CN110950963B - 用于蛋白质表面固定的多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有二氧化硅结合活性的多肽，所述多肽含有构成多肽主体部分的二氧化硅结合单元以及在多肽的N‑末端或者C‑末端至少一个组氨酸残基组成的氢键形成单元。本发明还公开了含有上述多肽和具有生物学效应的功能蛋白质的融合蛋白，以及一种蛋白质固定方法。本发明提供的融合蛋白通过与定向控制的非共价结合，使相关蛋白简单、快速、一步固定到硅基表面。在高盐、极端pH和变性条件下，蛋白质的结合保持稳定，肽固定化既不需要表面修饰，也不需要化学偶联，可以以较低的成本制备融合蛋白。此外，由于二氧化硅结合肽融合到亲本蛋白的一个特定末端，蛋白的结合位点受到控制，消除了活性位点的空间位阻。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质的固定方法，具体地，本发明涉及：(1)融合蛋白的制备，所述融合蛋白含有能够结合以二氧化硅为基质的材料(石英、玻璃)的多肽。(2)固定所述融合蛋白的方法。更具体地，本发明涉及上述的蛋白质和方法，其中所述蛋白质为酶、抗体、抗体片段或抗原。
背景技术
在生物分析工具的设计和制备中，功能蛋白在固体基质上的固定是一个具有重要商业价值的方法(Vijayendran&Leckband,2001；Weetall,1993；Wu,Chen,&Liu,2009)。以诸如酶、抗体、抗体片段、抗原等高价值蛋白使表面具有功能化是设计与制造生物活性装置的基本方法，该方法被越来越多的应用于生物传感、纯化、解毒、催化等工业领域。
诸如石英和玻璃等以二氧化硅(silica)为基质的材料具有各种不同的形式，平滑表面(Coyle&Baneyx,2014)，纳米粒子(Ikeda et al.,2011)，微球(Johnson,Zawadzka,Deobald,Crawford,&Paszczynski,2008)，纳米颗粒以及硅基表面因其丰富、低成本和生物相容性而成为蛋白质最常用的固体基质。虽然吸附或化学交联可以用来固定高价值的蛋白质。改进的方法包括使用重组结合的二氧化硅结合肽。整合有二氧化硅结合肽的融合蛋白可以通过强非共价相互作用附着在硅基表面，这种固定化方法不需要使用化学交联剂。
通常，蛋白质在硅基材料上的固定是基于非特异性吸附或化学偶联的原理。吸附到固体表面通常伴随着显著的构象破坏和相关蛋白的部分展开和变性(Hartmann,2005；Lundqvist,Sethson,&Jonsson,2004；Roach,Farrar,&Perry,2006)。对于化学偶联法，通过对表面进行化学修饰实现蛋白质的固定(Chen,Kong,Yuan,&Fu,2014；Wang,Rabe,Ahmed,&Niemeyer,2015)，既可以使用功能性硅烷醇(例如3-氨丙基三乙氧基硅烷)进行表面处理或使用活性化学交联剂(例如戊二醛)。因此，这种方法有以下缺点:(1)需要使用有害化学品，(2)需要额外的反应步骤，这会增加固定过程的时间和成本，(3)不受控制的固定方向可能会损害蛋白质的功能。例如，抗体的结合位点可能在化学交联过程中被阻断，因为这种结合不是位点特异性结合。
开发一种快速、低成本、可控的目的蛋白质固定方法具有重要意义。本发明的目的就是提供一种具有二氧化硅结合活性的多肽，以使含有这些肽的融合蛋白通过与定向控制的非共价结合，使相关蛋白简单、快速、一步地被固定到硅基表面。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种具有二氧化硅结合活性的多肽，所述多肽含有构成多肽主体部分的二氧化硅结合单元以及在多肽的N-末端或者C-末端至少一个组氨酸残基组成的氢键形成单元。
本发明是基于发现在融合蛋白中引入多聚组氨酸片段能够促进二氧化硅与肽结合的效率，该多聚组氨酸片段在二氧化硅表面能够与硅醇基团形成氢键。
