CN111004781A - 长期扩增粒细胞-巨噬细胞祖细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了粒细胞‑巨噬细胞祖细胞，由其产生的粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的长期扩增的方法，以及其粒细胞巨噬细胞祖细胞的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月8日提交的序号为62/742,887，US的临时申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供了长期扩增粒细胞-巨噬细胞祖细胞的的方法、由此产生的粒细胞-巨噬细胞祖细胞以及粒细胞-巨噬细胞祖细胞的用途。
背景技术
粒细胞、巨噬细胞和树突细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分。它们是抵御病原体的第一道防线，在维持我们身体的体内稳态和预防包括感染、代谢疾病和癌症的各种疾病方面发挥着核心作用。这些细胞来源于骨髓中的共同祖细胞，即粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)。
发明内容
本文提供了能够扩增粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的方法，例如，GMP的长期扩增和克隆性扩增。这些方法通常适用于由任何数量的受试者来源(包括小鼠、大鼠、人等)来生成GMP的长期和克隆性扩增。在一些实施例中，通过本公开的方法生成的GMP的许多优点之一是GMP易受遗传修饰技术的影响，从而允许将GMP用于基础科学研究和临床治疗的应用。因此，扩增和遗传修饰了的GMP可以容易地转化为广泛的临床应用。例如，可以对人GMP进行遗传修饰，使它们分化成巨噬细胞(例如，敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因)。这些工程化的巨噬细胞可能或预期具有增强的抗肿瘤作用，并且可以作为单一疗法或与其他免疫剂的组合疗法在临床上用于治疗癌症，诸如与抗-PD-1/PD-L1抗体和嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞联合。此外，离体扩增的人GMP可以容易地用于灌注或移植来治疗由于例如化疗、放疗等引起的中性粒细胞减少。这种离体扩增的GMP可以是自体的或者受试者同种异体的。
本公开提供了一种扩增粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)群的方法，其包含在培养基中培养GMP，所述培养基包含：(i)生长因子，(ii)B-Raf激酶抑制剂，以及(iii)Wnt激活剂和/或GSK-3抑制剂，其中，GMP在经历多次细胞传代和/或克隆扩增后形态基本上保持不变。在一个实施例中，GMP衍生自或者获自干细胞。在另一个实施例中，在培养之前或期间对干细胞进行基因工程改造。在又一个或另一个实施例中，干细胞是造血干细胞。在又一个或另一个实施例中，造血干细胞是从受试者的骨髓中分离的。在另一个实施例中，受试者是哺乳动物受试者。在又一个或另一个实施例中，受试者是人、大鼠或小鼠。在又一个或另一个实施例中，培养基包含DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或另一个实施例中，培养基包含比例为约5:1至约1:5的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或另一个实施例中，培养基包含比例为约1:1的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或另一个实施例中，培养基包含一种或多种补充物，补充物选自胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和/或亚麻酸。在又一个或另一个实施例中，培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚以及亚麻酸。在又一个或另一个实施例中，生长因子是干细胞因子(SCF)。在又一个或另一个实施例中，B-Raf激酶抑制剂选自GDC-0879、PLX4032、GSK2118436、BMS-908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、威罗菲尼、PLX8394、SB590885以及它们的任何组合。在又一个或另一个实施例中，B-Raf激酶抑制剂是GDC-0879。在又一个或另一个实施例中，Wnt激活剂选自SKL 2001、BML-284、WAY 262611、CAS853220-52-7、QS11以及它们的任何组合。在又一个或另一个实施例中，Wnt激活剂是SKL2001。在任一个前述实施例的又一个实施例中，GSK-3抑制剂选自CHIR99021、CHIR98014、SB216763、BIO、A1070722、ARA014418以及它们的任何组合。在又一个或另一个实施例中，GSK-3抑制剂是CHIR99021。在又一个或另一个实施例中，GMP具有小、圆形和/或非附着的均一形态。
本公开还提供了一种遗传修饰粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的方法，包含使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变对通过任何前述方法制备的GMP进行遗传工程修饰。在一个实施例中，基因编辑系统是基于TALEN或CRISPR的系统。在又一个或另一个实施例中，遗传工程修饰包括替换或破坏现有基因(敲除)，或者改变基因位点使得含有在该基因位点处未发现的序列信息(敲入)。在又一个或另一个实施例中，GMP的遗传工程修饰包含敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因。在前述任何的另一个实施例中，该方法还包含将GMP分化成巨噬细胞，包括用包含MCSF的巨噬细胞分化培养基培养GMP。在一个实施例中，巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和MCSF。在又一个或另一个实施例中，分化培养基包含RPMI 1640、10％FBS和20ng/mL的MCSF。在前述任何的又一个或另一个实施例中，该方法还包括将GMP分化成粒细胞，包括用包含GCSF的粒细胞分化培养基培养GMP。在又一个或另一个实施例中，粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和GCSF。在又一个或另一个实施例中，粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、10％FBS和20ng/mL的GCSF。
本公开还提供了通过本公开的方法扩增的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)群。
本公开还提供通过本公开的方法制备的遗传修饰的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)。
本公开提供通过本公开的方法制备的巨噬细胞。
本公开提供通过本公开的方法制备的粒细胞。
本公开还提供一种药物组合物，其包含有效量的通过本文公开的方法制备的GMP群，遗传修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞，以及药学上能接受的载体或赋形剂。
本公开还提供一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的通过本公开的方法制备的GMP群、遗传修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞，以及药学上能接受的载体或赋形剂。
本公开还提供有效量的本公开的GMP群、遗传修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。
附图说明
