CN110981992A

CN110981992A - 一种注射剂用透明质酸的制备方法

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Publication number: CN110981992A
Application number: CN201911372729.0A
Authority: CN
Inventors: 郭学平; 杨桂兰; 栾贻宏; 刘爱华; 石艳丽; 耿凤; 阚洪玲
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110981992B

Abstract

本发明提供了一种注射剂用透明质酸或其盐的制备方法，包括以下步骤：向终点发酵液中加入乙醇得HA粗品沉淀；再溶解，较低浓度下过滤，向滤液中加入乙醇，得到精制HA沉淀。将沉淀再次溶解，较低浓度下调pH调至6.0‑7.0，过极性吸附树脂柱，再将流出液pH调至5.0‑6.0，过非极性吸附树脂柱，然后过0.2μm滤芯，再加入乙醇进行沉淀，然后脱水、干燥，得注射剂用HA。本发明的方法采用低浓度、多次精制的方法，并结合树脂串联技术有效降低了注射剂用HA产品的杂质，尤其是内毒素降低至当前标准的1/20‑1/10，提高了注射剂用HA的安全性。本发明的方法广泛适用于大生产使用。

Description

一种注射剂用透明质酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种制备医用透明质酸的方法，具体涉及一种特定pH下树脂串联技术制备注射剂用透明质酸的纯化工艺。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid)又名玻璃酸，简称HA，化妆品及食品领域称其透明质酸，在医药领域应用称为玻璃酸或玻尿酸，常用形式为钠盐，故称透明质酸钠或玻璃酸钠，HA具有润滑、保湿、黏弹性、修复组织创伤、提高机体免疫力和药物靶向载体等生物活性不断被开发和利用，可用于美容填充、关节注射液、眼科手术粘弹剂，外科手术防粘连、止血等功效，在医药领域展现出广阔的应用前景。

未精制透明质酸含有内毒素，目前，欧洲药典注射剂用HA的内毒素标准≤0.05EU/mg，国内注射剂用HA的内毒素标准≤0.03EU/mg。内毒素是引起患者不明原因发热的重要原因之一，因此注射剂或其他体内医用材料的内毒素不仅要符合标准，还要越低越好，以最大程度上减少临床不良反应的发生，这对相应的原料药的纯度提出了更高的要求。

目前，透明质酸的提纯大多采用活性炭吸附和树脂吸附两种方式。

树脂有三种类型：离子交换树脂、大孔吸附树脂和螯合树脂，不同类型的树脂原理不同：离子交换树脂中树脂表面结合有阳离子或阴离子，当物质通过树脂时，会有离子交换发生，可用于不同离子形式的转型，如将钠型转为H⁺型或其他离子型。大孔吸附树脂具有多孔性、高比表面积的特点，不含离子交换基团。对HA中的杂质微粒具有吸附作用，而对HA的吸附力弱。因此适合用于HA纯化工艺。如，CN 102030837 A一种纯化浓缩透明质酸钠发酵液方法，公开了一种将透明质酸钠发酵液先经过树脂吸附和空气搅拌去除杂质纯化方法，虽然蛋白质含量较低、但内毒素含量仍然偏高。

CN 1675352 A生产透明质酸的微生物及透明质酸的纯化方法，公开了一种纯化透明质酸的方法，使用芳族吸附树脂和活性炭纯化透明质酸的方法。然而，活性炭吸附工艺最大的缺点是活性炭粉末中有少量细小颗粒，不容易被过滤介质拦截，即使0.2μm的滤膜都不能完全截留，造成少量细小活性炭粒子随滤液进入产品，用乙醇沉淀时残留在HA产品中，引入了新的杂质。

由此可见，需要开发一种能够有效降低透明质酸类产品中内毒素含量、提高纯度的方法，以进一步提高注射剂用透明质酸类产品的安全性。

发明内容

为进一步降低透明酸质类产品中内毒素含量，本发明提供一种降低处理料液浓度、多次精制并结合特定pH下树脂串联技术纯化透明质酸的方法，制备的产品中内毒素含量为国际标准的1/20至1/10，大大提高了注射剂用HA原料的安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种注射剂用透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

