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CN110904249A - 一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN110904249A CN201911030693.8A CN201911030693A CN110904249A CN 110904249 A CN110904249 A CN 110904249A CN 201911030693 A CN201911030693 A CN 201911030693A CN 110904249 A CN110904249 A CN 110904249A
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Abstract

本发明公开了一种革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括反应液、检测膜条、荧光检测液，所述反应液包括反应液I、反应液II、反应液III；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；本发明的有益效果在于：提供了一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测的试剂盒及方法，比现有的显色法基因芯片步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低，利于临床的推广。

Description

一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法，尤其可针对革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌耐药基因检测。
背景技术
当前，随着抗菌药物的大量使用，导致出现大量多重耐药(MDR)、广泛耐药(XDR)和全耐药(PDR)的细菌，细菌耐药呈多重性趋势且形式多样、变化迅速，而新药的研发速度往往滞后于细菌耐药性产生的速度，因而耐药机制的快速检测具有重要意义。
G-菌的耐药机制主要包含四种：酶对抗生素的修饰或破坏(主要为β-内酰胺酶)、膜通透性改变、主动泵出机制、新靶标的改变或产生，而β-内酰胺酶是一类可特异性水解β-内酰胺环的酶，是导致细菌尤其是G-菌耐药的最主要的机制，在各类耐药机制中占80％。迄今为止报道β-内酰胺酶已超过200种，目前主要将β-内酰胺酶分为四类(A/B/C/D)。A类主要包含TEM型、SHV型、CTX-M型(含四种)、KPC 等；B类又称金属β-内酰胺酶，主要包含IMP型、VIM型、NDM型等；C类主要包含DHA型等；D类主要包含OXA型等。
随着MDR菌在全球医院感染中肆虐，目前有效的治疗药物有限，多黏菌素类抗生素是治疗“超级细菌”最后选择。然而随着多黏菌素的广泛使用，相应的耐药菌流行导致临床治疗无效。Liu等在中国首次报道质粒介导mcr-1基因致人源性和动物源性的肠杆菌科细菌对多黏菌素耐药，随后全球其他国家相继报道在肠杆菌科细菌中检出mcr-1基因，包括美国、拉丁美洲、意大利、英国等西方欧美国家。携带mcr-1基因“超级细菌”的全球流行，敲响了产超广谱β内酰胺酶或产碳青霉烯酶同时耐多黏菌素的肠杆菌科细菌的警钟。
耐甲氧西林葡萄球菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)是目前院内感染的重要病原菌之一。M RSA除对西氧西林耐药外，对所有β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、林可霉素、氯霉素、庆大霉素等均可耐药，MRSA有位于染色体DN A的固有耐药性，也有位于质粒DN A的获得性耐药性。虽然其固有耐药性相对稳定，但与获得性耐药性相比，其产生频率较小，在临床耐药菌的控制中处于次要地位。mecA 基因介导为M RS A的主要耐药机制，该基因编码一种独特的PBP2a。耐药菌获得了敏感菌没有的mecA基因，与β-内酰胺类抗生素的亲和力减低，因而产生耐药性。
万古霉素耐药基因：万古霉素是糖肽类抗菌药物，通过干扰细胞壁的合成起作用。万古霉素的耐药基因有五种：VanA、VanB、VanC、VanD、VanE型，分别具有不同耐药基因簇编码，其中VanC为天然耐药，其余均为获得性耐药。在这几种基因型种VanA最常见，VanB次之，一般常见于肠球菌和金黄色葡萄球菌。
目前对于细菌耐药检测的方法有：常规药敏实验，抗性蛋白检测等，判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序。这些方法缺点是操作繁琐，经验依赖性强，报告时间长。
量子点(Quantum dot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。
量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：
1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；
2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；
3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；
4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；
5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；
6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；
7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。
8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。
量子点材料在20世纪80年代分别由Alexey I.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在 1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，形成微阵列，所以可以一次性对临床样品中大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。由于基因芯片技术具有高通量、高速度、高效率的检测特征，所以为高通量的病原菌检测鉴定提供了强有力的检测工具。但是目前基因芯片主要以有机荧光染料、BCIP/NBT、DAB及有机荧光为检测方法，有机荧光染料基因芯片存在很多缺陷：制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。BCIP/NBT及DAB方式存在操作步骤繁琐，检测灵敏度低，重复性差等技术上的缺陷。
