CN111044723A - 含有胰弹性蛋白酶-1-特异性的抗体以及样品准备装置的新型测试试剂盒 - Google Patents
含有胰弹性蛋白酶-1-特异性的抗体以及样品准备装置的新型测试试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及含有胰弹性蛋白酶‑1特异性的抗体以及样品准备装置的新型测试试剂盒。其令人惊讶地具有在粪便中的弹性蛋白酶1的更高测定准确度。
Description
技术领域
本发明涉及具有胰弹性蛋白酶-1-特异性的抗体以及用于计量和提取的新型样品准备装置的测试试剂盒，其令人惊讶地允许更精确地检测粪便中的胰弹性蛋白酶-1。
背景技术
已知通过定性和定量测定胰弹性蛋白酶-1（以下也称为E1）来检测胰腺的炎性疾病。EP 0547059 B1（SCHEBO TECH MEDIZINISCH-BIOLOGISCHE FORSCHUNGSGESELLSCHAFTM.B.H）尤其描述了免疫学测试试剂盒，其含有针对胰弹性蛋白酶-1的抗体。根据该文献，可以借助含有抗胰弹性蛋白酶-1-抗体的各种测试试剂盒来检验体液的E1。这例如通过血液、血浆、血清以及粪便实现。这种测试自多年来已用于检验粪便-和血清样品的E1。
发明内容
令人惊奇地已发现，相比于现有技术的测试试剂盒，根据权利要求1的测试试剂盒允许明显更精确地测定粪便中的E1。
所述测试试剂盒首先含有样品准备装置，通过其例如可以用于准备要通过酶法或免疫化学方式分析的粪便样品以进行分析。
本发明的样品准备装置允许在液体试剂和/或液体溶剂中精确计量和提取粪便样品，并且密封，以使得其也可以在可能的航空运输中暴露于负压。
本发明的样品准备装置由用于容纳液体试剂和/或液体溶剂的能够封闭的容器和取样棒构成，该取样棒在其端部区域中在其外周面上具有至少一个舀取凹陷并以这一端部通过所述容器的配备有剥离凸肩（Abstreifschulter）的插入开口而能够引入该容器中。这种样品准备装置原则上已在德国实用新型DE2032160U1中描述。然而已经发现，舀取凹陷的形状对于测量精确度具有很大影响。粪便的物料非常不均匀地构成并且其具有高纤维含量。待定量的E1仅存在于粪便的粘液（即非纤维）部分中。在粪便的纤维部分中几乎没有E1。
因此，要解决的技术问题在于，将粪便的粘液部分与纤维部分分开。该问题在技术上通过使用如下的样品准备装置得以实现，其根据下面的说明书具有特别研发的舀取凹陷。通过使用它们，几乎仅对粪便的粘液部分进行提取。在提取物的物料中几乎不存在纤维部分，而纤维部分会在计算中使结果失真。不希望受特定理论的束缚，发明人认为通过下面描述的舀取凹陷的设计将所取的粪便样品的纤维含量降低到最小。由于借助本发明待确定的E1主要包含在粪便的粘液部分中，几乎不包含在纤维部分中，不同的纤维含量严重地影响准确性。通过下面描述的（一个或多个）舀取凹陷的设计，将纤维含量降低到最小，由此可以尽可能精确地进行测量。此外，由文献已知的是，非常水性的粪便由于稀释作用而可能导致粪便中的弹性蛋白酶1浓度减小（低E1浓度 = 生病的结论），通过所述样品准备系统仅接收合适的粪便，这产生最佳的粪便 - 缓冲液浓度，经优化的浓度得到更高的精度。
根据本发明，舀取凹陷通过来自圆柱形取样棒的一个或多个环形或环段形凹槽形成。该取样棒通常具有1-2mm的直径d。在取样棒的插入粪便中的端部处，圆柱变尖（在图中未示出）。在相反的端部处，存在把手和封闭元件（在图中未示出）。
基本上，取样棒可以含有环形凹槽（图1）。在此已发现，取样棒的外侧面与凹槽之间的角度α应大致为直角。此外，凹槽基面和芯筒之间的角度β同样应大致为直角。凹槽的深度t应不比0.1毫米深，凹槽的高度h应不高于0.5毫米。这种凹陷的总体积应不超过20 µl。
此外已发现，舀取凹陷的完全环形凹槽不是最佳的，因为通过凹槽留下的芯筒由于在将取样棒再次引入容器中时产生的力而可能容易弯曲或甚至折断，在一定程度上形成预定断裂点。通过不完全环形凹槽，而是通过环段形凹槽（图2），取样棒获得机械稳定性，同时凹槽的总体积减小。掏出的环段可以例如围拢圆柱截面的270°（图2）、180°（图4）或90°（图3）。作为取样棒的机械稳定性和凹槽体积之间的最佳折衷，得出180°的角度（图4）。
