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CN110997718B - 血管内皮生长因子/抗纤连蛋白抗体融合蛋白 - Google Patents

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CN110997718B CN201880051312.1A CN201880051312A CN110997718B CN 110997718 B CN110997718 B CN 110997718B CN 201880051312 A CN201880051312 A CN 201880051312A CN 110997718 B CN110997718 B CN 110997718B
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Abstract

本发明申请涉及包含抗体分子或其抗原结合片段和血管内皮生长因子家族成员如VEGF‑C或VEGF‑D的缀合物。抗体分子优选地结合与血管生成有关的抗原如纤连蛋白的ED‑A同种型。具体地，本发明申请涉及这些缀合物在炎性疾病或病症的治疗中的治疗性应用。

Description

血管内皮生长因子/抗纤连蛋白抗体融合蛋白
相关申请
本发明申请涉及2017年6月7日提交的GB1709080.4和2017年10月10日提交的GB1716594.5，以上专利的内容以其全部内容通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及一种缀合物，包含抗体分子或其抗原结合片段和血管内皮生长因子家族成员如VEGF-C或VEGF-D。抗体分子优选地结合与血管生成有关的抗原，如纤连蛋白的ED-A同种型。具体地，本发明涉及这些缀合物在炎性疾病或病症的治疗中的治疗性应用。
背景技术
血管生成和淋巴管生成描述了分别从已有的血管和淋巴管生长新的血管和新的淋巴管。血液和淋巴脉管系统在生理条件下起重要作用，但是它们还可以在急性和慢性炎性疾病中起作用。事实上，血管重塑是许多炎性疾病的一个特征，炎性疾病如银屑病、慢性气道炎症、炎症性肠病、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎(Huggenberger and Detmar,“Thecutaneous vascular system in chronic skin inflammation”,J Investig DermatolSymp Proc.(2011)15:24-32；Baluk P,Adams A,Phillips K等人.“Preferentiallymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lunginflammation”,Am J Pathol.2014；184(5):1577-1592；Jurisic G,Sundberg JP,DetmarM.“Blockade of VEGF receptor-3aggravates inflammatory bowel disease andlymphatic vessel enlargement”,Inflamm Bowel Dis.2013；19(9):1983-1989；KutkutI,Meens MJ,Kwak BR等人.“Lymphatic vessels:an emerging actor inatherosclerotic plaque development”,Eur J Clin Invest.2015；45(1)100-8)；ZhangQ,Lu Y,Proulx ST等人.“Increased lymphangiogenesis in joints of mice withinflammatory arthritis”,Arthritis Res Ther.2007；9(6)；在本发明申请中提及的所有文档以其全部内容通过引用结合于此)。值得注意地，在所有这些病变中，已表明淋巴脉管系统的诱导与疾病严重性的降低有关。
VEGF
在哺乳动物中，血管内皮生长因子(VEGF)家族具有5个成员，VEGF-A(或者VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PGF)。通过结合至酪氨酸激酶细胞表面受体(VEGFR)来介导VEGF功能(Ferrara等人.,“the biology of VEGF and its receptors”,Nat Med.,2003 9(6):669-676；Holmes等人.,“the vascular endothelial growthfactor(VEGF)family:angiogenic factors in health and disease”,Genome Biol.(2005)6(2):209.1-209.10)。
VEGF-C及其受体VEGFR3(Flt-4)涉及淋巴内皮的形成(Holmes等人，2005)。VEGF-C激活VEGF-3和VEGF-2。其中156位置中的半胱氨酸被丝氨酸残基取代的VEGF-C的突变体结合并激活VEGF-3，但是既不结合VEGF-2，也不激活其自磷酸化或对ERK/MAPK途径的下游信号转导(Joukov等人,“A recombinant mutant vascular endothelial growth factor-Cthat has lost vascular endothelial growth factor receptor-2binding,activation,and vascular permeability activities”.J Biol Chem.1998；273:6599-6602)。Huggenberger等人已显示通过VEGF-2阻断对血管生成的全身性抑制显著改善了皮肤炎症过程，然而尽管在VEGF-A驱动的小鼠慢性皮肤炎症模型中抑制淋巴管生成，但是VEGF-3的抑制延长了炎性水肿的形成。它们还显示皮内注射仅激活VEGF-3的重组VEGF-C156S显著减轻了炎症并且表明了淋巴管在慢性炎症控制中的作用(Huggenberger R,Ullmann S,Proulx ST,Pytowski B,Alitalo K and Detmar M.,“Stimulation oflymphangiogenesis via VEGFR-3inhibits chronic skin inflammation.Journal ofExperimental Medicine.2010；207:2255-2269)。另外，Jurisic和Detmar已显示在患有炎症性肠病的白介素10缺陷型小鼠中，抗体介导的VEGFR3-信号转导的阻断导致结肠炎症的严重程度增加(Jurisic G,Sundberg JP,Detmar M.“Blockade of VEGF receptor-3aggravates inflammatory bowel disease and lymphatic vessel enlargement”,Inflamm Bowel Dis.2013；19(9):1983-1989)。与这些结果一致，D'Alessio等人已表明在两种不同的动物模型中，VEGF-C的腺病毒递送保护抵抗急性和慢性结肠炎两者(D’AlessioS,Correale C,Tacconi C“VEGF-C–dependent stimulation of lymphatic functionameliorates experimental inflammatory bowel disease”,J Clin Invest.2014:124(9):3863-78)。此外，Quan Zhou等人已研究了VEGF-C在小鼠慢性炎症性关节炎模型中的作用并且报道VEGF-C的腺病毒递送降低了骨侵蚀和炎症面积，并且改善了淋巴流动(QuanZhou,Ruolin Guo等人.“Vascular Endothelial Growth Factor C Attenuates JointDamage in Chronic Inflammatory Arthritis by Accelerating Local LymphaticDrainage in Mice”,Arthritis Rheum.2011；63(8):2318-28)。
血管内皮生长因子D(VEGF-D，也称为C-Fos诱导的生长因子，FIGF)与VEGF-C密切相关。成熟VEGF-D由非共价连接的糖基化的同型二聚体组成，它是翻译后蛋白彻底水解加工的结果(Stacker SA等人.“Biosynthesis of Vascular Endothelial Growth Factor-DInvolves Proteolytic Processing Which Generates Non-covalent Homodimers”,JBC.1999；274(45):32127-36)。VEGF-D结合至VEGFR2和VEGFR3(Achen MG,Jeltsch M等人.“Vascular endothelial growth factor D(VEGF-D)is a ligand for the tyrosinekinases VEGF receptor 2(Flk1)and VEGF receptor 3(Flt4)”,PNAS.1997；95(2):548-53)，借此调节淋巴内皮细胞的增殖并诱导体内淋巴管生成(Veikkola T等人.“Signallingvia vascular endothelial growth factor receptor-3is sufficient forlymphangiogenesis in transgenic mice”,EMBO J.2001；20(6):1223-1331)。在肿瘤研究中，VEGF-D已显示提高淋巴管生长和转移(Stacker S.A.等人.“VEGF-D promotes themetastatic spread of tumor cells via the lymphatics”,Nat.Med.2001；7:186-91)。与VEGF-C结合，VEGF-D还显示在皮肤致癌模型中参与调节炎性肿瘤环境(Alitalo AK等人,“VEGF-C and VEGF-D blockade inhibits inflammatory skin carcinogenesis”,CancerRes.2013；73(14):4212-21)。
纤连蛋白
纤连蛋白(FN)是在多种正常组织和体液中广泛表达的糖蛋白。它是胞外基质(ECM)组分并且在多个生物过程中起作用，多个生物过程包括细胞粘附、细胞迁移、止血、血栓形成、创伤愈合、组织分化和致癌转化。纤连蛋白经受初级转录本FN前体mRNA的三个区域(ED-A，ED-B、IIICS)的可变剪接，该过程受细胞因子和胞外pH调节(Balza E.等人.“Transforming growth factor beta regulates the levels of differentfibronectin isoforms in normal human cultured fibroblasts.”FEBS Lett.1988；228(1):42-4；Carnemolla B.等人.“A tumor-associated fibronectin isoform generatedby alternative splicing of messenger RNA precursors.”J Cell Biol.1989；108:1139-48；Borsi L.等人.“Transforming growth factor-beta regulates the splicingpattern of fibronectin messenger RNA precursor.”FEBS Lett.1990；261(1):175-8)。纤连蛋白含有可以经历可变剪接的两个III型球状额外结构域：ED-A和ED-B(Kaspar M.等人,“Fibronectin as target for tumor therapy.”Int J Cancer.2006,118(6):1331-9)，它们是已知的血管生成标志物。
ED-A
ED-A是通过可变剪接插入到纤连蛋白(FN)中的90个氨基酸的序列，并且位于FN的结构域11和12之间(Borsi等人.(1987),J.Cell.Biol.,104,595-600)。健康成人中ED-A的表达限制在其中发生生理学血管生成的少数组织即胎盘、增殖期的子宫内膜和卵巢中的一些脉管中的脉管结构中(Schwager K,Kaspar M,Bootz F,等人Preclinicalcharacterization of DEKAVIL(F8-IL10),a novel clinical-stage immunocytokinewhich inhibits the progression of collagen-induced arthritis.Arthritis ResTher 2009；11:R142)。小鼠纤连蛋白和人纤连蛋白的ED-A具有96.7％的同一性(两条90个氨基酸的序列之间仅相差3个氨基酸)。ED-A在胚胎发生、组织重塑、纤维化、心脏移植和实体瘤生长期间大量存在。
F8抗体
F8抗体是对纤连蛋白的可变剪接的ED-A结构域特异的高-亲合力抗体(Villa A,Trachsel E,Kaspar M等人,“A high-affinity human monoclonal antibody specificto the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targetstumor neo-vasculature in vivo”.Int J Cancer 2008,122:2405–13；WO2008/120101；WO2009/013619)。
已表明纤连蛋白的ED-A是肿瘤血管生成的标志物(Rybak等人.(2007)CancerRes.67,10948-10957)，并且F8抗体已单独用于肿瘤靶向(WO2008/12001、WO2009/0136619、WO2011/015333)或者融合至TNF或IL2或两者(Villa等人.(2008)Int.J.Cancer 122,2405-2413；Hemmerle等人.(2013)Br.J.Cancer 109,1206-1213；Frey等人.(2008)J.Urol.184,2540-2548、WO2010/078945、WO2008/120101、WO2016/180715)，融合至IL4(WO2014/173570)，或者融合至IL12(WO2013/014149)。
还已在炎性疾病如类风湿性关节炎(WO2009/056268)、子宫内膜异位(WO2010/078950)、炎症性肠病(WO2014/055073)、银屑病和动脉粥样硬化中报道了纤连蛋白的ED-A的表达。
已显示融合至抗炎细胞因子IL10或IL4的F8抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中提供治疗益处(WO2009/056268和WO2014/173570)。融合至白介素IL4的F8抗体选择性定位至小鼠中类风湿性关节炎位点的新生血管结构。当与地塞米松组合使用时，F8-IL4能够治愈具有确立的胶原蛋白诱导的关节炎的小鼠(Hemmerle等人,“Antibody-based delivery ofIL4 to the neovasculature cures mice with arthritis”,Proc Natl Acad Sci U SA.,2014 Aug 19；111(33):12008-12、WO2014/173570)。
还已在小鼠子宫内膜异位模型中显示F8抗体为人子宫内膜异位组织提供强染色并且在子宫内膜异位病变上积累(WO2010/078950)。
已表明融合至白介素IL4的F8抗体在同基因小鼠模型中抑制通过可能的对异位子宫内膜的粘附、侵袭和血管化的破坏所造成的子宫内膜异位的发展(WO2014/173570，Quattrone等人,“the targeted delivery of interleukin 4inhibits development ofendometriotic lesions in a mouse model”,Reprod Sci.2015Sep；22(9):1143-52)。
已显示融合至抗炎细胞因子IL10的F8抗体减少了小鼠子宫内膜异位模型中体内子宫内膜异位病变(Schwager等人,“The antibody-mediated targeted delivery ofinterleukin-10inhibits endometriosis in a syngeneic mouse model”.HumReprod.2011Sep；26(9):2344-52)。
纤连蛋白的ED-A还已鉴别为炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎中基于抗体的药物递送应用的靶标。基于抗体的融合蛋白IL22-F8能够选择性定位在DSS小鼠结肠炎模型中的炎症位点并促进疾病快速恢复，并伴有结肠形态的改善(Bootz等人,“Antibody-BasedTargeted Delivery of Interleukin-22Promotes Rapid Clinical Recovery in MiceWith DSS-Induced Colitis”(2016)Inflamm.Bowel Dis.Sep；22(9):2098-105)。
融合至鼠科IL12的p40亚基的F8抗体介导IBD中的抗炎活性(Bootz,F.,Schmid,A.S.&Neri,D.Alternatively Spliced EDA Domain of Fibronectin Is a Target forPharmacodelivery Applications in Inflammatory Bowel Disease.Inflammatorybowel diseases(2015))。
此外，已显示融合至抗炎细胞因子IL10的F8抗体在鼠科IBD模型中靶向结肠并且降低血清细胞因子。处于SIP形式的F8抗体还表明对新形成血管染色，但是不对受溃疡性结肠炎影响的患者中的正常血管染色(WO2014/055073)。
F8还已用于将免疫调节细胞因子选择性递送至处于急性和慢性阶段两者中的炎症皮肤病况。F8-IL4显示在两种具有免疫能力的小鼠银屑病模型中减少耳肿胀和炎症(WO2014/173570)。F8-IL4与TNF阻断的组合或者IL17阻断加强了单个因子F8-IL4的活性(Hemmerle等人.,J Dermato Science,2014)。
F8对于来自人颈动脉的动脉粥样硬化斑块的染色的免疫组织化学分析显示与稳定和不稳定斑块两者的强烈反应(Pedretti M,Rancic Z,Soltermann A等人,“Comparative immunohistochemical staining of atherosclerotic plaques usingF16,F8 and L19:three clinical-grade fully human antibodies”.Atherosclerosis2009；208:382–9)。在ApoE-/-小鼠模型中，对放射性碘化的处于SIP形式的单克隆抗体F8评价了对动脉粥样硬化斑块的靶向。据显示在饲喂高胆固醇饮食的ApoE-/-小鼠中，在静脉内施用后，F8抗体能够选择性定位至动脉粥样硬化斑块，具体地，主动脉内的所有斑块。F8抗体显示出优良的斑块靶向性能，因此使其成为体内斑块成像应用和药物递送应用的优良候选(Fiechter等人.,“Comparative in vivo analysis of the atherosclerotic plaquetargeting properties of eight human monoclonal antibodies”,Atherosclerosis(2011)214:325–330)。