随着技术发展，现在更多研究偏向于分子诊断，利用分子技术可以快速准确检测到病原菌种类及耐药情况，极大提高了治疗的效率。目前国内外所涉及到技术主要包括基因芯片、多重PCR技术、荧光定量 PCR技术、PCR-反向斑点杂交等。但目前的实时荧光定量PCR仪的通量受限问题而不能进行高通量的检测。
因此对这些病原菌快速检测确定其耐药性，不仅在指导临床合理选用抗菌药有重要价值，也为预防和控制耐药细菌感染和传播提供依据，为耐药疫情监控和监测检验提供了可靠的技术手段，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点。
所述反应液包括：反应液I、反应液II、反应液III。
所述反应液I包含以下引物：
引物VANAF:TGGCAAGTCAGGTGAAGATG(SEQ No.1)；
引物VANAR:CTAGACCTCTACAGCCGAGC(SEQ No.2)；
引物VANBF:CGTATTGACGTGGCTTTCCCG(SEQ No.3)；
引物VANBR:CGTGGATAGCGGCTGTACGAT(SEQ No.4)；
引物MEF:GAAATGACTGAACGTCCG(SEQ No.5)；
引物MER:CATAACCTAATAGATGTGAAGTC(SEQ No.6)；
引物NDF:AGCCGCTGCATTGATGCTGAG(SEQ No.7)；
引物NDR:CGCGGTTGCTGGTTCGACC(SEQ No.8)；
引物CT9F:GCGTTGCAGTACAGCGACAATA(SEQ No.9)；
引物CT9R:ATATCATTGGTGGTGCCGTA(SEQ No.10)；
引物CT1F:GGACGATGTCACTGGCTGAGC(SEQ No.11)；
引物CT1R:CACAACCCAGGAAGCAGGCAGTC(SEQ No.12)；
引物MCF:GGCCTGCGTATTTTAAGCG(SEQ No.13)；
引物MCR:ATAGACACCGTTCTCACCCAG(SEQ No.14)；
引物VIMF:CGAGTGGTGAGTATCCGACAG(SEQ No.15)；
引物VIMR:GTCGTCATGAAAGTGCGTG(SEQ No.16)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.17)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.18)；
所述反应液II包含以下引物：
引物O5F:GGCAACCACCACAGAAGTATT(SEQ No.19)；
引物O5R:CCAGCCTACTTGTGGGTCTAC(SEQ No.20)；
引物O2F:ATCTATATGGTAATGCTCTAAGC(SEQ No.21)；
引物O2R:ACCTCTTGAATAGGCGTAACCT(SEQ No.22)；
引物AMF:CAAAACAGCCGGTCACTG(SEQ No.23)；
引物AMR:AGCAACTGCTCATACGGCAT(SEQ No.24)；
引物KPF:AACTGACACTGGGCTCTGCACT(SEQ No.25)；
引物KPR:AATCCCTCGAGCGCGAGTCTA(SEQ No.26)；
引物IMPF:GTAGCATTGCTACCGCAGCAG(SEQ No.27)；
引物IMPR:CACTACGTTATCTGGAGTGTGT(SEQ No.28)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.17)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.18)；
所述反应液III为Hotstart Taq DNA聚合酶。
优选的，上述用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述捕获探针包含：
探针VANAP：TCAATAGCGCGGACGAATT(SEQ No.29)；
探针VANBP:GTGACAAACCGGAGGCGAGGAC(SEQ No.30)；
探针MEP:GGCATCGTTCCAAAGAATGTA(SEQ No.31)；
探针NDP:GCTGGGTCGAACCAGCAA(SEQ No.32)；
探针CT9P:GTTGGTGACGTGGCTCAAA(SEQ No.33)；
探针CT1P:AGCCGACGTTAAACACCGCCA(SEQ No.34)；
探针MCP:TGAAGGTAATGAGCTTGCCAA(SEQ No.35)；
探针VIMP:ACACAGCGGCACTTCTCGC(SEQ No.36)；
探针O5P:AAACGCTTCCATTTAGCCC(SEQ No.37)；
探针O2P:CTCTAAGCCGCGCAAATAC(SEQ No.38)；
探针AMP:CAGCAGTATCGGCCTGTTTGGTG(SEQ No.39)；
探针KPP:GTTGATTGGCTAAAGGGAAA(SEQ No.40)；
探针IMPP:CATTTAGCGGAGTTAACTAT(SEQ No.41)；
优选的，上述的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.42)。
优选的，上述的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链 DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的长度为1～12个碳原子，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的长度为1～12个碳原子，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述量子点的激发波长为 200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
优选的，上述的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒中，所述量子点为CdSe/ZnS核壳结构量子点。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，首次建立细菌耐药基因量子点芯片核酸检测方法，其具有如下优点：
