI-seq反应或者其他分析的试剂。因此，试剂可以包括例如，缓冲剂、化学品、酶、聚合酶、尺寸小于50个碱基对的引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在一些实施方案中，试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。
邻近性颗粒
在一些实施方案中，空心珠具有由水凝胶组合物制备的聚合物壳。如本文所用，术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然的或合成的)通过共价、离子或氢键交联以形成截留水分子的三维开放晶格结构而形成凝胶时形成的物质。在一些实施方案中，水凝胶可以是生物相容性水凝胶。如本文所用，术语“生物相容性水凝胶”是指形成对活细胞无毒并且允许氧气和营养物质充分扩散到截留的细胞以保持活力的凝胶的聚合物。在一些实施方案中，水凝胶材料包括藻酸盐、丙烯酰胺或聚乙二醇(PEG)、PEG-丙烯酸酯、PEG-胺、PEG-羧酸酯、PEG-二硫醇、PEG-环氧化物、PEG-异氰酸酯、PEG-马来酰亚胺、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚苯乙烯磺酸酯(PSS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPON)、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、聚环氧丙烷(PPO)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、肝素、藻酸硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合或混合物。在一些实施方案中，水凝胶是藻酸盐、丙烯酰胺或PEG基材料。在一些实施方案中，水凝胶是具有丙烯酸酯-二硫醇、环氧化物-胺反应化学性的基于PEG的材料。在一些实施方案中，水凝胶形成聚合物壳，其包含PEG-马来酰亚胺/二硫醇油、PEG-环氧化物/胺油、PEG-环氧化物/PEG-胺或PEG-二硫醇/PEG-丙烯酸酯。在一些实施方案中，选择水凝胶材料以避免产生可能破坏细胞内生物分子的自由基。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包含60-90％的流体，例如水，和10-30％的聚合物。在某些实施方案中，水凝胶的水含量为大约70-80％。如本文所使用的，术语“大约”或“近似”在修饰数值时是指数值中可能存在的变化。例如，通过特定基质或成分的制造中的差异可能发生变化。在一个实施方案中，术语“大约”是指所述数值的1％、5％或至多10％之内。
如本文所用，聚合物壳是空心珠的聚合物表面，其具有内部包封单细胞的壳体。由于本文所述的空心珠的性质，邻近性颗粒可以在多个分析后保留遗传物质，并且可以通过物理力、切割化学物质或根据聚合物壳的厚度通过产生渗透失衡来释放。
可以通过使亲水性生物聚合物或合成聚合物交联来制备水凝胶。因此，在一些实施方案中，水凝胶可包含交联剂。如本文所用，术语“交联剂”是指当与合适的基础单体反应时可以形成三维网络的分子。可以包含一种或多种交联剂的水凝胶聚合物的实例包括但不限于，透明质酸、壳聚糖、琼脂、肝素、硫酸盐、纤维素、藻酸盐(包括藻酸硫酸盐)、胶原蛋白、葡聚糖(包括硫酸葡聚糖)、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶(包括A型明胶)、琼脂糖、(甲基)丙烯酸酯-低聚丙交酯-PEO-低聚丙交酯-(甲基)丙烯酸酯、PEO-PPO-PEO共聚物(Pluronics)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙烯亚胺)、聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。因此，例如，组合可以包含聚合物和交联剂，例如聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/聚环氧丙烷(PPO)。在一些实施方案中，聚合物壳包含四臂聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，该四臂聚乙二醇(PEG)选自PEG-丙烯酸酯、PEG-胺、PEG-羧酸酯、PEG-二硫醇、PEG-环氧化合物、PEG-异氰酸酯和PEG-马来酰亚胺。
在一些实施方案中，交联剂是即时交联剂或慢速交联剂。即时交联剂是立即交联水凝胶聚合物的交联剂，并且在本文中也称为点击化学物质。即时交联剂可包括二硫醇油+PEG-马来酰亚胺或PEG环氧化物+胺油。慢速交联剂是缓慢交联水凝胶聚合物的交联剂，并且可以包括PEG-环氧化物+PEG-胺或PEG-二硫醇+PEG-丙烯酸酯。慢速交联剂可能花费超过几个小时来交联，例如，花费超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个小时来交联。在本文提供的一些实施方案中，邻近性颗粒通过即时交联剂配制，且从而与慢速交联剂相比更好地保持细胞状态。不希望受到理论的束缚，在较长的交联时间中，细胞可能通过细胞内信号传导机制发生生理变化。
在一些实施方案中，交联剂在水凝胶聚合物中形成二硫键，从而连接水凝胶聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物形成具有孔隙的水凝胶基质(例如，多孔水凝胶基质)。这些孔隙能够在聚合物壳内保留足够大的颗粒，例如单细胞或从中提取的核酸，但允许其他材料(例如试剂)穿过这些孔隙，从而进出空心珠。在一些实施方案中，通过改变聚合物的浓度与交联剂的浓度的比率来精细调节聚合物壳的孔隙大小。在一些实施方案中，聚合物与交联剂的比率为30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20或1:30，或在由上述比率中的任何两个限定的范围内的比率。在一些实施方案中，可以将附加的功能(例如，DNA引物或带电化学基团)接枝到聚合物基质上，以满足不同应用的要求。
如本文所用，术语“孔隙率”是指由开放空间(例如孔隙或其他开口)组成的水凝胶的体积分数(无量纲)。因此，孔隙率测量材料中的空白空间，且是空白的体积占总体积的分数，为0到100％(或0到1)之间的百分比。水凝胶的孔隙率可在从0.5至0.99，从大约0.75至大约0.99或从大约0.8至大约0.95的范围内。
聚合物壳可以具有允许试剂充分扩散，同时伴随地保留单细胞或从中提取的核酸的任何孔隙大小。如本文所用，术语“孔隙大小”是指孔隙的横截面的直径或有效直径。术语“孔隙大小”还可以指基于多个孔隙的测量值的孔隙横截面的平均直径或平均有效直径。非圆形横截面的有效直径等于具有与该非圆形横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方案中，当水凝胶水化时，水凝胶可溶胀。然后孔隙大小的尺寸可以根据水凝胶中的水含量而改变。在一些实施方案中，水凝胶的孔隙可具有足以将包封的细胞保留在水凝胶内，但允许试剂通过的尺寸的孔隙。在一些实施方案中，聚合物壳的内部是水性环境。在一些实施方案中，布置在聚合物壳内的单细胞不与聚合物壳相互作用和/或不与聚合物壳接触。在一些实施方案中，聚合物壳在细胞周围形成(如本文中更详细地描述的)，并且因为聚合物壳由于被动吸附或以靶向的方式(例如通过与抗体或其他特异性结合分子连接)而被带到细胞表面，细胞与聚合物壳接触。
在一些实施方案中，邻近性颗粒具有足以包封单细胞的尺寸。在一些实施方案中，邻近性颗粒的直径为大约20μm至大约200μm，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm，或者在上述任意两个值定义的范围内的直径。由于环境因素，邻近性颗粒的尺寸可能发生变化。在一些实施方案中，当邻近性颗粒与连续油相分离并浸入水相中时，它们会膨胀，如图2所示。在一些实施方案中，邻近性颗粒的膨胀增加了对所包封的细胞内的遗传物质进行分析的效率。在一些实施方案中，邻近性颗粒的膨胀为索引插入物在PCR期间扩增创造了更大的环境，否则其可能局限于当前基于细胞的分析。
在一些实施方案中，孔隙大小被充分增加以保留被包封的细胞，但是允许提取的核酸扩散通过聚合物壳，如图3所示。在一些实施方案中，可以通过改变交联化学来控制邻近性颗粒的孔隙大小。可以通过改变邻近性颗粒的环境来进一步改变最终交联的孔隙大小，例如，通过改变盐浓度、pH或温度，从而允许固定的分子从邻近性颗粒释放。
