CN110974822A

CN110974822A - 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的制药用途

Info

Publication number: CN110974822A
Application number: CN201911259794.2A
Authority: CN
Inventors: 毕洪凯; 黄衍强
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN110974822B

Abstract

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的制药用途，本发明为了提高难治性胃炎的治疗效果，提供一种吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）的医药用途，发现了PDTC在治疗幽门螺杆菌感染中的作用，且“奥美拉唑138.2mg/kg，PDTC 28mg/kg”在小鼠体内抑菌效果较好，该化合物在体内和体外对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用。

Description

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的制药用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的制药用途。

背景技术

目前人群幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染率约为50％-60％，Hp感染可以导致胃、十二指肠溃疡、胃炎和胃癌等疾病，并与肝癌、糖尿病等疾病相关。现在世界卫生组织推荐Hp感染的治疗方案是三联或四联疗法。三联是同时服用质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)；四联是铋剂(枸橼酸铋钾等)加质子泵抑制剂(奥美拉唑等)再加两种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)。随着抗生素的长期使用，Hp对抗生素产生不同程度的耐药，三联或四联疗法的根治失败率越来越高，急性胃炎演变成慢性胃炎或难治性胃炎的机率越来越高。因此，寻找具有高效、安全的治疗药物或治疗方法已经成为当前解决耐药性问题非常重要的途径和策略。本发明涉及治疗幽门螺杆菌感染的一种化合物，未见有相同药效作用的报道，该化合物安全、有效、成本低、副反应少；而且该方法对耐药性幽门螺杆菌有比较特异性的抑制作用，对难治性胃溃疡、胃炎有较好的治疗作用，其用途属于首次公开。

发明内容

解决的技术问题：本发明为了提高难治性胃炎的治疗效果，提供一种吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)的制药用途，发现了PDTC在治疗幽门螺杆菌感染中的作用，且“奥美拉唑138.2mg/kg，PDTC 28mg/kg”在小鼠体内抑菌效果较好，该化合物在体内和体外对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较好的抑制作用。

技术方案：吡咯烷二硫代氨基甲酸铵在制备治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用。

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的给药浓度为28mg/kg。

上述技术方案还包括奥美拉唑138.2mg/kg，

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵在制备体外抑制治疗幽门螺杆菌药物中的应用。

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵对不同幽门螺杆菌菌株的最低抑菌浓度为0.5～4μg/mL。

吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和奥美拉唑的组合物在制备治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用。

治疗幽门螺杆菌感染药物，组分为吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和奥美拉唑。

有益效果：本发明发现的PDTC可用于治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染导致的急、慢性胃炎、胃、十二脂肠溃疡等疾病，而且毒副作用小、医疗费用低，能有效缓解幽门螺杆菌耐药性问题。

附图说明

图1为PDTC在小鼠体内对幽门螺杆菌的抑制作用。设耐药幽门螺杆菌感染后的PBS治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+阿莫西林(28mg/kg)+克拉霉素治疗组(14mg/kg)、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(28mg/kg)治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(7mg/kg)治疗组。

图2为PDTC对耐药幽门螺杆菌感染的小鼠胃粘膜炎症的修复作用。胃粘膜分别进行HE染色和TUNEL染色，放大100倍；设正常对照组，耐药幽门螺杆菌感染后的PBS治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+阿莫西林(28mg/kg)+克拉霉素治疗组(14mg/kg)、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(28mg/kg)治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(7mg/kg)治疗组。

图3为PDTC对耐药幽门螺杆菌感染的小鼠炎症因子的抑制作用。用ELISA方法分别检测了A:IL-1β、B:IL-6、C:IL-8、D:TNF-α；设正常对照组，耐药幽门螺杆菌感染后的PBS治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+阿莫西林(28mg/kg)+克拉霉素治疗组(14mg/kg)、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(28mg/kg)治疗组、奥美拉唑(138.2mg/kg)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(7mg/kg)治疗组。

图4为PDTC体内10倍治疗量(280mg/kg)对小鼠组织器官的损伤情况；胃、肝、脾、肾组织分别进行HE染色，放大100倍；设PBS给药对照组和10倍治疗剂量组。