1)使用本发明试剂盒比现有的显色法基因芯片检测步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低(光源要求低)，并且现有的荧光基因芯片的载体为玻璃，其制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。
2)本发明采用多重PCR方法，多达9重，在一次检测中，能同时检测常见的13种革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌耐药基因，各耐药基因之间扩增不会相互干扰，探针的特异性高。利用杂交膜上固定特异性探针进行杂交鉴定结果比培养法更为快速、准确，为临床治疗提供一定的依据。本发明还可以指导抗生素的使用，避免由于抗生素的滥用而导致的超级耐药。
3)本发明用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒可直接对临床样本进行相关检测，传统的药敏检测需要对样本中的细菌进行分离、培养及生化反应鉴定，再进行药敏测试至少需要3～4天，而采用本发明的方法，检测时间大大缩短，只需要6小时左右。
4)本发明用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒灵敏度及特异性高，所有检测靶标均能达到 100copies/ul基因组。
5)本发明用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，同时增加一个内控靶标的检测，其为样本内源性的核酸(人源基因组管家基因)，每份样本检测均能得到有效的信号，保证每份样本从核酸提取到 PCR扩增及量子点核酸检测的全程监控，有效避免假阴性的出现。
6)本发明用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒可以使用量子点全自动核酸杂交仪进行光信号的检测，最大程度地避免人为判读导致的误差，并能实现高通量检测。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的本发明试剂盒反应液I各耐药基因杂交检测灵敏度检测结果示意图。
图2为本发明具体实施方式的本发明试剂盒反应液II各耐药基因杂交检测灵敏度检测结果示意图。
图3 为3例阳性临床样本示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：利用量子点材料的光学特性及基因芯片特性建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，可同时检测常见的13种常见的革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌耐药基因。
本发明用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒的检测谱为：mecA、VanA、VanB、KPC-2、 CTX-M-1、CTX-M-9、VIM-1、IMP-1/4、OXA-23、OXA-51、NDM-1、DHA-1、MCR-1。
本发明根据不同耐药基因核酸信息设计检测引物及探针，并且根据灵敏度筛选引物及探针，将满足要求的引物进行单重到多重的组合及相关优化，确定最佳的引物组合及不同的反应体系，减少引物之间的相关影响。最后确定各个反应体系的引物组合形式，将反应体系分为2管(6-9重PCR)。
实施案例1：
本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的制备和使用
一、量子点核酸检测原理：
将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
捕获探针为寡核苷酸单链DNA 3’端或5’端标记有氨基，且氨基与寡核苷酸单链DNA间有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligo dT(n)n数量为1～30。
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50uM)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。
量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(CdSe/ZnS)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm。所述量子点的尺寸1-200nm。
所核酸扩增产物为5’端带有生物素标记，具体为核酸扩增的一条引物5’端被修饰有生物素标记，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT (n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligo dT(n)n数量为1～30。
核酸扩增方法为聚合酶链式反应(如PCR等)、恒温扩增(如TMA/RPA/LAMP等)。
量子点核酸检测流程：
1)首先使用若干对引物进行核酸扩增，并且某一基因扩增的一对引物中其中一条引物5’端修饰有生物素，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligodT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligodT(n)n数量为1～30。
2)核酸扩增后，将产物进行核酸变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
3)将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至一定温度(40-55度)的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
4)杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至一定温度(40-55度)的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
5)洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入到一定温度的孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述温度为20-37度，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nMSA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
6)孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为 0.5*SSC与0.1％SDS。