在一些实施方案中，交联剂是可逆交联剂。在一些实施方案中，可逆交联剂能够使水凝胶聚合物可逆地交联，并且能够在切割剂(cleaver)存在下去交联。在一些实施方案中，可以通过存在还原剂，通过升高的温度或通过电场来切割交联剂。在一些实施方案中，可逆交联剂可以是N,N’-双(丙烯酰基)胱胺，一种聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中在合适的还原剂存在下二硫键可以被断裂。如图3所示，可以通过温度或化学方法来提高珠的孔隙率，从释放交联剂与还原剂的接触使交联剂的二硫键断裂，从而使空心珠破裂。空心珠降解并释放内容物，例如保留在其中的核酸。在一些实施方案中，通过将温度升高至大于50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃来切割交联剂。在一些实施方案中，通过使空心珠与还原剂接触来切割交联剂。在一些实施方案中，还原剂包含膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别为2,3-二羟基-1,4-二硫代丁烷的顺式和反式异构体)、2-巯基乙醇或β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙醇酸、2,3-二巯基丙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THP)或对-[三(羟甲基)膦]丙酸(THPP)。
在一些实施方案中，升高温度以增加扩散或与还原剂接触使交联剂降解，从而从邻近性颗粒释放包封的遗传物质。
在一些实施方案中，交联剂的交联在邻近性颗粒内建立孔隙。在一些实施方案中，聚合物壳中的孔隙的尺寸是可调节的，并且被配制为包封细胞或大于大约300个碱基对的核酸，但允许较小的颗粒(例如试剂)或小于大约50个碱基对的较小的尺寸的核酸(例如引物)穿过孔隙。在一些实施方案中，试剂包括用于处理遗传物质的试剂，例如用于从细胞分离核酸，用于扩增或测序核酸或用于制备核酸文库的试剂。在一些实施方案中，试剂包括，例如，溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂或二价阳离子。
可以在邻近性颗粒内使用的示例性细胞类型可以包括，例如，从组织活检(例如，来自具有诸如结肠、乳腺、前列腺、肺、皮肤癌的疾病或感染病原体的组织等)分离的细胞和来自相同的组织(例如，来自相同患者)的正常细胞；在组织培养中生长的细胞，其是永生化的(例如，具有增殖性突变或永生化转基因的细胞)、感染病原体的或者经过(例如，用环境或化学剂，例如肽、激素、温度变化、生长条件、物理应激、细胞转化等)处理的和正常的细胞(例如，除了未永生化、感染或凸显等外与实验细胞另外相同的细胞)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年哺乳动物或暴露于某种条件的哺乳动物分离的细胞，以及来自相同物种(例如，来自健康或年轻的同一家族)的哺乳动物的细胞；以及来自同一哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，一个细胞是例如哺乳动物中另一细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可以比较不同类型的细胞(例如，神经元和非神经元细胞)或不同状态的细胞(例如，在对细胞的刺激之前和之后)。在另一个实施方案中，实验材料是易受病原体(例如，病毒，例如，人免疫缺陷病毒(HIV)等)感染的细胞，而对照材料是对病原体感染具有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中，样品对由未分化的细胞(例如，干细胞)和分化的细胞代表。来自酵母、植物和动物(例如鱼、鸟、爬行动物、两栖动物和哺乳动物)的细胞可以用于本发明的方法。在某些实施方案中，可以使用哺乳动物细胞，即来自小鼠、兔子、灵长类或人的细胞或者其培养的衍生物。
制备邻近性颗粒的方法
本文提供的一些实施方案涉及将单细胞包封在聚合物壳内以形成邻近性颗粒的方法。在一些实施方案中，获得包含将被包封在邻近性颗粒内的细胞的样品。在一些实施方案中，可以在将细胞包封在邻近性颗粒中之前用固定剂固定细胞。如本文所用，固定剂通常是指可以固定细胞的试剂。例如，固定的细胞可以稳定细胞中的蛋白质复合物、核酸复合物或蛋白质-核酸复合物。合适的固定剂和交联剂可包括，基于醇或醛的固定剂、甲醛、戊二醛、基于乙醇的固定剂、基于甲醇的固定剂、丙酮、乙酸、四氧化锇、重铬酸钾、铬酸、高锰酸钾、汞制剂(mercurials)、苦味酸盐、福尔马林、多聚甲醛、胺反应性NHS-酯交联剂，例如，辛二酸双[磺基琥珀酰亚胺基酯](BS3)、3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯](DTSSP)、乙二醇双[磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](磺基-EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSG)、二硫代双[琥珀酰亚胺基丙酸酯](DSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](EGS)、NHS-酯/二吖丙啶交联剂如NHS-二吖丙啶、NHS-LC-二吖丙啶、NHS-SS-二吖丙啶、磺基-NHS-二吖丙啶、磺基-NHS-LC-二吖丙啶和磺基-NHS-SS-二吖丙啶。在一些实施方案中，固定细胞保持了细胞的内部状态，从而防止了在将细胞包封在邻近性颗粒内的过程中细胞的改变。
在一些实施方案中，通过静态方式(例如，通过单细胞微孔/微阵列方法或显微解剖方法)来制备邻近性颗粒，而不需要微流体装置。因此，在一些实施方案中，通过无装置方法制备本文所述的邻近性颗粒。无装置的方法可以包括通过使细胞与聚合物接触而在细胞表面上引发聚合反应，从而在细胞周围形成聚合物壳。聚合反应的引发可以通过单体单元上的活性基团与膜蛋白的特定部分、聚糖或其他小分子的化学反应而发生。单体聚合的初始步骤之后可以进行通过静电力或疏水力促进的一轮或几轮单体单元沉积。一些单体层可以包含官能团，例如，生物素或其他配体，这些官能团之后可用于特异捕获包封的细胞。例如，如图4所示，包埋的细胞可以包含生物素，并且用磁性链霉亲和素珠涂覆包埋的细胞将使其具有磁性，从而实现自动化和容易的处理。或者，当通过被动吸附或以靶向方式(例如，与抗体或其他特异性结合分子连接)将引发剂分子带到细胞表面并促进局部聚合物扩增时，可以通过光或其他物理或化学方式来初始化活细胞或固定细胞的包封，如图5所示。
以靶向的表面引发的聚合方法包封细胞使用户能够特异性地选择感兴趣的细胞，并同时为后续的下游分析制备细胞，从而将流分选与单细胞分析相结合。可以使用细胞分离试剂盒进行特定细胞类型的富集，该试剂盒使用磁性标记的珠或对偶联于富集表面的某些细胞膜蛋白特异性的定制结合分子。
在一些实施方案中，通过动态方式(例如，通过涡旋辅助乳化、微流体液滴产生或基于阀的微流体装置)制备邻近性颗粒。如本文所用，涡旋辅助乳化是指在容器中(例如管、小瓶或反应容器中)使水凝胶聚合物与细胞(包括本文所述的固定细胞)一起涡旋。可以例如，通过手动或机械涡旋或摇动来混合组分。在一些实施方案中，手动混合产生具有直径20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的尺寸，或者在上述任意两个值定义的范围内的尺寸的包封遗传物质的空心珠。在一些实施方案中，珠的尺寸是不均匀的，且因此，珠的尺寸包括各种直径的珠。
在一些实施方案中，通过微流体流技术制备邻近性颗粒。微流体流包括使用微流体装置用于辅助凝胶乳液的产生，如图1所示。在一些实施方案中，微流体装置包含微通道，其配置成产生所需大小的邻近性颗粒并且配置成每个邻近性颗粒包封单细胞。在一些实施方案中，微流体装置的高度为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm，或在由上述任意两个值定义的范围内的高度。在一些实施方案中，微流体装置包括一个或多个通道。在一些实施方案中，微流体装置包括用于引入已经引入到聚合物中的细胞(包括固定细胞)的通道、用于引入交联剂的通道以及用于不混溶流体的通道。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是相同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是不同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、135、140、145或150μm，或者在上述任意两个值定义的范围内的宽度。通道的宽度和高度不必然限于本文所述的值，并且本领域技术人员将认识到，邻近性颗粒的尺寸将部分地取决于微流体装置的通道的尺寸。因此，可以通过改变通道的尺寸来部分地调整邻近性颗粒的尺寸。除了微流体装置的尺寸和通道的宽度之外，通道的流速也可能影响邻近性颗粒的尺寸，并且还可能影响包封在每个邻近性颗粒内的细胞的数量。
