CN110940639B - 一种死宰羊肉的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明通过对血红蛋白残留和过氧化物酶活性进行双标检测，同时测定待测样本中过氧化物酶的浓度C1以及血红蛋白的浓度C2，通过公式R＝C2/C1，获得R值，并通过收集大量的因不同病因、不同部位的死宰羊肉的数据，确立了R值的标准阈值，从而完成了对死宰羊肉的判定的绝对标准。采用本发明的检测方法，仅对待测样品进行单次实验，不受检测样本部位的限制，就可以确定待测样本是死宰羊肉还是屠宰羊肉。
Description
技术领域
本发明涉及肉类检测领域，具体地，涉及一种死宰羊肉的鉴定方法。
背景技术
随着现代物质文化水平的提高，人们对于肉类消费的品质要求也越来越高。但不少商家以死宰羊肉冒充优质羊肉进行销售，严重威胁人的身体健康。目前，对于羊肉的检测仍然是一个难题。
死宰羊肉是指法律法规规定的，患有对人体有害的传染性疾病、寄生虫病和中毒性疾病的生羊，非经屠宰死亡的生羊以及经检疫检验不合格、不能食用的羊肉及其肉类产品。对于市场上来源复杂的死宰羊肉及其产品，我国现行的死宰羊肉的检测和鉴别还相当缺乏。肉品的卫生检验是一个比较复杂的过程，主要包括肉品新鲜度检验和肉品健康度检验。目前市场检疫中心对于死宰羊肉的检验方法主要包括感官检验、理化检验和细菌学检验。感官检验主要包括视检、嗅检和触检，主要检查肉品的杀口状态、放血程度、血液坠积情况、组织和淋巴结病理变化以及肉品异常气味等。检验方法虽然简单，但多凭经验判断且主观性较强，对一些隐性感染和无临床症状的染疫肉品很难检出，肉品检出合格率低。细菌学检验主要检查肉品所含有的致病细菌的种类和数量，细菌学检验方法实验条件要求严格，对实验人员的技术有一定要求，难以达到快速或现场检验病死畜禽肉的目的。理化检验方法主要有pH值测定法、过氧化物酶法、硫酸铜蛋白沉淀法、细菌内毒素氧化呈色法等。
在传统检测鉴别死宰羊肉和屠宰羊肉的方法中，pH检测和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性检测具有一定客观性，已成为当前鉴别死宰羊肉的常用辅助手段。现有技术中，中国专利申请CN201511001061采用的过氧化物酶的检测来鉴别死宰猪肉，但是其在鉴别诊断中需要同时采用健康猪肉样品作为对照，通过比较来进行鉴别诊断。如果对照组样品出现问题，则整个鉴别的参考标准也就错了。CN201710320285则是采用基于MALDI-TOF-MS的死宰肉鉴别方法，应用MALDI-TOF-MS对样本集进行测定，得到对应质谱图；基于训练样本集和检验样本集的质谱图建立神经网络分类器；应用神经网络分类器对待测样本集中的样本进行分类，得出鉴定结果。该方法所需要的设备昂贵，操作复杂，技术难度高，并非普通技术人员可以准确的实施的。并且，上述两个专利都是以猪肉为样品进行的鉴别诊断，其能够准确地应用于羊肉的鉴别还不得而知。
另外，在临床屠宰中，死宰羊常出现放血不完全，导致血红蛋白残留的现象。因此，血红蛋白也可以作为评价肉的病健情况的指标。
然而在实际工作中，存在肉样处理方法和检测条件不一致，检测结果难以标准化衡量的现象。此外，pH检测和POD检测均存在死宰羊肉与屠宰羊肉检测离散区间重叠，导致重叠区间无法区分的现象。
发明内容
针对现有检测技术的不足，本发明通过研究，建立一种新型的鉴别死宰羊肉的方法，通过对血红蛋白残留和过氧化物酶活性进行双标检测，同时测定待测样本中过氧化物酶的浓度C1以及血红蛋白的浓度C2，通过C2/C1，获得R值，并通过收集大量的因不同病因、不同部位的死宰羊肉的数据，确立了R值的标准阈值，从而完成了对死宰羊肉的判定的绝对标准。
本发明提出一种死宰羊肉的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)制备样本处理液：取待测羊肉为检测样本，加入缓冲溶液后进行搅拌粉碎，浸渍后得到浸渍液，将所述浸渍液离心取上清，即得所述样本处理液；
(2)检测所述步骤(1)中样本处理液的过氧化物酶的浓度，所述过氧化物酶的浓度为C1；
(3)检测所述步骤(1)中样本处理液的血红蛋白浓度，所述血红蛋白的浓度为C2；
(4)根据公式R＝C2/C1计算R值；
