CN110964646B - 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 - Google Patents
一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110964646B CN110964646B CN201911119067.6A CN201911119067A CN110964646B CN 110964646 B CN110964646 B CN 110964646B CN 201911119067 A CN201911119067 A CN 201911119067A CN 110964646 B CN110964646 B CN 110964646B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- preparation
- medium
- pf1022a
- seed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 108010004210 PF 1022A Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- YJNUXGPXJFAUQJ-LYWANRAQSA-N PF1022A Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N(C)[C@H](C(O[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O1)=O)CC(C)C)C1=CC=CC=C1 YJNUXGPXJFAUQJ-LYWANRAQSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 42
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 33
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 32
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 28
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 28
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 21
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 18
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 16
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 11
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 11
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 11
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 10
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 9
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 claims description 9
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims description 7
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 16
- 241000220286 Sedum Species 0.000 abstract description 8
- 241001412224 Firmiana Species 0.000 abstract description 4
- 241001184073 Basilicum Species 0.000 abstract description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 18
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 16
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 16
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 9
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 6
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 4
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 4
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 4
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000088443 Rosellinia sp. Species 0.000 description 3
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical group O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 3
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241001088011 Sechium Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 2
- 239000000921 anthelmintic agent Substances 0.000 description 2
- 229940124339 anthelmintic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMZCLZPXPCNKML-UHFFFAOYSA-N 2h-imidazo[4,5-d][1,3]thiazole Chemical class C1=NC2=NCSC2=N1 UMZCLZPXPCNKML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001530056 Athelia rolfsii Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000243974 Haemonchus contortus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001299709 Rosellinia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001556 benzimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006063 cullet Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 102000035110 latrophilin Human genes 0.000 description 1