动脉粥样硬化
动脉粥样硬化描述了动脉壁的变厚、硬化、弹性消失以及纤维脂肪性斑块的形成。通常，所述疾病在几年或数十年的持续时间内发展。动脉粥样硬化具有广泛的不利的心血管影响。病变可以生长至足够大以阻碍血流，从而导致冠心病和心绞痛。此外，血栓可以在(破裂)病变表面上形成，并且在移位后，阻塞下游血管，从而导致心肌梗塞或肺栓塞。
动脉粥样硬化是复杂的疾病，并且尽管已对于阐明所述疾病机制和发展做出了显著的科学进展，但是对于其起因的了解以及治疗选择的可用性仍是有限的。广泛接受低密度脂蛋白(LDL)具有重要功能。它在动脉内膜中积累，其中它聚集并进行氧化，从而长期刺激免疫细胞并引起炎症反应。将巨噬细胞和平滑肌细胞(SMC)招募至动脉壁。巨噬细胞结合并通常吞噬LDL，从而产生泡沫细胞并释放促炎细胞因子，如TNF-α和干扰素-γ。SMC分泌胶原蛋白、蛋白聚糖和弹性蛋白，在斑块上产生纤维帽，其稳定病变并降低了在斑块表面上血液凝固的机会。最终，巨噬细胞/泡沫细胞以及SMC经历细胞凋亡或继发性坏死，从而在正在发展的病变中心形成坏死核心。含有坏死核心的斑块被认为将标记高度晚期的动脉粥样硬化并且可以经历钙化(Bentzon JF等人.“Mechanisms of plaque formation andrupture”,Circ Res.2014；114:1852-1866)。
已在动脉粥样硬化斑块中观察到了淋巴管(Kutkut I等人.“Lymphatic vessels:an emerging actor in atherosclerotic plaque development”,Eur J Clin Invest2015；45(1):100–108)。它们在动脉粥样硬化中的作用未很好理解，但是它们可能能够通过排出炎症介质来阻碍疾病发展。另外，淋巴管是从病变中的巨噬细胞向肝脏的胆固醇逆向转运(RCT)的主要途径，如Martel等人在手术和遗传小鼠模型中所示(Martel C等人.“Lymphatic vasculature mediates macrophage reverse cholesterol transport inmice”,J Clin Invest.2013；123(4):1571–1579)。
重要地，注意到世界卫生组织估计动脉粥样硬化和相关疾病(例如，冠心病、心肌梗塞、心力衰竭)导致了全世界全部死亡的31％(http://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/)，借此成为主要公共卫生问题。另外，就动脉粥样硬化来说，除抑制素外，目前尚无可用的用于预防疾病发展的可行的治疗选择。的确，大部分干预旨在治疗下游/动脉粥样硬化相关病变，如心力衰竭或冠心病。
发明内容
本发明人已显示血管内皮生长因子可以成功缀合至结合与血管生成有关的胞外基质组分，如纤连蛋白的ED-A的抗体，从而所获得的缀合物保留了抗体的靶向性以及VEGF-C的体外和体内生物活性两者。这通过使用野生型VEGF-C和VEGF-C的VEGFR3特异性突变体形式VEGF-C156Ser两者得到证实。基于抗体的治疗剂的靶向递送是复杂的。尽管已显示细胞因子可以缀合至抗体分子以产生免疫细胞因子，但是并非所有的免疫细胞因子保留了亲代抗体的体内靶向性质(Pasche&Neri,2012,Immunocytokines:a novel class of potentarmed antibodies,Drug Discov.Today,17:583-90)或预期的生物活性。因此，具有治疗效果，如抗炎活性的免疫缀合物的制备仍是困难的。
具体地，本发明人证明结合纤连蛋白的ED-A的抗体F8和VEGF-C的缀合物(F8-VEGF-C)能够促进淋巴内皮细胞(LEC)体外增殖并且在FVB小鼠幼崽的膈膜中体内诱导有效的淋巴管生成。F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物还显示显著提高了微载体珠上涂覆的LEC的芽形成，并且F8-VEGF-C缀合物表明能够提高过表达VEGFR3的猪主动脉内皮(PAE)细胞的迁移。
在小鼠炎症模型中用F8-VEGF-C处理小鼠还显示该缀合物还能够降低白细胞、调节性T细胞和γδT细胞的绝对数目，这些细胞在炎症反应中均是非常重要的，借此表明F8-VEGF-C缀合物具有抗炎效果。已表明这种抗炎效果比非靶向VEGF-C更有效。
此外，与融合至不相关抗体KSF(对于鸡蛋溶菌酶特异)的VEGF-C相比，用F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物处理表明显著降低了两种慢性皮肤炎症小鼠模型中的耳水肿，表明VEGF-C的靶向递送在体内炎症位点意外地获得了VEGF-C的治疗水平。F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物对炎症的影响与使用作为慢性炎性疾病，如银屑病和类风湿性关节炎的标准疗法的TNFR-Fc所观察到的相当。基于这些结果，VEGF-C的靶向递送预期代表了用于炎性疾病的TNFR-Fc的有价值的替代疗法。
F8-VEGF-C还显示改善了小鼠炎症模型中的发炎耳中的淋巴清除。
已知纤连蛋白的ED-A主要位于血管周围。然而，由于血管和淋巴管的位置彼此紧密靠近，并且通过淋巴管影响组织排液，因此本发明人假定因此可以将F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物靶向两种管腔隙。不希望受理论束缚，据认为F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物改善了淋巴功能并因此改善了炎症介质和细胞的排放，借此有利于炎性疾病中水肿和炎症的消退。另外，近年来越来越多的证据表明淋巴内皮细胞可以发挥多种免疫调节作用(例如，通过调节抗原递呈细胞向淋巴结的进入，或者通过调节T细胞活性，如Card CM等人,“Emerging roles of lymphatic endothelium in regulating adaptiveimmunity.”,J Clin Invest.2014,124(3)；943-952中综述的)。如本发明人所观察到的，在用F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物处理后，淋巴管的局部膨胀可以因此通过这些机制导致炎性疾病中的炎症反应的局部下调。
除其有效的抗炎活性之外，与非靶向VEGF-C相比，F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物的其他优势在于可以全身注射这些缀合物，如通过本发明人所表明的。相对于非靶向VEGF-C情况下的局部应用需要，这代表了很大的改善，因为在多个位点同时发生疾病(如银屑病或类风湿性关节炎中)或者在简单注射难接近的位置(例如，胃肠道)发生疾病的情况下，局部应用是受阻碍的。这些限制使得局部递送方法不适合于临床使用，并因此表明非靶向VEGF-C不适合于体内治疗这些疾病。
在治疗应用中，与游离VEGF-C的使用相比，F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser缀合物中的抗体部分还预期改善VEGF-C的稳定性，具体地，其血清稳定性。本发明人意外地发现在两个冻融循环之后，F8-VEGF-C缀合物保留了活性，而VEGF-C将预期在这些条件下丧失活性。
小鼠动脉粥样硬化模型中使用F8-VEGF-C的小鼠治疗表明F8-VEGF-C导致治疗小鼠血液中甘油三酯水平降低以及胆固醇水平降低的倾向。在动脉粥样硬化条件下这些代谢参数的改善是临床重要的。F8-VEGF-C处理还导致所研究的所有脉管系统位点处的病变和坏死核心尺寸的减小。用F8-VEGF-C处理的小鼠中的病变还倾向于具有更厚的纤维帽，并且在围绕左颈总动脉(LCCA)中的脱落物所形成的斑块中，平滑肌细胞面积显著增加。这些平滑肌细胞还具有降低的脂质负荷，表示它们处于更健康和良好的状态。据认为所有这些因素，较小的坏死核心、更厚的纤维帽和更大数目的“健康”平滑肌细胞对于病变稳定性，降低斑块破裂风险和后续不良心血管事件是有益的。因此，F8-VEGF-C处理使斑块稳定并且甚至能够停止和逆转病变生长。因此，这些结果表明了F8-VEGF-C在动脉粥样硬化治疗中的治疗潜能。除抑制素外，目前对于动脉粥样硬化尚无可用的可以用于预防动脉粥样硬化中的疾病发展的可行的治疗选择。因此，预期F8-VEGF-C将填补动脉粥样硬化治疗中的治疗空白。具体地，由于F8-VEGF-C代表了动脉粥样硬化治疗的崭新方法，因此它具有用作动脉粥样硬化治疗中的抑制素的替代或者结合抑制素使用的潜能。
基于以上发现，预期能够将血管内皮生长因子家族成员如VEGF-C靶向脉管系统的缀合物可以用于治疗炎性疾病和病症，如动脉粥样硬化。
因此，在第一个方面，本发明涉及包含结合与血管生成有关的胞外基质组分的抗体或其抗原结合片段和血管内皮生长因子家族成员的缀合物。
本发明人已表明包含VEGF-C或其变体，如VEGF-C156Ser的缀合物可以用于治疗小鼠炎症模型中的炎症，和动脉粥样硬化。在优选的实施方式中，本发明的缀合物因此包含VEGF-C或其变体。然而，由于还已知其他血管内皮生长因子家族成员在炎症中起作用，因此预期包含结合与血管生成有关的胞外基质组分的抗体或其抗原结合片段和另一个血管内皮生长因子家族成员，如VEGF-D或其变体的缀合物还将在炎性疾病和病症，包括动脉粥样硬化的治疗中获得应用。因此，在替代实施方式中，本发明涉及包含结合与血管生成有关的胞外基质组分的抗体或其抗原结合片段和VEGF-D或其变体的缀合物。
本发明人已表明包含对纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)特异的双体抗体，抗体F8的缀合物可以用于将血管内皮生长因子家族成员递送至小鼠炎症模型中的炎症位点并降低炎症反应。在优选的实施方式中，本发明的缀合物因此结合纤连蛋白的ED-A同种型，更优选地，结合ED-A。然而，预期结合与血管生成有关的其他胞外基质组分如纤连蛋白的ED-B或固生蛋白C的抗体或其抗原结合片段同样可以用于将血管内皮生长因子家族成员靶向患者中的炎症位点。因此，在替代实施方式中，本发明的缀合物可以包含结合纤连蛋白的ED-B同种型或者固生蛋白C的抗体或其抗原结合片段和血管内皮生长因子家族成员。
本发明还涉及编码本发明的缀合物的核酸分子，以及包含编码本发明的缀合物的核酸的表达载体以及包含这些载体的宿主细胞。产生根据本发明的缀合物的方法可以包括培养本发明的宿主细胞，其也构成了本发明的一部分。
如以上详细说明的，基于本发明人的发现，预期本发明的缀合物在疗法中、特别是炎性疾病和病症的治疗中获得应用，其中炎性疾病和/或病症优选地与血管生成和/或淋巴管生成有关和/或以它们为特征。
因此，在其他实施方式中，本发明涉及本发明的缀合物用于在通过疗法的人体治疗方法中的使用。一种治疗方法，方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的缀合物，其类似地构成了本发明的一部分，如本发明的缀合物用于药剂的生产的使用一样。优选地，治疗是炎性疾病或病症的治疗并且所述药剂用于炎性疾病或病症的治疗。
本发明的缀合物的一个优势在于将血管内皮生长因子家族成员靶向炎症位点。这使得所述缀合物能够在炎性疾病或病症的治疗中使用，其中由于疾病的扩散性或者因为通过注射不可达到炎症位点，血管内皮生长因子家族成员，如VEGF-C的局部应用是不可能的。因此，在优选的实施方式中，通过静脉注射将缀合物施用于所述患者。
另外，在其他实施方式中，本发明涉及根据本发明的缀合物用于在将血管内皮生长因子家族成员递送至患者中的炎性疾病或病症的位点的方法中的使用。将血管内皮生长因子家族递送至患者中的炎性疾病或病症位点的方法包括向患者施用本发明的缀合物，其类似地构成了本发明的一部分，如本发明的缀合物用于生产用于将血管内皮生长因子家族成员递送至患者中的炎性疾病或病症位点的药剂的使用一样。
如以上已提及的，通过使用本发明的缀合物而成为可能的血管内皮生长因子家族成员的靶向递送使得能够治疗炎性疾病和病症，其中由于疾病的扩散性或者因为通过注射不可达到炎症位点，血管内皮生长因子家族成员的局部应用是不可能的。在优选的实施方式中，炎性疾病或病症选自动脉粥样硬化、炎症性肠病，如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、淋巴水肿、青光眼、黄斑变性、心肌梗塞、银屑病、慢性气道炎症、特应性皮炎和类风湿性关节炎。更优选地，所述疾病是银屑病、特应性皮炎、动脉粥样硬化或炎症性肠病。
附图说明
图1：KSF-VEGF-C和F8-VEGF-C的纯化。(A)F8-VEGF-C(左图)和KSF-VEGF-C(右图)的考马斯亮蓝染色显示在非还原条件下蛋白主要作为二聚体存在(1μg纯化蛋白/泳道)。L：标准分子量梯(ladder)，N：非还原条件，R：还原条件。(B)F8-VEGF-C(顶部)和KSF-VEGF-C(底部)的尺寸排阻色谱确认了融合蛋白的纯度和二聚体形式。(C)免疫印迹分析显示通过抗VEGF-C抗体识别F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C(500ng的纯化蛋白/泳道)。
图2：F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C的体外和体内生物活性。(A)人淋巴内皮细胞(LEC)的增殖测定显示与饥饿培养基和SIP蛋白对照(SIP-F8)相比，F8-VEGF-C或KSF-VEGF-C的添加显著提高了增殖；影响与游离VEGF-C相当。(B)与PBS相比，在P1至P5天，每天腹膜内注射F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C显著提高了FVB小鼠幼崽的膈膜肌中的淋巴管生成。(C)F8-VEGF-C和VEGFR3特异性突变体形式F8-VEGF-C156Ser显著提高了微载体珠上涂覆的LEC的芽形成。(D)在转板测定中，F8-VEGF-C导致过表达VEGFR3的猪主动脉内皮(PAE)细胞的迁移显著增加。比例尺，100μm。数据表示为平均±SD。*P<0.05，***P<0.001。
图3：F8-VEGF-C降低了白细胞和T细胞亚型的数目。FACS分析显示与PBS和KSF-VEGF-C对照相比，用F8-VEGF-C处理降低了(A)白细胞、(B)调节性T细胞、(C)γδT细胞和(D)CD4 T细胞的绝对数目。数据表示为平均±SD。*P<0.05。这些结果与基于染色的耳切片的图5中所示的结果一致。
图4：F8-VEGF-C减轻慢性皮肤炎症，但是KSF-VEGF-C不能。(A)进行了CHS诱导的皮肤炎症的K14-VEGF-A小鼠的耳厚度。在激发后第7、9、11和13天，动物接受F8-VEGF-C、KSF-VEGF-C或PBS的静脉内(i.v.)注射。F8-VEGF-C，而不是对照KSF-VEGF-C或PBS减轻耳水肿。(B)冷冻K14-VEGF-A耳切片对于淋巴(LYVE-1，绿色)管的染色。(C)染色的K14-VEGF-A耳切片的定量显示与KSF-VEGF-C和PBS对照相比，用F8-VEGF-C处理提高了淋巴管面积。(D)C57Bl/6小鼠的耳厚度。在第1-5天和第7天每天应用含咪喹莫特的乳膏剂。在第7、9和11天，小鼠接受F8-VEGF-C、KSF-VEGF-C或SIP-F8的i.v.注射。F8-VEGF-C，而不是KSF-VEGF-C或者SIP-F8促进了水肿消退。(E)经历咪喹莫特诱导的炎症的动物的冷冻耳切片的LYVE-1染色。(F)LYVE-1染色的耳组织的定量显示与KSF-VEGF-C或者SIP-F8相比，用F8-VEGF-C处理增加了淋巴管面积。比例尺，100μm。数据表示为平均±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5：F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser，而不是SIP-F8将皮肤炎症抑制至与CHS诱导的皮肤炎症中TNFR-Fc相当的程度。(A)在半合K14-VEGF-A转基因小鼠(n＝5每组)中引起CHS诱导的皮肤炎症。与SIP-F8相比，从第7天往后，每隔一天用F8-VEGF-C或F8-VEGF-C156Ser处理显著降低了炎症性耳肿胀，并且其具有与TNFR-Fc类似的效果。数据表示为平均±SEM。(B，C)发炎的K14-VEGF-A tg耳皮肤对于LYVE-1和MECA-32的免疫荧光染色和定量图像分析显示在F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理组中LYVE-1阳性淋巴面积显著增加。比例尺代表100μm。(D，E)对于LYVE-1的免疫荧光染色和定量图像分析显示在F8-VEGF-C-和F8-VEGF-C156Ser处理的小鼠中淋巴管网络增加。比例尺代表500μm。(F，G)发炎的耳皮肤对于CD4的免疫荧光染色和定量图像分析显示与PBS和SIP-F8相比，F8-VEGF-C、F8-VEGF-C156Ser和TNFR-Fc处理降低了CD4+T细胞的浸润。比例尺代表100μm。数据表示为平均±SD。*P<0.05；***P<0.001。
图6.VEGF-C的全身应用不影响K14-VEGF-A小鼠发炎的耳中的血管表型。(A)来自已接受PBS(左图)、KSF-VEGF-C(中间)或者F8-VEGF-C(右图)的小鼠的发炎的耳对于MECA-32染色的免疫荧光图像(浅灰色)。比例尺＝100μm。(B)已接受指定处理的小鼠的发炎的耳中的血管面积的定量(表示为分析面积的％，n＝6只动物每组，使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析)。(C)发炎的耳中的血管数目(归一化为基质膜，n＝6-7只动物每组)。(D)发炎的耳中的血管尺寸(n＝6只动物每组，使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析)。BM＝基质膜。数据表示为平均±SD。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
图7：F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser，而不是SIP-F8将皮肤炎症抑制至与IMQ诱导的皮肤炎症中TNFR-Fc相当的程度。(A)在IMQ诱导的皮肤炎症模型中(n＝5只小鼠每组)，与SIP-F8或PBS相比，从第7天往后，每隔一天用F8-VEGF-C或F8-VEGF-C156Ser处理显著加快了水肿的消退。效果与TNFR-Fc的效果相当。数据表示为平均±SEM。(B，C)耳皮肤切片的H&E染色和定量图像分析显示与PBS-和SIP-F8处理的小鼠相比，TNFR-Fc、F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理显著降低了表皮厚度。(D)IMQ炎症耳皮肤对于LYVE-1和MECA-32的代表性免疫荧光染色图像。(E)定量图像分析显示F8-VEGF-C处理小鼠中淋巴管尺寸显著增加。比例尺表示100μm。数据表示为平均±SD。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图8.VEGF-C的全身应用不影响IMQ诱导的耳皮肤炎症中的血管表型。(A)来自已经接受SIP-F8(左图)、KSF-VEGF-C(中间)或者F8-VEGF-C(右图)的小鼠的IMQ炎症耳对于MECA-32染色的免疫荧光图像(浅灰色)，比例尺＝100μm。(B)已接受指定处理的小鼠的发炎的耳中的血管面积的定量(表示为分析面积的％，n＝6-9只动物每组，使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析)。(C)发炎的耳中的血管数目(归一化为基质膜，n＝6-9只动物每组)。(D)发炎的耳中的血管尺寸(n＝6-9只动物每组，使用Bonferroni事后检验的单因素方差分析)。数据表示为平均±SD。BM＝基质膜。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图9：F8-VEGF-C处理促进淋巴清除。(A-C)将P20D800(3μl，3μM)注射到用PBS(n＝5)或F8-VEGF-C(n＝5)处理的CHS诱导的炎症小鼠的耳中，并随时间追踪荧光信号的衰减(A)。F8-VEGF-C处理小鼠具有提高的淋巴示踪剂清除，如通过显著提高的清除速率(B)和组织半衰期降低(C)所示。类似地，与接受KSF-VEGF-C的动物相比，F8-VEGF-C的4次注射提高了经历IMQ诱导的皮肤炎症的小鼠中的清除速率(D)并且降低了组织半衰期(E)。数据表示为平均±SD。*P<0.05。