在一些实施方案中，聚合物中的细胞(包括与聚合物混合的固定细胞)通过微流体通道的流速为1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μL/分钟，或上述任何两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，微流体通道中交联剂的流速为1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μL/分钟，或在上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，微流体通道中不混溶流体的流速为20、30、50、80、100、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375或400μL/分钟，或上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，与聚合物混合的细胞(包括与聚合物混合的固定细胞)与交联剂在微流体液滴发生器中不混溶流体的上游彼此接触。邻近性颗粒在与交联剂接触时开始形成，从而将细胞包封在聚合物壳内。形成的邻近性颗粒继续以小于不混溶流体流速的流速通过微流体液滴发生器流入不混溶流体(例如，隔离油(spacer oil)和/或交联油)中，从而形成液滴。在一些实施方案中，不混溶流体分两个阶段引入，如图1所示，包括作为隔离油和作为交联剂油。在一些实施方案中，隔离油是矿物油、烃油、硅油、氟碳油或聚二甲基硅氧烷油，或其混合物。本文所用的隔离油用于避免聚合物在通道水-油界面处交联。
在一些实施方案中，邻近性颗粒通过与即时交联剂交联而立即形成。例如，使用微流体液滴发生器用聚合物如四臂PEG马来酰亚胺或环氧化物包封的细胞可以使用可溶于油(如，矿物油或氟碳油(如HFE-7500))中的交联剂即时交联，从而形成交联油。在一些实施方案中，交联油包括甲苯、丙酮、四氢呋喃与二硫醇、胺官能团，如在甲苯3,4-二硫醇、2,4-二氨基甲苯、己烷二硫醇的情况下，其易于扩散到形成的液滴中，从而即时交联邻近性颗粒。
在一些实施方案中，邻近性颗粒配制成均匀的尺寸分布。在一些实施方案中，通过调节微流体装置的尺寸、一个或多个通道的尺寸或通过微流体通道的流速来精细调节邻近性颗粒的尺寸。在一些实施方案中，所得的邻近性颗粒的直径范围为从20至200μm，例如，20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm，或者在上述任意两个值定义的范围内的直径。
在一些实施方案中，可以通过在颗粒形成之前使水凝胶聚合物与流体改性剂(例如，与醇，包括异丙醇)接触来进一步控制邻近性颗粒的尺寸和均匀性。在不存在异丙醇的情况下，形成的邻近性颗粒的直径大于存在异丙醇的情况下形成的邻近性颗粒的直径。异丙醇影响水凝胶聚合物的流体特性，从而允许调节邻近性颗粒的尺寸。
如本领域技术人员将认识到的，图1所示的微流体装置是三通道微流体装置的示例，但是微流体装置可以被修改、变化或改变以产生特定尺寸的邻近性颗粒或产生由变化的水凝胶材料或交联剂形成的邻近性颗粒。
在一些实施方案中，无论是通过涡旋辅助乳化还是通过微流体惯性流辅助乳化制备，邻近性颗粒均包封单细胞，包括本文所述的单一固定细胞。在一些实施方案中，可以通过稀释或浓缩输入样品中包含细胞的溶液来控制邻近性颗粒内的细胞数量。如本文所述，包含细胞的样品与水凝胶聚合物混合，并且包含细胞的水凝胶聚合物经受涡旋辅助乳化或微流体流辅助乳化。
在一些实施方案中，邻近性颗粒用核苷酸功能化。在一些实施方案中，核苷酸是寡核苷酸或聚T核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸与邻近性颗粒结合，并且功能化的邻近性颗粒可用于靶向捕获目的核苷酸。
在一些实施方案中，包封单细胞的邻近性颗粒被固化(cured)以维持对单个邻近性颗粒进行多个共分析，包括基于进行的测定的多个缓冲液洗涤、多次试剂交换和多个分析。通过本文所述的任何方法(包括表面引发的聚合技术、涡旋或通过微流体技术)制备的配制的邻近性颗粒可以加载或接种到图案化的流动池、微阵列、具有孔的平板、蚀刻的表面、微流体通道、珠、柱或其他表面上用于对被包封的细胞进行多个共分析。
对邻近性颗粒内包封的细胞进行多个共分析的方法
本文提供的一些实施方案涉及对包封在邻近性颗粒内的单细胞进行多个顺序共分析的方法。在一些实施方案中，该方法包含获得如本文所述的邻近性颗粒，并使包封在邻近性颗粒内的单细胞顺序地与试剂接触以进行多个顺序共分析。
在一些实施方案中，如本文所述制备邻近性颗粒，并将邻近性颗粒加载到表面上，例如流动池装置、平板的孔、载玻片或图案化表面。在一些实施方案中，该表面是流动池装置，并且包含插入物，该插入物具有成阵列的微孔或微柱用于分布邻近性颗粒以在流动池装置中进行空间索引。在一些实施方案中，邻近性颗粒加载到孔板上，每个孔中具有单个邻近性颗粒。孔板可以包括例如，12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板、3456孔板或9600孔板，或平板中的任何数量的孔，每个孔中沉积单一邻近性颗粒，并因此具有单细胞。在一些实施方案中，所述邻近性颗粒用渗透剂渗透。在一些实施方案中，渗透剂包括温和去污剂，例如TritonX-100。在一些实施方案中，渗透剂渗透邻近性颗粒内的细胞的细胞膜以增加对细胞核酸如基因组DNA和RNA的可及性。在一些实施方案中，将具有沉积在每个孔内的单个邻近性颗粒的孔板依次进行多个共分析，包括例如，缓冲液洗涤、裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质分析(ATAC-seq)、邻近性保持转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增，或者顺序执行的其任何组合。
在一些实施方案中，处理包封细胞或病毒颗粒的邻近性颗粒以从细胞纯化和分离核酸。因此，例如使邻近性颗粒与裂解缓冲液接触。如本文所用，“裂解”是指对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变，从而促进访问或释放细胞RNA或DNA。细胞壁的完全破坏或破裂都不是裂解必要的。术语“裂解缓冲液”是指包含至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶裂解剂包含但不限于，溶菌酶、葡萄糖酶、消解酶(zymolose)、溶细胞酶(lyticase)、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素和外溶素。因此，例如，可以通过将诸如溶菌酶和蛋白酶K的裂解剂引入到邻近性颗粒中来进行对邻近性颗粒中细胞的裂解。现在，来自细胞的gDNA被包含在邻近性颗粒中。在一些实施方案中，在裂解处理之后，分离的核酸保留在邻近性颗粒内，并且可以用于进一步处理。
DNA分析是指用于扩增、测序或以其他方式分析包封的细胞内包含的DNA的任何技术。DNA扩增可以使用PCR技术或焦磷酸测序来完成。DNA分析还可以包含非靶向的非基于PCR的DNA测序(例如，宏基因组学)技术。作为非限制性实例，DNA分析可包括对16S rDNA(核糖体DNA)的高变区进行测序，并将该测序用于通过DNA的物种鉴定。
RNA分析是指用于扩增、测序或以其他方式分析包封的细胞内包含RNA的任何技术。用于分析DNA的相同技术可用于扩增和测序RNA。稳定性低于DNA的RNA是DNA响应于刺激的翻译。因此，RNA分析可提供群落的代谢活性成员的更准确图景，并可用于提供有关样品中生物体群落功能的信息。核酸测序是指使用测序来测定核酸分子(例如DNA或RNA)序列中核苷酸的顺序。
如本文所用，术语“测序”是指获得多核苷酸的至少10个连续核苷酸的身份(例如，至少20、至少50、至少100或至少200或更多个连续核苷酸的身份)的方法。
术语“下一代测序”或“高通量测序”或“NGS”通常是指高通量测序技术，包括但不限于大规模并行签名测序、高通量测序、连接测序(例如SOLiD测序)、质子离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子测序和纳米孔测序，并且可以指Illumina，Life Technologies或Roche等目前使用的并行化合成测序或连接测序平台。下一代测序方法还可以包括纳米孔测序方法或基于电子检测的方法，例如Life Technologies商业化的Ion Torrent技术或Pacific Biosciences商业化的基于单分子荧光的方法。
蛋白质分析是指对包封细胞中的蛋白质的研究，并可包括蛋白质组分析，目标蛋白质的翻译后修饰的测定，蛋白质表达水平的测定或蛋白质与其他分子(包括与其他蛋白质或与核酸)的相互作用的测定。
如本文所用，术语“标签化”是指通过转座体复合物对DNA的修饰，所述转座体复合物与包含转座子末端序列的接头复合的转座酶。标签化同时导致DNA的片段化和接头与双链体片段的两条链的5'末端的连接。在纯化步骤以去除转座酶之后，可以例如，通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法将另外的序列添加至衔接的片段的末端。
使用测序的转座酶可及染色质的分析(ATAC-seq)是指综合的表观基因组学分析的快速且灵敏的方法。ATAC-seq捕获开放性染色质位点，并以核苷酸分辨率揭示了开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白、单个核小体及调控区域的较高阶压缩之间的相互作用。已发现严格避免的、可以耐受的或倾向于与核小体重叠的DNA结合因子的类别。使用ATAC-seq，通过标准血样从pro带测量和评估静息人类T细胞的连续日常表观基因组学，证明了在临床时程上读取个人表观基因组学以监测健康和疾病的可行性。更具体地，ATAC-seq可以通过用插入的酶复合物处理来自邻近性颗粒内单一包封细胞的染色质以产生标记的基因组DNA片段而进行。在此步骤中，使用插入酶(例如，Tn5或MuA)对染色质标签化(例如，在同一反应中片段化并标记)，该酶可在染色质的开放区域内切割基因组DNA并向片段的两端添加接头。