(5)根据R值进行死宰羊肉的鉴定：
若R≤15，则判定所述检测样本为屠宰羊肉；
若R≥25，则判定所述检测样本为死宰羊肉。
进一步地，所述步骤(1)中检测样本为待测羊肉的肌肉组织；待测羊肉为新鲜羊肉或冻存羊肉。
进一步地，所述步骤(1)中加入缓冲溶液的质量为检测样本的9～12倍；
进一步地，所述步骤(1)中浸渍8～15分钟得到浸渍液；
进一步地，所述步骤(3)中血红蛋白浓度的检测方法为酶联免疫吸附法；
进一步地，在步骤(1)中，搅拌粉碎的条件为：转速为16000r/min，时间为30秒。本发明通过研究发现，采用机搅涡旋法在对肌肉处理完全程度、检测结果精度和稳定性上均优于研磨器震荡法。
进一步地，在步骤(1)中，浸渍的时间为8～10分钟。本发明通过检测不同浸泡时间的样本后发现，延长浸渍液的浸泡时间并不显著影响过氧化酶活性、血红蛋白浓度和R值检测结果。因此，为了缩短检测时间，将浸渍的时间确定为8～10分钟，即可满足本发明的检测要求。
进一步地，在步骤(1)中，离心的条件为：转速为3000～4000r/min，时间为2～4分钟。
进一步地，在步骤(2)中，选用四甲基联苯胺和过氧化脲作为底物，采用比色法测定所述过氧化物酶的浓度。
具体的测定方法为：按顺序入磷酸二氢钠缓冲液、过氧化脲溶液、样本处理液、四甲基联苯胺溶液，室温下反应1～2min，加入硫酸溶液终止反应，在450nm波长下测定样品吸光度OD值，通过标准曲线获得所述样本处理液中过氧化物酶的浓度。
其中，标准曲线通过将辣根过氧化物酶溶液(10mg/L)1000倍稀释后，再进行倍比稀释，制作而成。
进一步地，在步骤(3)中，酶联免疫吸附法至少包括以下步骤：实验前准备标准品、试剂及待检样本；向微孔中分别加入标准品和样本37℃孵育2小时，然后加入血红蛋白抗体37℃孵育1小时，洗涤微孔板3次，甩干后加入HRP标记37℃孵育1小时，再将微孔板彻底洗涤5次后加入TMB底物显色15-25min，加入终止液。在酶标仪450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。
进一步地，在步骤(4)中，浓度C1与浓度C2的单位相同，均为ng/mL。
有益效果
健康畜禽肉中含有过氧化物酶，当畜禽处于病理状态或濒死状态时肉中的过氧化物酶将显著减少甚至完全消失。过氧化物酶具有从过氧化物中裂解出氧的特性,裂解出的氧可使胺类物质氧化形成有色化合物,其颜色变化程度与肉内过氧化物酶的含量成正比。在临床屠宰中，死宰羊常出现放血不完全，导致血红蛋白残留的现象。因此，肉样血红蛋白残留是潜在的死宰羊肉鉴别靶标。但两个参数单独应用均存在死宰羊肉与屠宰羊肉检测离散区间重叠，导致重叠区间无法区分的现象。以上方法的单一检测均不能建立死宰羊肉鉴别的绝对标准。
本发明通过锐意研究，通过对血红蛋白残留和过氧化物酶活性进行双标检测，同时测定待测样本中过氧化物酶的浓度C1以及血红蛋白的浓度C2，通过C2/C1，获得R值，并通过收集大量的因不同病因、不同部位的死宰羊肉的数据，确立了R值的标准阈值，从而完成了对死宰羊肉的判定的绝对标准。采用本发明的检测方法，仅对待测样品进行单次实验，不受检测样本部位的限制，就可以确定待测样本是死宰羊肉还是屠宰羊肉。
本发明通过酶联免疫吸附法检测样本处理液的血红蛋白浓度，克服了采用比色法收到肌红蛋白干扰、测定不准确的缺陷。
本发明的检测方法简化了判定的步骤，缩短了检测时间，无需设立阴性和阳性检测对照组，提高了检测的效率，减小了实验人员的工作负担，并且提高了检测结果的准确度，保障了检测结果的权威性。
在本发明中，待测羊肉不仅可为新鲜羊肉，也可为冻存时间在20天内的羊肉。
附图说明
图1是死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的过氧化物酶总浓度分布。