图1A-D示出了小鼠GMP的长期培养。(A)在SCF/2i培养基中长期培养后的细胞形态图像。将1×105个新鲜骨髓细胞于SCF/2i培养基中接种到12孔板的一个孔中。3天后形成GMP细胞集落，收集细胞集落，用胰蛋白酶消化，每2-3天传代一次。代表性图像显示了不同传代数目后的GMP集落。比例尺：200μm。(B)使用不同培养条件的细胞形态图像。为了确定SCF(F)、GDC(G)和SKL(S)对于GMP的扩增是否重要，将1×105个新鲜骨髓细胞接种在补充有指定抑制剂或生长因子的基础培养基(N2B27)中。在接种后第3天拍摄代表性图片。比例尺：200μm。(C)示出了在不同培养条件下生长的细胞的延长的细胞生长曲线。将1x105个新鲜骨髓细胞在指定的条件下进行培养。每2天对悬浮细胞进行计数和传代。G:GDC0879；S:SKL2001；F:SCF。(D)示出了显示人GMP可在SCF、GDC和CHIR存在下进行扩增的图像。比例尺：200μm。
图2A-B提供了在SCF/2i培养基中培养的来源于小鼠骨髓细胞的GMP细胞的表征。(A)通过使用BD Arial流式细胞仪从骨髓细胞中新鲜分离出的HSC(Lin-cKit+Sca1+Flk2-CD34-Slam+)、GMP(Lin-cKit+Sca1-FcgR+)、单核细胞(Mac1+CD115+B220-TCRab-)、粒细胞(Mac1+CD115-Gr1+B220-TCRab-)、T细胞(TCRab+Gr-Ma1c-B220-)和B细胞(B220+CD19+Gr1-Mac1-TCRab-)的图像。所有细胞均在SCF/2i培养基中培养，接种后2天拍摄代表性照片。比例尺：200μm。(B)示出了细胞表面标志物的流式细胞术数据。GMP：Lin-cKit+Sca1-FcgR+。
图3A-I示出了由GMP分化产生巨嗜细胞的结果。(A)示出了表明巨噬细胞分化的图像。将P7GMP在RPMI 1640+10％FBS+20ng/mL MCSF中培养7天。将成熟的巨噬细胞重新接种，固定并针对CD11b和F4/80进行染色。(B)提供分化的巨噬细胞的体外功能测试结果。将1x105个GMP(P7)或1x106个BM细胞于RPMI 1640+10％FBS+20ng/mL MCSF中接种到6孔板的一个孔中。7天后，将成熟的骨髓来源的巨噬细胞(BMM)和GMP来源的巨噬细胞(GMPM)用胰蛋白酶处理，计数并按每孔1×105个细胞于RPMI 1640+10％FBS中重新接种至48孔板中。过夜后，用500ng/mL LPS刺激细胞6或24小时。通过ELISA测定上清液中的炎性细胞因子。(C)提供分化的巨噬细胞的另一种体外功能测试的图像。绿色：E.coli-GFP。红色：tdTomato+巨噬细胞。上图，GFP标记的E.coli与tdTomato+GMP来源的巨噬细胞共培养。在Zeiss LSM-780共聚焦显微镜下每30'拍摄共1小时的连续图片。比例尺：25μm。下图：洗去未被吞噬的细菌后，将细胞进行固定并用DAPI染色细胞核，在Zeiss LSM-780共聚焦显微镜下拍摄图片。(D-E)提供分化的巨噬细胞的其他体外功能测试的图像。将FITC标记的珠子与GMP来源的巨噬细胞共培养1小时。绿色：FITC-珠。蓝色：细胞核。(D)固定细胞并用DAPI染色，在Zeiss显微镜下拍摄图片。(E)收获细胞，并通过使用BD Arial流式细胞仪对FITC阳性细胞进行分析。(F-G)示出了粒细胞分化的结果。基础培养基：RPMI 1640+10％FBS。(H-I)提供使用分化的粒细胞进行体外功能测试的结果。(H)观察分化的粒细胞的MPO活性时的结果；以及(I)观察分化的粒细胞的细胞因子表达/释放时的结果。
图4A-D显示了小鼠体内研究的结果，其中小鼠已经被移植了tdTomato+GMP。(A)第一天，FAC分析。Mac：巨噬细胞，Gr：粒细胞。(B)在不同时间点对巨噬细胞和粒细胞分化的FACS分析。(C)对GMP移植小鼠肝脏的巨噬细胞和tdTomato阳性细胞进行双重免疫染色。每只小鼠通过尾静脉注射移植3×106个tdTomato+GMP。7天后，处死小鼠并将肝组织进行固定、切片以及针对F4/80和tdTomato进行染色。(D)接受了GMP移植的小鼠的腹腔巨噬细胞。通过尾静脉注射了3×106个GMP，腹膜内注射1mL Bio-Gel p100，在移植后4天收获腹腔巨噬细胞并进行接种。
图5A-E提供移植有PBS或tdTomato+GMP的小鼠的器官的表征，该小鼠腹膜内注射了2×107个金黄色葡萄球菌(S.aureus)。(A)金黄色葡萄球菌处理后的小鼠的内脏照片，该小鼠移植有PBS或tdTomato+GMP。脓疱如箭头所指。(B)从S.aureus处理后的小鼠中分离出的肝脏的照片，这些小鼠移植了PBS或tdTomato+GMP。脓疱如箭头所指。(C)从S.aureus处理后的小鼠中分离出的脾脏的照片，这些小鼠移植了PBS或tdTomato+GMP。(D)S.aureus处理后的小鼠的存活百分比，这些小鼠移植了PBS或tdTomato+GMP。(E)用B.cepacia 200处理后的小鼠的存活百分比，这些小鼠移植了PBS或tdTomato+GMP。
图6A-C提供了离体扩增的GMP的遗传修饰。(A)用GFP mRNA转染GMP的转染效率。超过95％的转染有GFP mRNA的GMP为GFP阳性。(B)将靶向GFP的gRNA转染到来源于ROSA26-CAG-Cas9-GFP小鼠的GMP中。转染后48小时，约91.1％的转染有GFP gRNA的GMP变为GFP阴性。(C)将靶向TLR4的gRNA转染到成熟巨噬细胞中，将这些巨噬细胞用Poly I:C和LPS进行刺激。24小时后，收获上清液，通过ELISA测定炎性细胞因子的分泌。
具体实施方式
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种细胞”包括多个细胞，提及“粒细胞-巨噬细胞祖细胞”包括提及一个或多个粒细胞-巨噬细胞祖细胞及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
此外，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包含”和“包括”是可互换的，而无意于进行限制。
还应理解，当各种实施例的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施例可以可选地使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来进行描述。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管许多方法和试剂与本文描述的那些类似或等同，但本文公开了示例性方法和材料。
出于描述和公开方法的目的，本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文，其可以与本文的说明结合使用。此外，对于在一份或多份出版物中出现的与本公开中明确定义的术语类似或相同的任何术语，本公开中明确提供的术语的定义将在所有方面受到控制。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、操作指南和试剂等，因此可以在一定程度上有所不同。这里使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
除了在操作实施例中或另有说明之外，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当用于描述本发明时，与百分比相关的术语“约”是指±1％。