基于现有技术的理论(蛋白与二氧化硅的结合强度取决于电荷，氢键以及多肽构型)，对二氧化硅结合肽进行重新设计，在融合蛋白的N-或C-末端引入以形成独立于折叠蛋白的局部有序结构。在重新设计的二氧化硅结合肽中存在的多聚组氨酸，可以促进形成额外的氢键，从而增加融合蛋白对二氧化硅表面的亲和力。本发明还通过在结构上独立的二氧化硅结合肽设计从而提升了蛋白质固定到表面的可能性，对蛋白质的功能而言，这些结构上独立的二氧化硅结合肽不是必需的，因此可以独立地优化结合蛋白的功能和其表面结合性能。本发明所述的二氧化硅结合肽包括3～30个氨基酸残基，优选5～20个氨基酸残基。所述二氧化硅结合肽包括至少一个，优选地包括多个能够与二氧化硅表面形成静电吸引的带正电荷的氨基酸残基。所述二氧化硅结合肽包括至少一个，优选为能够与二氧化硅表面形成氢键的多个组氨酸残基。
在一个优选的实施方案中，所述氢键形成单元的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-3所示序列中的任意一种。
在一个优选的实施方案中，所述二氧化硅结合单元的氨基酸序列选自SEQ IDNO.4-8所示序列中的任意一种。
更为优选地，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.9-13所示序列中的任意一种。
特别优选的多肽片段可以从以下氨基酸序列中选择:
GRARAQRQSSRGRGGSHHHHHH(SEQ ID NO.9)，本发明中被定义为SBP1；
GRARAQRQSSRAHHIHHIHH(SEQ ID NO.10)，本发明中被定义为SBP2；
GRARAQRQSSRADAHHIHHIHH(SEQ ID NO.11)，本发明中被定义为SBP3；
GRARAQRQSSRGRKSLSRADHIHHHHH(SEQ ID NO.12)，本发明中被定义为SBP4；
DSARGFKKPGKRKSLSRADHIHHHHH(SEQ ID NO.13)，本发明中被定义为SBP5。
应该理解的是，序列中所包括的HHHHHH,HHIHHIHH,HHIHHIHH或者HIHHHHH氨基酸的部分是本发明的核心，该部分序列不能被其它常规的标签替换或删除。
其次，本发明还提供了一种含有上述多肽的融合蛋白，所述融合蛋白还含有具有生物学效应的功能蛋白质。
本发明的二氧化硅结合肽可以通过在蛋白序列内的突变或插入而引入，或者优选地可以在蛋白的N-或C-末端的任何一个或两个末端作为末端添加。
序列特征促进了蛋白质α-螺旋或β-折叠构象的形成。可以使用如核磁共振波谱法的传统技术检测到折叠结构的存在。
本发明适用于一般蛋白质，不限于任何特定的类型。在一个优选的实施方案中，所述功能蛋白质包括酶、抗体、抗体活性片段、抗原。
根据本发明的一个重要的实施方案，可以将抗体或其免疫活性片段固定在固体表面，以制备在诸如免疫亲和技术的免疫识别程序中应用的性能得到改进的免疫活性材料。
根据本领域的技术常识，所述的抗体是一种可以天然获得也可以人工合成的免疫球蛋白。除非另有说明，在本申请说明书中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”在使用时互为同义词。所述的免疫活性抗体片段是整个抗体的一部分，其保留了抗原结合活性的能力。所述的抗原结合位点可由抗体轻链和重链各自的可变区组成，也可由单个的抗体可变区构成。常规的片段包括Fab片段，其包含两个连接在一起的结合位点，Fv片段(含有彼此连接的抗体重链和轻链可变区)，以及单链Fv片段(抗体重链和轻链以融合蛋白的形式存在)。
根据本发明的一个具体实施方案，所述的蛋白质是一种天然缺乏轻链的免疫球蛋白(以下称为重链免疫球蛋白)，更具体地，其是一种天然重链的免疫球蛋白的可变区(VHH)，也称为纳米抗体(Nanobody)，其可以从骆驼科获得(Hamers-Casterman等,1993)，WO94/04678(Casterman等)。或者所述蛋白质也可以是同以上蛋白质功能等同的蛋白质。利用免疫球蛋白或来源于骆驼科的免疫球蛋白重链可变区的优点是，它们易于低成本大规模生产，例如，使用转化的较低级的原核宿主，如大肠杆菌生产。