图2是死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图3是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍10分钟后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图4是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍30分钟后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图5是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍60分钟后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图6是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍90分钟后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图7是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍120分钟后所检测到的血红蛋白浓度分布。
图8是死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的R值分布。
图9是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍10分钟后所检测到的R值分布。
图10是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍30分钟后所检测到的R值分布。
图11是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍60分钟后所检测到的R值分布。
图12是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍90分钟后所检测到的R值分布。
图13是死宰羊肉和屠宰羊肉样品浸渍120分钟后所检测到的R值分布。
图14是死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的R值的差异显著性分析。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例一
1、样品采集
分别采集4头屠宰羊取6个不同部位(A.通脊肉；B.五花肉C.前臀尖；D.前腿肉；E.后臀尖；F.后腿肉)，得到屠宰羊肉共24份，来自石家庄市某屠宰场。分别采集5头死宰羊取6个不同部位(A.通脊肉；B.五花肉C.前臀尖；D.前腿肉；E.后臀尖；F.后腿肉)，得到病死羊肉共30份，来自石家庄某无害化处理厂。每份肉样采集约50g，于-20℃冻存备用。
2、制备样本处理液
将冷冻待测样品，取10g肌肉组织加100mL PBS至搅拌机以最大转速机搅30秒至机搅完全，随后转移至200mL烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，浸渍10分钟时间，取4mL浸润液以3000r/min离心3分钟后取上清液2mL以备检测。
3、过氧化物酶检测
比色皿内按顺序入磷酸二氢钠缓冲液(1.56g/100mL，pH4.5)2mL、过氧化脲溶液(0.94g/100mL)(上海安耐吉化学有限公司)0.2mL、样品肉浸液0.2mL、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液(TMB)(0.065g/100mL)(BIOTOPPED)0.2mL，室温下反应1min，加入硫酸溶液终止反应，在450nm波长下测定样品吸光度(OD)值。将辣根过氧化物酶(SIGMA)溶液(10mg/L)1000倍稀释后，再进行倍比稀释，制作标准曲线。通过计算获得各羊肉样品的POD值(记为C1)，实验数据及比较结果如图1所示。
由图1可知，屠宰羊肉C、D、E、F部位的POD值与病死羊肉分布于同一区间而无法区分。由此可见，单独采用过氧化物进行检测，无法对屠宰羊肉和死宰羊肉进行区分。
4、羊血红蛋白ELISA检测
取步骤2中的样本处理液，检测羊血红蛋白的含量(记为C2)。羊血红蛋白ELISA检测方法参照试剂盒(货号：DL-HB-g，DEVELOP公司)说明书。具体如下：
