CN110878381A - 一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组合物、试剂盒及方法。本发明设计筛选出的引物组合物包括2组特异性引物和探针，在本发明优选的反应体系和反应条件下，能够在同一反应管中同时鉴别检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒，具有特异性好、灵敏度高、抗干扰、无污染、操作简便快速、成本低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组合物、试剂盒及方法
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV)和牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)是牛呼吸综合症常见的两种主要病原，是危害养牛业最为严重的疾病之一，制约着全球养牛业的发展。牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovine Rhinotracheitis virus，IBRV)主要引起牛高热、鼻炎、呼吸困难和母畜流产等疾病。MB(Mycoplasma bovis，MB)属支原体科、支原体属，主要引起犊牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和关节炎等病症，以呼吸系统疾病最为常见。由于MB具有在牛体内持续存在和条件性致病等特点，长期以来由其引起的疾病一直缺乏有效的防控手段，既无有效疫苗，也无特效药物，且随着抗生素的不合理使用，耐药株出现的频率逐年增加，给该病防控增加了困难。两种病临床症状态相似难以区分，且经常混合感染，所以常常因为不能进行及时准确的诊断和有效的治疗，而造成很大的经济损失。因此对上述两种病原体的鉴别诊断对牛呼吸综合症的防治显得尤其重要。
目前对这两种牛病原体的诊断方法主要有病毒分离、ELISA、血清中和、PCR 及荧光PCR等方法。环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，突破了恒温扩增的技术难点，6条引物同效率时增，敏感性高，特异性好，已在多种疾病的检测上得到应用。但是目前，国内的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能确定具体到底是哪一种阳性反应所引起的结果，不是真正意义上的鉴别诊断。专利申请CN107447056A公开了鉴别检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，但是这种检测方法的灵敏度较低，为100个拷贝/反应，并且其反应产物进行电泳后才能看结果，电泳需要一个小时，而且极易污染实验室。专利申请CN106868215A也公开了鉴别检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，其检测灵敏度也较低，为10000个拷贝/反应，且其操作复杂，使用的仪器也复杂，必须在实验室才能完成检测。
发明内容
本发明提供了一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的引物组合物，该引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括 MB-F3，MB-B3，MB-FIP，MB-BIP，以及MB-probe，第二组特异性引物和探针包括IBRV-F3，IBRV-B3，IBRV-FIP，IBRV-BIP，以及IBRV-probe，第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示核苷酸序列，或为将序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。MB-probe的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694nm波长下呈大红色；IBRV-probe 的5’端标记FITC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FITC荧光基团在 520nm波长下呈黄绿色。
本发明还提供一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的试剂盒,该试剂盒包括前述的引物组合物。该试剂盒还包括Bst DNA 3.0聚合酶。
进一步的，该试剂盒的每25ul反应体系中包括1μL DNA模板，10×缓冲液 2.5μL，15U Bst DNA 3.0聚合酶，MB-FIP、MB-BIP、IBRV-FIP、IBRV-BIP各 40pmol,MB-F3、MB-B3、IBRV-B3、IBRV-F3各5pmol，MB-probe、IBRV-probe 各0.1μM，加双蒸水补足至25μL。
本发明还提供一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，该方法包括采用前述的引物组合物或试剂盒进行环介导等温扩增反应。该环介导等温扩增反应的反应过程包括60-70℃反应60分钟，80℃作用5min终止反应。
进一步的，该环介导等温扩增反应的反应过程包括60℃反应60分钟，80℃作用5min终止反应。
本发明还提供一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的引物组合物、试剂盒以及检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法在同时检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎中的应用。
本发明在FIP与BIP之间添加分子信标探针，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。分子信标探针比普能的Taqman探针更特异，可识别1个碱基的差异。本发明的 LAMP扩增效率极高，扩增产物的数量比real-timePCR多，断裂的探针数量多, 因此能在反应管内凭肉眼可直接读取反应结果，不需要电泳，且可根据荧光基团所显示颜色的不同判断结果，能准确鉴别两种病毒。因此本发明具有以下优点：
1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低。使用仪器简单,全程只需要一台普通水浴锅既可以完成，可在条件差的基层开展。
2特异性高：本发明探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，我们尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不断裂，因此不能发光，由此可见本发明的二重荧光 RT-LAMP方法特异性较好。