在某些情况下，条件可以调节以获得染色质中期望的插入水平(例如，在开放区域中平均每50至200个碱基对发生的插入)。该方法中使用的染色质可以通过任何合适的方法制备。在一些实施方案中，可以分离、裂解细胞核，并且可以例如从核被膜进一步纯化染色质。在其他实施方案中，可以通过使分离的细胞核与反应缓冲液接触来分离染色质。在这些实施方案中，分离的细胞核可以在与反应缓冲液(其包含插入酶复合物和其他必要的试剂)形成接触时裂解，这允许插入酶复合物达到染色质。在这些实施方案中，该方法可以包括从细胞群体分离细胞核；将分离的细胞核与转座酶和接头组合，其中所述组合导致细胞核裂解以释放所述染色质和产生基因组DNA的接头标记的片段。染色质不需要如其他方法(例如ChIP-SEQ方法)中的交联。
在染色质被片段化并标记以产生基因组DNA的标记片段之后，至少一些接头标记的片段被测序以产生多个序列阅读片段。可以使用任何合适的方法对片段进行测序。例如，可以使用Illumina的可逆终止子方法，Roche的焦磷酸测序方法(454)，Life Technologies的连接测序(SOLiD平台)或Life Technologies的Ion Torrent平台对片段进行测序。在以下参考文献中描述了这些方法的实例：Margulies等(Nature 2005 437:376-80)；Ronaghi等(Analytical Biochemistry 1996242:84-9)；Shendure等(Science 2005 309:1728-32)；Imelfort等(Brief Bioinform.2009 10:609-18)；Fox等(Methods Mol Biol.2009；553:79-108)；Appleby等(Methods Mol Biol.2009；513:19-39)和Morozova等(Genomics.2008 92:255-64)，通过引用将其并入本文以用于方法和方法的特定步骤的一般描述，包括所有起始产物、用于文库制备的方法、试剂以及各个步骤的最终产物。显而易见的是，可以在扩增步骤中将与所选的下一代测序平台相容的正向和反向测序引物位点添加至片段的末端。在某些实施方案中，可使用与已添加至片段的标签杂交的PCR引物扩增片段，其中用于PCR的引物具有与特定测序平台相容的5'尾。进行ATAC-seq的方法在PCT申请号PCT/US2014/038825中给出，其通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“染色质”是指，如在真核细胞的细胞核中发现的，包括蛋白质和多核苷酸(例如，DNA、RNA)的分子的复合物。染色质部分地由形成核小体的组蛋白、基因组DNA和通常与基因组DNA结合的其他DNA结合蛋白(例如，转录因子)构成。
邻近性保持转座测序(CPT-seq)是指一种在通过使用转座酶保持靶核酸中邻近的模板核酸片段的关联性保持邻近性信息的同时进行测序的方法。例如，CPT可以在核酸(如DNA或RNA)上进行。可以通过将具有独特索引或条码和固定在固体支持物上的互补寡核苷酸的杂交来捕获CPT核酸。在一些实施方案中，固定在固体支持物上的寡核苷酸除条码外还可包含引物结合位点、独特分子索引。有利地，转座体用于维持片段化核酸的物理接近性的这种用途提高了来自相同原始分子(例如染色体)的片段化核酸从固定在固体支持物上的寡核苷酸接收相同的独特条码和索引信息的可能性。这将产生具有唯一条形码的连续关联的测序文库。可以对连续关联的测序文库进行测序以得到连续序列信息。可以使本文所述的邻近性颗粒与CPT-seq试剂接触以在从包封细胞提取的核酸地进行CPT-seq。
如本文所用，术语“邻近性信息”是指基于共享信息的两个或更多个DNA片段之间的空间关系。信息的共享方面可以是关于相邻、区隔和距离空间关系。有关这些关系的信息进而有助于从DNA片段获得的序列阅读片段的分层组装或映射。该邻近性信息提高了此类装配或映射的效率和准确性，因为与常规鸟枪测序结合使用的传统装配或映射方法不考虑相关基因组起源或单个序列阅读片段的坐标，因为它们与单个序列阅读片段由其获得的两个或多个DNA片段之间的空间关系有关。
因此，根据本文所述的实施方案，捕获邻近性信息的方法可以通过确定相邻的空间关系的短范围邻近性(short range contiguity)方法、确定区隔空间关系的中范围邻近性连续性方法或确定距离空间关系的长范围邻近性方法来完成。这些方法促进DNA序列组装或映射的准确性和质量，并且可以与任何测序方法一起使用，例如本文所述的那些。
邻近性信息包含相对基因组起源或单个序列阅读片段的坐标，因为它们与单个序列阅读片段由其获得的两个或多个DNA片段之间的空间关系有关。在一些实施方案中，邻近性信息包含来自非重叠序列阅读片段的序列信息。
在一些实施方案中，靶核酸序列的邻近性信息指示单倍型信息。在一些实施方案中，靶核酸序列的邻近性信息指示基因组变体。
单细胞组合索引测序(SCI-seq)是用于同时生成用于体细胞拷贝数变异检测的数千个低通单细胞文库的测序技术。
因此，出于分析细胞或细胞核酸的目的，可在单细胞上单独或与任何其他分析组合进行多个共分析，包括本文所述的分析。
索引的邻近性颗粒也可以被直接加载到通过柱/微孔阵列保持的流动池上。索引文库从邻近性颗粒释放(化学/温度释放)并结合到流动池。这允许有力的索引方法，其中第一级索引来自空间位置，然后下一级来自单个邻近性颗粒的索引文库。或者，可以将从邻近性颗粒提取的索引库集体加载到流动池上。
在一些实施方案中，将包封在邻近性颗粒内的细胞与一种或多种试剂接触以进行核酸处理。在一些实施方案中，细胞被保留在邻近性颗粒内，并且试剂能够穿过邻近性颗粒的孔隙。在一些实施方案中，试剂可包括裂解试剂、核酸纯化试剂、DNA扩增试剂、标签化试剂、PCR试剂或用于遗传材料处理的其他试剂。因此，通过允许试剂通过屏障进出聚合物壳，同时将细胞本身保留在邻近性颗粒内，邻近性颗粒提供了在邻近性颗粒内细胞(包括从细胞提取的核酸)的受控反应的微环境。在一些实施方案中，调节聚合物外壳的孔隙以允许通过聚合物壳的试剂的流动以及核酸(例如从细胞提取的DNA和RNA)的流动。
在一些实施方案中，可以用通过多孔凝胶的多次试剂交换而同时将gDNA及其文库产物保留在聚合物壳内，整个DNA文库的制备在邻近性颗粒内无缝地完成。水凝胶可耐受高达95℃的高温数小时以支持不同的生化反应。
如本文所用，除非另有说明，否则本文所用的术语“分离的”、“分离”、“隔离”、“纯化的”、“纯化”、“提纯”及其语法等同物是指该材料从其中分离出的样品或来源(例如，细胞)中至少一种污染物(例如蛋白质和/或核酸序列)的量的减少。因此，纯化导致“富集”，例如，增加样品中所需蛋白质和/或核酸序列的量。
裂解和核酸分离后，可以进行扩增，例如多重置换扩增(MDA)，这是一种广泛用于扩增少量DNA(尤其是来自单细胞)的技术。在一些实施方案中，将包封的核酸扩增、测序或用于制备核酸文库。如本文所用，术语“扩增”或“扩增的”、“进行扩增”如用于指核酸或核酸反应时，是指制备特定核酸(如靶核酸或包封在邻近性颗粒内的核酸)的拷贝的体外方法，例如，通过本发明的一个实施方案。扩增核酸的许多方法是本领域已知的，并且扩增反应包括聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应、基于多个退火和成环的扩增循环(MALBAC)、转录介导的扩增方法(例如，NASBA)、环介导的扩增方法(例如，使用环形成序列的“LAMP”扩增)。被扩增的核酸可以是DNA，包括DNA或RNA或者DNA和RNA的混合物、由DNA或RNA或者DNA和RNA的混合物组成或衍生自DNA或RNA或者DNA和RNA的混合物，包括修饰的DNA和/或RNA。由一个或多个核酸分子的扩增产生的产物(例如，“扩增产物”)，无论起始核酸是DNA、RNA还是两者，可以是DNA或RNA，或者DNA和RNA核苷或核苷酸的混合物，或者它们可以包含修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。“拷贝”不一定是指与靶序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物，例如脱氧肌苷或脱氧尿苷，有意的序列改变(例如，通过包含可与靶序列杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)和/或在扩增过程中发生的序列错误。
可以根据本领域已知的任何合适的扩增方法来扩增在邻近性颗粒内分离的包封的核酸。在一些实施方案中，包封的核酸在邻近性颗粒内扩增。在一些实施方案中，邻近性颗粒被捕获在固体支持物上并被降解，其中包封的核酸被释放到固体支持物上，并且核酸在固体支持物上扩增。
在一些实施方案中，包封的核酸在邻近性颗粒内扩增。例如，在一些实施方案中，扩增引物和酶穿过邻近性颗粒的孔隙并与包封的核酸杂交。