所述酶联免疫吸附法包括以下步骤：实验前准备标准品、试剂及待检样本；向微孔中分别加入标准品和样本37℃孵育2小时，然后加入血红蛋白抗体37℃孵育1小时，洗涤微孔板3次，甩干后加入HRP标记37℃孵育1小时，再将微孔板彻底洗涤5次后加入TMB底物显色15-25min，加入终止液。在酶标仪450nm波长下测定吸光度O.D.值，计算样品浓度。
各样品检测羊血红蛋白的含量的实验数据及比较结果图2所示。
由图2可知，死宰羊肉B、C部位的血红蛋白值与屠宰羊肉血红蛋白值分布区间存在部分交叉，无法区分。由此可见，单独采用血红蛋白进行检测，无法对屠宰羊肉和死宰羊肉进行区分。
将各时间条件下血红蛋白检测结果进行详细比对的示意图如图3～7所示。
由图3～7可知，不同羊肉样本中血红蛋白含量变化明显，存在严重的交叉现象，难以区分。
5、将各样品中所检测到的过氧化物酶浓度C1与其血红蛋白浓度C2带入如下公式中进行计算R值：
根据式I计算R值；
R＝C2/C1 (式I)；
获得的实验数据及比较结果图9所示。
如图9所示，屠宰羊肉和死宰羊肉样本的R值区间有明显区分，病死羊肉R值明显高于屠宰羊。
屠宰羊和死宰羊的不同部位在浸渍10分钟下所检测到的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值如表一所示。
表一 各样品在浸渍10分钟下的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值
6、死宰羊肉的鉴定标准的确定
通过对图9中的结果进行进一步分析，R值在20----30之间为区分死宰羊肉与屠宰羊肉的有效隔离区间。更加精确的，死宰羊肉的R值在25以上，屠宰羊肉的R值都在15以下。因此，根据以上数据，可以获得死宰羊肉的鉴定标准。即：
根据计算所获得的R值进行死宰羊肉的鉴定：
R≤15，判定所述检测样本为屠宰羊肉；
R≥25，判定所述检测样本为死宰羊肉。
实施例二
本实施例中，在制备样本处理液时，浸渍的时间为30分钟，其他步骤与实施一相同。
屠宰羊和死宰羊的不同部位在浸渍30分钟下所检测到的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值如表二所示。对其进行统计学分析，如图10所示，屠宰羊肉和死宰羊肉样本的R值区间有明显区分，病死羊肉R值明显高于屠宰羊。
表二 各样品在浸渍30分钟下的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值
实施例三
本实施例中，在制备样本处理液时，浸渍的时间为60分钟，其他步骤与实施一相同。
屠宰羊和死宰羊的不同部位在浸渍60分钟下所检测到的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值如表三所示。对其进行统计学分析，如图11所示，屠宰羊肉和死宰羊肉样本的R值区间有明显区分，病死羊肉R值明显高于屠宰羊。
表三 各样品在浸渍60分钟下的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值
实施例四
本实施例中，在制备样本处理液时，浸渍的时间为90分钟，其他步骤与实施一相同。
屠宰羊和死宰羊的不同部位在浸渍90分钟下所检测到的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值如表四所示。对其进行统计学分析，如图12所示，屠宰羊肉和死宰羊肉样本的R值区间有明显区分，病死羊肉R值明显高于屠宰羊。
表四 各样品在浸渍90分钟下的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值
实施例五
本实施例中，在制备样本处理液时，浸渍的时间为120分钟，其他步骤与实施一相同。
屠宰羊和死宰羊的不同部位在浸渍120分钟下所检测到的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值如表五所示。对其进行统计学分析，如图13所示，屠宰羊肉和死宰羊肉样本的R值区间有明显区分，病死羊肉R值明显高于屠宰羊。
表五 各样品在浸渍120分钟下的氧化物酶浓度、血红蛋白浓度及R值