（1）向HA终点发酵液中加入乙醇进行沉淀，静置分层，沉淀即为HA粗品；

（2）将HA粗品用水溶解，然后过滤，收集滤液，再用乙醇沉淀，将沉淀脱水、干燥，得精制HA；

（3）精制HA用水溶解，并将pH调至6.0-7.0，过极性大孔吸附树脂柱，获得流出液1；

（4）将流出液1的pH调至5.0-6.0，过非极性大孔吸附树脂柱，获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集滤液，再用乙醇沉淀，将沉淀脱水、干燥，得注射剂用HA。

步骤（1）、（2）、（5）中，所述乙醇的体积浓度为90%-100%（v/v），优选为92%-95%（v/v）。

步骤（1）中，所述发酵液和乙醇的体积比为1:1.5-2.0。

步骤（2）中，HA粗品溶解后的浓度为0.2-1.0g/L。

步骤（2）中，所述过滤过程为以硅藻土或珍珠岩为助滤剂。

步骤（2）和（5）中，所述滤液和乙醇的体积比为1:1.5-2.0。

步骤（2）和（5）中沉淀脱水可以采用有机溶剂夹带法。所述有机溶剂为体积浓度90%-100%（v/v），优选为92%-95%（v/v）。

步骤（3）中，所述精制HA的溶解浓度为0.2-1.0g/L。

步骤（3）和（4）中，过柱条件为：柱温20-50℃，流速0.1-3.0BV/h，优选为0.2-3.0BV/h。

步骤（3）中，所述极性大孔吸附树脂包括极性树脂和中极性树脂。极性树脂是以苯乙烯为单体二乙烯苯为交联剂合成的含酰胺、硫氧、氮氧、氰基等功能团的一类树脂；优选含有酰胺、硫氧基团；型号包括但不限于XDA-8。中极性树脂是以苯乙烯为单体，以丙烯酸酯为交联剂合成的一类树脂；型号包括但不限于HPD-400。

步骤（4）中，所述非极性树脂选自苯乙烯为单体合成的一类树脂；型号包含但不限于D-101。

所述步骤（3）和步骤（4）的顺序可调换。

一种上述制备方法获得的透明质酸。所述透明质酸产品中含量大于99.5wt%，蛋白含量≤0.01wt %，内毒素≤0.0025EU/mg。

本发明所述的透明质酸，简称为HA，是透明质酸的羧基结合各种阳离子的物质的总称，阳离子包括但不限于氢离子、钠离子、锌离子、钙离子。

本发明具有以下优点：

原有的生产注射剂用HA的技术，一般采用处理浓度1.0g/L-3.0g/L的浓度，由于HA本身黏度高，不利于杂质的去除，本发明降低料液浓度，黏度会随之降低，有利于去除杂质，同时本发明采用多次精制的方式，并确定了树脂吸附的特定pH及特定的树脂类型，本发明方法能有效去除蛋白质、多肽、核酸及内毒素等杂质。本专利制备的HA产品，含量可以到达99.5wt%以上，蛋白含量≤ 0.01wt%，内毒素≤ 0.0025EU/mg。同时，吸附树脂可再生，经处理后可重复使用，降低了成产成本。由于采用树脂柱，操作在密闭系统中进行，减少外界污染，本发明的方法广泛适用于大规模生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

如无特殊说明，本发明各实施例中的树脂采用以下前处理方法：首先用蒸馏水充分洗涤树脂，除去表面杂质，再用90%-95%（v/v）乙醇浸泡24h，使树脂充分溶胀。弃去乙醇，用蒸馏水冲洗至树脂无醇味，然后用4%HCl溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，再用4%NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，装柱备用。

实施例1

（1）向HA终点发酵液中加入2.0体积倍的90%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（2）将HA粗品用纯化水溶解为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L的溶液，然后以珍珠岩为助滤剂过滤，收集滤液，再用1.5体积倍的90%（v/v）乙醇进行沉淀，以90%（v/v）乙醇脱水，真空干燥后得精制HA；

（3）精制HA以注射水溶解为0.2 g/L的溶液，以HCl溶液将pH调至6.0，20℃下控制流速3.0BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液1；

（4）以HCl溶液将流出液1的pH调至5.1，20℃下控制流速3.0BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用1.5体积倍的90%（v/v）乙醇进行沉淀，以90%（v/v）乙醇脱水3次，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。