粒细胞、巨噬细胞和树突细胞来源于骨髓中的共同祖细胞，即粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)。尽管先天免疫细胞具有巨大的治疗潜力，但由于目前无法对这些细胞或其祖细胞GMP进行有效扩增和遗传修饰，它们在临床中的应用受到很大限制。本文提供了对小鼠和人GMP进行长期扩增的方法。这些条件也可以用于对来源于其他物种的GMP进行扩增。离体扩增的GMP可以在体外和体内有效地分化成成熟的功能性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。还可以对这些离体扩增的GMP进行遗传修饰。本文公开的用于生产GMP的方法和由其生产的GMP具有很大的实用性，因为：(1)人GMP的长期扩增为基础研究和临床应用提供了无限的均质细胞群；(2)人GMP的长期扩增使得能够通过修饰GMP基因及其表达来研究免疫应答的调节；以及(3)离体扩增的人GMP可用于临床应用，包括移植。例如，离体扩增的人GMP可以容易地用于治疗中性粒细胞减少。此外，本公开提供了对人GMP的遗传修饰(例如，敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因；血管紧张素转化酶的过表达)，其可以进一步诱导分化成巨噬细胞和树突细胞。预计这些工程化的巨噬细胞和树突细胞具有增强的抗肿瘤作用，并且可以作为单一疗法或与其他免疫剂的组合疗法而在临床上用于治疗癌症，例如与抗-PD-1/PD-L1抗体和嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞联合。还可以将人GMP进行工程化以产生CAR-巨噬细胞，其可以用于开发针对癌症和其他疾病的新疗法。
巨噬细胞显示出最初被分类为M1或M2极性的不同表型。M1极化的巨噬细胞显示出呈递抗原，产生IL-12、IL-23、干扰素γ(IFNγ)和活性氧(ROS)的能力。M1巨噬细胞在抗肿瘤和使T细胞应答偏移向T辅助细胞1型(Th1)或细胞介导的免疫应答方面更有效。相反，M2巨噬细胞产生IL-10和TGF-β，参与组织重塑，具有免疫抑制性质，并促进Th2或抗体介导的免疫应答。肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的重要组成部分。这些细胞主要是促进肿瘤免疫抑制的M2表型巨噬细胞。最近的研究支持了它们对T细胞功能抑制的作用，这种抑制作用并未因免疫检查点阻断的使用而消除。因此，巨噬细胞已成为对抗癌症的一个有吸引力的治疗靶点。尽管巨噬细胞具有巨大的治疗潜力，但它们在临床中的应用受到很大限制，因为目前没有有效的方法来对巨噬细胞或其祖细胞GMP进行扩增和遗传修饰。对人GMP的长期扩增从而允许进行遗传修饰使得这些细胞在治疗上更具适用性。
已经发现对两种蛋白激酶——丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)和糖原合成酶激酶3(GSK3)进行抑制，使得小鼠和大鼠胚胎干细胞(ESC)能够长期自我更新。基于该发现，假定通过抑制负责启动分化的信号传导途径，在长期体外培养期间可以维持许多(如果不是全部)类型的干细胞。为了鉴定能促进造血系统干细胞/祖细胞自我更新的抑制剂，将从成年C57BL/6小鼠中分离的骨髓细胞接种到96孔板中的无血清N2B27培养基中，然后用小分子文库进行筛选。鉴定出一种B-Raf激酶抑制剂(GDC-0879)，其可显著促进含有均匀光亮、小而圆形细胞的集落的形成。然而，传代后，这些细胞逐渐附着和分化。因此，进行了另一轮筛选。第二次筛选鉴定出Wnt激活剂(SKL2001)，其与GDC0879协同作用促进均匀圆形细胞的扩增。然而，发现GDC和SKL的组合并不足以使细胞长期扩增。进行了第三次筛选。在此次筛选中，鉴定出可能对细胞的长期扩增很重要的一组生长因子。进一步的实验之后，发现利用干细胞因子(SCF)与B-Raf激酶抑制剂(GDC-0879)和Wnt激活剂(SKL2001)组合的方法可以产生光亮、小而圆形的细胞的均匀细胞群，该细胞群能进一步进行长期的细胞扩增(例如，参见图1A)。上述组合(SCF+GDC-0879+SKL2001)在本文中称为SCF/2i。因此，在本文提供的各实施例中，本公开的方法利用SCF与B-Raf激酶抑制剂(GDC-0879)和Wnt激活剂(SKL2001)来促进GMP的长期扩增。在又一个实施例中，本公开的方法利用SCF/2i促进小鼠和其他GMP的长期扩增。在一个可选实施例中，本公开的方法利用SCF与GDC-0879和GSK3抑制剂(CHIR99021)的组合来促进人和其他GMP的长期扩增。
在一个特定实施例中，本公开提供了对粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的均一细胞群进行长期扩增的方法，该粒细胞/巨噬细胞祖细胞在经历多次细胞传代和克隆扩增后在形态学上保持不变。在另一个实施例中，本文公开的方法包括在培养基中培养GMP的步骤，该培养基包括因子和试剂的组合，因子和试剂包括但不限于生长因子(例如，SCF)、B-Raf激酶抑制剂(例如，GDC-0879)和Wnt激活剂(例如，SKL 2001)和/或GSK-3抑制剂(例如，CHIR99021)。
如本文所用，“基本上均一的群体”是指其中至少80％的细胞是指定类型细胞的细胞群，优选至少90％、95％，或甚至98％或更多。
如本文所用，“长期培养”或“长期扩增”是指细胞在受控条件下增殖，使得细胞数量增加和/或维持基本活力和基本相似的形态。在一些实施例中，该术语是指进行培养同时保持所需的形态和细胞数量的时间段(例如，约两个月或更长)或者其可能与至少10种培养基传代的传代数目(例如，培养基改变)相关。在其他实施例中，该术语是指在一段时间内数量的增加(例如，在约两个月的时间内增加至少一百万倍)。在一些实施例中，长期培养物培养超过4个月、超过6个月或超过1年。在其他实施例中，长期培养物传代超过15代、超过18代或超过20代。
在另一个实施例中，本文公开的GMP来源于干细胞。干细胞可以包括胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、非胚胎(成体)干细胞和脐带血干细胞。可以使用本公开的培养基进行培养的干细胞类型包括来源于任何哺乳动物物种的干细胞，包括人、小鼠、大鼠、猴子和猿(参见例如《自然》,448:313-318,2007年7月；和Takahashi等，《细胞》,131(5):861-872；它们通过引用并入本文)。
在一个特定实施例中，本公开的GMP来源于诱导的多能干细胞(iPS或iPSC)。iPSC是一种通过(内源基因的)基因选择性表达或通过转染异源基因的方式从非多能细胞获得的多能干细胞。日本京都大学Shinya Yamanaka的团队对诱导的多能干细胞进行了描述。Yamanaka鉴定出了在胚胎干细胞中特别活跃的基因，并使用逆转录病毒将这些基因有选择的转染小鼠成纤维细胞。最终，分离出产生多能干细胞必需的四个关键多能性基因：Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4。通过针对Fbx15+细胞的抗生素选择来分离细胞。该研究小组与来自哈佛大学、麻省理工学院和加利福尼亚大学洛杉矶分校的另外两个独立研究小组一起发表了一项研究，表明小鼠成纤维细胞成功重编程为iPS，甚至产生了可存活的嵌合体。
在一个可选实施例中，本文公开的GMP来源于胚胎干细胞(ESC)。ESC是来源于人胚胎的未分化内细胞团的干细胞。胚胎干细胞是多能的，意味着它们能够生长(即，分化)成三个原胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层。多能性将胚胎干细胞与成年动物中发现的成体干细胞区分开来；而胚胎干细胞在体内可以生成所有细胞类型，成体干细胞是专能的且只能产生有限数量的细胞类型。另外，在限定的条件下，胚胎干细胞能够对其自身进行无限繁殖。这使得胚胎干细胞可以用作研究和再生医学的有用工具，因为它们可以产生无限数量的自身细胞用于继续研究或临床用途。
在另一个可选实施例中，本文公开的GMP来源于脐带血干细胞。脐带血是婴儿出生后在胎盘和脐带中留下的血液。脐带血包含全血中的所有成分。它含有红细胞、白细胞、血浆、血小板，还含有丰富的造血干细胞。可以使用本领域所教导的任意数量的分离方法从脐带血中分离造血干细胞，包括Chularojmontri等在J Med Assoc Thai 92(3):S88-94(2009)中所教导的那些方法。此外，可用来自于多个供应商的商业试剂盒从人脐带血分离CD34+细胞(即，造血干细胞)，包括STEMCELL Technologies公司、Thermo FisherScientific公司、Zen-Bio公司等。
在又一个可选实施例中，本文公开的GMP来源于非胚胎干细胞。非胚胎干细胞可以自我更新并且可以分化产生组织或器官的一些或所有主要的特化细胞类型。非胚胎干细胞在活生物体中的主要作用是维持和修复它们被发现所在的组织。科学家还使用术语成体干细胞代替非胚胎干细胞，其中成体是指身体细胞(非生殖细胞、精子或卵子)。已经在许多器官和组织中鉴定出非胚胎干细胞，包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝、卵巢上皮和睾丸。它们被认为存在于每个组织的特定区域(称为“干细胞壁龛”)。在活体动物中，非胚胎干细胞可以在需要时进行长时间的分裂，并且可以产生特定组织的具有特定形状以及特定结构和功能的成熟细胞类型。