- 108091005543 latrophilin Proteins 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000010899 old newspaper Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- QXJKBPAVAHBARF-BETUJISGSA-N procymidone Chemical compound O=C([C@]1(C)C[C@@]1(C1=O)C)N1C1=CC(Cl)=CC(Cl)=C1 QXJKBPAVAHBARF-BETUJISGSA-N 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法；所述座坚壳菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18132；所述座坚壳菌用于PF1022A生产，菌丝生长快，菌丝浓度低，发酵时间短，发酵单位高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法。
背景技术
PF1022A是一种对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫药物，其是继大环内酯类驱虫药后，最有潜力的用于牲畜和宠物的一类驱虫药。PF1022A可以与七螺旋状类latrophilin跨膜受体的氨基位点相结合,该受体分离自捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus Rudolphi),其作用是诱导外部钙流入细胞。这种新的抗线虫药物的作用模式与已知的驱虫剂,如苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、大环内酯类的作用机理大不相同。所以PF1022A类抗虫药物效果好，对耐药的寄生虫同样有强大的杀虫效果。
目前PF1022A合成有固相合成法和生物合成方法。固相合成法步骤繁琐、工艺复杂，不适于大规模生产。而用微生物发酵方式生产PF1022A的报道比较少，产量又比较低，仅限于实验室水平。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及PF1022A的制备方法；所述座坚壳菌用于PF1022A生产，菌丝生长快，菌丝浓度低，发酵时间短，发酵单位高。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种座坚壳菌，所述座坚壳菌(Rosellinia sp.)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18132，保藏日期为2019年6月19日。
本发明提供了所述座坚壳菌在生产PF1022A中的应用。
本发明还提供了用于培养上述座坚壳菌的发酵培养基，以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成
优选的，以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
本发明还提供了一种PF1022A的制备方法，包括：上述座坚壳菌经发酵，得到PF1022A。
优选的，所述方法具体包括：将所述座坚壳菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
优选的，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于斜面培养基中培养；得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
优选的，所述方法具体：
所述座坚壳菌活化接种于保藏分离斜面培养基中25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到发酵液。
优选的，将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230r/min，培养135h，得到发酵液。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％～4％，酪蛋白胨0.4％～1.0％，琼脂1.0％～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.5％～1.5％，麦芽抽提物0.2％～1.5％，棉籽粉0.2％～1.5％，黄豆饼粉0.2％～1.5％，，酵母浸粉0.2％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.2％，氯化钠0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.4％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
优选的，以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成。
优选的，所述方法还包括：从所述发酵液中分离提取PF1022A。
优选的，所述发酵液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩后，用乙酸乙酯进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；
所述浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，收集目标组分；
目标组分减压浓缩、结晶，得到PF1022A成品。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明利用等离子体诱变育种并结合紫外诱变的复合诱变方法得到的座坚壳菌，其生物合成PF1022A的能力得到提高；经10L不锈钢发酵罐验证，在10L发酵罐中，具有菌丝生长快、菌丝浓度低(菌浓24％左右)、发酵时间短(135h)的特点，而且在10L发酵罐上发酵单位最高达到1.81g/L；与现有专利报道(专利申请号CN107217007A)的5L发酵罐上192h放罐的发酵单位1.481g/L相比，不仅发酵时间明显缩短，而且产量最高提高了22.2％，既缩短了发酵周期同时也降低了能耗。
本发明采用的常压室温等离子体(ARTP)诱变系统具有温度低、活性粒子浓度高等特点，对菌株的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，并最终稳定遗传进而形成突变株。因此，常压室温等离子体(ARTP)诱变系统可以作为一种快速简便的方法应用到座坚壳菌育种中。
本技术发明完全符合工业化PF1022A生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的经济价值。
附图说明