应当理解，本文所述或本领域通常已知的任何扩增方法可与通用或靶特异性引物一起使用以扩增包封的核酸。合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如8,003,354号美国专利中所述的，其全部内容通过引用合并于此。上述扩增方法可用于扩增一种或多种目的核酸。例如，可以利用PCR包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等来扩增包封的核酸。在一些实施方案中，特异性针对目的核酸的引物包含在扩增反应中。
其他合适的核酸扩增方法可包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi等，Nat.Genet.19:225-232(1998)，其通过引用并入本文)和寡核苷酸连接分析(OLA)技术(一般参见美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP 0 320 308B1；EP0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696；和WO 89/09835，通过引用将其全部并入)。应当理解，可以将这些扩增方法设计为扩增包封的核酸。例如，在一些实施方案中，扩增方法可以包括连接探针扩增或寡核苷酸连接分析(OLA)反应，其包含特异性针对目的核酸的引物。在一些实施方案中，扩增方法可以包括引物延伸-连接反应，其包含特异性针对目的核酸并且能够穿过水凝胶孔隙的引物。作为可以专门设计来扩增目的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可以包含用于GoldenGate分析(Illumina，Inc.，San Diego，CA)的引物，如第7,582,420和7,611,869号美国专利中例示的，其全部通过引用整体并入本文。在所述的每种方法中，核酸反应中涉及的试剂和组分能够穿过邻近性颗粒的孔隙，同时核酸本身保留在邻近性颗粒内。
在一些实施方案中，使用簇扩增方法来扩增包封的核酸，如第7,985,565和7,115,400号美国专利的公开中所例示的，其全部内容通过引用整体并入本文。7,985,565和7,115,400号美国专利的并入材料描述了核酸扩增的方法，其允许将扩增产物固定在固体支持物上以形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。这样的阵列上的每个簇或集落由多个相同的固定化多核苷酸链和多个相同的固定化互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列在本文中通常被称为“簇状阵列”。固相扩增反应的产物，例如，在7,985,565和7,115,400号美国专利中所述的，是所谓的“桥接”结构，其通过成对的固定的多核苷酸链和固定的互补链的退火形成，两条链均优选地通过共价连接以5'端固定在固体支持物上。簇扩增方法是其中使用固定的核酸模板产生固定的扩增子的方法的实例。其他合适的方法也可以用于从根据本文提供的方法产生的固定的DNA片段产生固定的扩增子。例如，无论每个扩增引物对中的一个或两个引物是否固定，可以通过固相PCR形成一个或多个簇或集落。在一些实施方案中，包封的核酸在邻近性颗粒内扩增，然后以阵列沉积或以簇沉积在固体支持物上。
其他扩增方法包括等温扩增。可以使用的示例性等温扩增方法包含但不限于，例如由Dean等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)所例示的多重置换扩增(MDA)，或者例如由No.6,214,587号美国专利所例示的等温链置换核酸扩增，其每一个均通过引用整体并入本文。可以在本公开中使用的其他非基于PCR的方法包括，例如，链置换扩增(SDA)，其被描述于例如Walker等，Molecular Methods for Virus Detection,AcademicPress,Inc.,1995；Nos.5,455,166和5,130,238号美国专利，以及Walker等，Nucl.AcidsRes.20:1691-96(1992)中，或超支化链置换扩增，其被描述于例如Lage等，GenomeResearch 13:294-307(2003)，其中每一个均通过引用整体并入本文。等温扩增方法可与链置换的Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'exo-一起使用，用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用了它们的高持续合成能力和链置换活性。高持续合成能力使聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所述，使用具有低持续合成能力和链置换活性的聚合酶(如Klenow聚合酶)可以在等温条件下产生较小的片段。在7,670,810号美国专利的公开中详细列出了扩增反应、条件和组分的其他描述，其全部内容通过引用合并于此。在一些实施方案中，进行这些扩增反应所需的聚合酶、试剂和组分能够穿过邻近性颗粒的孔隙以与包封的核酸相互作用，从而扩增邻近性颗粒内的核酸。在一些实施方案中，随机六聚体与变性的DNA退火，然后在催化酶Phi 29存在的情况下在恒定温度下进行链置换合成。这导致邻近性颗粒内的DNA扩增，如MDA后通过荧光强度(DNA用SYTOX染色)的增加所证实的。独立地，还可以进行裂解和清理后的基于Nextera的标签化以及随后通过PCR进行的gDNA扩增，如Nextera标签化和PCR后邻近性颗粒内荧光强度的显著增加所表明的。在该Nextera文库制备之后，可以将邻近性颗粒加热至80℃3分钟以释放邻近性颗粒的内容物，即来自细胞的测序备用文库产物。
在本公开中有用的另一种核酸扩增方法是标记PCR，其使用具有恒定5'区和随后的随机3'区的两结构域引物的群体，例如，Grothues等，Nucleic Acids Res.21(5):1321-2(1993)中所述的，在此全文引入作为参考。进行第一轮扩增，以基于来自随机合成的3'区的单个杂交对热变性DNA进行大量启动。由于3'区的性质，预期起始位点在整个基因组中是随机的。此后，可以除去未结合的引物，并且可以使用与恒定5'区互补的引物进行进一步的复制。
在一些实施方案中，包封的核酸在邻近性颗粒内全部或部分地测序。可以根据任何合适的测序方法对包封的核酸进行测序，例如，直接测序，包括合成测序、连接测序、杂交测序、纳米孔测序等。
一种测序方法是合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如，靶核酸或其扩增子)的延伸以测定模板中核苷酸的序列。基础的化学过程可以是聚合反应(例如，通过聚合酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，将荧光标记的核苷酸以模板依赖性的方式添加到引物中(从而延伸引物)，以便可以利用对添加到引物的核苷酸的顺序和类型的检测来测定模板的序列。
可以对一种或多种扩增的包封的核酸进行SBS或其他涉及试剂在循环中重复递送的检测技术。例如，为了启动第一SBS循环，可以使一种或多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等流入/流过容纳一个或多个扩增核酸分子的邻近性颗粒。可以检测引物延伸导致标记核苷酸掺入的那些位点。任选地，核苷酸可以进一步包含可逆的终止性质，其中一旦将核苷酸添加到引物中，该可逆的终止性质终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得随后的延伸不再发生直到递送解封闭剂以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭剂递送至流动池(在检测之前或之后)。可以在各个输送步骤之间进行洗涤。然后可以重复该循环n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可以容易地适应于与通过本公开的方法产生的扩增子一起使用的示例性SBS过程、流体系统和检测平台描述于，例如，Bentley等，Nature456:53-59(2008),WO04/018497；7,057,026号美国专利；WO 91/06678；WO 07/123744；7,329,492号美国专利；7,211,414号美国专利；7,315,019号美国专利；7,405,281号美国专利和US 2008/0108082中，其各自通过引用并入本文。
可以使用其他使用循环反应的测序程序，例如，焦磷酸测序。当特定的核苷酸被掺入新生核酸链中，焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi等，AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等Science281(5375),363(1998)；6,210,891号美国专利；6,258,568号美国专利和6,274,320号美国专利，将其各自引入本文在此引用)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来进行检测，并且可以通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。焦磷酸测序程序不需要用于基于荧光的检测系统的激发辐射源。可以适用于将焦磷酸测序应用于根据本发明产生的扩增子的有用的流体系统、检测器和程序被描述于，例如，WIPO专利申请系列号No.PCT/US11/57111、US 2005/0191698A1、7,595,883号美国专利和7,244,559号美国专利中，其中每个通过引用并入本文。