如果仅实现单个凹槽，则凹槽的体积当然对应于样品的体积。如果所需的样品体积应该大于20 µl，则适宜的是实现多个凹槽，例如2至6个凹槽（参见例如具有3个凹槽的图5）。为了本发明的目的，已发现50 µl的样品体积是最佳的，其通过每个12.5 µl的四个凹槽形成。
能够封闭的样品准备装置含有1-2 ml缓冲溶液。该缓冲溶液含有pH值为6.9-8的磷酸盐缓冲盐水溶液、吐温20和<0.05％的叠氮化钠。为了确保完全提取，重要的是向所述经磷酸盐缓冲的提取缓冲液中混入10 mM的洗涤剂CHAPS（3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐（Sigma）。
此外对于使用者而言，通过该样品准备装置可以快速和更卫生地操作；省略了测试试剂盒操作中的繁琐步骤，因为不必再需要对粪便称重，而是基于根据本发明的腔体几何而对其进行计量。这种使用的另一个优点是，不同于迄今的现有技术，现在仅还需要较少量的粪便用于测量。
本发明的测试试剂盒还含有用于体外测量粪便中的E1的装置，其中该装置含有至少一个固相，在该固相上结合至少一种选自能够结合的弹性蛋白酶1特异性的单克隆抗体的抗体。优选地，在该固相上结合的抗体是克隆1。克隆1表示根据WO 92/02630 A的在固相上结合的抗体，并且描述在该文献中。
本发明的一个特别主题是本发明的E1特异性的抗体用于定性和/或定量测定E1的用途。可以使用抗体来特异性地检测体液和粪便中的弹性蛋白酶1。
因此，本发明还涉及含有本发明抗体的测试试剂盒，并且特别是用于在粪便中诊断和排除外分泌胰腺功能不全的免疫学测试试剂盒。
在用于检测粪便中的E1的实验中，使用间接、竞争性和夹心ELISA。然而已经表明，夹心ELISA最适合于在大的样本量时的快速诊断。为此，需要至少两种不同的单克隆抗体，其针对酶的不同表位。通过这样的测试，可以定量检测粪便中的酶转移（Enzymverschiebungen），特别是在胰腺状态变化时出现的所述转移。
根据免疫测定原理的测定方法是普遍的。这种测定方法的优点是其准确度和快速性（高安全性和样品通量）以及可以检测非常少量物质（纳克范围）的可能性。为了进行测定，可以使用各种方法变体，既可以通过均相，也可以通过非均相。在通过非均相的实施方案中，受体之一与载体结合。在夹心方法中，例如第一抗体作为受体或作为所谓的捕捉剂或捕集剂与载体结合，加入测试溶液，其中在测试溶液中待测定的抗原被受体从测试溶液中选出并结合。随后，加入经标记的第二抗体，其特异性地与抗原或抗原-受体复合物反应。通过第二抗体的标记，然后可以借助校准溶液（经分离、提纯的人弹性蛋白酶1）测定抗原量。
在本发明的另一个优选实施方案中，第一抗体作为受体与具有膜-、织造-或非织造结构的载体基质如此结合，以使得其不像通常那样构成Elisa免疫板的孔底部，而是以结合在基质中的形式存在。优选的基质是微孔平膜或中空纤维膜，其在一个特别实施方案中配备有离子交换基团。为此，优选使用如例如Pall Corp., New Jersey, USA销售的那些微孔平膜。根据本发明使用的中空纤维膜同样是可商购的，并且例如由Sepracor Inc., Ma.,USA销售。借助这类载体材料，可以提供特别快速且不复杂的检测方法。
对于所述一般原则，存在许多变化可能性。例如，可以用三种受体进行测定，其中这三种受体之一以非均相形式存在，且另外两种受体是可溶的。标记这两种可溶性受体之一，而另一种未标记。然后，将该标记的受体靶向（gerichtet）未标记的受体。
本发明的E1特异性的抗体用于根据免疫测定原理而选择性定量测定E1的用途是通过与至少两种不同的受体一起温育来实现的。这两种受体（例如单克隆抗体）必须对于E1而言是特异性的，该E1必须通过各自不同的表位（结合位点）结合。
所述两种受体之一与固相结合。与固相的结合以常规方式进行，并且是本领域技术人员已知的。此外，使用至少一种其它受体，其以可溶形式存在。
所述其它受体带有标记。如果使用几种其它受体R2，则它们中只有一种带有标记。受体的标记以常规方式进行，并且是本领域技术人员已知的。