在一个优选的实施方案中，所述功能蛋白质为纳米抗体。
在一个更为优选的实施方案中，所述纳米抗体为抗CEA抗原(癌胚抗原)的纳米抗体。
尤为优选地，所述抗CEA抗原的纳米抗体为2D5或者11C12。纳米抗体2D5公开于中国发明专利申请201711358747.4，纳米抗体11C12公开于中国发明专利申请201710120052.6。
最后，本发明提供了一种蛋白质固定方法，所述方法包括使上述融合蛋白与以二氧化硅为基质的材料接触，并使所述融合蛋白被固定于所述材料表面。
应该理解的是，本发明可应用于抗体等衍生蛋白以外的蛋白质。例如，酶可以耦合到表面用于果汁净化。固定化蛋白的其他应用可在《Protein Immobilisation》中，第2-9页，R.F.Taylor ed.，Marcel Dekker,Inc.，纽约，1991。如本领域普通技术人员所理解的，本发明还可以应用于诊断试剂盒。
本发明的优点体现于以下方面：
1、五种新型二氧化硅结合肽，可与酶、抗体、抗体片段、抗原等高价值蛋白融合。与已发表的二氧化硅结合肽进行比较(Canabady-Rochelle et al.,2012；Coyle&Baneyx,2014；Ikeda et al.,2011)，本发明包含至少一个组氨酸促进氢键的形成，从而增强结合亲和力(图1)，融合蛋白可以通过强而非共价键靶向包括石英和玻璃在内的以二氧化硅为基质的材料表面。
2、二氧化硅结合肽促进二氧化硅结合强度高(kD＝3.6nM，表1)，结合过程不需要任何化学交联剂或特定的缓冲环境
3、通过二氧化硅结合肽的静电吸引以及氢键形成固定蛋白质，可以控制固定方向，从而对被修饰蛋白质的功能干扰达到最小化。由于二氧化硅结合肽融合到亲本蛋白的一个特定末端，从而控制了蛋白的结合位点，消除了活性位点的空间位阻。
4、通过二氧化硅结合肽对蛋白质进行固定化，在高盐、变性环境下以及广泛的pH值范围条件下都是稳定的(图3)。在高盐、极端pH和变性条件下，蛋白质的结合保持稳定。这种借助多肽实现固定化既不需要表面修饰，也不需要化学偶联，而且这种融合蛋白可以通过较低成本的大肠杆菌系统一步制得。
5、利用重组技术，可以将二氧化硅结合肽融合到功能蛋白中作为单一分子。融合蛋白只需一步即可经济地在大肠杆菌系统表达。这使得低成本功能化成为可能，并在蛋白质纯化、蛋白质固定化、药物递送和生物分析方面具有潜在的应用。
6、采用单链抗体片段VHH模型，通过硅微球从5％BSA(牛血清白蛋白)溶液中分离出VHH与二氧化硅结合肽的融合蛋白。采用一步捕获方案，该分子被用于富集和检测二氧化硅微球上的CEA(图4)。该检测装置在实现CEA到ng范围的定量测定方面显示出了潜力(图5)。
附图说明
图1.多聚组氨酸肽通过促进与表面硅烷形成氢键而增强二氧化硅结合亲和力的协同作用示意图；
图2.抗CEA纳米抗体结合二氧化硅结合肽的分子设计和序列示意图；
图3.二氧化硅结合肽纳米抗体融合蛋白表达的克隆优化选择SDS-PAGE图谱；
图4.二氧化硅结合肽纳米抗体融合蛋白表达的SDS-PAGE图谱；
图5.IMAC一步纯化法获得的融合蛋白SDS-PAGE图谱；
图6.CotB1P与2D5和11C12融合蛋白组氨酸标签去除后SDS-PAGE图谱；
图7.使用CotB1P以MagSi-S粒子展示蛋白的富集作用SDS-PAGE图谱；
图8.使用CotB1P以多空二氧化硅纳米粒子展示蛋白的富集作用SDS-PAGE图谱；
图9.SBP4和SBP5与二氧化硅粒子结合力检测的SDS-PAGE图谱；
图10.SBP4和SBP5与二氧化硅粒子结合力检测的SDS-PAGE图谱；
图11.使用C5柱进行典型的纳米抗体HPLC层析图谱；
图12.融合蛋白在不同pH和盐浓度下的硅结合亲和力示意图；
图13.融合蛋白在CEA检测中的应用示意图；
图14.520nm荧光强度与CEA溶液浓度之间的示意图；
图15.检测实验中分离的二氧化硅微球的荧光显微镜观察图；
图16.使用2D5-SBP4融合蛋白确定互补的结合抗体亲和活性的检测对照图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求限定的保护范围构成任何限制。