在特定实施例中，本文公开的GMP来源于造血干细胞(HSC)。HSC可以很容易地从脐带血和骨髓中分离出来。此类分离操作指南是本领域已知的，并且通常使用CD34+作为分离HSC的细胞选择标记(例如，参见Lagasse等，Nat Med.6:1229-1234(2000))。
干细胞是能够分化成其他细胞类型的细胞，包括具有特定、专门功能的细胞(例如，组织特异性细胞、实质细胞以及它们的祖细胞)。祖细胞(即“专能干细胞”)是能够产生不同终末分化细胞类型的细胞，以及能够产生各种祖细胞的细胞。产生生物体中的一些或多种(但不是全部)细胞类型的细胞通常被称为“多能”干细胞，它能够分化成成熟生物体内的任何细胞类型，然而在没有重编程的情况下它们不能去分化成它们所源于的细胞。可以理解，“专能”干细胞/祖细胞(例如，粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP))具有比多能干细胞更窄的分化潜能。在衍化成GMP之前，可以使用任意数量的基因工程技术对本文公开的干细胞进行遗传修饰，例如基因治疗、基因编辑系统、同源重组等。这样修饰的干细胞可以提供增强的治疗(例如，参见Nowakowski等，Acta NeurobiolExp(Wars)73(1):1-18(2013))。
在本文公开的方法中，GMP可以在培养基中生长和扩增，该培养基包括因子和试剂的组合，包括但不限于生长因子(例如，SCF)、B-Raf激酶抑制剂(例如，GDC-0879)和Wnt激活剂(例如，SKL 2001)和/或GSK-3抑制剂(例如，CHIR99021)。培养基是经改良的基础培养基，其补充有各种其他生物试剂。基础培养基是指氨基酸、维生素、盐和营养物质的溶液，它们在培养中有效支持细胞生长，尽管除非补充有其他化合物，否则通常这些化合物不支持细胞生长。营养物质包括可被细胞代谢的碳源(例如，糖，诸如葡萄糖)，以及细胞存活所必需的其他化合物。这些是细胞自身不能合成的化合物，因为缺乏编码合成该化合物(例如，必需氨基酸)所需蛋白质的一个或多个基因，或者，对于细胞可以合成的化合物，由于其特定的发育状态，编码必需的生物合成蛋白的基因表达水平不够。哺乳动物细胞培养领域中已知许多基础培养基，诸如Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)、RPMI 1640、Knockout-DMEM(KO-DMEM)以及DMEM/F12，不过任何能补充有支持干细胞以基本未分化的状态生长的试剂的基础培养基均可以使用。本文进一步发现，包含一定比例的上文例举的基础培养基之一(例如DMEM/F12)与神经基础培养基的培养基出人意料地改善了GMP的生长。特别地，比例为5:1至1:5的上文例举的基础培养基之一(例如，DMEM/F12)与神经基础培养基可用于培养GMP。在另一个实施例中，用于生长GMP的培养基包含1:1的DMEM/F12与神经基础培养基。
如上文所指出的，本文公开的用于生长GMP的培养基可以补充有一种或多种其他的试剂，包括但不限于胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和亚麻酸。在某一实施例中，本文公开的用于生长GMP的培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和亚麻酸。
应当理解，理想的是用新鲜培养基连续地或定期(通常每1至3天)更换用过的培养基。使用新鲜培养基的一个优点是能够调整条件，使得细胞比按照常规技术在饲养层细胞上培养或在条件培养基中培养时更均匀和快速地扩增。
与先前的起始细胞群相比，可获得扩增4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多的GMP细胞群。在合适的条件下，与用于起始培养的GMP相比，扩增的群体中的细胞会有50％、70％或更多处于未分化状态。每次传代的扩增程度可以通过将培养结束时收获的大概细胞数除以最初接种到培养基中的大概细胞数来计算。在生长环境的几何形状受到限制或出于其他原因的情况下，可任选地将细胞传代到类似的生长环境中以进一步扩增。总扩增是每次传代中所有扩增的产物。当然，没有必要在每次传代时保留所有扩增的细胞。例如，如果每次培养细胞扩增两倍，但每次传代仅保留约50％的细胞，那么大约相同数量的细胞将被继续传代。但经过四次培养后，这些细胞可以说经历了16倍的扩增。细胞可以通过本领域已知的低温冷冻技术进行储存。
如本文更详细地指出的，GMP可在培养基中生长和扩增，该培养基包括因子和试剂的组合，包括但不限于生长因子(例如，SCF)、B-Raf激酶抑制剂(例如，GDC-0879)和Wnt激活剂(例如，SKL 2001)和/或GSK-3抑制剂(例如，CHIR99021)。
“生长因子”是指有效促进细胞(例如，干细胞)生长且除非作为补充剂添加到培养基中，否则它不是基础培养基的组分的物质，例如，化合物或分子。生长因子包括但不限于干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、血小板衍生生长因子-AB(PDGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活素A、Wnt和骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、细胞因子、趋化因子、形态发生素、中和抗体、其他蛋白质和小分子。还可以将外源性生长因子添加到根据本公开的培养基中，来帮助维持处于基本上未分化状态的GMP的培养。这些因子及其有效浓度可如本文其他地方所述或使用细胞培养领域的技术人员已知的技术来确定。在一个特定实施例中，在包含SCF的培养基中对GMP进行培养。
“B-Raf”激酶抑制剂是指阻断或降低被称为B-Raf激酶的蛋白质的活性或减少B-Raf激酶的量的物质，例如化合物或分子。B-Raf是一种激酶，其帮助控制细胞生长和信号传导。可以在某些类型的癌症中发现它的突变(改变)形式，包括黑素瘤和结肠直肠癌。一些B-Raf激酶抑制剂用于治疗癌症。B-Raf激酶抑制剂的实例包括但不限于GDC-0879、PLX4032、GSK2118436、BMS-908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、威罗菲尼、PLX8394以及SB590885。在特定实施例中，本文公开的方法包括使用B-Raf激酶抑制剂GDC-0879。
“Wnt激活剂”是指诱导Wnt信号途径的化合物或分子。Wnt信号途径是一组信号转导途径，其起始于通过细胞表面受体将信号传递到细胞中的蛋白质。已经表征了三种Wnt信号途径：经典Wnt途径、非经典平面细胞极性途径以及非经典Wnt/钙途径。所有三种途径都是通过Wnt-蛋白质配体与Frizzled家族受体结合而激活的，Frizzled家族受体将生物信号传递至细胞内的Dishevelled蛋白。Wnt包含不同家族的分泌的脂质修饰的信号传导糖蛋白，它们的长度为350-400个氨基酸。在这些蛋白质上发生的脂质修饰类型是以对23-24个半胱氨酸残基的保守模式对半胱氨酸的棕榈酰化。棕榈酰化是必要的，因为它启动Wnt蛋白质靶向质膜以进行分泌，并且由于脂肪酸的共价连接，棕榈酰化允许Wnt蛋白质与其受体结合。Wnt蛋白质也经历糖基化，其连接碳水化合物以确保适当的分泌。在Wnt信号传导中，这些蛋白质作为配体通过旁分泌和自分泌途径激活不同的Wnt路径。这些蛋白质在物种间高度保守。它们可以发现于小鼠、人类、非洲爪蟾、斑马鱼、果蝇和许多其他物种中。Wnt激活剂的实例包括但不限于SKL 2001、BML-284、WAY 262611、CAS853220-52-7以及QS11。在特定实施例中，本文公开的方法包含使用Wnt激活剂SKL 2001。