在本发明的测试试剂盒中，标记以本身已知的方式进行，特别是通过放射性标记、通过生物素（生物素/抗生物素蛋白）的结合、通过引发可测量反应的酶或通过化学发光或荧光化合物进行标记。特别优选的是用酶标记，特别是过氧化物酶或磷酸酶。在一个特别的实施方案中，用酶标记也允许在第二酶扩增系统（Enzymamplifikationssystem）中使用该抗体（Stanley, C. J., Paris, F., Plumb, A., Webb, A. Johannsson, A. AmericanBiotechnology Laboratory: May/June; 1985; Self, C. H., J. Immunol. Meth.;1985）。
在该方法的一个特别优选的实施方案中，将可与E1非特异性结合的受体或优选可与E1特异性结合的受体与固相结合。然后将该与固相结合的受体与应含有待测定E1的溶液和可与E1特异性结合、以可溶形式存在且带有标记的抗体一起温育。
如果与固相结合的受体是可与E1非特异性结合的受体，则不仅E1，而且其它抗原也附着在固相上。然而，可与E1特异性结合的第二抗体仅附着在E1上，以使得仅E1分子特异性地带有标记的抗体，而其它抗原未标记。以这种方式，可以在将固相与液相分离之后通过测量标记来测定E1的含量。
如果在固相上固定有可与E1特异性结合的第一受体，则仅E1特异性结合在该固相上。在与可溶性的E1特异性第二受体或抗体一起温育时，其也仅与E1反应。因为由此几乎没有其它抗原与固相结合，所以该方法是高度特异性的，因此允许非常准确地测定。在此，在固相上选择性地结合E1，其它抗原保留在溶液中。此外，可溶性的、经标记的、可与E1结合的抗体附着在E1上。在将固相与液相分离之后，进而可以通过标记而非常精确地测定E1的含量。在一个特别优选的实施方案中，为了进一步提高选择性而加入第三抗体，其靶向第二抗体并带有标记。
本领域技术人员已知的通过三种受体的其它方法变体同样通过使用可与E1特异性结合的抗体是可行的，这里不需要作进一步说明。
在用于实施本发明方法的抗体中，优选至少一种为单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，仅使用单克隆抗体作为受体。
可特异性结合E1的抗体可以以与固相结合的形式存在或用作可溶性的、经标记或未标记的受体。优选地，该受体是单克隆抗体。特别优选地，所有使用的受体是单克隆抗体。
本发明的方法以及测试试剂盒特别适用于自动化分析系统，特别是适用于基于生物传感器并利用芯片技术的那些系统。
附图说明
图1显示根据本发明一个实施方案的取样棒；
图2显示根据本发明另一个实施方案的取样棒；
图3显示根据本发明另一个实施方案的取样棒；
图4显示根据本发明另一个实施方案的取样棒；
图5显示根据本发明另一个实施方案的取样棒；
图6显示用于计量和提取的样品准备装置的制造；
图7显示ELISA系统的制造；
图8显示根据本发明一个实施方案的测试；
图9显示所测量的粪便称重的样品准备装置测定；
图10显示精确度的测定；和
图11显示使用不同样品准备装置的测试结果。
具体实施方式
实施例：
通过下列实施例更详细地阐述本发明：
a) 借助经提纯的E1制备单克隆抗体：
将已被描述从人胰腺中获得的经提纯的人E1（Sziegoleit A., Purification andCharacterization of a cholesterol binding protein from human pancreas.Biochem. J. 207:573-582;1982）溶解在PBS中，并以相同份与弗氏佐剂混合。将各100 μg该混合物腹膜和皮下注射到6至8周龄Balb/c小鼠中。所述注射以3至4周的间隔重复两次。在取出脾之前3天，根据上述方案通过经提纯的E1免疫的小鼠静脉注射溶于PBS中的100 μg经提纯的E1。
将免疫小鼠的大约1亿个脾细胞与5000万个骨髓瘤细胞（x 63-Sp8-653，不合成免疫球蛋白的细胞系；获自The Salk Institute, Cell Distribution Center, San DiegoCA 92112, USA）在聚乙二醇（MG 3400）存在下融合。将融合细胞接种在8个板上，所述板各含有24个孔。这些孔的每一个在含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的营养培养基中含有未免疫同源小鼠的5000万个脾细胞。