实施例1二氧化硅结合肽抗CEA纳米抗体融合蛋白的制备
1.二氧化硅结合肽抗CEA纳米抗体融合蛋白的构建
按照WO 94/25591中描述的步骤，将二氧化硅结合肽重组到从免疫美洲驼中分离的抗CEA重链抗体(克隆号2D5,11C12)。2D5重链抗体的信息参见中国专利申请CN201711358747.4)。11C12重链抗体的信息参见中国专利申请CN201710120052.6。二氧化硅结合肽的序列见SEQ ID NO.9-13，本发明将其命名为SBP1-5，另外，本发明还使用了来自现有技术的二氧化硅结合肽CotB1P(Abdelhamid,M.A.,Motomura,K.,Ikeda,T.,Ishida,T.,Hirota,R.,&Kuroda,A.(2014).Affinity purification of recombinant proteinsusing a novel silica-binding peptide as a fusion tag.Applied microbiology andbiotechnology,98(12),5677-5684.)与2D5,11C12纳米抗体的融合蛋白以用于对比研究。本文中“重链抗体”与“纳米抗体”均用于指代天然缺乏轻链的抗体。
应用SWISS-MODEL根据氨基酸序列中高度保守的框架区预测抗CEA纳米抗体的结构。使用PEP-FOLD3.5服务器对硅结合肽结构再次进行预测。应用PyMOL对蛋白质和肽进行可视化显示。
由GenScript合成以pet28a(+)质粒为骨架质粒的含有最终构建物的DNA，将4μg的构建质粒重悬于30μL dH2O，并转化入大肠杆菌中。
图1为多聚组氨酸肽通过促进与表面硅烷形成氢键而增强二氧化硅结合亲和力的协同作用示意图；图1说明了组氨酸在肽促进固定化中起关键作用。其中，图1-a中，1为His-6标签，2为凝血酶切割位点，3为纳米抗体，4为连接肽，5为CotB1 p。CotB1P是14个氨基酸长度的，精氨酸丰富的多肽序列，对硅基表面具有强烈的亲和性。该序列由Abdelhamid,M.A.,Motomura,K.,Ikeda,T.,Ishida,T.,Hirota,R.,&Kuroda,A.于2014年发现。
图1-b中，A为带有组氨酸标签的纳米抗体-CotB1p的融合蛋白，B为切去组氨酸标签的纳米抗体-CotB1P的融合蛋白。图1-b说明了带有CotB1P序列的纳米抗体在石英表面有显著富集。
图1-c中，A为带有组氨酸标签的纳米抗体-CotB1P的融合蛋白，B为切去组氨酸标签的纳米抗体-CotB1P的融合蛋白。图1-c说明了带有CotB1P序列以及N端组氨酸标签的纳米抗体在硅纳米颗粒表面有显著富集，切除组氨酸标签后该纳米抗体在硅表面结合力下降。
图1-d中，A为带有组氨酸标签的纳米抗体-CotB1P的融合蛋白，B为切去组氨酸标签的纳米抗体-CotB1P的融合蛋白，图1-d说明了当N端组氨酸序列被酶切后，带有CotB1p的纳米抗体对于硅的结合力出现显著下降。
图1-e中，A为500mM NaCl，B为250mM NaCl,50mM CuCl2。图1-e说明了在离子强度一致时，Cu2+离子抑制组氨酸的纳米抗体显示出明显的硅表面结合力下降。
图2显示了二氧化硅结合肽抗CEA纳米抗体融合蛋白的结构示意图，以及本发明使用到的二氧化硅结合肽序列信息和空间构型预测示意图。其中，图2(a)为抗CEA纳米抗体结合二氧化硅结合肽的分子设计示意图；图2(b)为二氧化硅结合肽的氨基酸残基排列示意图；图2(c)为二氧化硅结合肽的设计结构示意图。
图2(c)中Car9的相关信息参考文献(Coyle,B.L.,&Baneyx,F.(2014).Acleavable silica-binding affinity tag for rapid and inexpensive proteinpurification.Biotechnology and bioengineering,111(10),2019-2026.)