图5为PDTC体内10倍治疗量对小鼠体重的影响。设PBS给药组和10倍治疗剂量组。

具体实施方式

实施例1

第一，体外抑菌：用液体稀释法检测PDTC对耐药性和敏感性幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为0.5～4μg/mL。

第二，体内治疗：用幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎模型，每天灌胃给药胃炎小鼠1次，连续给药3次，每次给药量分别是奥美拉唑138.2mg/kg、PDTC 28mg/kg，幽门螺杆菌在小鼠体内定植量下降10³以上，胃粘膜损伤明显好转，炎症因子明显降低，其它脏器未见有损伤，体重无明显变化。

实施例2

第二，体内治疗：用幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎模型，每天灌胃给药胃炎小鼠1次，连续给药3次，每次给药量分别是奥美拉唑138.2mg/kg、PDTC 7mg/kg，幽门螺杆菌在小鼠体内定植量明显下降，胃粘膜损伤好转，炎症因子降低，其它脏器未见有损伤，体重无明显变化。

本发明PDTC对幽门螺杆菌的抑制作用通过如下实施例进一步详细的说明

1.材料

1.1药品

奥美拉唑肠溶胶囊(广东逸舒制药股份有限公司，产品批号20180433)，PDTC(MCE公司，Cat.No.:HY-18738)

1.2菌株

标准菌株26695、菌株NSH57、G27；临床甲硝唑耐药菌株、克拉霉素耐药菌株、左氧氟沙星耐药菌株、左氧氟沙星和甲硝唑耐药菌株、克拉霉素和甲硝唑耐药菌株、左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药菌株(由本实验室从临床患者胃粘膜样本分离培养获得)。

1.3培养基和主要试剂：哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基、选择性抗生素(万古霉素、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶)、血清、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素、革兰氏染色液、细菌基因组DNA提取试剂盒、幽门螺杆菌16SrRNA特异性引物。

1.4实验动物：6-8周龄雌性C57BL/6。

1.5主要仪器：二氧化碳培养箱、离心机、组织破碎仪、电子天平、灌胃针、剪刀等。

1.6耗材：EP管、Tip头、离心管等。

2.方法与结果

2.1体外抑菌，检测PDTC对幽门螺杆菌和非幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)。

(1)配备PDTC，4mg/mL。

(2)MIC板制备第一孔先加培养基173.6μL，再加6.4μL抗菌药物，倍比稀释至第10孔；第11孔不加药，保留90μL培养基，作为加菌不加药阳性对照，第12孔不加菌，验证培养基和药是否污染。

(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用BHI培养基制作成菌悬液，调整浓度OD₆₀₀为0.3(1×10⁸CFU/mL)，稀释10倍，为1×10⁷CFU/mL，备用。

(4)接种菌液取10μL加至第1-10孔(每孔菌液浓度约为1.0×10⁶CFU/mL)。培养72h判断结果。第1孔至第10孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL。

(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔第11孔(即不含抗生素)内细菌明显生长和第12孔(无菌)不生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。

(6)结果：结果见表1。

表1 PDTC对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MICμg/mL)

2.2体内治疗，构建动物模型体内检测PDTC对幽门螺杆菌的抑制效果。

2.2.1药物：奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素、PDTC均溶解稀释为10mg/mL。

2.2.2菌株：对左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药的菌株(由本实验室从临床患者胃粘膜样本分离培养获得)。

2.2.3动物造模：

(1)动物分组：将60只小鼠随机分出15只为阴性对照组，其余45只为感染组。对各组小鼠称重，计算平均体重。

(2)小鼠灌胃：45只感染组小鼠灌胃前12个小时禁食，然后用BHI配制的左氧氟沙星和克拉霉素及甲硝唑多重耐药菌株菌液灌胃，菌液浓度为OD₆₀₀为3(1×10⁹CFU/mL)，每只小鼠给予0.5mL，灌完后禁食禁水4个小时。隔天灌胃1次，连续灌5次。