图1为本发明复合诱变筛选得到的诱变菌株发酵效价、菌体生长量与pH结果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
菌株SIIA-16-1#的分离与特征
1.菌株SIIA-16-1#的分离：
从四川雅安蒙顶山的土壤样品中分离筛选得到产PF1022A的原始菌株SIIA-16-1#。
试验方法和步骤：
1.培养基的制备
(1)配方：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、琼脂20g、K2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、1/3000孟加拉红水溶液100mL、0.03℅链霉素稀释液100mL、自来水800mL。
(2)操作步骤：
1)按上述配方将原料混合，并煮沸至琼脂溶化。
2)趁热分装于18mm×180mm试管，每管15mL，塞好棉塞，贴好标签，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好。
3)高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
其中，0.03％链霉素溶液的制备过程为：取国产链霉素1g/瓶，用无菌吸管吸入10mL无菌水溶解，得到10％链霉素溶液取0.3mL该溶液定容于100mL灭菌容量瓶即可得到0.03％链霉素溶液。
2.土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10-5。
称取土样10g放入盛90mL无菌水的三角瓶中，振摇约20分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用1mL无菌移液管吸取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。
3.平板分离
(1)倒平板
将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
(2)涂布
将上述每种培养基的三个平板分别标上10-1、10-2、10-3三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10-1、10-2、10-3三管土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
4.恒温培养
将上述接种土壤稀释液的平板倒置于28℃培养5～7d。
5.挑菌纯化
从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。
6.计数
选择每皿出现10～100个菌落的平板，计算土壤真菌(包括酵母菌)的含量。
选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算：
每g样品的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。
7.菌种保存
将分离到的真菌菌株SIIA-16-1#转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存。
2.菌株SIIA-16-1#的特征
2.1.菌体形态：菌体为真菌，不产生有性孢子或无性孢子。
2.2.菌落形态：在平板上，菌落菌丝体呈白色绒毛状，该菌落的反面是白色至淡黄色。生长约3周后在菌落的反面可观察到直径为2～3mm的深褐色斑点。
2.3.培养特征：
将菌株SIIA-16-1#接种在各种合成培养基和有机培养基上，25～26℃培养7d，记录相应的生长特征(见表1)。
表1
| 培养基种类 | 生长状况 | 菌落背面颜色 | 可溶性色素 |
| 土豆葡萄糖培养基 | 良好，菌落白色 | 白色至淡黄色 | 无 |
| 土豆胡萝卜培养基 | 良好，菌落白色 | 白色至淡黄褐色 | 无 |
| 麦芽提取物培养基 | 良好，菌落白色 | 白色至淡黄色 | 无 |
| 燕麦粥培养基 | 良好，菌落白色 | 白色至淡黄色 | 无 |
2.4.菌株SIIA-16-1#的生理生化特征：
在营养丰富的固体培养基上进行培养(在CzA琼脂、LcA琼脂和CMA琼脂上分别进行培养)，发现其最适生长温度为25～26℃，25℃以下生长缓慢，37℃以上该菌株不生长。该菌株为真菌，需氧生长；能够利用葡萄糖、淀粉、淀粉浆、蔗糖、糊精、甘油、糖蜜、动物及植物油。
CzA琼脂培养基组成：葡萄糖3％、硝酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂1.5％，PH自然；
LcA琼脂培养基组成：葡萄糖0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、氯化钾0.02％、硝酸钠0.2％、酵母抽提物0.02％、琼脂1.5％，PH自然；
CMA琼脂培养基组成：玉米粉4％、琼脂1.5％，PH自然。
实施例2
1、诱变菌株SIIA-18-56#的分离、诱变与特征
1、诱变菌株SIIA-18-56#的分离、诱变
1.1菌悬液制备：
从四川雅安蒙顶山的土壤样品中分离筛选得到产PF1022A的原始菌株SIIA-16-1#。往菌株SIIA-16-1#的斜面培养物中加入10mL无菌生理盐水进行洗涤，倒入加有碎玻璃的摇瓶中振荡打散，制成菌悬液备用。
1.2复合诱变处理：
(1)用移液枪吸取10μL1.1中菌悬液于直径为1cm的载玻片上，置于以氦气为工作气体，功率120W，通气量为10SLM，处理距离为2mm的常压室温等离子体诱变系统(ARTP诱变系统)中。分别处理0s、15s、30s、45s、60s、80s，将诱变处理后的菌悬液稀释后涂布于分离培养基上，25～26℃培养7d。根据菌落计数和摇瓶筛选结果，统计出每个照射剂量下的致死率和正变率。
由实验结果可知：当ARTP处理时间为80s时，致死率接近于100％；而诱变时间为45s时菌株的正突变率最大为38.2％，致死率为92％。考虑复合诱变后获得足够的菌株数量，本实验复合诱变采用的ARTP处理时间选取30s。
(2)用移液枪吸取1.1中菌悬液5mL于无菌培养皿中，紫外(功率30W，灯距35cm)分别照射0s、20s、30s、40s、60s、90s、120s。将诱变处理后的菌悬液稀释后涂布于分离培养基上，25～26℃培养7d。根据菌落计数和摇瓶筛选结果，统计出每个照射剂量下的致死率和正变率。
由实验结果可知：座坚壳菌对紫外线较为敏感，当照射时间为120s时，致死率接近100％。而照射时间为40s时菌株的正突变率最大为32.3％，致死率为88.6％。考虑复合诱变后获得足够的菌株数量，本实验复合诱变采用的UV处理时间选取30s。
(3)将1.1中的菌悬液采用(1)中选用的照射剂量处理(ARTP处理时间30s)后，将载玻片上的菌体用无菌生理盐水洗下，并立即(在30s内)按(2)中选用的紫外照射时间(功率30W，灯距35cm，UV处理时间30s)进行复合诱变处理。
1.3平板初筛:
分离培养基：以质量百分比计，由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成，pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
用生理盐水梯度稀释并取0.1mL涂布于分离培养基上，25～26℃培养7～10d。
1.4摇瓶复筛:
斜面培养基：以质量百分比计，由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成，pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