图10：对血液值的处理效果。(A)研究总览，列出了用于各个处理组中的分析的所包括的动物数目。显示了以周数表示的研究持续时间(0、2、9和11)。(B)显示其中形成斑块的所关心的不同位点的示意图；该图中的结果与血液参数相关。(C)甘油三酯水平的定量。(D)胆固醇水平的定量。(E)典型单核细胞(CD45+、CD11b+、CD115+、Gr1(高))数目的定量。(F)非经典单核细胞(CD45+、CD11b+、CD115+、Gr1(低))数目的定量。(G)嗜中性白细胞数目的定量。(H)B细胞数目的定量。(I)T细胞数目的定量。数据表示为平均值±SEM，其通过单因素方差分析进行分析。
图11：对左颈总动脉(LCCA)中不稳定斑块的处理效果。(A)研究总览，列出了用于各个处理组中的分析的所包括的动物数目。显示了以周数表示的研究持续时间(0、2、9和11)。(B)显示所关心的不同位点的示意图；该图中的结果与围绕脱落物所形成的不稳定斑块有关。(C)含有动脉粥样硬化斑块的LCCA的苏木精-伊红染色，矩形突出显示了放大区域。(D)病变尺寸的定量，其表示为内膜/媒介物的比。(E)坏死核心尺寸的定量，其表示为内膜％。(F)含有动脉粥样硬化病变的LCCA的天狼星红染色。(G)病变中胶原纤维的定量，表示为内膜％。(H)纤维帽厚度的定量，表示为内膜％。(I)含有动脉粥样硬化斑块的LCCA中对于平滑肌肌动蛋白、CD68(巨噬细胞标志物)和DAPI的免疫荧光染色。(J)平滑肌细胞面积的定量，表示为内膜％。(K)巨噬细胞面积的定量，表示为内膜％。(L)对于平滑肌肌动蛋白、CD68和DAPI的油红O染色结合免疫荧光染色。(M)平滑肌细胞中脂质的定量，表示为平滑肌细胞面积％。(N)巨噬细胞中脂质的定量，表示为巨噬细胞面积％。数据表示为平均值±SEM，其通过单因素方差分析进行分析。
图12：对主动脉弓内弧(inner curvature)中斑块的处理效果。(A)研究总览，列出了用于各个处理组中的分析的所包括的动物数目。显示了以周数表示的研究持续时间(0、2、9和11)。(B)显示所关心的不同位点的示意图；该图中的结果与主动脉弓内弧中形成的病变有关。(C)病变尺寸的定量，表示为面积。(D)坏死核心尺寸的定量，表示为面积。(E)病变中胶原蛋白沉积的定量，表示为面积。(F)纤维帽厚度的定量。数据表示为平均值±SEM，其通过单因素方差分析进行分析。
图13：对臂头动脉中斑块的处理效果。(A)研究总览，列出了用于各个处理组中的分析的所包括的动物数目。显示了以周数表示的研究持续时间(0、2、9和11)。(B)显示所关心的不同位点的示意图；该图中的结果与头臂动脉中形成的病变有关。(C)病变尺寸的定量，表示为面积。(D)坏死核心尺寸的定量，表示为面积。(E)病变中胶原蛋白沉积的定量，表示为面积。(F)纤维帽厚度的定量。数据表示为平均值±SEM，其通过单因素方差分析进行分析。
具体实施方式
抗体分子
术语“抗体分子”描述了免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或完全合成产生的。该术语还覆盖了具有作为抗体结合结构域或者与抗体结合结构域显著同源的结合结构域的任何多肽或蛋白。抗体分子的实例是免疫球蛋白同种型以及它们的同型亚类，以及包含抗原结合结构域的抗体分子片段，如单链Fv(scFv)和双体抗体。抗体分子或其片段可以是人或人源化的。抗体分子可以是单克隆抗体或其片段。
由于抗体可以在多个方面改变，因此术语“抗体分子”应视为涵盖抗体片段、抗体的衍生物、功能等价物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。因此包括包含融合至另一个多肽的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。
如上所述，完整抗体的片段可以实施结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341,544-546；McCafferty等人.,(1990)Nature,348,552-554；Holt等人.(2003)Trends inBiotechnology 21,484-490)，其由VH结构域或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过允许两个域结合以形成抗原结合位点的氨基酸接头连接VH结构域和VL结构域(Bird等人,(1988)Science,242,423-426；Huston等人.(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双重特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双体抗体”，通过基因融合构建的多价或多重特异性片段(WO94/13804；Holliger等人.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)。可以通过掺入连接VH结构域和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双体抗体分子(Reiter等人.(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。还可以制备包含连接至CH3域的scFv的微抗体(Hu等人.(1996),Cancer Res.,56(13):3055-61)。结合片段的其他实例是Fab'，其通过在重链CH1域的羧基末端添加几个残基而不同于Fab片段，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，和Fab'-SH，它是其中恒定域的半胱氨酸残基具有游离巯基基团的Fab'片段。
可以通过化学修饰，特别是通过PEG化，或者通过掺入到脂质体中来提高用于在本发明中使用的抗体分子或者本发明的缀合物的半衰期。
用于在本发明中使用的抗体分子可以是或者包含单链Fv(scFv)、小免疫蛋白质(SIP)、双体抗体(diabody)或IgG分子。优选地，用于在本发明中使用的抗体分子是或者包含scFv。双体抗体(例如)包含两个scFv分子。最优选地，用于在本发明中使用的抗体分子是双体抗体。双体抗体和scFv不包含抗体Fc区，因此潜在地降低了抗独特型反应的影响。
双体抗体包含两个VH-VL分子，其结合以形成二聚体。每个VH-VL分子的VH结构域和VL结构域优选地通过5至12个氨基酸的接头连接。例如，可以通过长度为5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸的氨基酸接头连接VH结构域和VL结构域。优选地，所述氨基酸接头的长度为5个氨基酸。适合的接头序列在本领域中是已知的并且包括SEQ ID NO:4中所示的接头序列。
当抗体分子为scFv时，优选地通过10至20个氨基酸的接头连接抗体的VH结构域和VL结构域。例如，可以通过长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20个氨基酸的氨基酸接头连接VH结构域和VL结构域。适合的接头序列在本领域中是已知的并且包括SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37中所示的接头序列。
本发明人已显示包含VEGF-C或VEGF-C156Ser和结合纤连蛋白的额外结构域A(ED-A)的抗体分子的缀合物可以靶向炎症位点的新生血管并且与非靶向VEGF-C相比，提供有效的体内抗炎效果。通过这些缀合物所观察到的抗炎效果与使用作为慢性炎性疾病，如银屑病和类风湿性关节炎的标准疗法的TNFR-Fc所观察到的相当。因此，预期这些缀合物适合于治疗患者中的炎性疾病和病症。
基于这些结果，还预期包含血管内皮生长因子家族成员和结合与血管生成有关的胞外基质组分的抗体或其抗原结合片段的其他缀合物将类似地适合于将血管内皮生长因子家族成员靶向患有炎性疾病或病症的患者中的炎症位点。与血管生成有关的几种胞外基质组分在本领域中是已知的，如能够结合这些抗原的抗体一样。另外，可以使用熟知的方法，如本发明申请中所述的那些来产生抗给定抗原的抗体。
在一个实例中，抗原可以是与血管生成有关的胞外基质组分，如纤连蛋白，包括纤连蛋白的额外结构域A(ED-A)同种型(A-FN)、纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)同种型(B-FN)、固生蛋白C、纤连蛋白的ED-A、纤连蛋白的ED-B或者固生蛋白C的A1结构域。抗原优选地为人抗原。结合人纤连蛋白的ED-A，并因此还结合人A-FN的抗体在本领域中是已知的并且包括抗体F8。结合人纤连蛋白的ED-B或人固生蛋白C的A1结构域(并因此还结合B-FN和固生蛋白C)的抗体在本领域中也是已知的并且分别包括抗体L19和F16。已显示结合纤连蛋白的ED-B或者固生蛋白C的A1结构域的抗体，包括抗体L19和F16能够体内特异性靶向新生血管。因此，预期包含血管内皮生长因子家族成员和结合B-FN、固生蛋白C、纤连蛋白的ED-B或者固生蛋白C的A1结构域的抗体分子的缀合物将能够以与包含VEGF-C和结合A-FN的抗体分子的缀合物相同的方式将血管内皮生长因子家族成员，如VEGF-C靶向至新生血管，如使用本文的抗体F8所证明的，并因此在炎性疾病和病症的治疗中获得应用。
因此，用于在本发明的缀合物中使用的抗体分子或其抗原结合片段结合与血管生成有关的抗原。优选地，用于在本发明中使用的抗体分子结合与血管生成有关的胞外基质组分，如A-FN、B-FN、固生蛋白C、纤连蛋白的ED-A、纤连蛋白的ED-B或者固生蛋白C的A1结构域。更优选地，用于在本发明中使用的抗体分子结合A-FN或者纤连蛋白的ED-A。最优选地，用于在本发明中使用的抗体分子结合纤连蛋白的ED-A。
在优选的实施方式中，用于在本发明中使用的抗体分子可以具有本文所描述的抗体F8、L19或F16的CDR和/或VH结构域和/或VL结构域。用于在本发明中使用的抗体分子优选地具有SEQ ID NO:7-12所示的抗体F8的CDR。更优选地，用于在本发明中使用的抗体分别包含SEQ ID NO:3和5中所示的抗体F8的VH结构域和/或VL结构域。更优选地，用于在本发明中使用的抗体包含SEQ ID NO:3和5所示的抗体F8的VH结构域和VL结构域。所述F8抗体优选地处于双体抗体或scFv的形式，最优选地处于双体抗体的形式。当所述F8抗体处于双体抗体形式时，用于在本发明中使用的抗体分子优选地具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
用于在本发明中使用的抗体分子可以以与(例如)处于双体抗体形式的抗ED-A抗体F8相同的亲合力或者以更好的亲合力结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A。用于在本发明中使用的抗体分子可以以与(例如)处于双体抗体形式的抗ED-B抗体L19相同的亲合力或者以更好的亲合力结合B-FN和/或纤连蛋白的ED-B。用于在本发明中使用的抗体分子可以以与(例如)处于双体抗体形式的抗固生蛋白C的A1结构域的抗体相同的亲合力或者以更好的亲合力结合固生蛋白C和/或固生蛋白C的A1结构域。
用于在本发明中使用的抗体分子可以结合至A-FN和/或纤连蛋白的ED-A上与抗ED-A抗体F8相同的表位。用于在本发明中使用的抗体分子可以结合至B-FN和/或纤连蛋白的ED-B上与抗ED-B抗体L19相同的表位。用于在本发明中使用的抗体分子可以结合至固生蛋白C和/或固生蛋白C的A1结构域上与抗体F16相同的表位。
可以在本发明中产生和使用本文所公开的抗体分子的变体。在CDR、抗体VH结构域或VL结构域，具体地VH结构域和VL结构域的框架区以及抗体分子的氨基酸序列内进行替换所需的技术通常在本领域中是可用的。可以通过可以或可以不预测对活性具有最小或有益影响的替换来制备变体序列，并且将所述变体序列对结合A-FN和/或纤连蛋白的ED-A、B-FN和/或纤连蛋白的ED-B、固生蛋白C和/或固生蛋白C的A1结构域的能力或对任何其他所期望的性质进行测试。
考虑可以在如本文所描述的抗体分子的一个或多个CDR和/或VH结构域和/或VL结构域中做出1至5，例如，1至4，包括1至3或者1或2，或者3或4个氨基酸变化(氨基酸残基的添加、缺失、替换和/或插入)。因此，结合FN-A、FN-B或者固生蛋白C的抗体分子可以包含本文所描述的抗体F8、L19或F16的CDR和/或VH结构域和/或VL结构域，其在所述CDR和/或VH结构域和/或VL结构域内具有5个或以下，例如，5、4、3、2或1个氨基酸变化。例如，结合FN-A、FN-B或者固生蛋白C的抗体分子可以包含本文所描述的抗体F8、L19或F16的VH结构域和/或VL结构域，其在所述VH结构域和/或VL结构域的框架区内具有5个或以下，例如，5、4、3、2或1个氨基酸变化。如本文所提及的，结合FN-A或者纤连蛋白ED-A的抗体分子因此可以包含SEQ IDNO:3所示的VH结构域和/或SEQ ID NO:5所示的VL结构域，其在所描述的VH结构域和/或VL结构域的框架区内具有5个或以下，例如，5、4、3、2或1个氨基酸变化。这种抗体分子可以以与包含SEQ ID NO:3所示的VH结构域和SEQ ID NO:5所示的VL结构域的抗体分子相同或基本相同的亲合力结合ED-A同种型或者纤连蛋白的ED-A，或者可以以比包含SEQ ID NO:3所示的VH结构域和SEQ ID NO:5所示的VL结构域的抗体分子更高的亲合力结合ED-A同种型或者纤连蛋白的ED-A。
用于在本发明中使用的抗体分子可以包含与SEQ ID NO:3、5、24、25、33、34和39中所示的抗体F8、L19或F16(如果适用的话)的VH结构域和/或VL结构域具有至少70％，更优选地，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％之一的序列同一性的VH结构域和/或VL结构域。用于在本发明中使用的抗体分子可以分别与SEQ ID NO:6、26、35和40所示的F8、L19或F16抗体的氨基酸序列具有至少70％，更优选地，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％之一的序列同一性。
通常参考算法GAP(Wisconsin GCG package,Accelerys Inc,San Diego,USA)定义序列同一性。GAP使用Needleman and Wunsch算法来对两条完整序列进行比对，其使得匹配数目最大，缺口数目最小。通常，使用缺省参数，其中缺口产生罚分＝12，缺口延伸罚分＝4。GAP的使用可以是优选的，但是可以使用其他算法，例如BLAST(其使用Altschul等人,(1990)J.MoI.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson and Lipman(1988)PNASUSA 85:2444-2448的方法)或者Smith-Waterman算法(Smith and Waterman(1981)J.MoIBiol.147:195-197)，或者Altschul等人.(1990)，同上的TBLASTN程序，其一般使用缺省参数。具体地，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。
抗原结合位点
这描述了结合至靶标抗原的全部或部分并与之互补的分子的一部分。在抗体分子中，将其称为抗体抗原结合位点，并且它包括结合至靶标抗原的全部或部分并与之互补的分子的一部分。当抗原较大时，抗体可以仅结合至抗原的特定部分，该部分称为表位。可以通过一个或多个抗体可变结构域提供抗体抗原结合位点。抗体抗原结合位点优选地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
可以通过互补决定区(CDR)的布置提供抗原结合位点。具有CDR或CDR组的结构通常将是抗体重链或轻链序列或其基本部分，其中CDR或CDR组位于对应于通过重排的免疫球蛋白基因所编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组的位置。可以通过参考Kabat等人(1987)(Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版.USDepartment of Health and Human Services)及其修订版，其现在在因特网(immuno.bme.nwu.edu或者使用任何搜索引擎查找“Kabat”)上可用，确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。
CDR区或CDR旨在表示免疫球蛋白的重链和轻链高变区，如Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,US Department of Healthand Human Services(Kabat等人.,(1991a),Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington以及随后的版本)所定义的。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。在本文中使用术语CDR以根据情况表示这些区域中的一个或几个，或者甚至整个含有负责通过抗体对它所识别的抗原或表位的亲合力的结合的大部分氨基酸残基的这些区域。
在6个短CDR序列中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸变化(基本上由于产生它的基因重排机制所造成的更大的多样性)。它可以短至2个氨基酸，尽管已知的最长尺寸为26。在功能上，HCDR3部分起到了决定抗体特异性的作用(Segal等人,(1974),PNAS,71:4298-4302；Amit等人.,(1986),Science,233:747-753；Chothia等人.,(1987),J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia等人.,(1989),Nature,342:877-883；Caton等人.,(1990),J.Immunol.,144:1965-1968；Sharon等人.,(1990a),PNAS,87:4814-4817；Sharon等人.,(1990b),J.Immunol.,144:4863-4869；Kabat等人.,(1991b),J.Immunol.,147:1709-1719)。
形成用于在本发明中使用的抗体分子的一部分的抗原结合位点优选地包含以下中的一个或多个，优选地全部六个：SEQ ID NO:7-12中所示的抗体F8的CDR，SEQ ID NO:18-23或者SEQ ID NO:18、38、20、21、22和23中所示的抗体L19的CDR，或者SEQ ID NO:27-32中所示的抗体F16的CDR。最优选地，形成用于在本发明中使用的抗体分子的一部分的抗原结合位点包含SEQ ID NO:7-12中所示的抗体F8的CDR。
抗体分子的制备和选择
