CN110940820B - 一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置及其使用方法，属于离心微流控技术及单线虫分析领域。包括圆盘式单线虫分析微流控芯片和便携式离心分析装置；所述微流控芯片包括沿圆心均匀排布的若干线虫分析单元；所述线虫分析单元包括储液池、单线虫分析通道和线虫清除结构，以及废液池；所述单线虫分析通道由线虫进样结构、线虫培养池、线虫捕获结构和通道出口组成；所述线虫清除结构包括线虫清除通道和集成微阀；所述的便携式离心分析装置：包括离心控制模块和线虫检测模块。该方法简便、快速、低成本，尤其适用于高通量、自动化、便携化的单线虫长期培养及观测，为模式生物线虫的深入研究和广泛应用提供可行的解决方案。

Description

一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置及其使用 方法

技术领域

本发明属于离心微流控技术及单线虫分析领域，具体涉及一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置及其使用方法。

背景技术

秀丽隐杆线虫是一种优秀的模式生物，已被广泛应用于寿命、发育、运动等方面的研究，这些研究都涉及线虫培养和检测。常规线虫培养主要是在液体或琼脂板上进行，在实验过程中需要周期性的更换培养基；对线虫进行研究时，需要清洗、挑取单线虫，麻醉、固定线虫并录像、拍照等，步骤较繁琐，不能实现单线虫的精确追踪观察，线虫亲代和子代间难以分离，而且用胶水或麻醉剂固定很可能对线虫的神经和行为造成副作用。为了实现线虫的长期培养和研究，就要解决单线虫的追踪和生理条件下的实验操作等技术问题。同时，为了保证数据的可靠性和统计学意义，有必要进行单线虫的高通量分析。微流控技术是在微米尺度的流道中，精确控制纳升到皮升量级流体的新技术，具有微型化、集成化、高通量、自动化等突出特征。微流控芯片(Lab on a Chip)可作为操控微米级模式生物线虫的实用的技术平台，已具备多种单线虫操控和分析技术，广泛应用于不同的线虫研究领域。但是，已有的微流控线虫分析系统多数采用压力驱动方式，一般微流控芯片设计、加工难度较大、成本较高，且往往需要复杂的流路接口和额外的流体驱动控制设备，导致微流控系统便携性差、自动化程度低，同时增加了操作、控制的复杂性，在实际应用中存在诸多不便，限制了其应用范围。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置及其使用方法，该方法简便、快速、低成本，尤其适用于高通量、自动化、便携化的单线虫长期培养及观测，为模式生物线虫的深入研究和广泛应用提供可行的解决方案。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，包括圆盘式单线虫分析微流控芯片和便携式离心分析装置，其中：

所述的圆盘式单线虫分析微流控芯片：包括沿圆心均匀排布的若干线虫分析单元；所述的线虫分析单元由圆心向外依次包括储液池、呈放射状排列的若干单线虫分析通道和线虫清除结构、以及废液池；所述的单线虫分析通道从连接储液池一侧起由线虫进样结构、线虫培养池、线虫捕获结构和通道出口组成；所述的线虫清除结构包括线虫清除通道和集成微阀；

所述的便携式离心分析装置：包括离心控制模块和线虫检测模块；所述的离心控制模块由转轴和旋转电机构成，可与圆盘式微流控芯片匹配，精确控制微流控芯片的转速、时间及旋转方向；所述的线虫检测模块用于依次对多个培养池中的单线虫进行视频录制，或对固定于线虫捕获结构处的单线虫进行显微成像。

进一步地，上述技术方案中，所述微流控芯片由上层微通道结构层和下层底板层组成，两层紧密键合，所述上层微通道层为透气的弹性硅橡胶材料，包括聚二甲基硅氧烷，聚二甲基硅氧烷PDMS；底板层为透光材料，包括玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚碳酸酯PC。

进一步地，上述技术方案中，所述单线虫分析通道中，所述线虫进样结构由锥形结构通道和长条形结构通道组成，所述锥形结构通道的锥形底部朝向储液池，锥形顶部与线虫培养池之间为长条形结构通道，所述长条形结构通道的宽度小于线虫样品的直径，深度与线虫样品的直径相当。所述线虫捕获结构为锥形结构通道，所述锥形结构通道的锥形底部朝向线虫培养池，锥形顶部与通道出口连接，所述锥形结构通道顶部的宽度小于线虫样品的直径，深度与线虫样品的直径相当。

进一步地，上述技术方案中，所述单线虫分析通道中的线虫培养池为椭圆形或圆形，线虫培养池的直径大于线虫样品的长度，深度大于线虫样品的直径。

进一步地，上述技术方案中，所述线虫清除结构中，通道的宽度和深度均大于线虫样品的直径；所述集成微阀为自动控制的电磁阀或机械微阀，位于线虫清除通道的上方，用于控制线虫清除通道的开闭状态。.