2.融合蛋白的表达和纯化
在大肠杆菌SHuffle T7中表达含有二氧化硅结合肽的抗CEA重链抗体。
来自新鲜转化的大肠杆菌的克隆涂布于LB和TB板上，将培养板在30℃下孵育36-48小时，从培养板上“刮”出每种重链抗体类型的单个菌落接种入10ml TB培养基种子培养物，10ml培养物在30℃孵育12小时。根据NEB Shuffle菌株表达说明书，将种子培养物在大型摇瓶中再培养进行蛋白表达。
重链抗体种子培养物接种于2L摇瓶中500mL TB培养基，初始OD值为0.1。1mM IPTG诱导蛋白表达，之后摇瓶在20℃孵育36-48小时。以10000rpm离心收集大肠杆菌细胞，在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8,500mM NaCl,1mM EDTA,0.5％Triton-X)中超声裂解。细胞溶解样品在10000rpm再次离心30分钟，纯化前上清液通过0.22μm滤膜过滤。
使用HisTrap Ni-NTA柱(GE healthcare)纯化纳米抗体，该柱每毫升容量可结合4mg his标签蛋白。通常，1mL HisTrap HP柱首先在20mM Tris-HCl pH8,500mM NaCl中平衡5个柱体积，然后加入过滤后的上清液。样品装入HisTrap柱后，用20mM Tris-HCl pH8,500mM NaCl洗涤7个柱体积，再用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH8,500mM NaCl,500mM咪唑)洗脱。
使用凝血酶在凝血酶切割位点切去纳米抗体的N末端的组氨酸标签。简言之，取浓度为1U/μL的凝血酶2μL加入浓度为0.25mg/mL的蛋白质溶液中，并4℃孵育过夜。使用5mL脱盐柱(GE healthcare)在PBS(磷酸缓冲盐溶液,phosphate buffer saline)中脱盐以纯化切割后的纳米抗体。通过SDS-PAGE以及MALDI-TOF质谱法验证纳米抗体的切割。
重链抗体的洗脱是通过线性梯度0-0.5M咪唑冲洗超过12个柱体积，然后通过53mLSephadex G25脱盐柱进行脱盐入PBS。用这种方法分离的重链抗体纯度可达到95％或更高。图11为使用C5柱进行典型的纳米抗体HPLC层析图谱。移动相：缓冲液A、水0.1％TFA；洗脱液B,100％氰甲烷，0.1％TFA。于HPLC峰形可得结论，一步镍柱纯化的纳米抗体具有95％以上的纯度并且于19分钟处洗脱。
根据常规步骤进行SDS-PAGE。使用预制的4-12％Bris-Tris胶(ThermoFisherScientific)。大约使用50ug的硅纳米粒子分散于20μL的标准还原样本缓冲液，95℃孵育10分钟后直接加样于胶孔。
图3为二氧化硅结合肽纳米抗体融合蛋白表达的克隆优化选择SDS-PAGE图谱。加样液为10微升，其中，泳道1:2D5-SBP2培养沉淀物(克隆A)，泳道2:2D5-SBP2培养上清(克隆A)，泳道3:2D5-SBP2培养沉淀物(克隆B)，泳道4:2D5-SBP2培养上清(克隆B)，泳道5:2D5-SBP2培养沉淀物(克隆A)，泳道6:2D5-SBP2培养上清(克隆A)，泳道7:Nb-L2培养沉淀物(克隆A)，泳道8:Nb-L2培养上清(克隆A)，泳道9:Nb-L2培养沉淀物(克隆B)，泳道10:Nb-L2培养上清(克隆B)，泳道11:11C12-SBP2培养沉淀物(克隆A)，泳道12:11C12-SBP2培养上清(克隆A)，泳道13:11C12-SBP2培养沉淀物(克隆B)，泳道14:11C12-SBP2培养上清(克隆B)。泳道7-9的Nb-L2的L2是指核糖体蛋白L2，L2是另一个具有硅基结合能力的蛋白基序，该序列由于表达量低，不满足低成本生产需求而未被优选。
图4.是二氧化硅结合肽纳米抗体融合蛋白表达的SDS-PAGE图谱。加样液为10微升，其中，泳道1:2D5-SBP1培养沉淀物，泳道2:2D5-SBP1培养上清，泳道3:2D5-SBP4培养沉淀物，泳道4:2D5-SBP4培养上清，泳道5:2D5-SBP5培养沉淀物，泳道6:2D5-SBP5培养上清。
图3及图4说明了设计多肽可由大肠杆菌可溶性表达。