图8是死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的R值分布，即对实施例一至五中结果进行汇总。通过对图8中的结果进行进一步分析，R值在20----30之间为区分死宰羊肉与屠宰羊肉的有效隔离区间。根据计算所获得的R值进行死宰羊肉的有效的鉴定标准如下：
R≤15，判定所述检测样本为屠宰羊肉；
R≥25，判定所述检测样本为死宰羊肉。
更加精确的，死宰羊肉的R值在25以上，屠宰羊肉的R值都在15以下。因此，根据以上数据，可以获得死宰羊肉的更加严格的鉴定标准。即：
R≤15，判定所述检测样本为屠宰羊肉；
R≥25，判定所述检测样本为死宰羊肉。
将各时间条件下R值检测结果进行详细比对的示意图如图9～13所示，将所有死宰羊肉与屠宰羊肉的数据进行处理分析，得到图14。
由图9～13可知：相较于单一血红蛋白靶标区分，病死羊肉和屠宰羊肉R值在各浸泡时间下均有明显区分，且差异极显著。
在各时间条件下，鉴别正确率均在90％以上，而在10分钟时，死宰羊肉与健康羊肉的区分区域最为显著。
由图14可知，死宰羊肉和屠宰羊肉样品经过不同的浸渍时间后所检测到的R值的差异显著性分析结果是差异极显著，因此，以R值作为死宰羊肉与健康羊肉的区分指标是可靠的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备样本处理液：取待测羊肉为检测样本，加入缓冲溶液后进行搅拌粉碎，加入缓冲溶液的质量为检测样本的9～12倍，浸渍8～15分钟后得到浸渍液，将所述浸渍液离心取上清，即得所述样本处理液；
(2)检测所述步骤(1)中样本处理液的过氧化物酶的浓度，所述过氧化物酶的浓度为C1；
(3)采用酶联免疫吸附法检测所述步骤(1)中样本处理液的血红蛋白浓度，所述血红蛋白的浓度为C2；
(4)根据公式R＝C2/C1计算R值；
(5)根据R值进行死宰羊肉的鉴定：
若R≤15，则判定所述检测样本为屠宰羊肉；
若R≥25，则判定所述检测样本为死宰羊肉；
采用所述鉴定方法，仅对所述检测样本进行单次实验，不受所述检测样本部位的限制，就可以确定所述检测样本是死宰羊肉还是屠宰羊肉。
2.根据权利要求1所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中检测样本为待测羊肉的肌肉组织，待测羊肉为新鲜羊肉或冻存羊肉。
3.根据权利要求1所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，在步骤(1)中，搅拌粉碎的条件为：转速为16000r/min，时间为30秒。
4.根据权利要求1所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，在步骤(1)中，离心的条件为：转速为3000～4000r/min，时间为2～4分钟。
5.根据权利要求1所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，在步骤(2)中，选用四甲基联苯胺和过氧化脲作为底物，采用比色法测定所述过氧化物酶的浓度。
6.根据权利要求5所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，过氧化物酶浓度的具体的测定方法为：按顺序入磷酸二氢钠缓冲液、过氧化脲溶液、样本处理液、四甲基联苯胺溶液，室温下反应1～2min，加入硫酸溶液终止反应，在450nm波长下测定样品吸光度OD值，通过标准曲线获得所述样本处理液中过氧化物酶的浓度；其中，标准曲线通过将浓度为10mg/L辣根过氧化物酶溶液1000倍稀释后，再进行倍比稀释，制作而成。
7.根据权利要求1所述的一种死宰羊肉的鉴定方法，其特征在于，在步骤(3)中血红蛋白浓度的检测方法为酶联免疫吸附法，所述酶联免疫吸附法包括以下步骤：实验前准备标准品、试剂及待检样本；向微孔中分别加入标准品和样本37℃孵育2小时，然后加入血红蛋白抗体37℃孵育1小时，洗涤微孔板3次，甩干后加入HRP标记37℃孵育1小时，再将微孔板彻底洗涤5次后加入TMB底物显色15-25min，加入终止液；在酶标仪450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。
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