在本领域中多种方法可用于获得抗靶标抗原的抗体分子。用于在本发明中使用的抗体分子优选地是单克隆抗体，特别是人、鼠科、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，其可以根据本领域技术人员熟知的标准方法获得。用于在本发明中使用的抗体分子最优选地是人抗体分子。
有可能采用单克隆及其他抗体并且使用DNA重组技术来产生结合靶标抗原的其他抗体或嵌合分子。这些技术可以包括将编码抗体分子的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区或者恒定区加框架区。参见，例如，EP-A-184187、GB2188638A或者EP-A-239400以及大量后续文献。还可以对产生抗体的杂交瘤或其他细胞进行遗传突变或其他改变，其可以或可以不改变所产生的抗体的结合特异性。
在抗体工程领域中可用的技术使得有可能分离人和人源化抗体。例如，可以如下所述制备人杂交瘤：Kontermann&Dubel(2001),S,Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC；ISBN:3540413545。已在多个出版物，如WO92/01047(以下将进一步讨论)和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404和Kontermann&Dubel(2001),S,Antibody Engineering,Springer-Verlag NewYork,LLC；ISBN:3540413545中详细描述了噬菌体展示，另一种已建立的用于产生特异性结合成员的技术。其中小鼠抗体基因失活并且被人抗体基因功能性替换，同时保留了小鼠免疫系统完整的其他组分的转基因小鼠可以用于分离人抗体(Mendez等人,(1997),NatureGenet,15(2):146–156)。
一般地，对于单克隆抗体或它们的功能性片段，特别是鼠科来源的单克隆抗体或它们的功能性片段的制备，有可能涉及“抗体”手册(Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.,726页，1988)中具体描述的技术或者涉及Kohler and Milstein,1975,Nature,256:495-497所描述的从杂交瘤制备的技术。
例如，可以根据常规工作方法，通过从包含在编码A-FN、B-FN或固生蛋白C或其片段的cDNA序列中的核酸序列开始的基因重组，或者通过从包含在A-FN、B-FN或固生蛋白C或其片段的肽序列中的氨基酸序列开始的肽合成，从对于与血管生成有关的抗原，如A-FN、B-FN、固生蛋白C、纤连蛋白的ED-A、纤连蛋白的ED-B或固生蛋白C的A1结构域免疫的动物细胞获得单克隆抗体。
可以通过从通过在适合的表达载体中合成和组装的寡核苷酸所产生的基因的表达来产生合成抗体分子，例如，如通过Knappik(2000)J.Mol.Biol.296,57-86或者Krebs等人.(2001)Journal of Immunological Methods,254 67–84所述的。
作为另外一种选择，可以通过使抗体分子文库与抗原或其片段，例如，包含ED-A、ED-B或固生蛋白C的A1结构域或其肽片段或由其组成的片段接触，并选择能够结合抗原的所述文库的一个或多个抗体分子来获得与血管生成有关的抗原，如A-FN、ED-A、B-FN、ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域的一个或多个抗体分子。
可以使用重复菌落过滤筛选(ICFS)来筛选抗体文库。在ICFS中，将含有编码几种结合特异性的DNA的细菌在液体培养基中生长，并且一旦达到指数生长阶段，则将几十亿个所述细菌分布在由适当预处理的膜过滤器所组成的生长支持物上，将所述膜过滤器培育直至出现完全汇合的菌落。第二捕集基质由另一个膜过滤器组成，将其预加湿并用所期望的抗原覆盖。
然后，将所述捕集膜过滤器放置在含有适合的培养基的板上，并用生长过滤器覆盖，其中菌落所覆盖的表面朝上。将因此所获得的夹心过滤器在室温下培育约16h。因此，有可能获得编码具有延展作用(spreading action)的抗体片段scFv的基因的表达，从而捕集与存在于所述捕集膜上的抗原特异性结合的那些片段。然后，使用出于该目的常用的比色技术来处理所述捕集膜以指出所结合的抗体片段scFv。
捕集过滤器上彩色斑点的位置使得能够返回到存在于生长膜上并产生所捕集的抗体片段的相应菌落。收集这些菌落并使其生长，并将细菌——几百万个细菌分布在新的培养膜上，重复上述程序。然后，进行类似的循环直至捕集膜上的阳性信号对应于单个阳性菌落，它们中的每一个代表抗所述选择中所使用的抗原的单克隆抗体片段的潜在来源。例如，在WO0246455中描述了ICFS。
还可以在颗粒或分子复合物，例如，可复制基因包，如噬菌体(例如，T7)颗粒或者其他体外展示系统上展示文库，每个所述颗粒或分子复合物含有编码在其上展示的抗体VH可变结构域的核酸，并且任选地，如果存在，还含有编码所展示的VL结构域的核酸。在WO92/01047和(例如)美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404中描述了噬菌体展示。
在能够结合抗原并在噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上展示的抗体分子的选择之后，可以从展示所述所选择的抗体分子的噬菌体或其他颗粒或分子复合物获得核酸。可以通过具有从展示所述所选择的抗体分子的噬菌体或其他颗粒或分子复合物所获得的核酸序列的核酸的表达，在抗体分子或抗体VH或VL可变结构域的后续产生中使用这种核酸。
还可以测试结合与血管生成有关的抗原，如A-FN、B-FN、纤连蛋白的ED-A或ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域或者其他靶标抗原或同种型的能力，例如，与对A-FN、B-FN、纤连蛋白的ED-A或ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域特异的抗体，如抗体F8、L19或F16竞争的能力。
还可以使用一种或多种所选VH和/或VL基因的随机诱变来在整个可变结构域内产生突变，从而产生用于在本发明中使用的携带CDR来源的序列的新的VH结构域或VL结构域。在一些实施方式中，在整个可变结构域或CDR的组内进行一个或两个氨基酸替换。可以使用的另一种方法是VH或VL基因的CDR区的定向突变。
在本发明中使用的可变结构域可以获自或来源于任何种系或重排的人可变结构域，或者可以是基于已知的人可变结构域的共有序列或真实序列的合成可变结构域。可变结构域可以来源于非人抗体。可以使用DNA重组技术将用于在本发明中使用的CDR序列(例如，CDR3)引入到缺少CDR(例如，CDR3)的可变结构域组库中。例如，Marks等人(1992)描述了产生抗体可变结构域组库的方法，其中将针对可变结构域区域的5'端或附近的共有引物结合人VH基因的第三框架区的共有引物使用以提供缺少CDR3的VH可变结构域组库。Marks等人还描述了如何可以将该组库与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，本发明所述的CDR3来源的序列可以与缺少CDR3的VH结构域或VL结构域组库重排，并且与同源VL结构域或VH结构域组合的重排的完整VH结构域或VL结构域提供了用于在本发明中使用的抗体分子。然后，可以在适合的宿主系统，如WO92/01047或者任何后续大量文献，包括Kay,Winter&McCafferty(1996)中所述的噬菌体显示系统中展示所述组库，从而可以选择适合的抗体分子。组库可以由来自104个单个成员以上，例如，至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员的任何事物组成。
可以在抗体分子例如用于在本发明中使用的抗体分子的筛选中使用与血管生成有关的抗原，如A-FN、B-FN、纤连蛋白的ED-A或ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域。所述筛选可以是如本文在其他处所公开的组库的筛选。
类似地，可以将三个CDR中的一个或多个或者全部移植到VH结构域或VL结构域的组库中，然后将其对抗体分子筛选与血管生成有关的抗原，如A-FN、B-FN、纤连蛋白的ED-A或ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域。可以使用抗体F8、L19或F16的HCDR1、HCDR2和HCDR3或者抗体F8、L19或F16的HCDR组中的一种或多种，和/或可以使用抗体F8、L19或F16的LCDR1、LCDR2和LCDR3或者抗体F8、L19或F16的LCDR组中的一种或多种。
免疫球蛋白可变结构域的基本部分可以包括至少三个CDR区，以及它们的插入框架区。部分还可以包括第一和第四框架区中的任一个或两者的至少约50％，所述50％是第一框架区的C末端50％和第四框架区的N末端50％。可变结构域的基本部分的N末端或C末端的其他残基可以是通常与天然存在的可变结构域区域无关的那些。例如，通过重组DNA技术所进行的本发明的抗体分子的构建可以导致引入以有利于克隆或其他操作步骤的接头所编码的N-或C末端残基的引入。其他操作步骤包括接头的引入以将在本文其他处所公开的可变结构域连接至其他蛋白序列，包括抗体恒定区，其他可变结构域(例如，在双体抗体的产生中)或者可检测/功能标记物，如在本文其他处更详细地讨论的。
尽管抗体分子可以包括一对VH结构域和VL结构域，但是也可以在本发明中使用基于VH结构域或VL结构域序列中的任一个的单一结合结构域。已知单一免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域能够以特异性方式结合靶标抗原。例如，参见以上dAb的讨论。
就单一结合结构域中的任一个来说，这些结构域可以用于筛选能够形成双结构域抗体分子的互补结构域，该双结构域抗体分子能够结合与血管生成有关的抗原，如A-FN、B-FN、纤连蛋白的ED-A或ED-B、固生蛋白C或固生蛋白C的A1结构域。这可以使用如WO92/01047中所公开的所谓的等级双重组合方法(hierarchical dual combinatorial approach)，通过噬菌体展示筛选方法来实现，其中将含有H链或L链克隆中任一个的单个菌落用于感染编码另一条链(L或H)的完整克隆文库，并且根据噬菌体展示技术，如参考文献中所述的那些来选择所得的双链抗体分子。在Marks 1992中也公开了该技术。
可以从本文所描述的任何抗体分子，例如，包含本文所描述的任何抗体的VH结构域和/或VL结构域或CDR的抗体分子起始，通过以下方法，如使用酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通过使用化学还原的二硫键切割，获得用于在本发明中使用的完整抗体的片段。以另一种方式，可以通过本领域技术人员同样熟知的基因重组技术，或者通过使用(例如)自动肽合成仪，如Applied Biosystems公司所提供的那些的肽合成，或者通过核酸合成和表达获得抗体片段。
缀合物
根据本发明的缀合物包含血管内皮生长因子家族成员和如本文所描述的结合与血管生成有关的抗原的抗体分子。抗体分子优选地是双体抗体或scFv，最优选地双体抗体，如本文所述。
血管内皮生长因子家族成员优选地是人血管内皮生长因子家族成员。血管内皮生长因子家族成员优选地是人VEGF-C或人VEGF-D，最优选地人VEGF-C。
在本发明的缀合物包含VEGF-C的情况下，缀合物可以包括野生型VEGF-C，或者VEGF-C的突变体，如VEGF-C156Ser。优选地，缀合物包含VEGF-C。VEGF-C可以与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性。作为另外一种选择，VEGF-C可以包括具有10个或更少，例如，10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化(氨基酸残基的添加、缺失、替换和/或插入)的SEQ ID NO:13中所示的序列或由其组成。VEGF-C156Ser突变体优选地具有或包含SEQ ID NO:15中所示的序列。最优选地，缀合物包含SEQ ID NO:13中所示的VEGF-C序列或者SEQ ID NO:15中所示的VEGF-C156Ser序列。
在缀合物包含VEGF-D的情况下，VEGF-D可以与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性。作为另外一种选择，所述VEGF-D可以包括具有10个或更少，例如，10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化的SEQ ID NO:17中所示的序列或由其组成。
本发明的缀合物中的血管内皮生长因子家族成员优选地保留了血管内皮生长因子家族成员的生物活性，如抑制炎症的能力。例如，血管内皮生长因子家族成员可以保留诱导淋巴管生成的能力。
优选地，通过接头，优选地氨基酸接头将抗体分子连接至血管内皮生长因子家族成员。
当抗体分子是双链或多链分子时，可以通过接头将血管内皮生长因子家族成员连接至抗体分子中的一个或多个多肽链。
当通过氨基酸接头将抗体分子连接至血管内皮生长因子家族成员时，缀合物可以是或者包括融合蛋白。“融合蛋白”是指作为由两个或更多个基因或者核酸编码序列融合为一个开放阅读框(ORF)所产生的翻译产物的多肽。当缀合物包含双体抗体时，构成所述双体抗体的两个scFv分子(它们中的每一个优选地通过氨基酸接头连接至血管内皮生长因子家族成员)可以分别作为融合蛋白表达，并然后使其结合以形成二聚体。
连接抗体分子和血管内皮生长因子家族成员的氨基酸接头可以是柔性氨基酸接头。适合的氨基酸接头序列的实例在本领域中是已知的。所述接头的长度可以为10-20个氨基酸，优选地，10-15个氨基酸。最优选地，所述接头的长度为11-15个氨基酸。所述接头可以具有SEQ ID NO:14中所示的序列。
当抗体分子是或者包含scFv时，可以将血管内皮生长因子家族成员通过氨基酸接头连接至scFv的VH结构域的N末端或者通过氨基酸接头连接至scFv的VL结构域的C末端。
本发明的缀合物可以包括SEQ ID NO:1或2中所示的序列或者由其组成。优选地，本发明的缀合物包含SEQ ID NO:1中所示的序列或者由其组成。缀合物可以与SEQ ID NO:1或2，优选地，SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少70％，更优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％之一的序列同一性。
本发明的缀合物可以是去糖基化的。用于多肽去糖基化的方法在本领域中是已知的并且包括使用肽-N-糖苷酶F(PNG酶F)的处理。
核酸
还提供了编码根据本发明的缀合物的分离的核酸分子。核酸分子可以包括DNA和/或RNA并且可以是部分或完全合成的。除非上下文中另外要求，否则对本文所描述的核苷酸序列的提及涵盖了具有指定序列的DNA分子，并且涵盖了具有其中用U替换T的所述指定序列的RNA分子。
还提供了处于包含这些核酸的质粒、载体(例如，表达载体)，转录或表达盒的形式的构建体。可以选择或构建适合的载体，其根据情况含有适当的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、强化子序列、标志物基因及其他序列。根据情况，载体可以是质粒，例如，噬粒，或者病毒，例如，噬菌体。有关其他细节，参见，例如，Sambrook&Russell(2001)Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press。在Ausubel等人.(1999)第4版,Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons中详细描述了用于核酸操作，例如，在核酸构建体的制备、突变、测序、DNA向细胞中的引入和基因表达中的核酸操作以及蛋白分析的多种已知的技术和规程。
宿主细胞
还提供了包含如上所述的一个或多个构建体的重组宿主细胞。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。
可以使用这种重组宿主细胞生产根据本发明的缀合物。生产方法可以包括表达如上所述的核酸或构建体。可以通过在对于缀合物的生产适当的条件下培养重组宿主细胞来方便地实现表达。在生产后，可以使用任何适合的技术来分离和/或纯化缀合物，然后在适当时使用。可以将缀合物配制成包含至少一种其他组分，如药物可用的赋形剂的组合物。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。在本领域中很好地建立了抗体，包括其缀合物在原核细胞中的表达。有关综述，参见，例如Plückthun(1991),Bio/Technology 9:545-551。常见的细菌宿主是大肠杆菌(E.coli)。
作为缀合物生产的选择，在培养中的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可用的，例如，Chadd等人(2001),Current Opinion in Biotechnology12:188-194)；Andersen等人.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:117；Larrick&Thomas(2001)Current Opinion in Biotechnology 12:411-418。在本领域中可用的用于异源多肽表达的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞以及多种其他细胞。
还描述了将本文所公开的核酸或构建体引入宿主细胞的方法。所述引入可以使用任何可用的技术。对于真核细胞，适合的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用反转录病毒或其他病毒，例如，牛痘病毒或者对于昆虫细胞，杆状病毒的转导。在宿主细胞，具体地真核细胞中引入核酸可以使用病毒或质粒基系统。可以游离基因地维持质粒系统，或者可以将质粒系统引入宿主细胞或者引入人工染色体。引入可以通过单一或多个基因座处的一个或多个拷贝的随机或靶向整合来进行。对于细菌细胞，适合的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
可以将所述核酸或构建体整合到宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。可以根据标准技术，通过包含促进与基因组的重组的序列来促进整合。
分离的
这是指其中本发明的缀合物，用于在本发明中使用的抗体或者编码这些缀合物的核酸通常将是根据本发明的状态。因此，可以以与(例如)制备它们所处的环境(如细胞培养物)分离和/或纯化，以基本纯或均一的形式，或者就核酸来说，不含或基本不含编码具有所需功能的多肽的序列之外的核酸的形式来提供本发明的缀合物，用于在本发明中使用的抗体或者编码这些缀合物的核酸。当这种制备通过体外或体内实践的DNA重组技术进行时，分离成员和分离核酸将不含或基本不含与它们一起存在于制备它们所处的环境(例如，细胞培养物)中的材料。可以将具体的缀合物和核酸与稀释剂或佐剂一起配制，并且出于实践的目的，它们仍是分离的——例如，当在疗法中使用时，它们可以与药物可用的载体或稀释剂混合。具体的缀合物可以是天然或通过异源真核细胞(例如，CHO或NS0(ECACC 85110503)细胞)系统糖基化的，或者它们可以是(例如，如果通过原核细胞中的表达生产)未糖基化的。
还可以在本发明中使用缀合物的非均一制备。例如，这些制剂可以是包含具有全长重链和缺少C末端赖氨酸的重链，具有不同糖基化程度和/或具有衍生化氨基酸，如N末端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基的抗体分子的缀合物。
纤连蛋白