(3)模型检查：末次灌胃后14天，对感染组和对照组小鼠称重，计算平均体重。随机取3只感染组小鼠禁食12小时后，断颈处死，解剖取小鼠胃，一部分胃组织保存在福尔马林中做病理检查；另一部分胃组织称重、匀浆后稀释10、100、1000倍，用接种环均匀涂布在含有10％血清的哥伦比亚培养基平板上,置于三气培养箱(10％CO₂、5％O₂、85％N₂)培养72-96h，观察培养基上细菌菌落特点，计算针尖样大小的透明菌落数量。

(4)菌株鉴定：从培养物中取针尖样大小的透明菌落进行革兰氏染色镜检；提取细菌DNA，用幽门螺杆菌16SrDNA特异性引物，PCR扩增，扩增产物以1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；胃组织进行石蜡切片并做HE染色检查。

(5)检查和鉴定结果：每只小鼠胃组织定植量范围为1×10⁵～1×10⁷CFU/g；

经HE染色检查胃粘膜病理损伤，发现有胃粘膜炎症细胞聚集，局部有粘膜有糜烂；经革兰氏染色检查培养物具有典型的幽门螺杆菌形态；经PCR扩增鉴定为幽门螺杆菌，结果汇总见表2，可以证明造模已成功。

表2造模小鼠验证

2.2.4药物治疗效果观察：

(1)动物分组：实验组将造模成功的感染组平均分成4组，分别为PBS治疗组、三联用药治疗组、PDTC 28mg/kg组、PDTC 7mg/kg组，每组10只；未感染幽门螺杆菌的10只小鼠为阴性对照组。

(2)动物给药：实验组灌胃给药，有奥美拉唑的组先给予奥美拉唑，30min后再给其它药物，给完药物后禁食禁水2小时；每天给药1次，连续3次，小鼠体重按照平均20g/只计算；三联用药组给药量为奥美拉唑138.2mg/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg，PDTC 28mg/kg组为奥美拉唑138.2mg/kg、PDTC 28mg/kg；PDTC 7mg/kg组为奥美拉唑138.2mg/kg、PDTC 7mg/kg；阴性对照组给PBS液，容量、次数同上。

(3)药效检测：停药后第3天感染组的小鼠称重并计算平均体重，行断颈处死，取胃组织，H.pylori的分离培养和鉴定同2.2.3(3)、(4)、(5)。

(4)治疗效果:PDTC 28mg/kg组优于三联治疗组(奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素)(P<0.05)，幽门螺杆菌胃内定植量显著降低如图1，胃粘膜修复明显好转如图2，炎症因子明显下降如图3。

2.3 PDTC的毒性检测

2.3.1动物毒性

(1)准备小鼠：20只8周龄C57BL/6雌性小鼠，随机分为10只为给药组，10只为阴性对照组。

(2)灌胃给药：10倍PDTC治疗量给药，即每只小鼠280mg/kg给药，连续3天，每天给药1次；阴性对照组给PBS液，次数和量同给药组。

(3)称量体重：从给药前1天开始称小鼠体重，连续称量7天。

(4)药效检测：停药后第3天感染组的小鼠称重并计算平均体重，行脱臼断颈处死，取胃、肾、肝和脾组织，做病理切片并进行HE染色。

(5)结果:10倍PDTC治疗量给药组和阴性对照组小鼠的胃、肾、肝和脾组织未见有损伤，如图4；实验组小鼠体重未见有明显变化，如图5。

Claims

1.吡咯烷二硫代氨基甲酸铵在制备治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于吡咯烷二硫代氨基甲酸铵的给药浓度为28mg/kg。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于还包括奥美拉唑138.2 mg/kg，

4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于吡咯烷二硫代氨基甲酸铵对幽门螺杆菌不同菌株的最低抑菌浓度为0.5~4 μg/mL。

5.吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和奥美拉唑的组合物在制备治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用。

6.治疗幽门螺杆菌感染药物，其特征在于组分为吡咯烷二硫代氨基甲酸铵和奥美拉唑。