3.本发明通过对环介导等温扩增反应体系的优化，尤其是采用了Bst DNA 3.0聚合酶后，检测灵敏度得到极大提高，可达1个拷贝/反应。
4.减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染。
5.结果准确：本发明使用了两种荧光基团，FITC和CY5.5,这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FITC吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色。不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FITC，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物电泳等方式观察更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。尤其是本发明中采用了FITC荧光基团，比现有技术常用的FAM荧光效果更加明显，颜色亮丽。
附图说明
图1为二重荧光LAMP特异性实验结果图，其中A为520荧光通道图 (IBRV-FITC标记),B为670荧光通道图(MB-CY5.5)，C为520和670荧光双通道图；图1A-1C中的1-12依次为MB，IBRV，MB+IBRV，FMDV，VSV，BTV， PPRV，BVDV，BRV，IBRV，ETEC，阴性对照；
图2为二重荧光LAMP敏感性实验结果图，其中A为520荧光通道图 (IBRV-FITC标记),B为670荧光通道图(MB-CY5.5)，C为520和670荧光双通道图；图2A-2C中的1-7依次为106～1拷贝/μl(PMD-18T-MB和 PMD-18T-IBRV混合质粒标准品)，8为空白对照，9为阴性对照；
图3为二重荧光LAMP干扰性实验结果图，其中A为520荧光通道图 (IBRV-FITC标记),B为670荧光通道图(MB-CY5.5)，C为520和670荧光双通道图；图3A-3C中的1-6依次为样品1-6。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，LAMP DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪购自日本荣研公司； RNA/DNA共提试剂盒(全式金EasyPure Viral DNA/RAN Kit(货号ER201))、反转录试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自全式金公司；premixTaq PCR试剂盒、 PMD-18T载体购自大连宝生物公司；Bst DNA3.0聚合酶购自new England公司； NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisherScientific公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司。
3株牛支原体、3株产肠毒大肠杆菌(ETEC)广西分离株由广西兽医研究所分离保存；2株牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、3株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、 2株牛轮状病毒(BRV)参考毒株购自中国兽药监察所；口蹄疫(FMDV)灭活疫苗A 型、O型、Asia 1型购自兰州兽医研究所；口蹄疫灭活病毒O型、A型、Asia 1 型、水泡性口炎(VSV)灭活病毒新泽西型(NJ型)和印第安型(IND型)、蓝舌病(BTV)灭活病毒(4型，8型，9型，15型，17型，18型)、小反刍兽疫(PPRV) 灭活病毒由云南出入境惠赠。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、引物组合物的设计
下载Genebank上已登录的的IBRV的tk基因和MB的opp D/F基因序列，利用MEGA5.0进行保守性和同源性分析，选取保守性好的区域，用primer5.0和 Primer explore V4软件设计2套LAMP特异性引物组成引物组合物。每套包括4 条引物和1条探针：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，探针Probe。两条探针Probe 分别标记不同的荧光基团：MB-probe在序列表中SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的5’端标记CY 5.5荧光，3’端标记BHQ3淬灭基团，在694nm波长下呈大红色； IBRV-probe在序列表中SEQ ID No：10所示的核苷酸序列的5’端标记FITC荧光， 3’端标记BHQ1淬灭基团，在520nm波长下呈黄绿色。引物和探针均由大连宝生物公司合成，HPLC方式纯化。引物组合物中的各条引物的序列见表1。
表1引物的序列
实施例2、牛支原体和牛传染性鼻气管炎二重荧光LAMP检测方法的验证试验
1.RNA/DNA模板的提取
按照全式金RNA/DNA共提试剂盒说明书，提取MB，IBRV的总DNA，同时提取参试毒株BVDV、FMDV、VSV、BTV、BRV、PPRV的总RNA，提取的总RNA用全式金反转录试剂盒反转录成cDNA。反转录反应体系为10μL：5×RT buffer 2μ L，50μmol/L Random 9mer 0.5μL，5U AMV反转录酶0.5μL，RNA抑制剂0.5μL，10μmol/L dNTPs 0.5μL，RNA模板2μL。
2.二重荧光LAMP反应体系和反应条件
二重荧光LAMP最佳的反应体系为：1μL DNA模板，10×buffer 2.5μL，15U of BstDNA 3.0聚合酶，实施例1中的内引物(MB-FIP，MB-BIP，IBRV-FIP,IBRV-BIP) 各40pmol,实施例1中的外引物(MB-F3，MB-B3，IBRV-B3,IBRV-F3)各5pmol，探针Probe(MB-probe，IBRV-probe)各0.1μM，加双蒸水补足至25μL。各组份混合均匀，置恒温仪60℃反应60分钟，80℃作用5min终止反应。
3.特异性验证实验
将步骤1获得的MB,IBRV DNA样品及BVDV、FMDV、VSV、BTV、PPRV、BRV的 cDNA样品加入到步骤2的二重荧光LAMP反应体系中进行扩增反应，验证MB和 IBRV二重LAMP方法的特异性。
如图1所示，结果表明用建立的二重荧光LAMP方法对 FMDV,VSV,BVDV,BRV,PPRV,BTV,ETEC检测结果均为阴性，只对MB和IBRV有扩增。
4.敏感性验证实验