一些实施方案可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或利用零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于，例如，Levene等Science 299,682-686(2003)；Lundquist等Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)中，其公开内容通过引用并入本文。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于检测释放质子的测序可以使用可商购的电检测器和相关技术。这样的测序系统的实例是焦磷酸测序(例如，Roche的子公司454Life Sciences的可商购平台)、使用γ-磷酸酯标记的核苷酸的测序(例如，Pacific Biosciences的可商购平台)和使用质子检测的测序(例如，Life Technologies的Ion Torrent子公司的可商购平台)或者US 2009/0026082A1；US2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1或US 2010/0282617A1中描述的测序方法和系统，其每一个通过引用并入本文。本文阐述的使用动力学排除来扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基质。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
另一测序技术是纳米孔测序(参见，例如，Deamer等Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer等Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li等Nat.Mater.2:611-615(2003)，其公开内容通过引用并入本文)。在一些纳米孔实施方案中，靶核酸或从靶核酸移除的单个核苷酸穿过纳米孔。随着核酸或核苷酸穿过纳米孔，可以通过测量孔的电导率波动来识别每种核苷酸类型。(7,001,792号美国专利；Soni等Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft等J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)，其公开内容通过引用并入本文)。
可用于根据本公开的检测的用于基于阵列的表达和基因型分析的示例性方法被描述于7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431号美国专利或美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1中，其中每一个通过引用合并于此。
在本文所述的分离核酸、扩增和测序的方法中，各种试剂用于核酸分离和制备。这样的试剂可以包括例如，溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。这些试剂穿过邻近性颗粒的孔隙，而遗传物质保留在邻近性颗粒内。本文阐述的方法的优点在于它们提供了用于处理邻近性颗粒中的核酸的包封的微环境。这使得能够进行单细胞处理以快速和有效地处理靶核酸。
接头可以包含测序引物位点、扩增引物位点和索引。如本文所用，“索引”可以包含可以用作分子标识和/或条码以标记核酸和/或识别核酸来源的核苷酸序列。在一些实施方案中，索引可用于鉴定单个核酸或核酸的亚群。在一些实施方案中，可以在邻近性颗粒内制备核酸文库。在一些实施方案中，包封在邻近性颗粒内的单细胞可用于例如通过使用邻近性保持转座(CPT-seq)方法对单细胞进行组合索引。在一些实施方案中，可以通过在WGA扩增后用另一带有条码化转座子的邻近性颗粒包封单细胞并通过使其与还原剂接触以溶解凝胶基质而释放基因组DNA以用于条码化来对来自单细胞的DNA进行条码化。
本文所述的“空间索引”方法和技术的实施方案缩短了数据分析并简化了从单细胞和长DNA分子制备文库的过程。现有的单细胞测序方案要求对细胞进行有效的物理分离，并对每个分离的细胞进行唯一条码化和将所有信息汇集在一起以进行测序。当前的用于合成长阅读片段的这群还需要繁琐的条码化步骤，并且将每个条码化片段合并在一起进行测序和进行数据分析以区分来自每个条码化细胞的遗传信息。在这些长的过程中，存在遗传物质的丢失，春导致序列的缺失。本文描述的实施方案不仅缩短了该过程，而且提高了单细胞的数据分辨率。此外，本文提供的实施方案简化了新生物体的基因组的组装。本文所述的实施方案可用于揭示罕见的遗传变异和突变的共现。在一些实施方案中，限制在邻近性颗粒中直至释放的DNA文库提供了通过控制释放过程和水凝胶制剂来控制在表面上释放的片段的大小的机会。
在一些实施方案中，可以使用接头序列中的引物位点来扩增文库，并使用接头序列中的测序引物位点进行测序。在一些实施方案中，接头序列可以包含识别核酸来源的索引。后续扩增步骤的效率可通过形成引物二聚体降低。为了提高后续扩增步骤的效率，可以从连接产物中除去非连接的单链接头。
用邻近性颗粒制备核酸文库
本文提供的系统、方法和组合物的一些实施方案包括其中接头与靶核酸连接的方法。接头可包含测序引物结合位点、扩增引物结合位点和索引。例如，接头可以包含P5序列、P7序列或其互补序列。如本文所用，P5序列包含由SEQ ID NO:1定义的序列(AATGATACGGCGACCACCGA)，并且P7序列包含由SEQ ID NO:2定义的序列(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)。在一些实施方案中，P5或P7序列可以进一步包含间隔区多核苷酸，其可以是1至20个核苷酸，例如1至15个核苷酸，或1至10个核苷酸，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，间隔区包含10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子是聚T间隔子，例如10T间隔子。间隔区核苷酸可被包含在多核苷酸的5'端，其可通过与多核苷酸的5'端的连接附接于合适的支持物。可以通过存在于多核苷酸5'端的含硫亲核试剂，如硫代磷酸酯来实现附接。在一些实施方案中，多核苷酸包含聚T间隔子和5'硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施方案中，P5序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3′(SEQ ID NO:3)，和在一些实施方案中，P7序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′(SEQ ID NO:4)。
索引可用于鉴定核酸分子的来源。在一些实施方案中，可以修饰接头以防止形成串接体，例如，通过添加防止接头在一端或两端延伸的封闭基团。3'封闭基团的实例包括3'-间隔子C3、双脱氧核苷酸和与基质的附接。5'封闭基团的实例包括去磷酸化的5'核苷酸和与基质的附接。
接头包含核酸，例如单链核酸。接头可包括短核酸，其长度小于、大于或等于大约5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸，或前述大小中任何两个之间的范围。在一些实施方案中，接头具有足够的尺寸以穿过邻近性颗粒的孔隙。靶核酸包括DNA，例如基因组DNA或cDNA；RNA，例如mRNA、sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂合体。可以从包封在邻近性颗粒内的单细胞分离核酸。核酸可以包含磷酸二酯键，并且可以包括其他类型的骨架，包括例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基磷酰胺和肽核酸骨架和连接。核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和碱基类似物，例如，硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)。在一些实施方案中，核酸可包含至少一个混杂碱基。混杂碱基可以与一种以上不同类型的碱基进行碱基配对，并且例如，当包含在寡核苷酸引物或用于复杂核酸样品如基因组DNA样品中的随机杂交的插入序列中时，可能是有用的。混杂碱基的实例包括可与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶配对的肌苷。其他实例包括次黄嘌呤、5-硝基吲哚、无环5-硝基吲哚、4-硝基吡唑、4-硝基咪唑和3-硝基吡咯。可以使用可以与至少两种、三种、四种或更多种类型的碱基配对的混杂碱基。