通过ELISA、Westernblott、冷冻切片、石蜡切片在10至14天后测试这些融合细胞（杂交瘤）的含抗体的上清液的对于高度提纯的人E1的特异性。
为了获得仅靶向E1的单克隆抗体，将上清液不含靶向其它抗原的抗体的杂交瘤细胞克隆两次。仅克隆杂交瘤细胞，没有AK分泌，其不显示与猪和牛的胰弹性蛋白酶的交叉反应。
由此可以确保，替代制剂的摄入不会使测试结果失真。
实施例1
通过单克隆E1特异性的抗体测定粪便中的E1
用ELISA测定粪便中的E1。为此，将所得的单克隆、E1特异性的抗体溶于PBS，pH 7.2中，并且固定在作为载体的聚苯乙烯上。洗涤步骤后，加入含有E1的所提取的粪便。将提取物在含有PBS、5 mmol EDTA和0.2％吐温20的缓冲液中稀释。
在PBS、0.2％吐温20中的洗涤步骤后，将与抗体结合的E1与单克隆抗体在室温下温育1小时，该单克隆抗体也结合E1并与磷酸酶偶联，溶于含有0.2％吐温20且pH为7.2的PBS中。在重新的洗涤步骤之后，通过加入对硝基苯基磷酸二钠六水合物来测量单克隆抗体与E1反应的反应容器中的光密度的变化。
实施例2
通过多克隆E1特异性的抗体测定粪便中的E1
用ELISA测定粪便中的E1。为此，将所得的多克隆、E1特异性的抗体溶于PBS，pH 7.2中，并且固定在作为载体的聚苯乙烯上。洗涤步骤后，加入含有E1的所提取的粪便。将提取物在含有PBS、5 mmol EDTA和0.2％吐温20的缓冲液中稀释。
在PBS、0.2％吐温20中的洗涤步骤后，将与抗体结合的E1与多克隆抗体在室温下温育1小时，该多克隆抗体也结合E1并与磷酸酶偶联，溶于含有0.2％吐温20且pH为7.2的PBS中。在重新的洗涤步骤之后，通过加入对硝基苯基磷酸二钠六水合物来测量多克隆抗体与E1反应的反应容器中的光密度的变化。
实施例3
通过两种不同的E1特异性的抗体测定血清中的E1
将靶向E1的单克隆抗体如实施例1中所述那样固定在载体上。洗涤步骤后，在与实施例1相同的条件下，将含有E1的血清与单克隆抗体一起温育。在进一步的洗涤步骤之后，通过本发明的E1特异性的第二单克隆抗体检测E1的结合。该E1特异性的第二抗体带有共价结合的过氧化物酶。在洗涤步骤之后，在加入ABTS作为过氧化物酶的底物后，测量光密度的变化。
实施例3a
通过两种不同的E1特异性的抗体测定血清中的E1
将靶向E1的单克隆抗体如实施例1中所述那样固定在载体上。在此，使用来自克隆1的抗体（获自根据WO92/02630A1的权利要求6的细胞系）。洗涤步骤后，在与实施例1相同的条件下，将含有E1的血清与单克隆抗体一起温育。在进一步的洗涤步骤之后，通过本发明的E1特异性的第二单克隆抗体检测E1的结合。该E1特异性的第二抗体是获自根据WO92/02630A1的权利要求7的细胞系的抗体。该E1特异性的第二抗体带有共价结合的过氧化物酶。在洗涤步骤之后，在加入ABTS作为过氧化物酶的底物后，测量光密度的变化。
实施例4
如实施例2中所述那样操作，但是在E1特异性的第二抗体上偶联生物素而不是酶。在加入底物之前，此时加入过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白或过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白。所选择的E1测定允许非常特异性地仅测定E1。溶液中所含的其它抗原不干扰根据本发明测定E1。
实施例5
制造用于计量和提取的样品准备装置
用于计量和提取的样品准备装置的制造如图6所示进行。
实施例6
制造ELISA系统
ELISA系统的制造如图7所示进行。
实施例7
测试实施
所述测试实施如图8所示进行。基本步骤是：
· 准备样品-/洗涤缓冲液
· 用样品准备装置计量和提取粪便，粪便提取物在样品-/洗涤缓冲液中稀释
· 将各50 µl空白、标准物、阳性对照和样品以双重测定的形式移取到ELISA板中 -在室温下温育30分钟 - 洗涤
· 各50 µl抗E1-bio-POD-链霉抗生物素蛋白复合物（即用型） - 在室温下在黑暗中温育15分钟 - 洗涤
· 100 µl底物溶液（即用型） - 在室温下在黑暗中温育15分钟
· 加入100 µl终止溶液（即用型）
测试评估