7)洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
二、引物的设计与筛选
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个检测耐药基因mecA、VanA、VanB、KPC-2、 CTX-M-1、CTX-M-9、VIM-1、IMP-1/4、OXA-23、OXA-51、NDM-1、DHA-1、MCR-1序列，经BLAST 比对找出各个靶标同源性最高的区域，设计扩增引物。通过大量的试验测试筛选(单重扩增及多重组合扩增)灵敏度满足要求的引物。具体的检测引物序列及序列编号如下：
引物VANAF:TGGCAAGTCAGGTGAAGATG(SEQ No.1)；
引物VANAR:CTAGACCTCTACAGCCGAGC(SEQ No.2)；
引物VANBF:CGTATTGACGTGGCTTTCCCG(SEQ No.3)；
引物VANBR:CGTGGATAGCGGCTGTACGAT(SEQ No.4)；
引物MEF:GAAATGACTGAACGTCCG(SEQ No.5)；
引物MER:CATAACCTAATAGATGTGAAGTC(SEQ No.6)；
引物NDF:AGCCGCTGCATTGATGCTGAG(SEQ No.7)；
引物NDR:CGCGGTTGCTGGTTCGACC(SEQ No.8)；
引物CT9F:GCGTTGCAGTACAGCGACAATA(SEQ No.9)；
引物CT9R:ATATCATTGGTGGTGCCGTA(SEQ No.10)；
引物CT1F:GGACGATGTCACTGGCTGAGC(SEQ No.11)；
引物CT1R:CACAACCCAGGAAGCAGGCAGTC(SEQ No.12)；
引物MCF:GGCCTGCGTATTTTAAGCG(SEQ No.13)；
引物MCR:ATAGACACCGTTCTCACCCAG(SEQ No.14)；
引物VIMF:CGAGTGGTGAGTATCCGACAG(SEQ No.15)；
引物VIMR:GTCGTCATGAAAGTGCGTG(SEQ No.16)；
引物O5F:GGCAACCACCACAGAAGTATT(SEQ No.19)；
引物O5R:CCAGCCTACTTGTGGGTCTAC(SEQ No.20)；
引物O2F:ATCTATATGGTAATGCTCTAAGC(SEQ No.21)；
引物O2R:ACCTCTTGAATAGGCGTAACCT(SEQ No.22)；
引物AMF:CAAAACAGCCGGTCACTG(SEQ No.23)；
引物AMR:AGCAACTGCTCATACGGCAT(SEQ No.24)；
引物KPF:AACTGACACTGGGCTCTGCACT(SEQ No.25)；
引物KPR:AATCCCTCGAGCGCGAGTCTA(SEQ No.26)；
引物IMPF:GTAGCATTGCTACCGCAGCAG(SEQ No.27)；
引物IMPR:CACTACGTTATCTGGAGTGTGT(SEQ No.28)；
每条反向引物均被修饰有生物素标记。其中筛选出内控IC扩增引物引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.17)；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.18)；
三、扩增反应液体系的确认
通过大量的多重组合测试及体系优化测试，确定各个反应液体系的组成，具体情况如下：
反应液I的反应体系(48人份)如表1；
表1
Figure BDA0002250063370000081
Figure BDA0002250063370000091
反应液II的反应体系(48人份)如表2；
表2
Figure BDA0002250063370000092
Figure BDA0002250063370000101
每个样本的检测需要同时进行三个反应体系进行扩增，每个反应体系21ul，提取的核酸模板为4ul，总体积为25ul。
四、PCR反应程序的确定
经过大量的试验测试，本扩增程序能有效使各个反应体系中的引物最大程度得到有效扩增，并且使各个耐药基因检测灵敏度达到100copies/ul基因组浓度。具体程序如下(采用了降落PCR程序)如表4；
表4
Figure BDA0002250063370000102
Figure BDA0002250063370000111
五、捕获探针的设计
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个耐药基因mecA、VanA、VanB、KPC-2、CTX-M-1、 CTX-M-9、VIM-1、IMP-1/4、OXA-23、OXA-51、NDM-1、DHA-1、MCR-1的序列。经BLAST比对找出各个靶标特异性最高的区域，同时兼顾各个捕获探针能在同一杂交温度进行杂交测试设计探针，并经过大量的灵敏度试验测试及特异性测试，确定各个耐药基因的探针序列，具体序列及编号如下：
探针VANAP：TCAATAGCGCGGACGAATT(SEQ No.29)；
探针VANBP:GTGACAAACCGGAGGCGAGGAC(SEQ No.30)；
探针MEP:GGCATCGTTCCAAAGAATGTA(SEQ No.31)；
探针NDP:GCTGGGTCGAACCAGCAA(SEQ No.32)；
探针CT9P:GTTGGTGACGTGGCTCAAA(SEQ No.33)；
探针CT1P:AGCCGACGTTAAACACCGCCA(SEQ No.34)；
探针MCP:TGAAGGTAATGAGCTTGCCAA(SEQ No.35)；
探针VIMP:ACACAGCGGCACTTCTCGC(SEQ No.36)；
探针O5P:AAACGCTTCCATTTAGCCC(SEQ No.37)；
探针O2P:CTCTAAGCCGCGCAAATAC(SEQ No.38)；
探针AMP:CAGCAGTATCGGCCTGTTTGGTG(SEQ No.39)；
探针KPP:GTTGATTGGCTAAAGGGAAA(SEQ No.40)；
探针IMPP:CATTTAGCGGAGTTAACTAT(SEQ No.41)；
探针ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.42)；
其中ICP1探针为一条内控探针，用于监控样本核酸提取及扩增反正出现假阴性。
所述各条探针的5’端标记有氨基，并且氨基与寡核苷酸链间有oligodT10。
六、检测膜条的制备
每条捕获探针由引物合成单位进行合成，然后采用稀释液稀释成所需的浓度，再通过氨基与羧基的缩合反应固定在尼龙膜上，制备成检测膜条。