靶核酸可以包括其中样品中核酸的平均尺寸小于、大于或等于大约2kb、1kb、500bp、400bp、200bp、100bp、50bp，或上述尺寸中任意两个之间的范围的样品。在一些实施方案中，样品中核酸的平均尺寸小于、大于或等于大约2000个核苷酸、1000个核苷酸、500个核苷酸、400个核苷酸、200个核苷酸、100个核苷酸、50个核苷酸，或在前述尺寸中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，核酸具有足够的尺寸以使核酸被截留在邻近性颗粒内，使得其不能穿过邻近性颗粒的孔隙。
示例性方法包括使靶核酸的5'端脱磷酸以防止在随后的连接步骤中形成串接体；使用连接酶将第一接头连接至去磷酸化靶标的3'端，其中第一接头的3'端被封闭；使连接的靶标的5'端重新磷酸化；使用单链连接酶将第二接头连接至去磷酸化靶标的5'端，其中第二接头的5'端是非磷酸化的。
另一个实例包括用5'核酸外切酶部分消化核酸以形成具有单链3'突出端的双链核酸。可以将含有3'封闭基团的接头连接到具有3'突出端的双链核酸的3'端。具有连接的接头的具有3'突出端的双链核酸可以去杂交以形成单链核酸。可以将含有非磷酸化5'端的接头连接至单链核酸的5'端。
使核酸(例如，核酸的5'核苷酸)脱磷酸化的方法包括使核酸与磷酸酶接触。磷酸酶的实例包括小牛肠磷酸酶、虾碱性磷酸酶、南极磷酸酶和APEX碱性磷酸酶(Epicentre)。
连接核酸的方法包括使核酸与连接酶接触。连接酶的实例包括T4 RNA连接酶1、T4RNA连接酶2、RtcB连接酶、甲烷杆菌RNA连接酶和TS2126 RNA连接酶(CIRCLIGASE)。
使核酸(例如，核酸的5'核苷酸)磷酸化的方法包括使核酸与激酶接触。激酶的实例包括T4多核苷酸激酶。
本文提供的实施方案涉及在邻近性颗粒中制备核酸文库，使得在单个反应体积中制备核酸文库。
本文提供的系统和方法的实施方案包括试剂盒，其包含用于制备包封细胞的邻近性颗粒的水凝胶聚合物、交联剂或微流体装置中的任何一种或多种，并且还包括用于处理遗传物质的组分，包括用于细胞裂解、核酸扩增和测序或者用于核酸文库制备的试剂，其中包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子，如本文所述和如用于遗传物质的相应处理的。
实施例
实施例1-邻近性颗粒的制备
以下实施例说明了使用微流液滴发生器制备包封单细胞的邻近性颗粒的实施方案。
在室温下解冻在-80℃下储存的包含细胞的样品。将100μL的每种样品转移到无菌的1.7mL管中，并用1mL 0.85％NaCl洗涤一次。将样品沉淀并除去洗涤溶液。将细胞沉淀物与水凝胶溶液混合以将细胞重悬于水凝胶溶液中。
为了产生均匀尺寸分布的邻近性颗粒，使用了微流体液滴发生器，例如，图1中所示的发生器。将包含水凝胶聚合物和细胞的溶液引入微流液滴发生器的第一通道中。将用作隔离油的矿物油添加至第二通道，并将交联剂添加至第三通道。在第三通道中与交联剂接触时，水凝胶立即形成包封单细胞的邻近性颗粒。如图6所示，用荧光染料对邻近性颗粒进行染色，其中该荧光染料靶向邻近性颗粒的聚合物壳的-SH基团。图6的右图面示出了邻近性颗粒内单细胞的染色，其描绘了用通过聚合物壳孔隙扩散到邻近性颗粒中的Hoechst(蓝色-核染色)和AF-647BSA染色的邻近性颗粒的60×物像。选择交联油的类型以调整交联的速度，包括慢速交联剂或即时交联剂，如表1所示：
表1：交联化学
Figure BDA0002346156300000321
Figure BDA0002346156300000331
实施例2-在邻近性颗粒上进行的共分析
以下实施例说明了对来自实施例1的邻近性颗粒进行的示例性分析，包括SCI-seq、ATAC-seq、组合索引和单细胞全基因组扩增。
获得来自实施例1的邻近性颗粒并将其沉积到具有孔的板上，使得将单个邻近性颗粒沉积到单个孔中。通过引入裂解缓冲液裂解细胞，随后洗涤，从而从细胞提取核酸。然后对具有裂解细胞的邻近性颗粒进行如下所述的一系列分析。
如图7中概述的，使用索引转座体(TSM)对基因组DNA标签化，从而生成ATAC-seq片段。在蛋白酶/SDS处理后，将具有与TSM相同索引的寡聚T加入每个孔中以通过逆转录(RT)启动cDNA合成。另一端的PCR接头通过随机体(randomer)延伸引入。这产生索引1。将来自每个孔的邻近性颗粒合并在一起，然后分割到索引的PCR板中以产生索引2。这种2层索引可以扩展到150,000(384x384)个细胞；生成的最终文库是ATAC-seq和RNA-seq的混合物，其中来自相同细胞的gDNA和cDNA按相同的索引分组，并且寡聚T-UMI模式用作内部标志物以区分RNA信号与ATAC信号。
另外，随机延伸也用于全长RNA-seq，如图8所示。在这种情况下，TSM的索引与随机体的索引不同。这两个索引集之间的一对一匹配有助于识别来自单细胞的阅读片段以及区分DNA和RNA信号。UMI还应用于此方法中以提高阅读片段分析的准确性。
还使用两轮索引夹板(splint)-连接和一轮索引PCR进行三层组合索引分析，如图9的示意图所概述的。在此方法中，TSM和寡聚T是通用的，都包含夹板1片段，其使得能够通过夹板连接来添加索引。三层索引实现高达100万细胞的通量(96×96×96)。使用索引的TSM进行用于ATAC-seq的另一个3层组合索引以增加细胞通量，如图10中所概述的。与使用通用TSM相反，TSM在其B7G和A7G侧包含独特索引。使用两个不同的夹板来连接索引PCR所需的索引接头。在图10中，索引包括以下组分：B15接头序列(SEQ ID NO:5)、N6和连接1(Link1)，其一起形成B15_N6_连接1序列(SEQ ID NO:11)；Phos_连接2、A7G序列(SEQ IDNO:9)和ME序列(SEQ ID NO:7)，其一起形成Phos_连接2_A7G_ME序列(SEQ ID NO:12)；A14接头序列(SEQ ID NO:6)、N6和连接1，其一起形成A14_N6_连接1序列(SEQ ID NO:13)；和Phos_连接2、B7G(SEQ ID NO:10)和ME序列(SEQ ID NO:7)，其一起形成Phos_连接2_B7G_ME序列(SEQ ID NO:14)。图10还提供了ME互补序列(SEQ ID NO:8)、夹板1序列(SEQ ID NO:15)和夹板2序列(SEQ ID NO:16)。
如图11所概述的，也使用邻近性颗粒进行单细胞全基因组扩增。这是通过单个孔中使用邻近性颗粒的索引T7转座，然后通过T7体外转录(IVT)线性扩增合并和延伸来完成的。珠再次分离以进行索引的随机延伸，合并并再次分割用于进行最终的索引PCR。
当邻近性颗粒被FAM标记的转座体靶向时，它们显示出有效的标签化。细胞核用Hoechst(发蓝光的DNA染料)染色，而转座的细胞核用FAM(荧光染料)绿色荧光染色。用SDS裂解细胞会增加邻近性颗粒的背景荧光，而没有任何细胞的邻近性颗粒没有观察到任何信号。结果表明，可以对包封在邻近性颗粒内部的细胞生成ATAC-seq文库，其中只有很小一部分的短片段从标签化的泄漏。
实施例3：邻近性颗粒中的核酸文库制备
以下实施例说明了从包封在邻近性颗粒内的细胞制备全基因组文库的方法。
图12概述了用于在包封在邻近性颗粒内的单细胞上进行全基因组文库制备的示意图。如在图12的示意图中所概述的，邻近性颗粒用于产生Nextera全基因组文库。获得如实施例1中制备的邻近性颗粒。将邻近性颗粒(CP)加载在45μm细胞过滤器上，并用PBS或Tris-Cl进行多次洗涤以去除任何非包封的细胞。将细胞包封在邻近性颗粒中的一个优点是提高了其操作和处理的能力。执行此操作的一种简单的方法是通过使用旋转柱或过滤板。过滤器的孔径可以小于珠直径。过滤板的实例包括但不限于，孔径20、40和60μm的Millipore’s MultiScreen-Mesh过滤板，孔径8.0μm的Millipore’s MultiScreenMigration Invasion and Chemotaxis过滤板，或孔径30-40μm的用于水性过滤的Pall’sAcroPrep Advance 96孔过滤板。使用这些过滤板，可以容易地将珠包封的细胞与溶液分离，从而允许进行多次缓冲液交换。
将洗涤的珠粒悬浮在缓冲液中，并从过滤器移除。为了估计珠的最终浓度、细胞加载效率，并确保没有非包封的细胞保留，等分珠试样在显微镜下可视化。
为了进行Nextera标签化，使用了Millipore的20μm尼龙MultiScreen-Mesh过滤板。为了限制珠对过滤器的粘附，将其用Pluronic F-127预湿润。板以500g离心30s后，缓冲液流过过滤器而珠保持。将珠用200μL Tris-Cl缓冲液洗涤两次，然后悬浮在裂解缓冲液(0.1％SDS)中。在通过离心去除之前，将珠在裂解缓冲液中孵育1分钟。为了除去残留的裂解缓冲液，进行两次另外的200μL Tris-Cl洗涤。接下来，通过上下吹打将细胞悬浮于45μL的1x标签化缓冲液中，然后转移至带管。向45μL的珠中加入5μL的标签化DNA酶(TDE，Illumina Inc.)，并在热循环仪中于室温下进行孵育1小时，在55℃下孵育30分钟。任选地，可以通过将珠包封的细胞悬浮在标签化主混合物中并在加热块上孵育来在过滤板上进行标签化。标签化后，将等分珠试样用Hoechst染料染色并在显微镜下可视化。可视化证实DNA保留在珠中。