OD测量在405 nm下在加入停止溶液后5至30分钟的时间进行。在测量之前，必须充分摇动ELISA板。如果相对于参考波长测量，则其应为492 nm。
实施例8
a) 弹性蛋白酶1测试试剂盒使用人粪便样品通过特别研发的样品准备装置进行测试，其与具有传统所含的提取缓冲液的弹性蛋白酶1测试试剂盒进行比较。额定值是通过ELISA和传统提取缓冲液测量的值。关于ScheBo弹性蛋白酶1测试试剂盒的所有文献都将其描述为胰腺功能诊断的非侵入性黄金标准，因此在我们的测试中也将ScheBo E1 ELISA用作黄金标准。用提取系统插入粪便中10次，测定弹性蛋白酶1的值并由此形成平均值。然后将该平均值与额定值进行比较。样品与额定值的偏差百分比在-14和4％之间波动。还有提供此类样品准备装置的其它已知的供应商；通过另一家领先制造商的样品准备装置进行了相同的测试。为此同样用样品准备装置插入粪便中10次。测量结果如图10所示。10个所测量的弹性蛋白酶1值的％CV在11.01和32.34％之间波动。由此得出样品与额定值的偏差百分比在-23和44％之间。在此可以清楚地看到，样品准备装置的精确度对于测试操作而言是非常关键的部分。这里，用竞争者的样品准备装置操作的样品被估算得（verrechnet）较低。这对于200µg/g粪便的临界值（Cut-Off）附近的样品而言尤其至关重要，因为它们将被错误地分类/分级为生病的（pathologisch）。
b) 附图（图9、10）说明了本发明样品准备装置的非常高的精确度。批内和批间变异系数两者的测量提供了非常高的准确度程度。为了确定批内和批间CV，使用两个样品准备系统在两个不同的粪便样品中相继在每个粪便样品中各30次测量用该系统接收量的粪便。所述样品准备装置在此显示出优异的％CV值。批内％CV值在一个小管中为2.6610％CV，在另一个小管中几乎相同地为2.6440％CV。由此得出的使用不同粪便样品在两个小管之间的批间CV刚好都为0.3205％CV，这也是极好的结果。因此，两个小管的一致性为99.6795％。
Claims (9)
1.用于体外诊断的试剂盒，其包含
a) 至少一个用于粪便样品的样品准备装置，其具有用于容纳液体试剂和/或溶剂的能够封闭的容器和直径d为1-2 mm的圆柱形取样棒，该取样棒在其端部区域中在其外周面上具有至少一个舀取凹陷并以这一端部通过所述容器的配备有剥离凸肩的插入开口而能够引入该容器中，其特征在于，
所述至少一个舀取凹陷是圆柱形取样棒的环形或环段形凹槽，其中所述取样棒的外侧面与所述凹槽之间的角度α大致为直角，并且其中所述凹槽基面与所述芯筒之间的角度β同样大致为直角，并且其中凹槽的总体积为10-100µl，
其中所述能够封闭的容器含有1-2 ml缓冲溶液，其中所述缓冲溶液含有pH值为6.9-8的磷酸盐缓冲盐水溶液、吐温20、<0.05％的叠氮化钠以及10mM的洗涤剂CHAPS（3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐，
以及
b) 用于在粪便中诊断和排除胰腺功能不全的免疫学装置，
其中所述装置含有固相，在该固相上已经结合至少一种选自能够结合的弹性蛋白酶1特异性的单克隆抗体的抗体，所述单克隆抗体不与动物胰弹性蛋白酶交叉反应。
2.根据权利要求1所述的测试试剂盒，其中所述圆柱形取样棒含有两个至六个环形或环段形凹槽作为舀取凹陷。
3.根据权利要求1所述的测试试剂盒，其中所述圆柱形取样棒含有四个环段形凹槽作为舀取凹陷，其中所述环段围拢所述圆柱截面的180°，并且其中四个环段形凹槽的总体积为50µl。
4.根据权利要求1所述的测试试剂盒，其中所述装置根据ELISA测试的方式构造，其中所述抗体以结合在微孔平膜或中空纤维膜中的形式存在。
5.根据权利要求1所述的测试试剂盒，其中所述装置根据免疫测定的方式构造。
6.根据权利要求3所述的测试试剂盒，其中所述装置根据横向流动免疫测定的方式构造。
7.根据权利要求1-6中至少一项所述的测试试剂盒，其中所有抗体是单克隆抗体。
8.根据权利要求1-7中至少一项所述的测试试剂盒，其中使用克隆1的抗体。
9.根据权利要求1-8中至少一项所述的免疫学测试试剂盒，其用于在粪便中诊断和排除外分泌胰腺功能不全或在血清中诊断和排除急性胰腺炎。
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