本文所用的“GSK-3抑制剂”是指抑制糖原合成酶激酶3作用的化合物或小分子。糖原合成酶激酶3是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸残基上。在哺乳动物中，GSK-3是由两种已知基因GSK-3α(GSK3A)和GSK-3β(GSK3B)编码的。GSK-3最近成为许多研究的主题，因为它涉及许多疾病，包括II型糖尿病(2型糖尿病)、阿尔茨海默病、炎症、癌症和双相情感障碍。GSK-3在许多中枢细胞内信号途径中具有活性，包括细胞增殖、迁移、葡萄糖调节和细胞凋亡。GSK-3也被证明可以调节免疫和迁移过程。GSK-3参与先天免疫反应中的许多信号途径，包括促炎细胞因子和白细胞介素的产生。GSK-3也与细胞增殖和凋亡的途径紧密相连。已证明GSK-3能够磷酸化β-连环蛋白，从而使其靶向降解。GSK-3抑制剂的实例包括但不限于CHIR99021、CHIR98014、SB216763、BIO、A1070722和AR-A014418。在特定实施例中，本文公开的方法包含使用GSK抑制剂CHIR99021。
本公开还提供了使用基因工程技术对本文公开的GMP进行遗传修饰的方法。特别地，本文证明本公开的GMP易受遗传修饰技术的影响，从而在基础科学研究和临床治疗应用中能够使用GMP。因此，可以容易地将扩增和遗传修饰的GMP转化为广泛的临床应用。因此，本公开还提供了对本文公开的GMP进行遗传修饰的方法。此类方法可包括通过使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变对GMP进行遗传工程修饰的步骤。基因编辑系统的特定实例包括TALEN和CRISPR。
在某一实施例中，CRISPR系统是II型CRISPR系统，Cas酶是催化DNA切割的Cas 9。来源于化脓性链球菌的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶促作用在靶位点序列处产生双链断裂，该靶位点序列与导向序列的20个核苷酸杂交且在靶序列的20个核苷酸之后具有前间隔区相邻基序(PAM)序列(实例包括NGG/NRG或PAM，其可如本文所述确定)。通过Cas9进行位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性由导向序列、部分与导向序列杂交的tracr序列和PAM序列限定。在Karginov和Hannon的《The CRISPR system:small RNA-guided defenceinbacteria and archaea》,Mole Cell 2010,January 15；37(1):7中描述了CRISPR系统的更多方面。
来自化脓性链球菌SF370的II型CRISPR位点，其包含四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的簇，以及两个非编码RNA元件，tracrRNA以及由短链非重复序列(间隔区，每个约30bp)间隔的重复序列(正向重复)的特征阵列。在该系统中，靶向DNA双链断裂(DSB)的生成分为四个有顺序的步骤。首先，将两个非编码RNA——即pre-crRNA阵列和tracrRNA从CRISPR位点进行转录。其次，tracrRNA与pre-crRNA的正向重复序列杂交，然后将其加工成含有单个间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA的间隔区和前间隔区DNA之间的异源双链形成，将Cas9导向包含前间隔区和相应PAM的靶序列。最后，Cas9介导PAM靶序列的切割以在前间隔区内产生DSB。在某一实施例中，基于RNA聚合酶III的U6启动子驱动tracrRNA的表达。
通常，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物的形成(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白形成复合物的导向序列)导致在靶序列或其附近(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)一条或两条链的切割。在不希望受理论约束的情况下，tracr序列可能包含或由野生型tracr序列的全部或部分组成(例如约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多野生型tracr序列的核苷酸)，也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如，通过至少一部分tracr序列与全部或部分tracr配对序列的杂交，可操作地连接到导向序列。在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一种或多种元件表达的一种或多种载体导入宿主细胞(例如，GMP或干细胞)中，使得CRISPR系统的元件的表达在一个或多个靶位点指导形成CRISPR复合物。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列的引导序列和tracr序列都可以可操作地连接到不同载体上的不同调节元件。可选地，可以将由相同或不同调节元件表达的两种或更多种元件组合在单一载体中，其中一种或多种其他载体提供不包含在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。组合在单个载体中的CRISPR系统元件可以以任何合适的方向布置，例如，一个元件相对于第二元件位于5'端(“上游”)，或相对于第二元件位于3'端(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的正义或反义链上，并且取向可以相同或相反。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶和一个或多个导向序列，tracr配对序列(任选地可操作地连接到导向序列)以及嵌入一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，每个在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部在单个内含子中)的转录物的表达。在一些实施例中，CRISPR酶、导向序列、tracr配对序列和tracr序列可操作地连接到相同的启动子并由相同的启动子进行表达。
在一些实施例中，CRISPR表达载体包含一个或多个插入位点，例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约或多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，载体包含tracr配对序列上游的插入位点，并且任选地位于与tracr配对序列可操作地连接的调控元件的下游，使得在将导向序列插入插入位点并且表达后，导向序列将CRISPR复合物序列特异性结合的导向真核细胞(例如，GMP或干细胞)中的目标序列。在一些实施例中，载体包含两个或更多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，以允许在每个位点插入导向序列。在这样的布置中，两个或更多个导向序列可以包括单个导向序列的两个或更多个拷贝、两个或更多个不同的导向序列，或这些的组合。当使用多个不同的导向序列时，单个表达构建体可用于将CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可包含约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个导向序列。在一些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个这样的含有导向序列的载体，并任选地递送至细胞。