使用Illumina’s Nextera PCR MM(NPM，Illumina)和PCR引物对标签化的珠(25μL)进行PCR扩增。向主PCR混合物中添加0.1％SDS以去除与DNA结合的Tn5。在75℃下进行预孵育以帮助在SDS存在下去除Tn5。进行11个PCR循环以生成最终文库。PCR之后，文库使用0.9x SPRI纯化，使用dsDNA qubit和/或BioAnalyzer进行定量，并在MiSeq和/或NextSeq上测序。
该本实施例中描述的方法可以放大以使用类似于sciSEQ的方法执行单细胞测序(Vitak等，Nat Meth.2017；14:302-308)。例如，可以在放大的过程中使用96孔滤板同时进行96个索引-标签化反应。将珠添加到平板中后，添加相继的缓冲液，然后通过离心或真空除去。标签化后，从过滤器收集珠并合并。将合并的珠重新分布在第二96孔PCR板中以进行多重PCR。在这种双级索引方案(标签化和PCR索引)中，来自单个珠包封细胞的所有DNA片段接受相同的条码，其可以进行反卷积以重建细胞的基因组。
本实施例中概述的步骤适合于通过添加真空歧管(例如，Millipore’sMultiScreen HTS Vacuum Manifold或Orochem’s 96well Plate Vacuum Manifold)在液体处理平台上实现自动化。这些真空歧管可以添加到许多液体处理平台上，包括BiomekFX、Microlab Star、Tecan Genesis等。通过将过滤板转移到热模块上，标签化可以自动化。然后将平板转移回真空歧管以进行标签化后清洗。
本文所述的实施方案、实施例和附图提供了用于在从裂解到文库生成的过程中将遗传物质保留在物理受限空间中的组合物、方法和系统。一些实施方案提供了在受限空间中释放在流动池的表面上的源自单个长DNA分子或单细胞的文库。一旦来自单个隔室中的单个DNA分子或单细胞的文库释放到流动池的表面，每个隔室中的文库彼此紧密接近地接种。
如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“由...表征”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。
上面的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于作出方法和材料的改变，以及制造方法和设备的改变。通过考虑本公开或本文中公开的本发明的实践，这样的改变对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限制于本文公开的特定实施方式，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代。
本文引用的所有参考文献，包含但不限于，已公开和未公开的申请、专利和文献参考文献，均通过引用全文并入本文，并因此成为本说明书的部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所包含的公开内容相抵触的程度上，该说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
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Claims (27)

1.一种包封单细胞的空心珠，其包含：
聚合物壳；和
布置在所述聚合物壳内的单细胞，
其中所述聚合物壳包含允许试剂扩散通过该聚合物壳而同时保留该单细胞的孔隙。
2.如权利要求1所述的空心珠，其中所述聚合物壳的内部包含水性环境。
3.如权利要求1所述的空心珠，其中布置在所述聚合物壳内的所述单细胞不与所述聚合物壳相互作用和/或不与所述聚合物壳接触。
4.如权利要求1所述的空心珠，其中所述空心珠的直径为大约20μm至大约200μm。
5.如权利要求1所述的空心珠，其中所述聚合物壳包含四臂聚乙二醇(PEG)。
6.如权利要求1所述的空心珠，其中所述聚合物包含PEG、PEG-丙烯酸酯、PEG-胺、PEG-羧酸酯、PEG-二硫醇、PEG-环氧化物、PEG-异氰酸酯、PEG-马来酰亚胺、聚丙烯酸(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、藻酸盐、聚苯乙烯(PS)、聚苯乙烯磺酸酯(PSS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPON)、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、聚环氧丙烷(PPO)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、肝素、藻酸硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合或混合物。
7.如权利要求1所述的空心珠，其中所述聚合物壳包含PEG-马来酰亚胺/二硫醇油、PEG-环氧化物/胺油、PEG-环氧化物/PEG-胺或PEG-二硫醇/PEG-丙烯酸酯。
8.如权利要求1所述的空心珠，其中所述单细胞是哺乳动物细胞。
9.如权利要求1所述的空心珠，其中所述试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。
10.如权利要求9所述的空心珠，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂或二价阳离子。
11.一种将单细胞包封在空心珠内的方法，包括：
将单细胞与聚合物在隔离油中混合以形成混合物(a)；
将混合物(a)与交联油混合以形成包封所述单细胞的聚合物壳，其中该聚合物壳包含允许试剂扩散通过该聚合物壳而同时保留该单细胞的孔隙。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述空心珠的直径为大约20μm至大约200μm。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述聚合物包含四臂聚乙二醇(PEG)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述四臂聚乙二醇(PEG)选自PEG-丙烯酸酯、PEG-胺、PEG-羧酸酯、PEG-二硫醇、PEG-环氧化物、PEG-异氰酸酯和PEG-马来酰亚胺。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述隔离油包含矿物油或氟碳油。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述交联油包含溶解在油中的二硫醇或胺。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述单细胞是哺乳动物细胞。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂、去污剂或二价阳离子。
20.如权利要求11所述的方法，其中所述混合包括将所述单细胞、所述聚合物、所述隔离油和所述交联油输入到液滴发生器中。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述液滴发生器是微流体芯片。
22.如权利要求11所述的方法，其中在混合之前，所述单细胞通过与固定剂接触来固定。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述固定剂包括醇，例如甲醇或乙醇，或者醛，例如多聚甲醛。
24.一种对包封在空心珠内的单细胞进行多个顺序共分析的方法，包括：
获得如权利要求1-10中任一项所述的包封单细胞的空心珠；和
依次使所述单细胞与试剂接触以执行多个顺序的共分析。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述多个顺序共分析包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质的分析(ATAC-seq)、邻近性保持转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增，或者顺序执行的它们的任何组合。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述包封单细胞的空心珠接种在固体支持物上。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述固体支持物是蚀刻表面、孔、流动池装置、微流体通道、珠或柱。
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