检测膜条的布局图如下表5；
表5
Figure BDA0002250063370000112
Figure BDA0002250063370000121
膜条上位点对应的耐药基因如下表6：
表6
Figure BDA0002250063370000122
七、杂交条件的确定
PCR扩增完成后，将2管扩增产物混合后进行95度10min变性处理，然后进行杂交、洗涤、孵育、洗涤、荧光检测。在杂交步骤中，杂交温度对结果的判读有着很大的影响，杂交温度过低，会出现非特异捕获导致假阳性，杂交温度过高，会出现目的产物与捕获探针的结合率下降，最终导致灵敏度下降而易误判阴性。后续的洗涤温度、孵育时间的长短、孵育液中SA-QD的浓度也会有对结果同样的影响。
杂交：
将变性后的PCR产物与检测膜条加入到预先孵育至48度的1ml杂交液中，48度轻摇杂交1.5h。同时将1ml洗涤液进行预热至48度。
所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
洗涤：
取出检测膜条，转移至预先预热至48度的洗涤液中，轻摇洗涤5min。
孵育：
按照1ml杂交液加入浓度为1uM SA-QD配制孵育液。将检测膜条转移至孵育液中室温孵育轻摇 30min。
洗涤：
取出检测膜条，转移至洗涤液中，室温轻摇洗涤5min。
综上，本实施例提供一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括上述的检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ。
本实施例用于细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒的使用流程如下：
1、将反应液I、反应液II与反应液III按20.75ul：0.25ul比例混合。
2、向上述混合好的反应液中加入4ul的样本核酸，置于PCR仪中进行PCR扩增。所述扩增程序如表4；
3、PCR扩增后，将产物混合后进行变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
4、将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至48度的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
5、杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至48度的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
6、洗涤结束后，将洗涤液去除后，在室温加入孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nM SA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为 400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
7、孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为 0.5*SSC与0.1％SDS。
8、洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
实施例2
本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的效果验证分析
1、灵敏度检测
将标定浓度的各耐药基因的重组质粒依次进行梯度稀释(1000copies/μL、100copies/μL、)，通过PCR- 量子点荧光检测法对上述各浓度DNA分别进行检测，出现明显亮斑的判定为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。检测按照实施1中的试剂盒使用流程进行测试。检测结果参见图1与图2。
2、临床样本检测
选择临床上血培养阳性结果血培养物临床样本检测，先进行基因组DNA提取，具体提取试剂采用杭州千基生物科技有限公司生产的1.2M山梨醇及循环游离核酸提取试剂盒(磁珠法)、天根生化生产的溶壁酶，提取流程如下：
1)取200ul血培养液至1.5ml EP管，12000r离心5min，弃上清；
2)加入600ul 1.2M山梨醇buffer，重悬沉淀后，加入5ul溶壁酶，30℃水浴30min；
3)水浴后，12000r离心5min，弃上清，再加入200ul生理盐水重悬沉淀；
4)向EP管中加入300ul裂解结合液，加入5ul mag，混匀后，常温下孵育10min；
5)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清；
6)向EP管中加入1ml洗涤液，充分洗涤；
7)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清，晾干2-5min；
8)向EP管中加入60ul洗脱液，重悬磁珠，56℃加热5min；
9)EP管置于磁力分离器上，分离上清并转至一个干净的EP管中，-20℃保存备用。
按照实施例1配制反应体系，再按照21ul/反应分装反应液，每个反应液中加入4ul提取的核酸，然后按照实施例1中方法进行PCR扩增，扩增后的产物按照实施例1中方法进行杂交测试。
检测结果参见图3。临床样本有一例KPC-2与OXA-23阳性，一例VanB阳性；一例NDM-1阳性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 杭州千基生物科技有限公司
杭州博芯生物技术有限公司
<120> 一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒及检测方法