挑选平板初筛生长出的座坚壳菌单菌落接种于斜面培养基上，25～26℃培养7～10d；
挑选出发酵单位高于出发菌株30％的突变株，即为诱变菌株SIIA-18-56#。
2.诱变菌株SIIA-18-56#特征与鉴定
2.1菌体形态：菌体为真菌，不产生有性孢子或无性孢子。
2.2菌落形态：在平板上，菌落菌丝体呈灰白色绒毛状，该菌落的反面是灰白色至淡黄色。
2.3培养特征：
将菌株SIIA-18-56#接种在各种合成培养基和有机培养基上，25～26℃培养7d，记录相应的生长特征(见表2)。
表2
| 培养基种类 | 生长状况 | 菌落背面颜色 | 可溶性色素 |
| 土豆葡萄糖培养基 | 良好，菌落灰白色 | 灰白色至淡黄色 | 无 |
| 土豆胡萝卜培养基 | 良好，菌落灰白色 | 灰白色至淡黄褐色 | 无 |
| 麦芽提取物培养基 | 良好，菌落灰白色 | 灰白色至淡黄色 | 无 |
| 燕麦粥培养基 | 良好，菌落灰白色 | 灰白色至淡黄色 | 无 |
2.4诱变菌株SIIA-18-56#的生理生化特征：
在营养丰富的固体培养基上进行培养在营养丰富的固体培养基上进行培养(在CzA琼脂、LcA琼脂和CMA琼脂上分别进行培养)，发现其最适生长温度为25～26℃，25℃以下生长缓慢，37℃以上该菌株不生长。该菌株为真菌，需氧生长；能够利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、糊精、甘油、糖蜜、果糖、麦芽糖、动物及植物油；不利用海藻糖和木糖。
CzA琼脂培养基组成：葡萄糖3％、硝酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂1.5％，PH自然；
LcA琼脂培养基组成：葡萄糖0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.02％、氯化钾0.02％、硝酸钠0.2％、酵母抽提物0.02％、琼脂1.5％，PH自然；
CMA琼脂培养基组成：玉米粉4％、琼脂1.5％，PH自然。
2.5鉴定
综合以上分类数据分析，诱变菌株SIIA-18-56#属于座坚壳属Rosellinia，其与已报道的座坚壳属中相关菌株在形态学、生理生化特征方面有所差异，因此，将诱变菌株SIIA-18-56#命名为Rosellinia sp.SIIA-18-56#。
诱变菌株SIIA-18-56#为座坚壳菌(Rosellinia sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18132，保藏日期为2019年6月19日。
实施例3
诱变菌株SIIA-18-56#的培养
1.培养基的配制：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
2.菌种活化：
将甘油保存的实施例2中的菌株SIIA-18-56#转接至斜面培养基，于25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种。
3.摇瓶种子培养：
选择生长良好的斜面菌种，接种于装有上述1中制得的种子培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液。
4.摇瓶发酵培养：
将3中制得的种子液以10％(v/v)的接种量接种于上述1中制得的发酵培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于转速230r/min，培养132h，得到发酵液。
5.从发酵液中分离提取PF1022A：
取发酵液1mL，加入2mL丙酮，震荡抽提1h后，取上清液，进行HPLC检测，PF1022A产量达到1.68g/L。
实施例4
诱变菌株SIIA-18-56#生产PF1022A
1.培养基的配制：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由芽抽提物3％，酪蛋白胨0.6％，琼脂1.5～2％和余量的水组成；pH5.6，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉1％，葡萄糖1％，麦芽抽提物0.5％，棉籽粉0.5％，黄豆饼粉0.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.2％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖2.5％，糊精0.5％，大豆油1％，麦芽抽提物1％，黄豆粉1.5％，酵母抽提物1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.2％，碳酸钙0.3％和余量的水组成；pH7.0，121℃高压(1.05kg/cm2)蒸汽灭菌30min。
2.菌种活化：
将甘油保存的实施例2中的菌株SIIA-18-56#转接至斜面培养基，于25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种。
3.摇瓶种子培养：
选择生长良好的斜面菌种，接种于装有上述1中制得的种子培养基中(250mL三角瓶内装25mL)，于25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液。
4.发酵培养：
将3中制得的种子液按10％(v/v)的接种量在火焰保护下移入到已灭菌的装有通6L发酵培养基的10L不锈钢发酵罐中，培养条件为搅拌轴转速420r/min，25～26℃，通气量1:1(VVM)，罐压0.05Mpa，培养135h后终止发酵，得到发酵液。
5.从发酵液中分离提取PF1022A：
将6L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入6L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品7.6g。
实施例5
本实施例和实施例4的区别在于：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物4％，酪蛋白胨0.4％，琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉2.0％，葡萄糖1.5％，麦芽抽提物1.5％，棉籽粉0.2％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.1％，碳酸钙0.4％和余量的水组成，pH7.0；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％，糊精1.0％，大豆油2.0％，麦芽抽提物0.5％，黄豆粉2.5％，酵母抽提物0.5％，磷酸二氢钾0.8％，氯化钠0.8％，硫酸镁0.3％，碳酸钙0.5％和余量的水组成，pH7.0。
其余所有条件均与实施例4完全一致。
将获得的5.6L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入5.6L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品6.6g。
实施例6
本实施例和实施例4的区别在于：
斜面培养基：以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％，酪蛋白胨1.0％，琼脂1.0～2.5％和余量的水组成；