在一些实施例中，载体包含与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作地连接的调节元件，CRISPR酶例如，Cas蛋白。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、它们的同源物或它们的修饰形式。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在一些实施例中，CRISPR酶指导靶序列位置处的一条或两条链的切割，诸如，靶序列内和/或靶序列的互补序列内部。在一些实施例中，CRISPR酶指导自靶向序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对内的一条或两条链的切割。在一些实施例中，载体编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶向多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓性链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸取代(D10A)，将Cas9从切割两个链的核酸酶转换成切口酶(切割单链)。可使Cas9转换成切口酶的突变的其他实例包括但不限于H840A、N854A和N863A。作为另一个实例，可以将Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvC III或HNH结构域)进行突变以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A或N863A突变中的一个或多个组合产生基本上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当突变酶的DNA切割活性与其非突变形式相比小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，认为CRISPR酶基本上缺乏所有的DNA切割活性。如果该酶不是SpCas9，则可在SpCas9的10、762、840、854、863和/或986位置对应的任何或所有残基处进行突变(可通过标准序列对比工具确定)。特别地，在SpCas9中优选以下任何或所有突变：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；以及任何取代氨基酸的保守性取代。在其他Cas9的相应位置也显示出同样的突变(或这些突变的保守取代)。
本文还描述了所示的直系同源物。一种Cas酶可以被鉴定为Cas9，因为其可以认为是与具有来自II型CRISPR系统的多个核酸酶结构域的最大核酸酶具有同源性的一般酶类。最优选地，Cas9酶来自spCas9或saCas9，或来源于spCas9或saCas9。来源于意指得来的酶在很大程度上与野生型酶具有高度的序列同源性，但是它已经以本文所述的某种方式发生突变(修饰)。
应当理解，术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换使用，除非另有说明。如上所述，本文使用的许多残基编号是指来自化脓性链球菌的II型CRISPR基因位点的Cas9酶。然而，应当理解，本公开内容包括来自其他微生物种类的更多种Cas9，诸如SpCas9、SaCa9、St1Cas9等。
基因编辑系统(例如，CRISPR和TALEN)可用于对GMP或干细胞进行遗传工程修饰，诸如，替换或破坏GMP或干细胞中发现的现有基因(敲除)。如本文提供的实施例中所示，本公开的GMP特别易受敲除突变的影响。此外，预期可以容易地由本公开的GMP产生其他敲除，诸如，SIRPα基因敲除和/或PI3Kγ基因敲除。可选地，可以使用相同的编辑系统(例如，CRISPR和TALEN)来改变基因位点以便含有该基因位点上未发现的序列信息(敲入突变)。这些修饰可用于产生“获得功能”的GMP。这种修饰的GMP特别适用于模拟疾病状态，例如，通过表达与疾病或病症相关的生物分子。
本公开进一步提供GMP分化成血细胞的髓系和淋巴系，诸如单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞至血小板、T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。在特定实施例中，本文公开的方法还包含通过用包含MCSF的巨噬细胞分化培养基对GMP进行培养来将本公开的GMP分化成巨噬细胞。在又一个实施方式中，巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、10％FBS和20ng/mL的MCSF。在可选实施方式中，本文公开的方法还包含将本公开的GMP分化成粒细胞，其包含：用包含GCSF的粒细胞分化培养基对GMP进行培养。在又一个实施方式中，粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、10％FBS和20ng/mL的GCSF。
以下实施例旨在说明而非限制本公开。虽然它们是可能使用的那些中的典型，，但是可以可选地使用本领域技术人员已知的其他方法。
实施例
确定SCF、GDC和SKL的特定组合对于小鼠和人GMP细胞的长期扩增是否重要。为了确定SCF、GDC和SKL对于小鼠GMPs的长期扩增是否都是重要的，在不存在SCF、GDC或SKL的情况下对小鼠GMP进行培养。如图1B所示，3天后，在仅含有基础培养基的组中几乎所有细胞都死亡了，在没有SCF的情况下大多数细胞都分化了并附着于平板上。尽管在(SCF+GDC)或(SCF+SKL)中培养的GMP可以传代3至5次，但它们都最终分化并死亡了。相反，在SCF/2i中培养的GMP可以长期繁殖(例如，参见图1B和1C)。小鼠GMP已经在SCF/2i中连续扩增超过2个月，且形态学上保持不变。
接下来，测试该SCF/2i条件是否也允许人GMP的扩增。使用EasySepTM人脐带血CD34阳性选择试剂盒(加拿大温哥华，STEMCELL Technologies Inc.公司)从人脐带血中分离CD34+细胞，并在补充有SCF/2i的N2B27培养基中进行培养。在培养3-5天后出现类似于小鼠GMP的均匀明亮、小而圆形的细胞。这些人类细胞可以扩增若干代，但随着传代数增加而逐渐死亡或分化，不能传代超过8-10代。用GSK3抑制剂(CHIR99021)代替SKL，发现SCF、GDC和CHIR的组合使得来源于脐带血、骨髓和G-CSF动员的CD34外周血干细胞产生的人GMP能够长期扩增。进一步发现B27补充剂中的一些组分对小鼠和人GMP的扩增产生不利影响。实验后，开发了基础培养基的简化版本，其进一步改善了小鼠和人GMP的扩增。该简化的基础培养基包含DMEM/F12和神经基础培养基(以1:1比例混合)，补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和亚麻酸。上述简化的基础培养基在本公开中被称为E7培养基。
小鼠GMP的表征。为了表征所培养的GMP，首先分离新鲜骨髓细胞，然后使用流式细胞仪分选出不同的造血干细胞/祖细胞，包括造血干细胞(HSC)(Lin-cKit+Sca1+Flk2-CD34-Slam+)、GMP(Lin-cKit+Sca1-CD34+FcgR+)、单核细胞(Mac1+CD115+B220-TCRab-)、粒细胞(Mac1+CD115-Gr1+B220-TCRab-)、T细胞(TCRab+Gr-Ma1c-B220-)和B细胞(B220+CD19+Gr1-Mac1-TCRab-)。用SCF/2i来对这些不同类型的细胞进行培养以确定哪些类型的细胞可以扩增并产生GMP。发现HSC和GMP形成相同的细胞集落，并且当使用SCF/2i时，这些细胞能够自我更新以进行长期扩增。然而，在其他细胞群中没有形成集落(例如，参见图2A)。这些结果表明使用SCF/2i的扩增细胞可能是髓系干细胞中的一种类型。接下来，在第3代后，收获细胞并在染色后通过流式细胞仪检查细胞表面标志物。如图2B所示，这些细胞是cKit+Sca1-CD34+FcgR+，这表明它们是GMP。GMP可以产生粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。接下来，进行体外分化试验以进一步表征这些离体扩增的GMP。