进一步地，上述技术方案中，所述储液池上的两端设有加液孔，储液池的两端连接有储液池排气通道；所述废液池的两端连接有废液池排气通道。

进一步地，上述技术方案中，所述的离心控制模块由与圆盘式微流控芯片匹配的转轴和旋转电机构成。

进一步地，上述技术方案中，所述的线虫检测模块可对线虫培养池中的单线虫进行视频录制，或对固定于线虫捕获结构处的单线虫进行显微成像。

本发明还提供了一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置的使用方法，其包括以下步骤：

①微流控芯片准备：关闭线虫清除通道上的集成微阀，将线虫样品和培养液一同从加液孔加到储液池中，封闭加液孔，将微流控芯片固定在离心控制模块的转轴上；

②线虫加样：启动旋转电机，带动微流控芯片旋转，使线虫进入单线虫分析通道的线虫进样结构中并被固定；

③剩余线虫清除：开启线虫检测模块，实时观察线虫固定的情况；当所有线虫进样结构处均固定有单线虫后，开启集成微阀，同时继续旋转微流控芯片，使储液池中剩余的线虫从线虫清除通道进入废液池；

④线虫进样：关闭集成微阀，同时旋转微流控芯片，将固定于线虫进样结构处的线虫冲入线虫培养池，此时可通过定期更换储液池中的培养液、清除废液池中的废液并旋转微流控芯片来更换单线虫分析通道中的培养液，以保持线虫的正常生长，并依次录制单线虫的运动视频；

⑤培养池中单线虫固定：使微流控芯片不断旋转，线虫培养池中的线虫进入并固定于线虫捕获结构处，此时利用线虫检测模块进行单线虫的成像检测；

⑥固定的单线虫释放：关闭旋转电机，微流控芯片逐渐停止旋转；当微流控芯片内的培养液停止流动后，被固定的单线虫将从线虫捕获结构逐渐返回线虫培养池，从而实现单线虫的可逆固定和释放。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明设计了圆盘式单线虫分析微流控芯片，并匹配了便携式离心分析装置，可实现高通量单线虫自动化控制、长期培养及观测，有效提高了微流控单线虫研究方法的实用性。

2.本发明提出的高通量单线虫分析方法简便、快速、低成本，无需泵阀控制和流路接口，为模式生物线虫的深入研究和广泛应用提供可行的解决方案。

附图说明

图1是微流控芯片结构示意图；

图2是单线虫分析通道结构示意图；

图3是线虫清除结构示意图；

图4是基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置结构示意图；

图5是含有四个线虫分析单元的圆盘式微流控芯片结构示意图；

图中：1、微流控芯片，11、线虫分析单元，111、储液池，112、单线虫分析通道，1121、线虫进样结构，1122、线虫培养池，1123、线虫捕获结构，1124、通道出口；113、线虫清除结构，1131、线虫清除通道，1132、集成微阀；114、废液池，115、加液孔，116、储液池排气通道，117、废液池排气通道；12、芯片固定孔；2、离心控制模块，21、转轴，22、旋转电机；3、线虫检测模块。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明所述微流控芯片和装置的示意图中，结构尺寸均未标注，主要体现其结构构造，实际生产使用过程中，可以根据需要调整结构比例和尺寸。

实施例1

下面结合附图对本发明作进一步描述。图1示出了本发明微流控芯片结构示意图；由图可见，本发明单线虫分析微流控芯片1为圆盘式，所述微流控芯片1由芯片底板和微通道结构层构成，芯片底板为圆形，中间设有芯片固定孔12，微通道结构层为紧密键合于芯片底板上的若干扇形的线虫分析单元11组成；所述线虫分析单元11沿圆心按一定角度均匀排布，线虫分析单元11靠近芯片固定孔12的一侧设有储液池111，储液池111为扇环形，储液池111两端靠近圆心位置各有一个加液孔115，在进样时用于储存线虫样品溶液，在培养时用于储存线虫培养液、以实现定期更新。在远离芯片固定孔12的一侧设有废液池114，废液池114为扇环形，所述储液池111和废液池114之间连接有若干单线虫分析通道112和线虫清除结构113，并且线虫清除结构113按对称分布的方式穿插在单线虫分析通道112之间。废液池114用于储存产生的废液，并收集进样过程中清除的线虫样品以及培养过程中的线虫虫卵。