纤连蛋白是经历可变剪接的抗原，并且纤连蛋白的一些替代同种型是已知的，其包括分别包含ED-A结构域或ED-B结构域的替代剪接同种型A-FN和B-FN，它们是已知的血管生成标志物。
纤连蛋白额外结构域-A(ED-A或EDA)也称为ED，额外III型重复A(EIIIA)或EDI。ED-A主要以FN的血浆形式缺失，但是在血管生成、胚胎发生、组织重塑、纤维化、心脏移植和实体瘤生长期间大量存在。Kornblihtt等人.(1984),Nucleic Acids Res.12,5853-5868和Paolella等人.(1988),Nucleic Acids Res.16,3545-3557已发表了人ED-A的序列。人ED-A的序列还作为以登录号P02751保藏的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(纤连蛋白Ill型12；额外结构域2)可获自SwissProt数据库。纤连蛋白的ED-A同种型(A-FN)含有额外结构域-A(ED-A)。可以根据以登录号P02751可获自SwissProt数据库的相应人纤连蛋白前体序列推断人A-FN序列。
纤连蛋白同种型B-FN是最熟知的血管生成标志物之一(WO1997/045544，WO2001/62298)。91个氨基酸的额外结构域“ED-B”存在于B-FN同种型中并且在小鼠、大鼠、兔、狗和人中是同一的。在侵袭性肿瘤及经历血管生成的其他组织，如增殖期中的子宫内膜和病理学状况中的一些眼部结构中，B-FN在新生血管结构周围积累，但是在正常成人组织中是不可检测的。
固生蛋白C
固生蛋白-C是调节细胞粘附的胞外基质的大型六聚体糖蛋白。它参与如细胞增殖和细胞迁移的过程，并且与形态发生和胚胎发生以及肿瘤发生或血管生成期间发生的组织结构变化有关。由于可以导致在该蛋白的中心部分中(多个)域(从A1结构域至D域)的包含的可变剪接，可以生产固生蛋白-C的几种同种型(Borsi L等人,Int J Cancer 1992；52:688-692；Carnemolla B等人,Eur J Biochem 1992；205:561-567,WO2006/050834)。
炎性疾病和/或病症
“炎性疾病和/或病症”是指伴有炎症和/或以炎症为特征的疾病和/或病症。炎性疾病和/或病症优选地与血管生成和/或淋巴管生成有关和/或以它们为特征。炎性疾病和/或病症可以是以血管生成和/或淋巴管生成为特征的炎性疾病和/或病症，其中新生血管表达纤连蛋白的ED-A同种型、纤连蛋白的ED-B同种型和/或固生蛋白C。
可以基于炎性疾病和/或病症中纤连蛋白的ED-A同种型、纤连蛋白的ED-B同种型和/或固生蛋白C的表达来选择用于在炎性疾病和/或病症的治疗中使用的缀合物或者血管内皮生长因子家族成员向患者中炎性疾病和/或病症的位点的递送。
炎性疾病或病症可以是急性或慢性炎性疾病或病症。
在优选的实施方式中，炎性疾病和/或病症选自：动脉粥样硬化、炎症性肠病，如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎、银屑病、慢性气道炎症、特应性皮炎、类风湿性关节炎、淋巴水肿、青光眼、黄斑变性和心肌梗塞。例如，疾病可以是与慢性皮肤炎症有关的疾病，如银屑病或特应性皮炎。在更优选的实施方式中，疾病是银屑病或特应性皮炎。在替代的更优选的实施方式中，疾病是动脉粥样硬化。在其他替代的更优选的实施方式中，疾病是炎症性肠病。所述炎症性肠病优选地是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
治疗
预期本发明的缀合物将具有抗炎活性，并因此在炎性疾病和/或病症的治疗(其可以包括预防性治疗)中具有应用。不受理论的限制，由于如实施例中所显示的，血管内皮生长因子家族成员向炎性疾病和病症中的血管生成位点的靶向，预期本发明的缀合物将显示出有效的抗炎活性。
缀合物可以处于药物组合物的形式。所述药物组合物通常包含治疗有效量的缀合物和任选地助剂物质，如药物可用的赋形剂。以药物领域熟知的方式制备药物组合物。载体或赋形剂可以是可以用作活性成分的媒介物或媒介的液体材料。适合的载体或赋形剂在本领域中是熟知的并且包括(例如)稳定剂、抗氧化剂、pH调节物质、控释赋形剂。所述药物组合物可以适应(例如)肠胃外使用并且可以以溶液等形式施用于患者。
包含本发明的缀合物的药物组合物可以施用于患者。施用优选地以“治疗有效量”进行，其足以对患者显示出益处。这种益处可以是至少一种症状的改善。所施用的真实量以及施用速率和时间-过程将取决于正在治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如，剂量的确定等在全科医生及其他医生的职责范围内。按照医师的决定，可以以每天、每周两次、每周或每月的间隔重复治疗。
可以通过任何适合的途径，通常通过注射至血流和/或直接注射至治疗位点来向需要治疗的患者施用药物组合物。精确剂量及其施用频率将取决于一些因素、治疗途径、要治疗的区域的大小和位置。优选地，静脉内施用本发明的缀合物。
用于口服施用的药物组合物可以处于片剂、胶囊剂、粉末剂或液体剂形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或者佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉注射，或者患病位点的注射，所述药物组合物将处于无热原且具有适合的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可用的水溶液的形式。本领域的相关技术人员将能够使用(例如)等渗媒介物，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液很好地制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
可以单独或与其他治疗同时或顺序结合，或者作为与另一种治疗剂的混合制剂施用根据本发明的缀合物以用于治疗炎性疾病或病症。例如，本发明的缀合物可以与已有的治疗剂组合用于所讨论的炎性疾病或病症。在动脉粥样硬化的治疗中，本发明的缀合物可以与抑制素组合施用。
考虑到包括以下实验例证的本发明公开，本发明的其他方面和实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。
在本说明书中提及的所有文档以其全部内容通过引用结合于此。
当在本文中使用时，“和/或”将被视为对两种所指明的特征或组分中的每一种在具有或不具有另一种的情况下的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为对(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一种的具体公开，就如同在本文中单独说明了每一种一样。
除非上下文另外指明，否则如上所述的特征的描述和定义不局限于本发明的任何具体方面或实施方式并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方式。
现将通过实施例并且参考以上附图来说明本发明的某些方面和实施方式。
实施例
实施例1—F8-VEGF-C、F8-VEGF-C156Ser和KSF-VEGF-C融合蛋白的生产。
材料和方法
融合蛋白F8-VEGF-C的克隆
将编码F8和ΔNΔCVEGF-C的基因(Joukov V,Kumar V,Sorsa T,Arighi E,WeichH,Saksela O,and Alitalo K.A recombinant mutant vascular endothelial growthfactor-C that has lost vascular endothelial growth factor receptor-2binding,activation,and vascular permeability activities.J Biol Chem.1998；273(12):6599-6602)扩增并PCR组装。使用HindIII/NotI使产物消化并克隆至同样消化的pcDNA3.1(+)质粒主链(Invitrogen)中。
融合蛋白F8-VEGF-C156Ser的克隆
将编码F8和ΔNΔCVEGF-C156Ser的基因(Joukov V,Kumar V,Sorsa T,Arighi E,Weich H,Saksela O,and Alitalo K.A recombinant mutant vascular endothelialgrowth factor-C that has lost vascular endothelial growth factor receptor-2binding,activation,and vascular permeability activities.J Biol Chem.1998；273(12):6599-6602)扩增并PCR组装。使用HindIII/NotI使产物消化并克隆至同样消化的pcDNA3.1(+)质粒主链中。
融合蛋白KSF-VEGF-C的克隆
将编码抗体KSF(对鸡蛋溶菌酶特异)和ΔNΔCVEGF-C的基因扩增并PCR组装。使用HindIII/NotI使产物消化并克隆至同样消化的pcDNA3.1(+)质粒主链中。
融合蛋白的表达
使用瞬时基因表达，在CHO-S细胞中表达所述融合蛋白。简要地，将CHO细胞在补充有含有100μM次黄嘌呤和16μM胸腺嘧啶核苷(Lonza)以及2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)的HT补充剂的PowerCHO-2CD培养基(Lonza)中悬浮培养。对于转染，将细胞转移至补充有含有100μM次黄嘌呤和16μM胸腺嘧啶核苷(Lonza)以及2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)的HT补充剂的ProCHO-4培养基(Lonza)中并加入与聚乙烯亚胺(PEI)预混合的质粒(DNA:PEI比为1:4)。将细胞在37℃培育，并在转染后约3-4小时1:1加入PowerCHO-2CD。24小时后，将培育温度降低至32℃，并将细胞以1×106个细胞每ml的原始细胞密度培养5-7天。
就F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser而言，使用在遗传霉素(Life Technologies)选择下保持>28天的瞬时转染的CHO-S细胞的连续稀释建立稳定转染的单克隆细胞系。
就KSF-VEGF-C而言，通过电穿孔(Nucleofector V试剂盒，Lonza，根据生产商的说明使用)建立稳定转染的单克隆细胞系，然后G-418(0.8mg/ml,Roche)选择>28天，并在FACSAria IIu(BD Biosciences)上使用FACSDiva软件对用兔抗人IgG(A0423,Dako)和Alexa 488缀合的山羊抗兔第二抗体(Invitrogen)染色的细胞进行荧光激活细胞分选。
融合蛋白的纯化
通过蛋白A亲合色谱法(HiTrap Protein A HP,GE Healthcare Life Sciences)纯化所述融合蛋白。
SDS-PAGE和免疫印迹分析
通过SDS-PAGE(NuPAGE system,Life Technologies)分析所述融合蛋白。将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)，然后将其用5％的牛奶封闭并与多克隆兔抗VEGF-C抗体(ab9546,Abcam)，然后与HRP缀合的第二抗体(驴ECL抗兔IgG，HRP连接的F(ab')2片段，GE Healthcare)培育。在Agfa Curix 60成像仪上通过化学发光(ECL Prime,Amersham)使信号显像。
对于VEGFR3磷酸化分析，用VEGF-C(200ng/ml)、VEGF-C156Ser(200ng/ml)、F8-VEGF-C(对应于200ng/ml VEGF-C)和F8-VEGF-C156Ser(对应于200ng/ml VEGF-C156Ser)刺激PAE细胞20分钟，然后在RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.5％NP-40、5mM EDTA、1％Triton-X100和1mM Na3VO4中裂解。通过使用与抗VEGFR-3抗体(C20,SantaCruz Biotechnology)复合的Dynabeads Protein G(Invitrogen)使VEGFR-3免疫沉淀。对免疫沉淀样品进行SDS-PAGE，并通过使用抗磷酸酪氨酸抗体(4G10,Milipore)分析磷酸化作用。最终，将膜在含有Tris、SDS和2-巯基乙醇的剥离缓冲液中剥离30min，并用VEGF-3抗体(C20,Santa Cruz Biotechnology)再次探查以分析总VEGF-3。为了研究VEGF-2的磷酸化，如上所述刺激人LEC并使其裂解。对细胞裂解液进行SDS-PAGE并使用兔抗人(p1175)VEGFR-2抗体(Cell Signaling)研究磷酸化作用。剥离后，用抗人VEGFR-2抗体(CellSignaling)再次探查膜。
融合蛋白的尺寸排阻色谱
在Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)上通过尺寸排阻色谱分析纯化的融合蛋白。
结果
F8-VEGF-C(左图)和KSF-VEGF-C(右图)的考马斯亮蓝染色显示在非还原条件下蛋白主要作为二聚体存在(图1A)。
免疫印迹分析显示通过抗VEGF-C抗体识别F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C(图1C)。
F8-VEGF-C(顶部)和KSF-VEGF-C(底部)的尺寸排阻色谱确认了融合蛋白的纯度和二聚体形式(图1B)。
实施例2—F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C的体外和体内生物活性。
材料和方法
对于增殖测定，将2500个人淋巴的内皮细胞(LEC)接种到胶原蛋白涂覆的96-孔板中含有20％FBS(Gibco)、25μg/ml cAMP(Sigma)和10μg/ml氢化可的松(Sigma)的EBM培养基(Lonza)中。在含有0.5％FBS的EBM中饥饿过夜后，将细胞与VEGF-A(20ng/ml,CellSciences)、VEGF-C(200ng/ml，Kurt Ballmer-Hofer博士,Villingen,Switzerland友情赠送)、F8-SIP(400ng/ml)、F8-VEGF-C(600ng/ml)或者F8-VEGF-C156Ser(600ng/ml)培育。72小时后，加入100μg/ml 4-甲基伞形酮庚酸酯(MUH,Sigma)并在SpectraMax酶标仪(Molecular Devices)上以355nm激发波长和460nm发射波长测量对应于活细胞数目的荧光强度(Detmar等人,“Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1expression ofhuman dermal microvascular endothelial cells in vitro”,J InvestDermatol.1992,98:147-53)。对于每个条件，分析至少5个重复样品并且测定重复进行三次。
为了分析F8-VEGF-C构建体对迁移的影响，将过表达VEGF-3的猪主动脉内皮(PAE)细胞(Lena Claesson-Welsh博士友情赠送)(Waltenberger J,Claesson-Welsh L等人,"Different signal transduction properties of KDR and Flt1,two receptors forvascular endothelial growth factor",J Biol Chem.1994,269:26988-95)在含有0.5％FBS的DMEM培养基(Gibco)中饥饿过夜。将转板(8μm孔，Costar)的下侧面用纤连蛋白(10μg/ml)涂覆，随后用100μg/ml BSA封闭，每一步进行1小时。将30,000个细胞接种到转板上的饥饿培养基中，并将500μl含有VEGF-A、VEGF-C、F8-双体抗体、F8-VEGF-C或F8-VEGF-C156Ser(与用于增殖测定的浓度相同)的培养基加入到下孔中。3小时后，使用棉拭除去转板上侧面上非迁移的细胞。为了分析迁移细胞，用Hoechst 33342(Life Technologies)对插入物染色，并且对每个转板采集5幅图像以使用ImageJ(http://imagej.nih.gov/ij)确定迁移细胞数目。对于每个条件，分析4个重复样品并且测定重复进行2次。
如前所述，进行3维出芽测定(Schulz等人,”Phenotype-based high-contentchemical library screening identifies statins as inhibitors of in vivolymphangiogenesis”,Proc Natl Acad Sci USA.2012,109:E2665-74)。简要地，用细胞绿色示踪剂(CTG,Invitrogen)标记LEC涂覆的细胞葡聚糖(cytodextran)微载体珠(Sigma-Aldrich)并将其包埋在I型胶原蛋白水凝胶中(1mg/ml,Advanced Bio-Matrix)，然后添加LEC培养基(EBM,20％FBS和40ng/ml bFGF(R&D Systems))。将VEGF-A(40ng/ml)、VEGF-C(200ng/ml)、VEGF-C156Ser(200ng/ml)、F8-VEGF-C(对应于200ng/ml VEGF-C)，F8-VEGF-C156Ser(对应于200ng/ml VEGF-C156Ser)或者F8双体抗体加入至培养基。在37℃保持24h之后，进行成像并对芽进行手动计数。对于每个条件，分析5个重复样品并且测定重复进行2次。
为了研究F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C对膈膜中淋巴管的影响，在第P1-P5天，FVB小鼠幼崽接受每日腹膜内注射F8-VEGF-C(2.27μg/g体重)、KSF-VEGF-C(2.27μg/g体重)或者PBS。在P6，将小鼠安乐死，切除膈膜并在4％PFA中固定2h，然后在5％驴血清、0.1％Triton-X、0.05％NaN3和1％BSA的PBS溶液中封闭1h。然后，将样品与第一抗体在4℃培育过夜。所使用的第一抗体是多克隆兔抗小鼠LYVE-1(Angiobio)和大鼠抗小鼠CD31(MEC13.3,BDPharmingen)。Alexa 488和594缀合的第二抗体购自Invitrogen。将染色样品水平封固在载玻片上，并使用Zeiss ZEN 2009软件，使用配备有10×0.3NA EC Plan-Neofluar物镜的Zeiss LSM 710-FCS共聚焦显微镜(Carl Zeiss)采集Z-堆叠图像。
结果
使用人LEC的增殖测定显示与饥饿培养基和SIP蛋白对照相比，F8-VEGF-C或KSF-VEGF-C的添加显著提高了增殖。效果与游离VEGF-C相当(图2A)。
与PBS相比，从第P1至P5天，每天腹膜内注射F8-VEGF-C和KSF-VEGF-C显著提高了膈膜肌中的淋巴管生成，表明融合蛋白是具有生物学活性的(图2B)。
F8-VEGF-C和VEGFR3特异性突变体形式F8-VEGF-C156Ser显著提高了微载体珠上涂覆的LEC的芽形成(图2C)。