长期离体扩增的GMP可以分化成功能性和成熟的巨噬细胞。为了诱导分化成成熟巨噬细胞，将离体扩增的GMP以1×105个/孔接种到6孔板中，并在RPMI 1640+10％FBS+20ng/mL MCSF中培养。细胞增殖，开始贴壁，并在接种后3天分化。到第7天，总细胞数增加到～2×106。将细胞传代并以1×105个细胞/孔重新接种于24孔板中。接种后24小时，固定细胞并用巨噬细胞标记物CD11b和F4/80进行染色，并用DAPI染色细胞核。发现几乎所有细胞都表达CD11b和F4/80(例如，参见图3A)，表明GMP已经诱导分化成巨噬细胞。作为先天免疫细胞的一种主要类型，巨噬细胞通过吞噬作用和分泌炎性细胞因子来发挥其功能。众所周知，巨噬细胞表达高水平的toll样受体4(TLR4)，并且LPS激活TLR4显著增加炎性细胞因子的产生。为了测试来源于GMP的巨噬细胞是否能分泌炎性细胞因子，将来源于GMP的巨噬细胞(GMPM)或来源于骨髓的巨噬细胞(BMM)以1×105个细胞/孔接种到48孔板中，然后用500ng/mL的LPS进行刺激。6或24小时后，收集上清液，并通过ELISA测定炎性细胞因子TNFα、IL6和IL10的浓度。如所预期的，这些细胞因子在LPS刺激后显著增加。有趣的是，与BMM相比，GMPM分泌更多的促炎细胞因子TNFα和IL6以及更少的抗炎细胞因子IL10(例如，图3B)。
为了评估GMPM的吞噬功能，从Rosa26-CAG-tdTomato敲入小鼠获取GMP。在该小鼠中，tdTomato荧光蛋白在所有细胞中表达。在使用SCF/2i扩增7代后，诱导tdTomato+GMP分化成成熟的巨噬细胞。然后将这些巨噬细胞与GFP标记的E.coli共培养。然后使用ZeissLSM-780共聚焦显微镜进行延时拍摄1小时。发现GMPM非常有效地吞噬和消化细菌(例如，参见图3C)。为了进一步评估GMPM的吞噬效率，使用FITC标记的乳胶珠按照厂商的操作指南进行吞噬作用试验。在与乳胶珠共培养30分钟后，将GMPM进行固定并用DAPI染色，或者用胰蛋白酶消化并在流式细胞仪下进行分析。如图3D和3E所示，超过80％的巨噬细胞吞噬了乳胶珠。总之，这些结果表明长期离体培养的GMP能够分化成成熟的功能性巨噬细胞。
长期离体扩增的GMP可以分化成功能性的成熟粒细胞。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是已知的造血生长因子，其调节骨髓中嗜中性粒细胞的产生。G-CSF用于诱导小鼠GMP向嗜中性粒细胞系分化。在E7+SCF/GDC/CHIR条件下培养3周后，将GMP重新置于RPMI 1640+10％FBS培养基中，并用20ng/mL的GCSF进行刺激。在用GCSF刺激后72小时，GMP分化成形态上类似于粒细胞的细胞(例如，参见图3F)。为了进一步鉴定这些细胞的身份，将细胞收获并用Gr1和CD115抗体染色，通过流式细胞仪分析。粒细胞是Gr1+且CD115-。如图3G所示，超过80％的来源于GMP的细胞是Gr1+CD115-，这表明GMP可以通过GCSF有效诱导分化成粒细胞。
从粒细胞/嗜中性粒细胞释放髓过氧化物酶(MPO)以降解入侵的病原体，提供先天免疫中最早的防线之一。为了在功能上评估来源于小鼠GMP的粒细胞，使用MPO活性测定试剂盒(Cayman Chemical Company)测定MPO活性。使用BD Arial I流式细胞仪从全血中分选小鼠嗜中性粒细胞(Gr1+CD11b+CD115-)并用作阳性对照。将GMP，来源于GMP的粒细胞和血液来源的嗜中性粒细胞以1×105个细胞/孔于含有1％BSA的RPMI 1640培养基中接种到96孔板中。然后用100nM佛波酯(PMA)刺激细胞2小时，并按照厂商的操作指南测定上清液中的MPO活性。用MPO的特异性抑制剂4-氨基苯甲酰肼(ABH)验证试验的特异性。如图3H所示，在未分化的GMP中未能检测到MPO活性，而来源于GMP的粒细胞和血液嗜中性粒细胞具有与PMA刺激(1.039±0.122与1.037±0.173,p＝0.98)或没有PMA刺激(0.580±0.017与0.535±0.062，p＝0.29)相似的MPO活性。如所预期的，PMA刺激的来源于GMP的粒细胞和血液嗜中性粒细胞中的MPO活性都被阻断(例如，参见图3H)。
由于嗜中性粒细胞也表达高水平的TLR4，因此用LPS对来源于GMP的粒细胞进行刺激以进一步评估其细胞因子生成能力。将GMP、来源于GMP的粒细胞和血液嗜中性粒细胞以1×105个细胞/孔于含有10％FBS的RPMI 1640培养基中接种到96孔板中。用500ng/mL LPS对细胞进行刺激。24小时后，收集上清液，通过ELISA测定炎性细胞因子TNFα、IL6和IL10。结果显示，与LPS刺激后的血液嗜中性粒细胞相比，来源于GMP的粒细胞分泌相似量的炎性细胞因子(例如，参见图3I)，有趣的是，未分化的GMP也对LPS有反应并分泌低水平的TNFα和IL6(例如，参见图3I)。总之，这些结果表明离体扩增的GMP保留了分化成成熟功能性粒细胞的能力。
长期离体扩增的GMP可在体内分化成粒细胞和巨噬细胞。为了确定体内扩增的GMP的分化潜能，我们用SCF/2i将tdTomato+小鼠GMP扩增了4周，然后以每只小鼠2×106个细胞通过尾静脉注射移植到C57BL/6小鼠中。移植后第1、4、7或14天处死小鼠。分离血液、脾脏和骨髓细胞，染色并通过FACS进行分析。将肝组织进行收获、切片并针对Tdtomato和巨噬细胞的标记物F4/80进行染色。移植一天后，骨髓、脾脏和白细胞总数的0.7％、9.4％和5.1％分别为tdTomato阳性。在这些tdTomato+细胞中，约10-25％已经分化成巨噬细胞(CD115+CD11b+)，4-10％分化成嗜中性粒细胞(CD115-CD11b+Gr1+)(例如，参见图4A)。血液中的供体细胞分化了且逐渐减少，并且它们中的大多数在移植后7天分化成成熟巨噬细胞(14.8％)和嗜中性粒细胞(75.8％)(例如，参见图4B)。在肝脏中也可以发现成熟的来源于供体的巨噬细胞(tdTomato+F4/80+)(例如，参见图4C)。众所周知，将Bio-Gel聚丙烯酰胺珠或巯基乙酸盐液体培养基注入腹膜腔可产生炎症反应并引发大量巨噬细胞的积聚。为了确定这些来源于GMP的巨噬细胞是否也对炎性刺激负责，每只小鼠通过尾静脉注射移植3×106tdTomato+GMP，并且同时腹腔内注射2％Bio-Gel p-100(1mL)。注射后4天，收集腹腔巨噬细胞并在RPMI 1640+10％FBS中进行培养。移植的GMP分化产生约1-2％的腹腔巨噬细胞(例如，参见图4D)。这些结果表明长期离体扩增的GMP能够在体内分化成成熟的巨噬细胞和嗜中性粒细胞，并响应炎症刺激。
移植离体扩增GMP保护了X连锁CGD小鼠免受细菌感染。慢性肉芽肿病(CGD)是一组遗传性疾病，其特征是吞噬细胞呼吸爆发氧化酶缺陷、危及生命的化脓性感染和炎症性肉芽肿。通过敲除编码gp91phox的X连锁基因来生成CGD的小鼠模型，其广泛用于研究该疾病。S.aureus是CGD患者软组织或内脏脓肿的常见原因，而洋葱伯克氏菌(B.cepacia)是一种可在CGD患者中产生严重感染，包括肺炎和相关败血症的机会性革兰氏阴性病原体。据报道，X-连锁CGD小鼠中腹腔的细菌清除作用受损。
为了进一步在功能上表征离体扩增的GMP，通过尾静脉注射以每只小鼠3×106个细胞将GMP移植到gp91phox-/-小鼠。在对照组中，注射相同体积的PBS。三天后，给小鼠腹膜内注射0.2ml 1×108/mL S.aureus菌株502A(ATCC No.27217；ATCC)或1x103/mL B.cepacia杆菌(ATCC No.25609；ATCC)的悬液。每天检查小鼠并在腹腔细菌攻击后2周处死。如图5A所示，对照组小鼠在S.aureus攻击后发生严重感染，并且在包括肝、脾、肠和肾的几个器官中发现脓肿。与此形成鲜明对比的是，移植GMP的组很少发生脓肿。收集肝脏，并计数在细菌攻击后脓肿的数量。发现与对照组相比，移植GMP显著减少了脓肿的形成(0.71±0.286与6.00±0.577，p<0.001)(例如，参见图5B)。已知活动性感染引起脾肿大。接下来，测量接种S.aureus后2周脾脏的大小。结果发现，对照组X连锁CGD小鼠的脾脏显著增大(1.62±0.166cm)，而移植了GMP的小鼠的脾脏尺寸与正常尺寸相似(0.88±0.0.07cm)(例如，参见图5C)。另外，对照组中接种S.aureus后8只小鼠中有2只死亡，而移植了GMP的组中所有8只小鼠全部存活(例如，参见图5D)。B.cepacia是一种机会性革兰氏阴性病原体，可在CGD患者中产生严重感染，包括肺炎和相关的败血症。注射PBS和B.cepacia的所有10只对照CGD小鼠均在6天内死亡。相反，注射了GMP和B.cepacia的10只小鼠中只有2只在6天内死亡(例如，参见图5E)。