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcaagtca ggtgaagatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagacctct acagccgagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtattgacg tggctttccc g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtggatagc ggctgtacga t 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaatgactg aacgtccg 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cataacctaa tagatgtgaa gtc 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agccgctgca ttgatgctga g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcggttgct ggttcgacc 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgttgcagt acagcgacaa ta 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atatcattgg tggtgccgta 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggacgatgtc actggctgag c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacaacccag gaagcaggca gtc 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcctgcgta ttttaagcg 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atagacaccg ttctcaccca g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgagtggtga gtatccgaca g 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcgtcatga aagtgcgtg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatggttggg ataaggctgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgagcttagt gatacttgtg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcaaccacc acagaagtat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccagcctact tgtgggtcta c 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctatatgg taatgctcta agc 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acctcttgaa taggcgtaac ct 22
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caaaacagcc ggtcactg 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcaactgct catacggcat 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aactgacact gggctctgca ct 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aatccctcga gcgcgagtct a 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtagcattgc taccgcagca g 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cactacgtta tctggagtgt gt 22
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcaatagcgc ggacgaatt 19
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgacaaacc ggaggcgagg ac 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggcatcgttc caaagaatgt a 21
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gctgggtcga accagcaa 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttggtgacg tggctcaaa 19
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agccgacgtt aaacaccgcc a 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgaaggtaat gagcttgcca a 21
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acacagcggc acttctcgc 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaacgcttcc atttagccc 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctctaagccg cgcaaatac 19
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cagcagtatc ggcctgtttg gtg 23
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttgattggc taaagggaaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
catttagcgg agttaactat 20

Claims (10)

1.一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ；
所述反应液I包含以下检测引物：
引物VANAF:TGGCAAGTCAGGTGAAGATG，即SEQ No.1；
引物VANAR:CTAGACCTCTACAGCCGAGC，即SEQ No.2；
引物VANBF:CGTATTGACGTGGCTTTCCCG，即SEQ No.3；
引物VANBR:CGTGGATAGCGGCTGTACGAT，即SEQ No.4；