图5为IMAC一步纯化法获得的融合蛋白SDS-PAGE图谱。图5提供了由Ni-IMAC一步纯化所获得的蛋白质纯度，其中，泳道1:2D5-SBP2，泳道2:2D5-SBP3，泳道3:2D5-SBP4，泳道4:2D5-SBP5。
图6为CotB1P与2D5和11C12融合蛋白组氨酸标签去除后SDS-PAGE图谱。其中，泳道1:11C12-CotB1P被凝血酶在pH6.2切割，泳道2:2D5—CotB1P组氨酸标签去除(N端组氨酸标签被凝血酶切除)泳道3::2D5—CotB1P组氨酸标签被凝血酶在pH6.2切割，泳道4:2D5—CotB1P组氨酸标签被凝血酶在pH7.4切割。图6为支持数据，说明了在图1-d中，组氨酸被凝血酶完全移除。
图7说明了使用二氧化硅结合肽CotB1P以MagSi-S粒子展示蛋白的富集作用。去除多组氨酸后结合力下降。图7中，泳道1：11C12-CotB1P0.13mg/ml，泳道2:11C12-CotB1P高盐PBS洗一次，泳道3:11C12-CotB1P高盐PBS洗两次，泳道4:11C12-CotB1P在纯镁离子之上，泳道5：11C12-CotB1P 0.13mg/ml，组氨酸标签被切除，泳道6:11C12-CotB1P高盐PBS洗一次，组氨酸标签被切除，泳道7:11C12-CotB1P高盐PBS洗两次，组氨酸标签被切除，泳道8:11C12-CotB1P在纯镁离子之上，组氨酸标签被切除，泳道9：2D5-CotB1P 0.13mg/ml，泳道10:2D5-CotB1P高盐PBS洗一次，泳道11:2D5-CotB1P高盐PBS洗两次，泳道12:2D5-CotB1P在纯镁离子之上，泳道13：2D5-CotB1P 0.13mg/ml，组氨酸标签被切除，泳道14:2D5-CotB1P高盐PBS洗一次，组氨酸标签被切除，泳道15:2D5-CotB1P高盐PBS洗两次，组氨酸标签被切除，泳道16:2D5-CotB1P在纯镁离子之上，组氨酸标签被切除。图7补充证明了图1-c及图1-d中对于优选的纳米抗体2D5以及11C12，移除N端组氨酸序列都导致了对于硅纳米颗粒结合力的下降
图8说明了使用二氧化硅结合肽CotB1P以多空二氧化硅纳米粒子(粒径200nm,孔径4nm)展示蛋白的富集作用。图8中，泳道1：
11C12-CotB1P 0.13mg/ml，泳道2:11C12-CotB1P在二氧化硅离子之上，泳道3:11C12-CotB1P高盐PBS洗一次，泳道4:11C12-CotB1P高盐PBS洗两次，泳道5：11C12-CotB1P0.13mg/ml，组氨酸标签被切除，泳道6:11C12-CotB1P高盐PBS洗一次，组氨酸标签被切除，泳道7:11C12-CotB1P高盐PBS洗两次，组氨酸标签被切除，泳道8:11C12-CotB1P在二氧化硅离子之上，组氨酸标签被切除，泳道9：
2D5-CotB1P 0.13mg/ml，泳道10:2D5-CotB1P高盐PBS洗一次，泳道11:2D5-CotB1P高盐PBS洗两次，泳道12:2D5-CotB1P在二氧化硅离子之上，泳道13：2D5-CotB1P 0.13mg/ml，组氨酸标签被切除，泳道14:2D5-CotB1P高盐PBS洗一次，组氨酸标签被切除，泳道15:2D5-CotB1P高盐PBS洗两次，组氨酸标签被切除，泳道16:2D5-CotB1P在二氧化硅离子之上，组氨酸标签被切除。
实施例2加尾的抗体片段与石英表面相互作用的结合动力学测定
将一种新型生物传感器(FORTEBIO)置于70℃水浴氧化液(H2O2、水和氨的混合物)中孵育30分钟，用超纯水洗净，制备石英表面。制备的石英传感器用BLItz生物层干涉仪(FORTEBIO)测量结合动力学。
结合动力学的具体测定步骤：
应用生物层干扰量度法(biolayer interferometry，BLItz(FORTEBIO))测定硅基结合纳米抗体构建物的结合动力学。在70℃氧化液体(H2O2、水、氨以1:3:1混合)水浴中孵育石英生物传感器末端硅基表面30分钟以制备硅基表面，之后以MilliQ水清洗。石英生物传感器储存于20v/v％乙醇中，使用前以PBS预平衡10分钟。除非另有所指，所有的动力学测定在PBS中进行，使用BLItz Pro 1.2软件(FORTEBIO)进行动力学的计算。
动力学测量在不同浓度NaCl的PBS或20mm磷酸盐缓冲液中进行。动力学数据分析使用BLItz Pro 1.2软件(FORTEBIO)。表1是用生物层干涉仪测定了融合VHH的二氧化硅结合肽的石英结合亲和力结果。