将MB外引物(MB-B3，MB-F3)和IBRV外引物(IBRV-F3,IBRV-B3)PCR扩增产物克隆到PMD-18T载体，构建PMD-18T-MB和PMD-18T-IBRV重组质粒，用试剂盒提取阳性重组菌的质粒。经NanoDrop 2000核酸测定仪测定质粒浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-20℃保存备用。拷贝数(copies/μL) ＝质粒浓度(g/μL)×10-9×6.02×1023/660×2692(质粒总长度)。将计算好拷贝数的PMD-18T-MB和PMD-18T-IBRV重组质粒作10倍速梯度稀释，终浓度为1×108～1拷贝/μL，再将两种重组质粒等体积混合，制备成标准品，每个标准品取1μ L为模板，用步骤2的二重荧光LAMP，反应体系进行敏感性实验，结果见图2。
图2结果表明二重LAMP检测体系的灵敏度可达1拷贝/μL，该方法灵敏度高。
5.干扰性验证实验
将步骤4中计算好拷贝数的PMD-18T-MB和PMD-18T-IBRV重组质粒作10倍速梯度稀释，终浓度为1×108～1拷贝/μL，再按不同浓度将MB和IBRV样品进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品：样品1：MB(108copies/μL)+IBRV(103 copies/μL)，样品2：MB(103copies/μL)+IBRV(108copies/μL)，样品3：MB(107 copies/μL)+IBRV(102copies/μL)，样品4：MB(102copies/μL)+IBRV(107 copies/μL)，样品5：MB(106copies/μL)+IBRV(103copies/μL)，样品6：MB(103 copies/μL)+IBRV(106copies/μL)，用二重荧光LAMP检测，确定不同模板浓度相差较大时，各模板间是否存在干扰现象。
如图3所示，对不同浓度模拟混合感染样品的检测发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，二重荧光LAMP仍然可同时检测到两个模板，不影响彼此扩增结果，干扰性小。
6.临床样品的检测
利用实施例2步骤2建立的二重荧光LAMP方法，对保存在–70℃的83份牛鼻黏液棉拭子进行检测。牛鼻黏液拭子用双蒸馏水洗脱，参照全式金DNA/RNA共提试剂盒说明书抽提待测样品DNA。这些样品采自广西某牛场(该牛场2016-2018 年间陆续发生牛支原体病肺炎)，采集时牛没有表现临床症状，验证本方法对临床样品检测的准确性。
对83份临床样品的检测结果见表2，其中牛支原体阳性样品17份，感染率为20.5％；牛传染性鼻气管炎阳性样品9份，感染率为10.8％；牛支原体和牛传染性鼻气管炎混合感染样品6份，混合感染率为7.2％；与荧光定量PCR检测方法相比，检测MB的敏感性和特异性均为100％，检测IBRV的敏感性和特异性均为100％。结果表明二重荧光LAMP临床检测效果好。
表2临床样品检测结果
本发明通过设计多套引物，优化筛选特异性引物组合，最终成功建立了在同一反应管里鉴别诊断牛支原体和牛传染性鼻气管炎的二重荧光LAMP检测方法。二重荧光LAMP方法特异性好，敏感性高，最低能检测到1个混合模板拷贝/ 反应，反应时间快，全程只需要1个小时就能完成检测。综上所述，本发明所建立的MB和IBRV二重荧光LAMP方法是一种简便，快速，低成本的诊断方法，适用于大规模的流行病学调查。
Claims (8)
1.一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括MB-F3，MB-B3，MB-FIP，MB-BIP，以及MB-probe，第二组特异性引物和探针包括IBRV-F3，IBRV-B3，IBRV-FIP，IBRV-BIP，以及IBRV-probe，所述第一组和第二组特异性引物和探针依次为序列表中SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10所示核苷酸序列，或为将所述序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述序列表中所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；所述MB-probe的5’端标记CY 5.5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团，该CY 5.5荧光基团在694nm波长下呈大红色；所述IBRV-probe的5’端标记FITC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，该FITC荧光基团在520nm波长下呈黄绿色。
2.一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合物。
3.根据权利要求2所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Bst DNA 3.0聚合酶。
4.根据权利要求2或3所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每25ul反应体系中包括1μL DNA模板，10×缓冲液2.5μL，15U Bst DNA3.0聚合酶，MB-FIP、MB-BIP、IBRV-FIP、IBRV-BIP各40pmol,MB-F3、MB-B3、IBRV-B3、IBRV-F3各5pmol，MB-probe、IBRV-probe各0.1μM，加双蒸水补足至25μL。
5.一种检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的引物组合物或试剂盒进行环介导等温扩增反应。
6.根据权利要求5所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程包括60-70℃反应60分钟，80℃作用5min终止反应。
7.根据权利要求6所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应过程包括60℃反应60分钟，80℃作用5min终止反应。
8.权利要求1所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的引物组合物、权利要求2-4任一项所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的试剂盒、权利要求5-7任一项所述的检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎的方法在同时检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎中的应用。
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