引物MEF:GAAATGACTGAACGTCCG，即SEQ No.5；
引物MER:CATAACCTAATAGATGTGAAGTC，即SEQ No.6；
引物NDF:AGCCGCTGCATTGATGCTGAG，即SEQ No.7；
引物NDR:CGCGGTTGCTGGTTCGACC，即SEQ No.8；
引物CT9F:GCGTTGCAGTACAGCGACAATA，即SEQ No.9；
引物CT9R:ATATCATTGGTGGTGCCGTA，即SEQ No.10；
引物CT1F:GGACGATGTCACTGGCTGAGC，即SEQ No.11；
引物CT1R:CACAACCCAGGAAGCAGGCAGTC，即SEQ No.12；
引物MCF:GGCCTGCGTATTTTAAGCG，即SEQ No.13；
引物MCR:ATAGACACCGTTCTCACCCAG，即SEQ No.14；
引物VIMF:CGAGTGGTGAGTATCCGACAG，即SEQ No.15；
引物VIMR:GTCGTCATGAAAGTGCGTG，即SEQ No.16；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQ No.17；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQ No.18；
所述反应液II包含以下检测引物：
引物O5F:GGCAACCACCACAGAAGTATT，即SEQ No.19；
引物O5R:CCAGCCTACTTGTGGGTCTAC，即SEQ No.20；
引物O2F:ATCTATATGGTAATGCTCTAAGC，即SEQ No.21；
引物O2R:ACCTCTTGAATAGGCGTAACCT，即SEQ No.22；
引物AMF:CAAAACAGCCGGTCACTG，即SEQ No.23；
引物AMR:AGCAACTGCTCATACGGCAT，即SEQ No.24；
引物KPF:AACTGACACTGGGCTCTGCACT，即SEQ No.25；
引物KPR:AATCCCTCGAGCGCGAGTCTA，即SEQ No.26；
引物IMPF:GTAGCATTGCTACCGCAGCAG，即SEQ No.27；
引物IMPR:CACTACGTTATCTGGAGTGTGT，即SEQ No.28；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQ No.17；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQ No.18；
所述反应液III为Hotstart Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应液I的组分含量为：
水：9.7μL，
10×PCR buffer：2.5μL，
20mM dN(U)TP：0.25μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.1-16所示的引物各0.5μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的引物各0.1μL，
1U/μL UNG酶：0.1μL；
所述反应液II的组分含量为：
水：12.7μL，
10×PCR buffer：2.5μL，
20mM dN(U)TP：0.25μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.19-28所示的引物各0.5μL，
10μM核苷酸序列如SEQ ID No.17-18所示的引物各0.1μL，
1U/μL UNG酶：0.1μL。
3.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针包含：
探针VANAP：TCAATAGCGCGGACGAATT，即SEQ No.29；
探针VANBP:GTGACAAACCGGAGGCGAGGAC，即SEQ No.30；
探针MEP:GGCATCGTTCCAAAGAATGTA，即SEQ No.31；
探针NDP:GCTGGGTCGAACCAGCAA，即SEQ No.32；
探针CT9P:GTTGGTGACGTGGCTCAAA，即SEQ No.33；
探针CT1P:AGCCGACGTTAAACACCGCCA，即SEQ No.34；
探针MCP:TGAAGGTAATGAGCTTGCCAA，即SEQ No.35；
探针VIMP:ACACAGCGGCACTTCTCGC，即SEQ No.36；
探针O5P:AAACGCTTCCATTTAGCCC，即SEQ No.37；
探针O2P:CTCTAAGCCGCGCAAATAC，即SEQ No.38；
探针AMP:CAGCAGTATCGGCCTGTTTGGTG，即SEQ No.39；
探针KPP:GTTGATTGGCTAAAGGGAAA，即SEQ No.40；
探针IMPP:CATTTAGCGGAGTTAACTAT，即SEQ No.41。
4.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC，即SEQ No.42。
5.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链长度为1～12个碳原子，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
6.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链长度为1～12个碳原子，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
7.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
8.根据权利要求1所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒，其特征在于，所述量子点为CdSe/ZnS核壳量子点。
9.一种细菌耐药基因量子点芯片核酸检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8任意一项所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测试剂盒进行检测。
10.根据权利要求9所述的细菌耐药基因量子点芯片核酸检测方法，其特征在于，进行检测时，PCR反应液进行PCR扩增的条件设置为：
Figure FDA0002250063360000031
Figure FDA0002250063360000041
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