表1.二氧化硅亲和肽结合动力学检测结果
该表格说明了由BLItz测定的结合动力学常数，证明设计多肽SBP1-5与CotB1p相比具有显著二氧化硅结合力提升。其中最强的SBP4提升约100倍。
图12为融合蛋白在不同pH和盐浓度下的硅结合亲和力示意图；图12中Kon为结合常数(Association constant)，Koff为解离常数(Disassociation constant)。
实施例3加尾的抗CEA重链抗体的二氧化硅固定
将二氧化硅纳米颗粒和微球置于PBS中超声分散5分钟(Qsonica Q125)。将纯化的重链抗体加入分散的二氧化硅纳米颗粒或微球中。短涡后，室温孵育30分钟。然后将混合物以14800rpm离心5分钟以分离颗粒。用PBS洗涤两次，收集各洗涤步骤的上清液。采用SDS-PAGE和280nm吸光度法对固定于颗粒或上清液中的重链抗体进行定量分析。
目前已发表的二氧化硅结合肽(如CotB1p，参考文献同前)未能确定多组氨酸是通过与表面硅烷醇形成氢键来增强二氧化硅结合亲和力的关键残基。在本发明中，至少加入一个组氨酸以促进氢键的形成。经光干涉仪测定，其中的一个优选多肽二氧化硅结合肽(SBP4)解离常数比对照组CotB1p提高了约100倍。
图9说明了使用SBP4和SBP5提高与二氧化硅粒子的结合。图9中，泳道1：2D5-SBP4溶液(0.34mg/ml)，泳道2:2D5-SBP4上清液，泳道3:2D5-SBP4 PBS洗一次，泳道4:2D5-SBP4PBS洗两次，泳道5：2D5-SBP4在0.5mg粒子上的吸收，泳道6：2D5-SBP5溶液(0.29mg/ml)，泳道7:2D5-SBP5上清液，泳道8:2D5-SBP5 PBS洗一次，泳道9:2D5-SBP5 PBS洗两次，泳道10：2D5-SBP5在0.5mg粒子上的吸收。图9说明了优选的SBP4与SBP5使得纳米抗体于硅纳米颗粒表面大量富集
图10说明了二氧化硅结合肽促进蛋白质被固定于二氧化硅粒子上。
图10中，泳道1：11C12-SBP4上样，泳道2:11C12-SBP4上清液，泳道3:11C12-SBP4PBS洗一次，泳道4:11C12-SBP4 PBS洗两次，泳道5：11C12-SBP4在粒子上(0.1mg)，泳道6：2D5-SBP4上样，泳道7:2D5-SBP5上清液，泳道8:2D5-SBP5 PBS洗一次，泳道9:2D5-SBP5 PBS洗两次，泳道10：2D5-SBP5在粒子上(0.1mg)，泳道11：2D5-SBP4上样，泳道12:2D5-SBP4上清液，泳道13:2D5-SBP4 PBS洗一次，泳道14:2D5-SBP4 PBS洗两次，泳道15：2D5-SBP4在粒子上(0.1mg)。
对二氧化硅结合肽的突变，包括替换、添加或删除一个或多个氨基酸，可能会导致二氧化硅结合能力的显著改变。二氧化硅结合肽设计的关键因素是:1)用于建立静电相互作用的正电荷残基(精氨酸，赖氨酸)。2)多组氨酸使氢键形成。3)具有定向功能的残基能保证性能最大化。
实施例4.融合蛋白在CEA检测中的应用
采用单链抗体片段VHH模型，通过硅微球从5％BSA溶液中分离出VHH与二氧化硅结合肽的融合蛋白。采用一步捕获方案，该分子被用于富集和检测二氧化硅微球上的CEA。该检测装置在实现CEA到ng范围的定量测定方面显示出了潜力。
具体步骤：
在离心管中混合20μL 100μg/mL浓度的2D5-SBP4，20μL 10μg/mL ATTO488燃料标记的第二纳米抗体，以及不同浓度的CEA抗原(10-10000ng/mL)。混合样品于室温孵育10分钟后加入25μg的硅纳米颗粒混合并继续孵育10分钟。离心分离硅纳米颗粒后用PBS缓冲液冲洗2次以移除未固定的抗原抗体复合物。冲洗后的硅纳米颗粒重新分散于200μL PBS并使用酶标仪(Tecan Infinite 200pro)于535nm处测定荧光信号。
第二纳米抗体荧光标记
在DMSO中制备2mg/mL的NHS-ATTO488染液。在标记之前使用超滤将第二纳米抗体浓缩至1mg/mL。50μL的浓缩纳米抗体需要加入3μL的NHS-ATTO488和7μL的1M NaHCO3。于4℃进行标记反应过夜，采用标准方法以MiniTrap脱盐柱对产物纯化(GE healthcare)。