如图2所示，为单线虫分析通道结构示意图，所述单线虫分析通道112由圆心向外依次包括线虫进样结构1121、线虫培养池1122、线虫捕获结构1123和通道出口1124。线虫进样结构1121与储液池111连接处为锥形通道，并且锥形底部与储液池111连接，线虫培养池1122一端与线虫进样结构1121之间通过细通道连接，所述细通道的宽度小于线虫样品的直径，这样设计有利于线虫在较低转速时进入开口端并被暂时固定于细通道处，此时线虫所在通道的流动阻力明显增加，从而阻止后续线虫的进入，确保单线虫分离。线虫培养池1122的尺寸根据线虫成虫大小而设计，使培养池为线虫活动提供足够大的空间，并可对整个培养池内线虫的运动进行观测；同时，线虫培养池1122另一端锥形通道的线虫捕获结构1123，线虫捕获结构1123的锥形底部朝向线虫培养池1122，线虫捕获结构1123的最小宽度小于线虫样品的直径，可将进入线虫培养池1122的单线虫限制在单线虫分析通道内112内，从而实现单线虫控制和长期追踪。通道出口1124与废液池114连接。

如图3所示为线虫清除结构示意图，线虫清除结构113由圆心向外依次由集成微阀1132和线虫清除通道1131组成。所述线虫清除通道1131的宽度和深度均大于线虫样品的最大直径，可将储液池111中剩余的线虫全部冲入废液池114而清除。所述集成微阀1132为自动控制的电磁阀或机械微阀，可按流程设计控制线虫清除通道1131的开闭状态。

如图4所示是基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置结构示意图；由图可知，所述便携式离心分析装置：包括离心控制模块2和线虫检测模块3。所述的离心控制模块2由转轴21和旋转电机22构成；圆盘式微流控芯片1固定于转轴21上，并由旋转电机22精确控制微流控芯片1的转速、时间及旋转方向，从而控制培养液的流动和线虫的运动状态。所述线虫检测模块3的检测视场可覆盖整个线虫培养池1122或线虫固定结构1123，用于依次对多个线虫培养池1122中的单线虫进行视频录制，或对固定于线虫捕获结构1123处的单线虫进行显微成像。

实施例2

本实施例中所用的圆盘式微流控芯片含有四个线虫分析单元，每个线虫分析单元中包括17条单线虫分析通道和2个线虫清除结构(见图5)，微流控芯片直径为100mm；其中，线虫进样结构和捕获结构的最小通道宽度为22μm，深度为50μm，可实现秀丽隐杆线虫L4期幼虫的进样和分离；线虫培养池为椭圆形结构，直径为1.5mm×1.35mm，可满足单个秀丽隐杆线虫成虫的正常活动需求。线虫清除通道的尺寸为7.4mm×100μm×50μm，集成微阀采用自保持电磁阀。

实施例3

本发明所述基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置的使用方法，其包括以下步骤：

①微流控芯片准备：关闭线虫清除通道上的集成微阀，将线虫样品和培养液一同从加液孔加到储液池中，封闭加液孔，将微流控芯片固定在离心控制模块的转轴上；

②线虫加样：启动旋转电机，带动微流控芯片旋转，使线虫进入单线虫分析通道的线虫进样结构中并被固定；

③剩余线虫清除：开启线虫检测模块，实时观察线虫固定的情况；当所有线虫进样结构处均固定有单线虫后，开启集成微阀，同时继续旋转微流控芯片，使储液池中剩余的线虫从线虫清除通道进入废液池；

④线虫进样：关闭集成微阀，同时旋转微流控芯片，将固定于线虫进样结构处的线虫冲入线虫培养池，此时可通过定期更换储液池中的培养液、清除废液池中的废液并旋转微流控芯片来更换单线虫分析通道中的培养液，以保持线虫的正常生长，并依次录制单线虫的运动视频；