在转板测定中，F8-VEGF-C导致过表达VEGFR3的猪主动脉内皮(PAE)细胞的迁移显著增加(图2D)。在用VEGFR3特异性突变体形式F8-VEGF-C156Ser处理后，未观察到PAE细胞迁移的显著增加。不希望受理论束缚，一种可能的解释是通过VEGFR2的信号转导，至少部分调节了迁移，其不受F8-VEGF-C156Ser的激活。的确，通过受体特异性阻断显示人LEC的迁移以明显加和的方式需要VEGFR2和VEGFR3两者的激活(Goldmann等人,“Cooperative andredundant roles of VEGFR-2and VEGFR-3signaling in adult lymphangiogenesis”,FASEB J.2007,21(4)；1003-12)，这与本文所提供的结果一致。
这些结果清楚地显示在将VEGF-C或VEGF-C156Ser融合至靶向部分之后，构建体中的VEGF-C和VEGF-C156Ser仍具有体外和体内生物学活性。此外，构建体的生物学活性与游离VEGF-C相当。
实施例3—F8-VEGF-C对细胞群体的影响
材料和方法
在如以下实施例4中所述的激发之后，在第15或16天从K14-VEGF-A转基因小鼠收获耳。在组织机械破坏之后，将样品在含有4mg/ml胶原酶IV(Gibco)的DMEM(Gibco)中在37℃振荡消化45min。将样品通过40μm过滤器(Falcon)过滤，离心并在含有2％FBS(Gibco)和2mM EDTA(Fluka)的FACS缓冲液中再悬浮。将样品与抗小鼠CD16/32抗体(93,Biolegend)在冰上培育20min，然后使用Pacific Blue抗小鼠CD45(30-F11,Biolegend)、APC抗小鼠CD4(GK1.5,Biolegend)、FITC抗小鼠CD8(53-6.7,Biolegend)、PerCP-eFluor 710抗小鼠γδTCR(GL-3,eBioscience)或者Brilliant Violet抗小鼠CD25(PC61,Biolegend)抗体和活/死可固定水染料(Life Technologies)在冰上染色30min。根据生产商的说明，使用抗小鼠/大鼠Foxp3染色组PE(eBioscience)对Foxp3进行染色。使用FACSDiva软件，在LSRFortessa(BD Biosciences)上采集样品。使用FlowJo v10.1进行分析。使用AccuCheck计数珠(Invitrogen)进行绝对细胞数目的定量。
结果
F8-VEGF-C融合蛋白降低了白细胞和T细胞亚型的数目。具体地，FACS分析显示与使用非靶向KSF-VEGF-C对照抗体的处理相比，使用F8-VEGF-C处理降低了白细胞(图3A)、调节性T细胞(图3B)、γδT细胞(图3C)和(D)CD4 T细胞(图3D)的绝对数目。
与使用KSF-VEGF-C的非靶向处理或者使用PBS的处理相比，使用F8-VEGF-C的靶向处理显著降低对于炎症反应至关重要的细胞群体的事实为F8-VEGF-C的抗炎有效性以及VEGF-C的靶向递送的重要性提供了强有力的证据。
实施例4—F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser对慢性皮肤炎症的影响
材料和方法
小鼠慢性皮肤炎症模型的制备
本研究中使用的小鼠在ETH苏黎士动物机构中增殖和饲养。根据当地兽医部门(Kantonales Veterinaramt Zürich)批准的动物规程117/2011和37/2013进行实验。K14-VEGF-A转基因小鼠如前所述(Detmar等人,“Increased microvascular density andenhanced leukocyte rolling and adhesion in the skin of VEGF transgenic mice”,J Invest Dermatol.1998,111:1-6,Xia等人.“Transgenic delivery of VEGF to mouseskin leads to an inflammatory condition resembling human psoriasis”,Blood.2003,102:161-8)。简要地，通过在备皮腹部(50μl)上和每只爪子(5μl)局部施用2％噁唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮；Sigma-Aldrich)在丙酮/橄榄油(4:1vol/vol)中的溶液，然后在5天后在双耳每侧上局部施用10μl噁唑酮(1％)(激发)的敏化在这些小鼠中导致了慢性皮肤炎症(Kunstfeld等人,“Induction of cutaneous delayed-type hypersensitivity reactions in VEGF-A transgenic mice results in chronicskin inflammation associated with persistent lymphatic hyperplasia”,Blood.2004,104:1048-57)。使用卡尺，在激发之前和之后重复测量耳厚度。从第7天开始，每隔一天i.v.应用以下处理直至第13天(终止前2天)：PBS、SIP-F8(Villa等人,2008)、TNFR-Fc(Doll等人,2013)、F8-VEGF-C、F8-VEGF-C156Ser或者KSF-VEGF-C(每个构建体50μg)。第15天，分析小鼠(图4A-图4C和图5)。
在第二慢性皮肤炎症模型中，每天向C57BL/6野生型小鼠(每组至少5只)的耳部皮肤施用含有咪喹莫特的乳膏剂(Aldara,3M Pharmaceuticals)，连续施用5天，然后1天不处理并在第7天施用另一个咪喹莫特剂量。从第7天开始，每只小鼠每隔一天接收静脉内注射PBS、SIP-F8、TNFR-Fc、F8-VEGF-C、F8-VEGF-C156Ser或KSF-VEGF-C，在第11天进行最后一次注射。每天测量耳厚度。在第12或13天分析小鼠(图4D-4F和图7)。
在这些实验中作为比较包括了TNFR-Fc，因为它是慢性炎性疾病，如银屑病和类风湿性关节炎的标准疗法之一。
免疫荧光
将K14-VEGF-A转基因小鼠和咪喹莫特处理小鼠的OCT包埋的耳样品在液氮中冷冻并制备7μm冷冻切片。在丙酮中固定并在80％甲醇中复水之后，用含有5％驴血清、0.1％Triton-X、0.05％NaN3和1％牛血清白蛋白的PBS封闭切片，然后与各自一抗培育。如上所述(Huggenberger等人,2010；Kunstfeld等人,2004)，使用以下抗体：生物素化的F8、多克隆兔抗小鼠LYVE-1(Angiobio)、大鼠抗小鼠CD31(MEC13.3,BD Pharmingen)、大鼠抗小鼠MECA-32(BD Biosciences)、大鼠抗小鼠CD68(FA-11，abcam)和大鼠抗小鼠CD4(GK1.5,eBioscience)抗体进行标准H&E和免疫荧光染色。Alexa 488-和Alexa 594缀合的第二抗体和Hoechst 33342购自Invitrogen。用mowiol封固剂封固载玻片，并在Axioskop2 mot plus显微镜(Zeiss)上成像。
对于H&E染色，根据Gill III(Merck)，将切片与苏木紫溶液培育，用水和0.1％盐酸清洗，并在使用Eukitt封固剂(Sigma-Aldrich)封固前，使用0.5％黄色曙红(Merck)水溶液染色。
结果
第一慢性皮肤炎症模型：CHS诱导的皮肤炎症
(i)评价了F8-VEGF-C对小鼠慢性皮肤炎症模型中的CHS诱导的皮肤炎症中的耳厚度和淋巴管的影响。F8-VEGF-C显示减轻慢性皮肤炎症，但是KSF-VEGF-C不能。
评价进行接触性过敏(CHS)的K14-VEGF-A小鼠的耳厚度。在激发后第7、9、11和13天，动物接受F8-VEGF-C、KSF-VEGF-C或PBS的i.v.注射。F8-VEGF-C，而不是KSF-VEGF-C或PBS减轻耳水肿(图4A)。图4B显示了K14-VEGF-A耳的冷冻切片中淋巴(LYVE-1，绿色)管的染色。染色的K14-VEGF-A耳切片的定量显示用F8-VEGF-C处理提高了淋巴管面积(图4C)。
(ii)F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser，而不是SIP-F8将皮肤炎症抑制至与CHS诱导的皮肤炎症中TNFR-Fc相当的程度。在半合K14-VEGF-A转基因小鼠中，诱导CHS诱导的皮肤炎症(n＝5每组)。与SIP-F8相比，从第7天往后，每隔一天用F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理显著降低了炎症性耳肿胀，并且其具有与TNFR-Fc类似的效果(图5A)。图5B和图5C显示发炎的K14-VEGF-A tg耳皮肤对于LYVE-1和MECA-32的免疫荧光染色的定量图像分析。它显示F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理组中LYVE-1阳性淋巴面积显著增加。图5D和图5E中对于LYVE-1的染色显示在F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理的小鼠中淋巴管网络增加。图5F和图5G显示发炎的耳皮肤对于CD4的免疫荧光染色，其显示与PBS和SIP-F8相比，F8-VEGF-C、F8-VEGF-C156Ser和TNFR-Fc处理降低了CD4+T细胞的浸润。
(iii)当与PBS处理的对照动物相比时，靶向F8-VEGF-C或非靶向KSF-VEGF-C的全身施用对血管表型无影响。图6A显示了经历CHS诱导的炎症的小鼠的发炎的耳皮肤对于MECA-32的免疫荧光染色的代表性图像(浅灰色)。MECA-32染色切片的定量显示血管面积(图6B)、血管数目(图6C)或者血管的平均尺寸(图6D)无变化。
第二慢性皮肤炎症模型：IMQ诱导的皮肤炎症模型
(i)评价了F8-VEGF-C对IMQ诱导的皮肤炎症模型中的耳厚度和淋巴管的影响。F8-VEGF-C减轻慢性皮肤炎症，但是KSF-VEGF-C不能。测量了F8-VEGF-C对C57Bl/6小鼠的耳厚度的影响。在第1-5天和第7天每天应用含咪喹莫特的乳膏剂。在第7、9和11天，小鼠接受F8-VEGF-C、KSF-VEGF-C或SIP-F8的i.v.注射。F8-VEGF-C，而不是KSF-VEGF-C或SIP-F8促进水肿消退(图4D)。图4E通过经历咪喹莫特诱导的炎症的动物的耳部冷冻切片中的淋巴特异性标志物LYVE-1的染色显示淋巴管。LYVE-1染色的耳组织的定量显示与KSF-VEGF-C或者SIP-F8相比，用F8-VEGF-C处理增加了淋巴管面积(图4F)。
(ii)F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser，而不是SIP-F8将皮肤炎症抑制至与该IMQ诱导的皮肤炎症模型中TNFR-Fc相当的程度。图7A显示在IMQ诱导的皮肤炎症模型中(n＝5只小鼠每组)，与SIP-F8和PBS相比，从第7天往后，每隔一天用F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理显著加快了水肿的消退。效果与TNFR-Fc的效果相当，如上所述，TNFR-Fc是慢性炎性疾病，如银屑病的标准疗法之一。在图7B和图7C中，耳皮肤切片的H&E染色显示与PBS和SIP-F8处理的小鼠相比，TNFR-Fc、F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser处理显著降低了表皮厚度。图7D显示了IMQ炎症耳皮肤对于LYVE-1和MECA-32的代表性免疫荧光染色图像。在图7E中，定量图像分析显示F8-VEGF-C处理小鼠中淋巴管尺寸显著增加。
(iii)当与SIP-F8处理的对照动物相比时，F8-VEGF-C或KSF-VEGF-C的全身施用对血管表型无影响。IMQ炎症耳皮肤对于MECA-32的免疫荧光染色分析(图8A中的代表性图像)显示与SIP-F8处理相比，通过F8-VEGF-C或KSF-VEGF-C处理，血管面积(图8B)、数目(图8C)或者平均血管尺寸(图8D)无变化。
可以从这些实验获得几个结论：
—与SIP-F8相比，F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser显著减少耳水肿，表明单独ED-A的靶向对耳部炎症无效果。
—与KSF-VEGF-C相比，F8-VEGF-C显著减少耳水肿，表明VEGF-C的靶向对于融合蛋白的有效性是必需的并且非靶向VEGF-C的注射对炎症无明显效果。
—F8-VEGF-C和F8-VEGF-C156Ser将耳水肿降低至与TNFR-Fc类似的程度，TNFR-Fc是慢性炎性疾病，如银屑病或类风湿性关节炎的标准疗法之一，表明靶向VEGF-C递送可以代表这些疾病的有价值的替代治疗方法。
—意外地，F8-VEGF-C不影响发炎的耳皮肤中的血管。这是意外的，因为先前报道VEGF-C还结合至VEGF-2，其在血液血管内皮细胞上表达(Saaristo A等人,AdenoviralVEGF-C overexpression induces blood vessel enlargement,tortuosity,andleakiness but no sprouting angiogenesis in the skin or mucous membranes.FASEBJ.2002；16(9):1041–1049)。这些结果支持通过淋巴脉管系统调节VEGF-C的治疗效果的结论。F8-VEGF-C或者KSF-VEGF-C的全身施用之后，血管表型无变化是有益的，因为已知在慢性皮肤炎症的背景中，血管膨胀是不利影响(例如，Schonthaler H等人Systemic Anti-VEGF Treatment Strongly Reduces Skin Inflammation in a Mouse Model ofPsoriasis.Proc Natl Acad Sci USA 2009；106(50):21264–69)。
值得注意的是可以在两种不同的小鼠慢性炎症性皮肤病模型中观察到以上影响。
实施例5—F8-VEGF-C对淋巴清除功能的影响
材料和方法
如前所述，制备了聚乙二醇(PEG)-基淋巴示踪剂P20D800(缀合至的PEG胺P20)(Proulx ST等人,“Use of a PEG-conjugated bright near-infrared dye forfunctional imaging of rerouting of tumor lymphatic drainage after sentinellymph node metastasis”,Biomaterials.2013；34:5128-37)。为了检查随时间的淋巴清除，用异氟烷(2％)使发炎的K14-VEGF-Atg小鼠(噁唑酮激发后10天)麻醉，并使用29g胰岛素注射器将3μl，3μM的示踪剂皮内注射至耳皮肤。将小鼠布置在IVIS光谱成像系统中，并在示踪剂注射并暴露2s(λex：745nm，λem：800nm，像素组合(bining)为4)后立即采集图像，并在注射后1h、2h、3h、4h和6h重复。在不同成像时间点之间，使小鼠醒来并自由移动。为了计算组织增强值，在示踪剂注射之前，将所有信号强度调节至基线耳信号。在示踪剂注射后直接获得的组织增强值用于归一化所有连续测量值。将单相指数衰减模型用于拟合每只小鼠的数据，其中将淋巴清除表示为衰减常数K(用h-1表示)或者半衰期(用h表示)。
结果
与PBS相比，F8-VEGF-C显著改善了K14-VEGF-A tg小鼠的发炎的耳中的淋巴清除功能(图9)。该结果清楚地显示扩大的淋巴脉管系统是功能性的。此外，提高的炎性细胞和/或炎症介质的清除可以是F8-VEGF-C融合蛋白发挥其抗炎效果的可能机制。
实施例6—F8-VEGF-C对动脉粥样硬化模型中血液值的治疗效果
材料和方法
疾病模型
对ApoE敲除(ApoE KO)小鼠进行高脂饮食(HFD)。两周后，在左颈总动脉(LCCA)周围植入脱落物，其调节所述血管中的血流并导致形成了不稳定的动脉粥样硬化斑块，同时在心脏、头臂动脉和主动脉弓中形成更稳定的斑块，从而使得斑块分级(plaque-staging)。HFD 8周后，用荧光乳胶珠标记单核细胞以定量从动脉粥样硬化病变流出的单核细胞。在第9周，将未处理的HFD小鼠安乐死以建立终点读数的基线值。在10-11天的过程中，在接受5次F8-VEGF-C或者PBS注射后将小鼠处死。由于一些小鼠不是完全反应性的并且不能在所有关心的位点出现病变，因此对于不同的解剖学位点，所包括的用于分析的动物数目是不同的。
血液值的定量
通过过度剂量的氯胺酮/塞罗卡因(xylacine)使小鼠安乐死，通过心穿刺术收集血液。
根据生产商的说明，分别通过CHOD-PAP试剂盒(Roche/Hitachi)和GPO-PAP试剂盒(Roche/Hitachi)确定血浆胆固醇和甘油三酯水平。
通过流式细胞术定量典型单核细胞、非典型单核细胞、嗜中性白细胞、B细胞和T细胞的数目。具体地，将血液与红细胞裂解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mMNa2EDTA)在室温下培育5min。用抗CD45抗体(Biolegend，克隆：30-F11)、抗CD11b抗体(Biolegend，克隆：M1/70)、抗Gr1抗体(eBioscience，克隆RB6-8C5)、抗CD115抗体(eBioscience，克隆：AFS98)、抗CD45R抗体(B220，eBioscience，克隆RA3-6B2)、抗CD3抗体(eBioscience，克隆145-2C11)在染色缓冲液中对白细胞染色(20min，4℃)。用以下表面标志物限定血液白细胞：典型单核细胞：CD45+CD11B+CD115+Gr1高，非典型单核细胞：CD45+CD11B+CD115+Gr1低，嗜中性白细胞：CD45+CD11B+CD115-Gr1高，B细胞：CD45+CD11B-B220+和T细胞：CD45+CD11B-CD3+。通过使用CountBrightTM绝对计数珠(Invitrogen)评价绝对细胞数目。使用LSR Fortessa(Beckton Dickinson)进行流式细胞术，并且使用FlowJo软件(BecktonDickinson)分析数据。
结果
与注射了PBS小鼠相比，使用F8-VEGF-C处理显著降低了血液甘油三酯水平(图10C)，并且显示出胆固醇降低的趋势(图10D)。与注射了PBS小鼠相比，当用F8-VEGF-C处理小鼠时，其他测量参数，如嗜中性白细胞、单核细胞、B和T细胞的数目保持不变(图10E-图10I)。
实施例7—F8-VEGF-C对LCCA中不稳定斑块的治疗效果
材料和方法
疾病模型
在这些实验中使用的ApoE KO小鼠模型如以上实施例6所述。
LCCA中脱落物处不稳定斑块的分析
含有动脉粥样硬化斑块的LCCA的苏木精-伊红染色：
通过过度剂量的氯胺酮/塞罗卡因(xylacine)使小鼠安乐死，通过心穿刺术收集血液，然后用20mL冰冷的PBS-EDTA(5mM EDTA)冲洗小鼠。随后，将左颈总动脉包埋在TissueTek O.C.T.化合物(Sakura Finetek)中用于分析。对于自发动脉发展(atheroprogression)模型，分离主动脉弓，用4％PFA固定并在石蜡中包埋。以70或40μm间隔，用苏木精和伊红(HE)分别对冷冻切片(7μm)或石蜡切片(4μm)组织染色。
组织学和免疫荧光：
以70或40μm间隔，用苏木精和伊红(HE)分别对冷冻切片(7μm)或石蜡切片(4μm)组织染色。在连续切片中，通过天狼星红染色评价总胶原蛋白含量。对于免疫荧光染色，用冷丙酮固定冷冻切片，然后使用5％山羊血清/磷酸盐缓冲盐水进行抗原封闭。在使用5％山羊血清/磷酸盐缓冲盐水抗原封闭之前，石蜡切片经历了使用柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 6.0)的抗原修复。然后，将切片与以下一抗在4℃培育过夜：兔抗小鼠CD68(Abcam，1:200)、小鼠抗小鼠平滑肌肌动蛋白(SMA)-Fitc缀合的(Sigma，1:500)。在彻底清洗后，将切片与DyLight 550或DyLight 650(Thermo Fisher，1:500)缀合的二抗一起培育。通过与DAPI(Molecular Probes)培育进行复染以使核显像。对于平滑肌细胞和巨噬细胞中的脂质染色，用4％PFA固定冷冻切片。然后，用油红O对样品染色。彻底清洗后，如上所述进行抗原封闭和免疫荧光以使SMA和CD68显像。使用配备有UV激光器、自由可调的脉冲白光激光器、混合检测器和63×1.40油物镜的Leica TCS SP8(Leica Microsystems)使免疫荧光切片成像。使用ImageJ软件(National Institutes of Health)，通过计算机辅助的形态测定分析定量组织切片。