以硫酸咔唑法测葡糖醛酸含量，测定530nm处的吸光度值A₅₃₀，计算获得的样品中透明质酸钠的含量；以福林-酚法测定蛋白质含量；以光度法测定内毒素含量；结果如表1所示。

表1 不同注射剂用透明质酸钠的含量和杂质含量

根据表1数据可知，当HA粗品溶解浓度为0.1-1.0 g/L时，获得的终产品的含量均在99.5wt%以上，蛋白含量也小于0.01wt%，内毒素能够控制在0.0025EU/mg以下。当HA粗品的溶解浓度超过1.0 g/L时，HA含量降低、蛋白含量和内毒素指标超出预期。

实施例2

（1）向HA终点发酵液中加入1.5体积倍的95%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（2）将HA粗品用纯化水溶解为0.3g/L的溶液，然后以硅藻土为助滤剂过滤，收集滤液，再用2.0体积倍的95%（v/v）乙醇进行沉淀，以无水乙醇脱水，真空干燥后得精制HA；

（3）将精制HA以注射用水分别溶解为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L的溶液，以NaOH溶液将pH调至6.5，35℃下控制流速1.5BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液1；

（4）以HCl溶液将流出液1的pH调至5.6，35℃下控制流速1.5BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用2.0体积倍的95%（v/v）乙醇进行沉淀，以无水乙醇3次脱水，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。

以硫酸咔唑法测葡糖醛酸含量，测定530nm处的吸光度值A₅₃₀，计算获得的样品中透明质酸钠的含量；以福林-酚法测定蛋白质含量；以光度法测定内毒素含量；结果如表2所示。

表2 不同注射剂用透明质酸钠的含量和杂质含量

根据表2数据可知，当精制HA的溶解浓度为0.2-1.0 g/L时，获得的终产品的含量均在99.5wt%以上，蛋白含量也小于0.01wt%，内毒素的含量能够控制在0.0025EU/mg以下。精制HA的溶解浓度超过1.0 g/L时，含量降低、内毒素含量升高，各项指标低于预期值。

实施例3

（1）向HA终点发酵液中加入1.7体积倍的98%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（2）将HA粗品用纯化水溶解为1.0 g/L的溶液，然后以硅藻土为助滤剂过滤，收集滤液，再用1.5体积倍的98%（v/v）乙醇进行沉淀，以98%（v/v）乙醇脱水，真空干燥后得精制HA；

（3）精制HA以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，以NaOH溶液将pH调至7.0，25℃下控制流速0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5BV/h过中极性大孔吸附树脂柱（填料：HPD-400），获得流出液1；

（4）以HCl溶液将流出液1的pH调至6.0，25℃下控制流速0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用1.8体积倍的98%（v/v）乙醇进行沉淀，将沉淀用98%（v/v）乙醇脱水5次，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。

以硫酸咔唑法测葡糖醛酸含量，测定530nm处的吸光度值A₅₃₀，计算获得的样品中透明质酸钠的含量；以福林-酚法测定蛋白质含量；以光度法测定内毒素含量；结果如表3所示。

表3 不同注射剂用透明质酸钠的含量和杂质含量

根据表3数据可知，HA溶液的过柱的流速为0.1-3.0 BV/h时，获得的终产品的含量均在99.5wt%以上，蛋白含量也小于0.01wt%，内毒素的含量能够控制在0.0025EU/mg以下。HA溶液2次过柱时，任何一次流速超过3.5 BV/h时，HA含量降低、内毒素含量升高。

实施例4

（1）向HA终点发酵液中加入2体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（2）将HA粗品用纯化水溶解为0.6 g/L的溶液，然后以硅藻土为助滤剂过滤，收集滤液，再用1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，以94%（v/v）乙醇3次脱水，真空干燥后得精制HA；

（3）精制HA以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，以HCl溶液或NaOH溶液将pH调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，30℃下控制流速1.0BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液1；

（4）以HCl溶液或NaOH溶液将流出液1的pH调至5.6，30℃下控制流速1.0BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用2.0体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，将沉淀用94%（v/v）乙醇脱水，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。

表4 不同pH值下过极性吸附树脂柱对产品质量的影响

可见，过极性树脂柱的pH对含量和内毒素指标影响不大，但影响蛋白含量。

实施例5

（1）向HA终点发酵液中加入1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（3）精制HA以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，以NaOH溶液将pH调至6.8，30℃下控制流速1.0BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液1；