种子培养基：以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％，葡萄糖0.5％，麦芽抽提物0.2％，棉籽粉1.5％，黄豆饼粉0.2％，酵母浸粉1.5％，硫酸镁0.2％，氯化钠0.3％，碳酸钙0.1％和余量的水组成，pH7.0；
发酵培养基：以质量百分数计，所述发酵培养基由所述麦芽糖3.5％，糊精0.2％，大豆油0.5％，麦芽抽提物2.0％，黄豆粉0.5％，酵母抽提物2.0％，磷酸二氢钾0.2％，氯化钠0.2％，硫酸镁0.1％，碳酸钙0.1％和余量的水组成，pH7.0。
其余所有条件均与实施例4完全一致。
将获得的5.8L发酵液倒入储罐中，往储罐中加入5.8L乙酸乙酯，搅拌2h，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，回收减压浓缩的有机溶剂；
采用所回收的有机溶剂(乙酸乙酯)对发酵液进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；所述浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为220nm，流动相为乙腈-水(体积比80:20)，收集目标组分减压浓缩干后，获得PF1022A组分，结晶后即得PF1022A成品6.8g。
实施例7
诱变菌株SIIA-18-56#生产PF1022A
本实施例和实施例4的区别在于：
4.发酵培养：
将实施例4中制得的种子液按10％(v/v)的接种量在火焰保护下移入到已灭菌的装有通6L发酵培养基的10L不锈钢发酵罐中，培养条件为搅拌轴转速420r/min，25～26℃，通气量1:1(VVM)，罐压0.05Mpa，培养66h、72h、90h、94h、114h、118h、135h、144h、159h、166h后终止发酵，得到发酵液。
HPLC测定所得的发酵液中PF1022A的发酵单位及发酵液中菌丝的浓度，结果如表3所示，效价、菌体生长量与pH结果见图1。
表3
表3、图1说明，通过复合诱变筛选得到的诱变菌株SIIA-18-56#，在10L发酵罐中，具有菌丝生长快、菌丝浓度低(菌浓24％左右)、发酵时间短(135h)的特点，而且在10L不锈钢发酵罐上发酵单位最高达到了1.81g/L。不仅极大地缩短了发酵周期(专利报道的发酵时间为192h，放罐单位为1.481g/L)，降低了能耗，而且在发酵单位上还有了一定的提高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种座坚壳菌(Roselliniasp.)，其特征在于，所述座坚壳菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18132。
2.权利要求1所述座坚壳菌在生产PF1022A中的应用。
3.一种PF1022A的制备方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1所述座坚壳菌，得到PF1022A。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：将所述座坚壳菌的种子液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于斜面培养基中培养；得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中培养，得到种子液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：
所述座坚壳菌活化接种于保藏分离斜面培养基中25～26℃，培养7～10d，得到斜面菌种；
斜面菌种接种至种子培养基中25～26℃,转速230r/min，培养3～5d，得到种子液；
将所述种子液接种至发酵培养基25～26℃,转速230～420r/min，培养3～5d，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
以质量百分数计，所述斜面培养基由麦芽抽提物2％～4％，酪蛋白胨0.4％～1.0％，琼脂1.0％～2.5％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述种子培养基由可溶性淀粉0.5％～2.0％，葡萄糖0.5％～1.5％，麦芽抽提物0.2％～1.5％，棉籽粉0.2％～1.5％，黄豆饼粉0.2％～1.5％，酵母浸粉0.2％～1.5％，硫酸镁0.05％～0.2％，氯化钠0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.4％和余量的水组成；
以质量百分数计，所述发酵培养基由麦芽糖1.0％～3.5％，糊精0.2％～1.0％，大豆油0.5％～2.0％，麦芽抽提物0.5％～2.0％，黄豆粉0.5％～2.5％，酵母抽提物0.5％～2.0％，磷酸二氢钾0.2％～0.8％，氯化钠0.2％～0.8％，硫酸镁0.1％～0.3％，碳酸钙0.1％～0.5％和余量的水组成。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：从所述发酵液中分离提取PF1022A。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩后，用乙酸乙酯进行二次萃取，减压浓缩，得到浓缩液；
所述浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，收集目标组分；
目标组分减压浓缩、结晶，得到PF1022A成品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911119067.6A CN110964646B (zh) | 2019-11-15 | 2019-11-15 | 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911119067.6A CN110964646B (zh) | 2019-11-15 | 2019-11-15 | 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110964646A CN110964646A (zh) | 2020-04-07 |
| CN110964646B true CN110964646B (zh) | 2021-07-27 |
Family
ID=70030693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911119067.6A Active CN110964646B (zh) | 2019-11-15 | 2019-11-15 | 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110964646B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114875093B (zh) * | 2022-05-20 | 2024-07-19 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种提高pf1022a发酵产量的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102257154A (zh) * | 2008-12-16 | 2011-11-23 | 拜尔动物保健有限责任公司 | 用座坚壳属物种以及炭角菌科其他属的真菌菌株制备具有24个环原子的含乳酸或含苯基乳酸的光学活性环缩酚酸肽的方法 |