病变尺寸的定量，表示为内膜/媒介物的比：
分析HE染色切片中的内膜和媒介物面积。作为内膜面积和媒介物面积的商分析内膜/媒介物的比。
坏死核心尺寸的定量，表示为内膜％：
分析HE染色切片中的内膜和坏死核心面积。将坏死核心(NC)定义为所形成的纤维帽下方缺少核的面积。将坏死核心尺寸表示为坏死核心和内膜面积的商。
含有动脉粥样硬化病变的LCCA的天狼星红(sirius red)染色：
将LCCA切片与天狼星红溶液培育。通过用酸化水清洗终止染色反应。随后，将切片在乙醇中脱水，清洗并封固。
病变中胶原纤维的定量，表示为内膜％：
分析HE染色切片中的内膜面积。通过如上所述的连续切片中的天狼星红染色评价总胶原蛋白含量，并表示为胶原蛋白面积和内膜面积的商。
纤维帽厚度的定量，表示为内膜％：
分析HE染色切片中的内膜面积。在如上所述的天狼星红染色切片上测量纤维帽(FC)厚度，并将其定义为与正方形网格线重叠的位置中的平均长度量测。通过分析平均FC长度和内膜面积的商，通过病变尺寸修正FC厚度。从分析中排除具有显示病变形成不存在的颈动脉样品的动物。
含有动脉粥样硬化斑块的LCCA中对于平滑肌肌动蛋白、CD68(巨噬细胞标志物)和DAPI的免疫荧光染色：
如以上“组织学和免疫荧光”中所述，对免疫荧光切片进行免疫荧光染色和成像。使用ImageJ软件(National Institutes of Health)，通过计算机辅助的形态测定分析定量组织切片。
平滑肌细胞面积的定量，表示为内膜％：
分析HE染色切片中的内膜面积。平滑肌细胞面积测量为平滑肌肌动蛋白阳性面积，并计算平滑肌细胞和内膜面积的商。
巨噬细胞面积的定量，表示为内膜％：
分析HE染色切片中的内膜面积。将巨噬细胞面积定义为染色载玻片上的CD68阳性面积。将巨噬细胞面积报告为巨噬细胞和内膜面积的商。
对于平滑肌肌动蛋白、CD68和DAPI的油红O染色结合免疫荧光染色：
对于平滑肌细胞和巨噬细胞中的脂质染色，用4％PFA固定冷冻切片。然后，用油红O对样品染色。彻底清洗后，如上所述进行抗原封闭和免疫荧光以使SMA和CD68显像。
平滑肌细胞中脂质的定量，表示为平滑肌细胞面积％：
将平滑肌细胞中的脂质计算为对于SMA和脂质(如油红O染色中所评价的)双阳性的面积除以定义为总SMA阳性面积的总平滑肌细胞面积。
巨噬细胞中脂质的定量，表示为巨噬细胞面积％：
将巨噬细胞中的脂质计算为对于CD68和脂质(如油红O染色中所评价的)双阳性的面积除以定义为总CD68阳性面积的总巨噬细胞面积。
结果
在临床上，不稳定斑块代表主要的健康风险，因此在LCCA中脱落物处的发现是非常受关注的。在该所关心的位点，使用F8-VEGF-C的处理显示出降低动脉粥样硬化病变尺寸的趋势(图11C-图11D)。此外，用F8-VEGF-C处理的动物表现出含有显著较小的坏死核心的斑块(图11E)。尽管F8-VEGF-C对病变中的胶原蛋白沉积无明显影响(图11F-G)，但是与接受PBS的小鼠相比，F8-VEGF-C处理组中斑块的纤维帽厚度显著增加(图11H)。另外，注射F8-VEGF-C的小鼠中病变的平滑肌细胞面积显著增加(图11I-图11J)，而巨噬细胞不受影响(图11K)。进一步的分析显示平滑肌细胞中脂质显著减少，如通过用F8-VEGF-C处理的小鼠中的染色所评价的(图11L-图11M)，并且巨噬细胞的脂质负荷无变化(图11N)。值得注意地，在基线动物和PBS处理动物之间，参数，如病变尺寸(图11D)、坏死核心尺寸(图11E)和纤维帽厚度(图11H)往往是不同或显著不同的。
实施例8—F8-VEGF-C对主动脉弓内弧中斑块的治疗效果
材料和方法
疾病模型
在这些实验中使用的ApoE KO小鼠模型如以上实施例6所述。
主动脉弓内弧中斑块的分析
含有动脉粥样硬化斑块的LCCA的苏木精-伊红染色和病变尺寸的定量：
如实施例7所述，将小鼠安乐死、分离主动脉弓并在石蜡中包埋。还如实施例7所述，使用苏木精和伊红(HE)对冷冻切片和石蜡切片组织学染色。病变尺寸测量为内膜面积。
坏死核心尺寸的定量，表示为面积：
在HE染色切片中分析坏死核心面积。将坏死核心(NC)尺寸定义为所形成的纤维帽下方缺少核的面积。
病变中胶原蛋白沉积的定量，表示为面积：
以70或40μm间隔，用HE分别对冷冻切片或石蜡切片组织学染色。在天狼星红染色的连续切片上评价总胶原蛋白含量，并且测量动脉粥样硬化病变中的胶原蛋白面积。
纤维帽厚度的定量：
以70或40μm间隔，用HE分别对冷冻切片或石蜡切片组织学染色。在天狼星红染色的连续切片上评价纤维帽(FC)厚度。将FC厚度定义为与正方形网格线重叠的位置中的平均长度量测。
结果
与在LCCA中的脱落物处形成的病变中的发现类似，通过F8-VEGF-C处理，主动脉弓内弧中的斑块尺寸显著减小(图12C)并且具有明显较小的坏死核心(图12D)。尽管胶原蛋白沉积未显著改变(图12E)，但是在VEGF-C处理组中观察到纤维帽厚度提高的强烈趋势(图12F)。与基线动物相比，PBS处理小鼠具有较大的病变和坏死核心(图12C-图12D)。
实施例9—F8-VEGF-C对臂头动脉中斑块的治疗效果
材料和方法
疾病模型
在这些实验中使用的ApoE KO小鼠模型如以上实施例6所述。
臂头动脉中斑块的分析
含有动脉粥样硬化斑块的LCCA的苏木精-伊红染色和病变尺寸的定量：
如实施例7所述，将小鼠安乐死、分离主动脉弓并在石蜡中包埋。还如实施例7所述，使用苏木精和伊红(HE)对冷冻切片和石蜡切片组织学染色。病变尺寸测量为内膜面积。
坏死核心尺寸、病变中胶原蛋白沉积和纤维帽厚度的定量：
如实施例8中所述，定量坏死核心尺寸、病变中胶原蛋白沉积和纤维帽厚度。
结果
与注射PBS的小鼠相比，接受F8-VEGF-C的动物中的头臂动脉中的斑块显著较小(图13C)。此外，F8-VEGF-C-治疗小鼠中存在的病变的坏死核心的尺寸显著减小(图13D)。在PBS-和F8-VEGF-C-治疗小鼠之间，在头臂动脉中未观察到病变的胶原蛋白含量(图13E)或纤维帽厚度(图13F)的显著差异。对照动物(PBS治疗的)表现出比基线小鼠显著更大的病变和坏死核心(图13C-图13D)并且往往具有较薄的纤维帽(图13F)。
实施例6至实施例9—结论
根据实施例6至实施例9中所提供的实验，可以得出以下几个结论。
小鼠中的动脉粥样硬化斑块中表达EDA。因此，F8-VEGF-C代表了VEGF-C向动脉粥样硬化病变的靶向递送的适合方法。
F8-VEGF-C处理降低了血液甘油三酯水平，并且显示出胆固醇含量降低的趋势。在动脉粥样硬化条件下，改善这些代谢参数是临床重要的。
与用PBS处理的对照小鼠相比，在所有研究位点，用F8-VEGF-C处理小鼠显著减小病变和坏死核心尺寸。此外，用F8-VEGF-C处理的小鼠中的病变还倾向于具有更厚的纤维帽，并且在围绕LCCA中的脱落物所形成的斑块中，平滑肌细胞面积显著增加。另外，这些平滑肌细胞具有降低的脂质负荷，表示它们处于更健康和良好的状态。
较小的坏死核心、更厚的纤维帽和更大数目的“健康”平滑肌细胞通常被认为对于病变稳定性，降低斑块破裂风险和后续不良心血管事件是有益的。因此，F8-VEGF-C处理使斑块稳定并且甚至能够停止和逆转病变生长。这些结果表明了F8-VEGF-C在动脉粥样硬化环境中的治疗潜能。
本领域中熟知动脉粥样硬化是非常难治疗的疾病。动脉粥样硬化的标准疗法基于抑制素的施用，其能够减缓动脉粥样硬化的发展，但是不能实现疾病的消退。
意外地，仅在5次注射后，F8-VEGF-C减小了动脉粥样硬化病变的尺寸并且改善了斑块稳定性。
明显地，可以在所有所研究的三个所关心的位点观察到这些变化。考虑到短的疗法持续时间和动脉粥样硬化本身难以治疗的性质，整体结果是意外的。
序列表
F8-VEGF-C融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
F8(双体抗体)-VEGF-C(CDR加下划线，连接F8的VH结构域和VL结构域的接头以斜体显示并加下划线，将F8连接至VEGF-C的接头加粗显示并加下划线，VEGF-C加粗显示)
F8-VEGF-C156Ser融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
F8(双体抗体)-VEGF-C156Ser(CDR加下划线，连接F8的VH结构域和VL结构域的接头以斜体显示并加下划线，将F8连接至VEGF-C的接头加粗显示并加下划线，VEGF-C加粗显示且156Ser加粗显示并加下划线和斜体)
F8 VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
将F8 VH结构域连接至F8 VL结构域的双体抗体接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
GGSGG
F8 VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
F8双体抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
F8抗体的VH结构域和VL结构域CDR加下划线。接头序列加粗显示并加下划线。
F8 CDR的氨基酸序列
F8 CDR1 VH–LFT(SEQ ID NO:7)
F8 CDR2 VH–SGSGGS(SEQ ID NO:8)
F8 CDR3 VH–STHLYL(SEQ ID NO:9)
F8 CDR1 VL–MPF(SEQ ID NO:10)
F8 CDR2 VL–GASSRAT(SEQ ID NO:11)
F8 CDR3 VL–MRGRPP(SEQ ID NO:12)
F8-VEGF-C融合蛋白中人ΔNΔCVEGF-C的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
AHYNTEILKSIDNEWRKTQCMPREVCIDVGKEFGVATNTFFKPPCVSVYRCGGCCNSEGLQCMNTSTSYLSKTLFEITVPLSQGPKPVTISFANHTSCRCMSKLDVYRQVHSIIRR
(i)将F8 VL结构域连接至F8-VEGF-C融合蛋白中的ΔNΔCVEGF-C或者(ii)将F8 VL结构域连接至F8-VEGF-C156Ser融合蛋白中的ΔNΔCVEGF-C156Ser的接头的氨基酸序列 (SEQ ID NO:14)
SSSSGSSSSGSSSSG
F8-VEGF-C156Ser融合蛋白中人ΔNΔCVEGF-C156Ser的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)
AHYNTEILKSIDNEWRKTQCMPREVCIDVGKEFGVATNTFFKPPSVSVYRCGGCCNSEGLQCMNTSTSYLSKTLFEITVPLSQGPKPVTISFANHTSCRCMSKLDVYRQVHSIIRR
KSF-VEGF-C融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)
接头序列加下划线。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPKVSLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSPLNRLAVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGAHYNTEILKSIDNEWRKTQCMPREVCIDVGKEFGVATNTFFKPPCVSVYRCGGCCNSEGLQCMNTSTSYLSKTLFEITVPLSQGPKPVTISFANHTSCRCMSKLDVYRQVHSIIRR
人VEGF-D的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu GluTrp Gln Arg Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu LeuGly Lys Ser Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys GlyGly Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Ile SerLys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro ValLys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro TyrSer Ile Ile Arg Arg
L19 CDR的氨基酸序列
L19 CDR1 VH-Ser Phe Ser Met Ser(SEQ ID NO:18)
L19 CDR2 VH-Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp SerVal Lys Gly(SEQ ID NO:19)
替代的L19 CDR2 VH-Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys(SEQ ID NO:38)
L19 CDR3 VH-Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr(SEQ ID NO:20)
L19 CDR1 VL-Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala(SEQ IDNO:21)
L19 CDR2 VL-Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr(SEQ ID NO:22)
L19 CDR3 VL-Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr(SEQ ID NO:23)
L19 VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser Met Ser TrpVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser SerGly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AsnSer Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ValThr Val Ser Ser
L19 VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala TrpTyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser ArgAla Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr LeuThr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr GlyArg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
L19双体抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
VH结构域和VL结构域接头序列加下划线显示。
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser Met Ser TrpVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser SerGly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AsnSer Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ValThr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly ThrLeu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser ValSer Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuIle Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser GlySer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala ValTyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys ValGlu Ile Lys
F16 CDR的氨基酸序列
F16 CDR1 VH–RYGMS(SEQ ID NO:27)
F16 CDR2 VH–AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:28)
F16 CDR3 VH–AHNAFDY(SEQ ID NO:29)
F16 CDR1 VL–QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO:30)
F16 CDR2 VL–GKNNRPS(SEQ ID NO:31)
F16 CDR3 VL–NSSVYTMPPVV(SEQ ID NO:32)
F16 VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSR
F16 VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
F16 VL结构域的替代氨基酸序列(SEQ ID NO:39)
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVL
F16双体抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
VH结构域和VL结构域接头序列加下划线显示。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
F16双体抗体的替代氨基酸序列(SEQ ID NO:40)
VH结构域和VL结构域接头序列加下划线显示。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVL
scFv分子中的VH结构域和VL结构域接头序列(SEQ ID NO:36)
GGGSGGGSGG
scFv分子中的VH结构域和VL结构域接头序列(SEQ ID NO:37)
GGGGSGGGGSGGGG
序列表
<110> 菲洛根股份公司(Philogen S.P.A.)
<120> 血管内皮生长因子/抗纤连蛋白抗体融合蛋白
<130> TEK/FP7363872
<150> GB1709080.4
<151> 2017-06-07
<150> GB1716594.5
<151> 2017-10-10
<160> 40
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8-VEGF-C融合蛋白
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
115 120 125