（4）以HCl溶液或NaOH溶液将流出液1的pH调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，30℃下控制流速1.0BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，将沉淀用94%（v/v）乙醇脱水，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。测定产品质量。

表5 不同pH值下过非极性吸附树脂柱对产品质量的影响

过非极性树脂柱的pH对含量和内毒素指标影响不大，但影响蛋白含量。

实施例6

（1）向HA终点发酵液中加入2.0体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，静置分层，分离上清液，得HA粗品沉淀；

（2）将HA粗品用纯化水溶解为0.6 g/L的溶液，然后以珍珠岩为助滤剂过滤，收集滤液，再用1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，以94%（v/v）乙醇3次脱水，真空干燥后得精制HA；

（3）精制HA以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，以HCl溶液将流出液1的pH调至5.6，30℃下控制流速1.0BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液1；

（4）以NaOH溶液将pH调至6.8，30℃下控制流速1.0BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液2；

（5）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，将沉淀用94%（v/v）乙醇的脱水，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。经测定，其含量99.5wt%，蛋白含量0.008wt%，内毒素＜0.0025EU/mg。

对比例1 不用树脂吸附

（3）精制HA以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，过0.2μm滤芯、收集滤液，然后用1.5体积倍的94%（v/v）乙醇进行沉淀，将沉淀用94%（v/v）的乙醇脱水，真空干燥后得透明质酸钠。经测定，其含量94.6wt%，蛋白含量0.21wt%，内毒素0.25EU/mg。

对比例2 一步精制

（2）将HA粗品以注射用水溶解为0.2 g/L的溶液，以HCl溶液将pH调至6.8，30℃下控制流速1.0BV/h过极性大孔吸附树脂柱（填料：XDA-8），获得流出液1；

（3）以HCl溶液将流出液1的pH调至5.6，30℃下控制流速1.0BV/h过非极性大孔吸附树脂柱（填料：D-101），获得流出液2；

（4）将流出液2过0.2μm滤芯，收集精滤液，再用1.5体积倍的94%（v/v）的乙醇进行沉淀，将沉淀用94%（v/v）乙醇脱水，真空干燥后得注射剂用透明质酸钠。经测定，其含量95.5wt%，蛋白含量0.16wt%，内毒素0.25EU/mg。

Claims

1.一种注射剂用透明质酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）向透明质酸终点发酵液中加入乙醇进行沉淀，静置分层后，沉淀即为透明质酸粗品；

（2）将透明质酸粗品用水溶解，然后过滤，收集滤液，再用乙醇沉淀，将沉淀脱水、干燥，得精制透明质酸；

（3）将精制透明质酸用水溶解，并将pH调至6.0-7.0，过极性大孔吸附树脂柱，获得流出液1；

（5）将流出液2过滤，收集滤液，再用乙醇沉淀，将沉淀脱水、干燥，得注射剂用透明质酸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸是指其羧基结合各种阳离子的形式；所述阳离子优选为氢离子、钠离子、锌离子和钙离子。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述透明质酸粗品溶解后的浓度为0.2-1.0g/L；步骤（3）中，所述精制透明质酸的溶解浓度为0.2-1.0g/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述极性大孔吸附树脂包括极性树脂和中极性树脂；所述极性树脂是以苯乙烯为单体二乙烯苯为交联剂合成的含酰胺、硫氧、氮氧、氰基功能团的树脂；优选酰胺、硫氧基团；所述中极性树脂是以苯乙烯为单体，以丙烯酸酯为交联剂合成的树脂；

步骤（4）中，所述非极性大孔树脂选自苯乙烯为单体合成的树脂。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中，过柱条件为：柱温20-50℃，流速0.1-3.0BV/h，优选为0.2-3.0 BV/h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）的顺序可调换。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（5）中，所述乙醇的体积浓度为90%-100%；

步骤（1）中，所述发酵液和乙醇的体积比为1:1.5-2.0；步骤（2）和（5）中，所述滤液和乙醇的体积比为1:1.5-2.0。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和（5）中沉淀脱水采用有机溶剂夹带法；所述有机溶剂为体积浓度90%-100%的乙醇。

9.一种如权利要求1-8任一制备方法获得的透明质酸，其特征在于，所述透明质酸产品蛋白含量≤0.01 wt %，内毒素≤0.0025EU/mg。