图13为融合蛋白检测CEA的应用示意图；
图14.520nm荧光强度与CEA溶液浓度之间的示意图。
图15为图14中分离的二氧化硅微球的荧光显微镜观察图，其中BF为亮视野，荧光图像摄于250ms曝光。
图16为使用2D5-SBP4融合蛋白确定互补的结合抗体的测试图谱；其中，2D5-SBP4被固定于生物层干涉传感器表面。通过捕获溶液中的600nM CEA可以测定第二纳米抗体的亲和活性。
序列表
<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司
<120> 用于蛋白质表面固定的多肽及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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His His Ile His His Ile His His
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Arg Ala Arg Ala Gln Arg Gln Ser Ser Arg Gly Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Arg Ala Arg Ala Gln Arg Gln Ser Ser Arg Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Arg Ala Arg Ala Gln Arg Gln Ser Ser Arg Ala Asp Ala
1 5 10
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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Ser Arg Ala Asp
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys Pro Gly Lys Arg Lys Ser Leu Ser
1 5 10 15
Arg Ala Asp His Ile His His His His His
20 25
Claims (8)
1.一种具有二氧化硅结合活性的多肽，其特征在于，所述多肽含有构成多肽主体部分的二氧化硅结合单元以及在多肽的N-末端或者C-末端至少一个组氨酸残基组成的氢键形成单元，所述氢键形成单元的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-3所示序列中的任意一种，所述二氧化硅结合单元的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4-8所示序列中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.9-13所示序列中的任意一种。
3.一种含有权利要求1或2所述多肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还含有具有生物学效应的功能蛋白质。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述功能蛋白质包括免疫活性片段、受体或其结合片段、凝集素和酶。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述功能蛋白质为纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体为抗CEA抗原的纳米抗体。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗CEA抗原的纳米抗体为2D5或者11C12，其中，纳米抗体2D5的信息见中国专利申请CN201711358747.4，纳米抗体11C12的信息见中国专利申请CN201710120052.6。
8.一种蛋白质固定方法，其特征在于，使权利要求4-7任一所述的融合蛋白与以二氧化硅为基质的材料接触，并使所述融合蛋白被固定于所述材料表面。
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