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser
245 250 255
Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys
260 265 270
Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys
275 280 285
Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu
290 295 300
Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile
325 330 335
Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val
340 345 350
Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg
355 360
<210> 2
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8-VEGF-C156Ser融合蛋白
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
115 120 125
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser
245 250 255
Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys
260 265 270
Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys
275 280 285
Pro Pro Ser Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu
290 295 300
Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile
325 330 335
Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val
340 345 350
Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg
355 360
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 VH结构域
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 将F8 VH结构域连接至F8 VL结构域的双体抗体接头
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 VL结构域
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8双体抗体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
115 120 125
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
130 135 140
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
165 170 175
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR1 VH
<400> 7
Leu Phe Thr
1
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR2 VH
<400> 8
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR3 VH
<400> 9
Ser Thr His Leu Tyr Leu
1 5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR1 VL
<400> 10
Met Pro Phe
1
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR2 VL
<400> 11
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F8 CDR3 VL
<400> 12
Met Arg Gly Arg Pro Pro
1 5
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> F8-VEGF-C 融合蛋白中的智人（Homo sapiens） ΔNΔCVEGF-C
<400> 13
Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg
1 5 10 15
Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu
20 25 30
Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val
35 40 45
Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn
50 55 60
Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro
65 70 75 80
Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr
85 90 95
Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser
100 105 110
Ile Ile Arg Arg
115
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头，将：(i)F8 VL结构域连接至F8-VEGF-C融合蛋白中的ΔNΔCVEGF-C，或
(ii)F8 VL结构域连接至F8-VEGF-C156Ser融合蛋白中的ΔNΔCVEGF-C156Ser
<400> 14
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> F8-VEGF-C156Ser融合蛋白中的智人（Homo sapiens） ΔNΔCVEGF-C156Ser
<400> 15
Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg
1 5 10 15
Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu
20 25 30
Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Ser Val Ser Val
35 40 45
Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn
50 55 60
Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro
65 70 75 80
Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr
85 90 95
Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser
100 105 110
Ile Ile Arg Arg
115
<210> 16
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KSF-VEGF-C融合蛋白
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Pro Lys Val Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Leu Thr Gln
115 120 125
Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys
130 135 140
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
145 150 155 160
Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro
165 170 175
Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala
180 185 190
Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
195 200 205
Cys Asn Ser Ser Pro Leu Asn Arg Leu Ala Val Val Phe Gly Gly Gly
210 215 220
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser
245 250 255
Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys
260 265 270
Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys
275 280 285
Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu
290 295 300
Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile
325 330 335
Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val
340 345 350
Tyr Arg Gln Val His Ser Ile Ile Arg Arg
355 360
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens） VEGF-D
<400> 17
Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu
1 5 10 15
Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val
20 25 30
Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys
35 40 45
Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile
50 55 60
Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile
65 70 75 80
Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala
85 90 95
Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr
100 105 110
Ser Ile Ile Arg Arg
115
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR1 VH
<400> 18
Ser Phe Ser Met Ser
1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR2 VH
<400> 19
Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR3 VH
<400> 20
Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR1 VL
<400> 21
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR2 VL
<400> 22
Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 CDR3 VL
<400> 23
Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 VH结构域
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19 VL结构域
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L19双体抗体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
130 135 140
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg
165 170 175
Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Lys Val Glu Ile Lys
225
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR1 VH
<400> 27
Arg Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR2 VH
<400> 28
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR3 VH
<400> 29
Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR1 VL
<400> 30
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR2 VL
<400> 31
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 CDR3 VL
<400> 32
Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val
1 5 10
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 VH结构域
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg
115
<210> 34
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16 VL结构域
<400> 34
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 35
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F16双体抗体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
115 120 125
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln
130 135 140
Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
165 170 175
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
180 185 190
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
195 200 205
Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv分子中的VH和VL结构域接头序列
<400> 36
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv分子中的VH和VL结构域接头序列
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替代的L19 CDR2 VH
<400> 38
Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替代的F16 VL结构域
<400> 39
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 40
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可替代的F16双体抗体
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
115 120 125
Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln
130 135 140
Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
165 170 175
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
180 185 190
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
195 200 205
Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Thr Val Leu
225

Claims (13)

1.一种缀合物，包含：
(i)双体抗体，其结合纤连蛋白的额外结构域-A(ED-A)，和
(ii)血管内皮生长因子C(VEGF-C)；
其中所述缀合物由SEQ ID NO:1或者2中所示的序列组成。
2.一种编码根据权利要求1所述的缀合物的核酸分子。
3.一种包含根据权利要求2所述的核酸分子的表达载体。
4.一种包含根据权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。
5.一种产生根据权利要求1所述的缀合物的方法，所述方法包括在用于表达所述缀合物的条件下培养根据权利要求4所述的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，还包括在表达后分离和/或纯化所述缀合物。
7.根据权利要求1所述的缀合物在制备用于治疗患者中的炎性疾病或病症的药物中的应用，其中所述炎性疾病或病症的特征在于淋巴管生成。
8.根据权利要求1所述的缀合物在制备用于将VEGF-C递送至患者中的炎性疾病或病症位点的药物中的应用，其中所述炎性疾病或病症的特征在于淋巴管生成。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中所述炎性疾病选自由以下各项组成的组：银屑病、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述炎性疾病是动脉粥样硬化。
11.根据权利要求9所述的应用，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎。
12.根据权利要求9所述的应用，其中所述炎性疾病是银屑病。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的应用，其中通过静脉注射将所述缀合物施用于所述患者。
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