⑤培养池中单线虫固定：使微流控芯片不断旋转，线虫培养池中的线虫进入并固定于线虫捕获结构处，此时利用线虫检测模块进行单线虫的成像检测；

⑥固定的单线虫释放：关闭旋转电机，微流控芯片逐渐停止旋转；当微流控芯片内的培养液停止流动后，被固定的单线虫将从线虫捕获结构逐渐返回线虫培养池，从而实现单线虫的可逆固定和释放。

Claims (8)

1.一种基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：包括圆盘式微流控芯片和便携式离心分析装置，其中：

所述的圆盘式微流控芯片：包括沿圆心均匀排布的若干线虫分析单元；所述的线虫分析单元由圆心向外依次包括储液池、呈放射状排列的若干单线虫分析通道和线虫清除结构、以及废液池；所述的单线虫分析通道从连接储液池一侧起由线虫进样结构、线虫培养池、线虫捕获结构和通道出口组成；所述的线虫清除结构包括线虫清除通道和集成微阀，所述集成微阀位于线虫清除通道的上方；

所述的便携式离心分析装置：包括离心控制模块和线虫检测模块；

所述线虫进样结构由锥形结构通道和长条形结构通道组成，所述锥形结构通道的锥形底部朝向储液池，锥形顶部与线虫培养池之间为长条形结构通道，所述长条形结构通道的宽度小于线虫样品的直径，深度与线虫样品的直径相当；

所述线虫捕获结构为锥形结构通道，所述锥形结构通道的锥形底部朝向线虫培养池，锥形顶部与通道出口连接，所述锥形结构通道顶部的宽度小于线虫样品的直径，深度与线虫样品的直径相当；

所述储液池为扇环形、废液池为扇环形。

2.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述微流控芯片由上层微通道结构层和下层底板层组成，两层紧密键合，所述上层微通道结构层为透气的弹性硅橡胶材料，包括聚二甲基硅氧烷，聚二甲基硅氧烷PDMS；底板层为透光材料，包括玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚碳酸酯PC。

3.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述单线虫分析通道中的线虫培养池为椭圆形或圆形，线虫培养池的直径大于线虫样品的长度，深度大于线虫样品的直径。

4.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述线虫清除通道的宽度和深度均大于线虫样品的直径；所述集成微阀为自动控制的电磁阀或机械微阀，位于线虫清除通道的上方。

5.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述储液池上的两端设有加液孔，储液池的两端连接有储液池排气通道；所述废液池的两端连接有废液池排气通道。

6.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述的离心控制模块由与圆盘式微流控芯片匹配的转轴和旋转电机构成。

7.根据权利要求1所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置，其特征在于：所述的线虫检测模块可对线虫培养池中的单线虫进行视频录制，或对固定于线虫捕获结构处的单线虫进行显微成像。

8.权利要求1-7中任一项所述的基于离心微流控技术的高通量单线虫分析装置的使用方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

①微流控芯片准备：关闭线虫清除通道上的集成微阀，将线虫样品和培养液一同从加液孔加到储液池中，封闭加液孔，将微流控芯片固定在离心控制模块的转轴上；

②线虫加样：启动旋转电机，带动微流控芯片旋转，使线虫进入单线虫分析通道的线虫进样结构中并被固定；

③剩余线虫清除：开启线虫检测模块，实时观察线虫固定的情况；当所有线虫进样结构处均固定有单线虫后，开启集成微阀，同时继续旋转微流控芯片，使储液池中剩余的线虫从线虫清除通道进入废液池；

④线虫进样：关闭集成微阀，同时旋转微流控芯片，将固定于线虫进样结构处的线虫冲入线虫培养池，此时可通过定期更换储液池中的培养液、清除废液池中的废液并旋转微流控芯片来更换单线虫分析通道中的培养液，以保持线虫的正常生长，并依次录制单线虫的运动视频；

⑤培养池中单线虫固定：使微流控芯片不断旋转，线虫培养池中的线虫进入并固定于线虫捕获结构处，此时利用线虫检测模块进行单线虫的成像检测；

⑥固定的单线虫释放：关闭旋转电机，微流控芯片逐渐停止旋转；当微流控芯片内的培养液停止流动后，被固定的单线虫将从线虫捕获结构逐渐返回线虫培养池，从而实现单线虫的可逆固定和释放。