对离体扩增的GMP的遗传修饰。在成熟的巨噬细胞和粒细胞中难以进行遗传修饰。接下来，开发了用于在GMP中进行有效遗传修饰的方法。开发了一种用于GMP中过表达或敲除基因的非常高效的方案。如图6A所示，超过95％的转染了用GFP mRNA的GMP是GFP阳性的。接下来，尝试通过CRISPR/Cas9系统对基因进行敲除。专门设计并合成了导向RNA，以便靶向GFP或toll样受体4(TLR4)基因。将靶向GFP的gRNA引入来源于ROSA 26-CAG-Cas9-GFP小鼠的GMP中。转染后48小时，大约91.1％转染了GFP gRNA的GMP变成了GFP阴性(例如，参见图6B)。在敲除GMP中的TLR4基因时得到了类似的效果(例如，参见图6C)。敲除GFP-GMP和敲除TLR4-GMP分化成成熟巨噬细胞并用Poly I:C和LPS进行刺激。24小时后，收获上清液，通过ELISA测定细胞分泌的炎性细胞因子的量。如图6C所示，与GFP敲除的细胞相比，TLR4敲除细胞中TNFα、IL-6和IL-10的浓度显著降低。如所预期的，在用TLR3配体Poly I:C刺激后，两组细胞中细胞因子的浓度相似。
应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施例在以下权利要求的范围内。
Claims (37)
1.一种扩增粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)群的方法，其包含：
在培养基中培养GMP，所述培养基包含：
(i)生长因子，
(ii)B-Raf激酶抑制剂，以及
(iii)Wnt激活剂和/或GSK-3抑制剂，
其中，所述GMP在经历多次细胞传代和/或克隆扩增后形态保持基本不变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GMP来源于干细胞或是从干细胞获得的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在培养之前或期间对所述干细胞进行遗传工程改造。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞分离自受试者的骨髓。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述受试者是人、大鼠或小鼠。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含DMEM/F12和神经基础培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包含比例为约5:1至约1:5的DMEM/F12和神经基础培养基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养基包含比例为约1:1的DMEM/F12和神经基础培养基。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含选自胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和/或亚麻酸的一种或多种补充物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL-α生育酚和亚麻酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生长因子是干细胞因子(SCF)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述B-Raf激酶抑制剂选自GDC-0879、PLX4032、GSK2118436、BMS-908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、威罗菲尼、PLX8394、SB590885以及它们的任意组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述B-Raf激酶抑制剂是GDC-0879。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt激活剂选自SKL 2001、BML-284、WAY 262611、CAS 853220-52-7、QS11以及它们的任意组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt激活剂是SKL 2001。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂选自CHIR99021、CHIR98014、SB216763、BIO、A1070722、AR-A014418以及它们的任意组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GMP具有小、圆形的和/或非附着的均一形态。
21.一种对粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)进行遗传修饰的方法，其包含：
使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变对通过前述权利要求中任一项所述方法制备的GMP进行遗传工程修饰。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述基因编辑系统是基于TALEN或CRISPR的系统。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述遗传工程修饰包含替换或破坏现有基因(敲除)，或改变基因位点使得含有在所述基因位点处未发现的序列信息(敲入)。
24.根据权利要求23所述的方法，其中对GMP的遗传工程修饰包括敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含将GMP分化成巨噬细胞，包含：
用包含MCSF的巨噬细胞分化培养基对GMP进行培养。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和MCSF。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分化培养基包含RPMI1640、10％FBS和20ng/mL的MCSF。
28.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其进一步包含将所述GMP分化成粒细胞，包含：
用包含GCSF的粒细胞分化培养基对所述GMP进行培养。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和GCSF。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、10％FBS和20ng/mL的GCSF。
31.根据权利要求1至20中任一项所述的方法扩增的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)群。
32.根据权利要求21-24中任一项所述的方法制备的遗传修饰的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)。
33.根据权利要求25或26所述的方法制备的巨噬细胞。
34.根据权利要求28或29所述的方法制备的粒细胞。
35.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求31所述的GMP细胞群、权利要求32所述的遗传修饰的GMP、权利要求33所述的巨噬细胞或权利要求34所述的粒细胞以及药学上能接受的载体或赋形剂。
36.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包含向所述受试者施用有效量的权利要求31所述的GMP细胞群、权利要求32所述的遗传修饰的GMP、权利要求33所述的巨噬细胞或权利要求34所述的粒细胞，以及药学上能接受的载体或赋形剂。
37.有效量的权利要求31所述的GMP细胞群、权利要求32所述的遗传修饰的GMP、权利要求33所述的巨噬细胞或权利要求34所述的粒细胞用于制备治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物的用途。
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