| CN107217007A (zh) * | 2016-03-22 | 2017-09-29 | 上海医药工业研究院 | 一种生产pf1022a的发酵培养基及发酵方法 |
| CN109880746A (zh) * | 2017-12-06 | 2019-06-14 | 海正药业(杭州)有限公司 | 一种座坚壳属真菌菌株及其应用 |
-
2019
- 2019-11-15 CN CN201911119067.6A patent/CN110964646B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102257154A (zh) * | 2008-12-16 | 2011-11-23 | 拜尔动物保健有限责任公司 | 用座坚壳属物种以及炭角菌科其他属的真菌菌株制备具有24个环原子的含乳酸或含苯基乳酸的光学活性环缩酚酸肽的方法 |
| CN107217007A (zh) * | 2016-03-22 | 2017-09-29 | 上海医药工业研究院 | 一种生产pf1022a的发酵培养基及发酵方法 |
| CN109880746A (zh) * | 2017-12-06 | 2019-06-14 | 海正药业(杭州)有限公司 | 一种座坚壳属真菌菌株及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 一株高产抗寄生虫环肽emodepside前体产生菌的鉴定及其次级代谢产物PF1022A的结构分析;童永亮等;《中国抗生素杂志》;20190731;第44卷(第7期);799-804 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110964646A (zh) | 2020-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110042061B (zh) | 高产赤霉素ga3的藤仓赤霉菌突变株及其应用 | |
| CN104342390A (zh) | 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用 | |
| CN108841733B (zh) | 一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法 | |
| CN103911293B (zh) | 一株高产紫杉醇的内生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法 | |
| CN101402929B (zh) | 一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用 | |
| CN101445784A (zh) | 布雷正青霉变种zjb082702及其发酵制备布雷菲德菌素a的应用 | |
| CN103740606A (zh) | 植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用 | |
| CN108841889B (zh) | 利用微生物发酵生产松刚霉素主份——灰黄霉素的方法 | |
| CN108823110B (zh) | 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 | |
| CN110964646B (zh) | 一种座坚壳菌、应用、发酵培养基及pf1022a的制备方法 | |
| CN105219653B (zh) | 产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用 | |
| CN106190898B (zh) | 一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌jzbc1的工业化液体发酵方法 | |
| CN116218690B (zh) | 一种产布雷非德菌素a的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法 | |
| CN109536392B (zh) | 杂色曲霉zjb16085及合成r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的应用 | |
| CN107099464A (zh) | 一种菌核曲霉及其制备青霉酸的方法 | |
| CN114032179B (zh) | 一株产cbd的工业大麻内生真菌及其应用 | |
| CN115093973B (zh) | 球孢白僵菌Bb1003及其介导合成纳米金的方法 | |
| CN113337432B (zh) | 一种产吡咯喹啉醌的食甲基菌及其应用 | |
| CN111154679B (zh) | 一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法 | |
| CN101386819B (zh) | 一株产紫杉醇的腐生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法 | |
| CN110358687B (zh) | 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 | |
| CN109609389B (zh) | 草酸青霉zjb16086及其合成r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的应用 | |
| US7846699B2 (en) | Process for gibberellic acid production with “Fusarium moniliforme” strains | |
| CN113337433B (zh) | 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用 | |
| CN118256402B (zh) | 一株耐酸枯草芽孢杆菌及其在发酵生产肌苷中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20210701 Address after: 610000 waidong Shiling Town, Longquanyi District, Chengdu City, Sichuan Province Applicant after: CHENGDU University Address before: 610052 Longtan Industrial Park, two section of Chenghua District East Three Ring Road, Chengdu, Sichuan. Applicant before: SICHUAN INDUSTRIAL INSTITUTE OF ANTIBIOTICS, CHINA NATIONAL PHARMACEUTICAL Group Corp. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |