CN110878250A - 基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法，芯片包括：微流道层，微流道层中形成有微流道；微通孔层，微通孔层中形成有多个微通孔，多个微通孔沿微流道的走向排布，且微通孔与微流道连通；第一封闭层，密封覆盖于微通孔层上，第一封闭层为透气而不透液的封闭层；以及第二封闭层，密封覆盖于微流道层上，第二封闭层中形成有与微流道连通的注入口。本发明通过微流道和微通孔以及透气不透液的封闭层的结合，采用施加液压的方式即可完成dPCR试剂的分散，解决了基于穿孔dPCR技术试剂需要通过刮涂完成液体分散的不便，同时有效解决基于穿孔dPCR技术试剂通过刮涂时样本的损失，可大大降低检验成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)提出至今已有20年时间，期间PCR已发展成为分子生物学领域的一项关键技术和常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。特别是90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(real time PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR由体外合成及定性/半定量检测技术发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的基因分析技术。
尽管经过十几年时间的迅速发展，qPCR技术已经用于除外伤和营养缺乏症外所有疾病的诊断，但是，在PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素有很多，不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导至其定量分析所依赖的基础——循环阈值(CT)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。
20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与qPCR不同的是，数字PCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量)，能够将误差控制在5％以内，数字PCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。
数字PCR(也可称单分子PCR)一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。
由于数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，相较于qPCR，能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠CT值不能很好分辨的应用领域，例如拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
目前市面上的数字PCR技术主要有三种。一种是通过在特定仪器中使用流动的油切断水相的PCR溶液形成液滴，然后在另外的两台仪器中完成PCR和检测；一种是通过将PCR溶液分布到挖空的硅片上，然后在特定仪器中进行PCR以及另外一台仪器中进行检测；最后一种是在一种仪器上将液体通过狭窄的沟道注入腔体形成液滴，并完成PCR，然后在另一台仪器中完成检测。由于刮涂的手工性，最后一种方法往往硅片上孔的填充率和重复性都不高，而且样本丢失严重。此外，刮涂限制了整个系统的自动化和小型化。这不但增加了仪器的购置的成本，限制了数字PCR的广泛使用，而且增加了实验操作的复杂度。
基于以上所述，提供一种可以利用微流控的自动化方法取代通孔dPCR的手动刮涂，从而提高通孔的填充率和实验重复性的dPCR原位芯片及制作方法实属必要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法，以利用微流控的自动化方法取代通孔dPCR的手动刮涂，从而提高通孔的填充率和实验重复性。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，包括：微流道层，所述微流道层中形成有微流道；微通孔层，所述微通孔层中形成有多个微通孔，所述多个微通孔沿所述微流道的走向排布，且所述微通孔与所述微流道连通；第一封闭层，密封覆盖于所述微通孔层上，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层；以及第二封闭层，密封覆盖于所述微流道层上，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
可选地，液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
可选地，所述微流道的宽度不小于所述微通孔的孔径。
可选地，所述微流道层及所述微通孔层分别形成于刚性基底的相对的第一面及第二面，且所述微通孔与所述微流道连通。
可选地，所述微通孔层包括刚性基底，所述微通孔贯穿所述刚性基底；所述微流道层包括光敏材料层，结合于所述刚性基底表面，所述微流道贯穿所述光敏材料层以与所述微通孔连通。
可选地，所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
可选地，所述二甲基硅氧烷PDMS与所述微通孔层通过氧等离子体处理后化学键合。
可选地，所述第二封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS及光刻材料中的一种。
可选地，所述微流道在所述微流道层中呈往返曲折延伸。
本发明还提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，包括步骤：1)提供一刚性基底，所述刚性基底包括相对的第一面及第二面；2)于所述刚性基底的第一面刻蚀出微沟道；3)于所述刚性基底的第二面刻蚀出多个微通孔，所述多个微通孔沿所述微流道的走向排布，且所述微通孔与所述微流道连通；4)于所述刚性基底的微通孔上密封覆盖第一封闭层，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层，于所述刚性基底的微流道上密封覆盖第二封闭层，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
可选地，液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
可选地，所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
可选地，所述第二封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS，步骤4)包括：同时对所述刚性基底具有微流道的第一面及具有微通孔的第二面进行氧等离子体处理，然后将所述第二封闭层与所述第一封闭层同时与所述刚性基底进行化学键合。
本发明还提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，包括步骤：1)提供一刚性基底，所述刚性基底包括相对的第一面及第二面，于所述刚性基底中刻蚀出贯穿所述刚性基底的微通孔；2)于所述刚性基底的第一面上形成微流道材料层，于所述微流道材料层中形成微流道，所述微流道贯穿所述微流道材料层以与所述微通孔连通；以及3)于所述刚性基底的第二面上密封覆盖第一封闭层，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层，于所述微流道材料层上密封覆盖第二封闭层，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
可选地，液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
可选地，所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
可选地，步骤3)先对所述刚性基底的第二面及所述第一封闭层进行氧等离子体处理，然后将所述刚性基底与所述第一封闭层进行化学键合。
可选地，所述第二封闭层的材质包括光刻材料。
如上所述，本发明的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法，具有以下有益效果：
1)本发明通过微流道和微通孔以及透气不透液的封闭层的结合，采用施加液压的方式即可完成dPCR试剂的分散，解决了基于穿孔dPCR技术试剂需要通过刮涂完成液体分散的不便。
2)本发明可以有效解决基于穿孔dPCR技术试剂通过刮涂时样本的损失，可大大降低检验成本。
3)本发明采用硅基底制作微通孔，降低了微通孔基体材料的热膨胀系数，可以解决操作时温度变化而引起反应体系差异过大的问题，从而使得每次检测中dPCR液滴具有较高的大小基本相同，提高检测的准确性。
4)本发明利用完整的半导体工艺的加工方式，保证了原位dPCR芯片的封闭性。
附图说明
图1显示为本发明的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的整体结构示意图。
图2显示为本发明的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的局部放大结构示意图。
图3显示为图2中的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的A-A’处的截面结构示意图。
图4显示为本发明的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的原理示意图。
图5显示为发明实施例2中的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法的步骤流程示意图，图6为该制作方法所呈现的结构示意图。
图7显示为发明实施例3中的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法的步骤流程示意图，图8为该制作方法所呈现的结构示意图。
元件标号说明
10 微流道层
101 微流道
11 微通孔层
111 微通孔
12 第二封闭层
121 注入口
13 第一封闭层
S11～S14 步骤
S21～S23 步骤
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
请参阅图1～图8。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图示中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
实施例1
如图1～图4所示，本实施例提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，包括：微流道层10、微通孔层11、第一封闭层13以及第二封闭层12。
如图1～图3所示，所述微流道层10中形成有微流道101，所述微流道101贯穿所述微流道层10，所述微流道101在所述微流道层10中呈往返曲折延伸，以提高所述微流道101在所述微流道层10中的密度，从而降低检验成本。
如图1～图3所示，所述微通孔层11中形成有多个微通孔111，所述多个微通孔111沿所述微流道101的走向排布，且所述微通孔111与所述微流道101连通；所述微流道101的宽度不小于所述微通孔111的孔径，以利于后续液相dPCR试剂在微流道101及微通孔111之间的压力的传递。
例如，所述微流道层10及所述微通孔层11分别形成于硅基底的相对的第一面及第二面，且所述微通孔111与所述微流道101连通。这种在硅基底两面分别制作微流道101及微通孔111的结构，可以大大提高结构的强度以及气密性，大大提高后液相dPCR试剂基于压力由微流道101进入微通孔111的稳定性。硅基底具有刚性强度大、加工工艺成熟的优点。当然，在其他的实施例中，也可以采用如玻璃基底等其他刚性基底，并不限于此处所列举的硅基底。
又例如，所述微通孔层11包括硅基底，所述微通孔111贯穿所述硅基底；所述微流道层10包括光敏材料层，结合于所述硅基底表面，所述微流道101贯穿所述光敏材料层以与所述微通孔111连通。这种结构的优点在于，只需要对硅基底进行一次加工，可以避免对硅基底进行二次加工而造成的缺陷，光敏材料只需通过光刻工艺即可完成微流道101的制作，加工较为简单，可有效降低工艺需求，且可以有效降低成本。硅基底具有刚性强度大、加工工艺成熟的优点。当然，在其他的实施例中，也可以采用如玻璃基底等其他刚性基底，并不限于此处所列举的硅基底。
本发明采用硅基底制作微通孔，降低了微通孔基体材料的热膨胀系数，可以解决操作时温度变化而引起反应体系差异过大的问题，从而使得每次检测中dPCR液滴具有较高的大小基本相同，提高检测的准确性。
如图1～图3所示，所述第一封闭层13密封覆盖于所述微通孔层11上，所述第一封闭层13为透气而不透液的封闭层；所述第二封闭层12密封覆盖于所述微流道层10上，所述第二封闭层12中形成有与所述微流道101连通的注入口121。
例如，所述第一封闭层13的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。所述二甲基硅氧烷PDMS与所述微通孔层11通过氧等离子体处理后化学键合。
所述第二封闭层12的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS及光刻材料中的一种。当然，所述第二封闭层12的材质也可以为其他的封口膜等材料，并不限于此处所列举的示例。
如图4所示，在使用的过程中，液相dPCR试剂通过所述注入口121进入所述微流道101，基于所述第一封闭层13的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔111。然后注入dPCR油填充并保持对所述注入口121的压力，该压力可以有效防止芯片内形成气泡，避免气泡对PCR温控过程的影响。
本发明通过微流道101和微通孔111以及透气不透液的封闭层的结合，采用施加液压的方式即可完成dPCR试剂的分散，解决了基于穿孔dPCR技术试剂需要通过刮涂完成液体分散的不便，同时，可以有效解决基于穿孔dPCR技术试剂通过刮涂时样本的损失，可大大降低检验成本。
实施例2
如图5及图6所示，本实施例提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，包括步骤：
如图5所示，首先进行步骤1)S11，提供一硅基底，所述硅基底包括相对的第一面及第二面，将所述硅基底通过如研磨等工艺减薄至所需厚度。硅基底具有刚性强度大、加工工艺成熟的优点。当然，在其他的实施例中，也可以采用如玻璃基底等其他刚性基底，并不限于此处所列举的硅基底。
如图5所示，然后进行步骤2)S12，于所述硅基底的第一面刻蚀出微沟道。例如，可以采用光刻工艺及等离子体刻蚀工艺与所述硅基底具有微流道101的第一面刻蚀出微沟道，所述微流道101在所述微流道层10中呈往返曲折延伸，以提高所述微流道101在所述微流道层10中的密度，从而降低检验成本。
如图5所示，接着进行步骤3)S13，采用硅穿孔工艺于所述硅基底的第二面刻蚀出多个微通孔111，所述多个微通孔111沿所述微流道101的走向排布，且所述微通孔111与所述微流道101连通；所述微流道101的宽度不小于所述微通孔111的孔径，以利于后续液相dPCR试剂在微流道101及微通孔111之间的压力的传递。
本发明在硅基底两面分别制作微流道101及微通孔111的结构，可以大大提高结构的强度以及气密性，大大提高后液相dPCR试剂基于压力由微流道101进入微通孔111的稳定性。
如图5及图6所示，其中，图6显示为本实施例的制作方法所呈现的分解结构示意图，最后进行步骤4)S14，于所述硅基底的微通孔111上密封覆盖第一封闭层13，所述第一封闭层13为透气而不透液的封闭层，于所述硅基底的微流道101上密封覆盖第二封闭层12，所述第二封闭层12中形成有与所述微流道101连通的注入口121。
例如，所述第一封闭层13的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。所述第二封闭层12的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS，步骤4)包括：同时对所述硅基底具有微流道101的第一面及具有微通孔111的第二面进行氧等离子体处理，然后将所述第二封闭层12与所述第一封闭层13同时与所述硅基底进行化学键合。本步骤可以避免氧气等离子对硅基底表面的重复处理，进一步地，在氧气等离子处理后，所述化学键合的时间不超过2～3分钟，以加强所述第一封闭层13及所述第二封闭层12与所述硅基底的结合强度。当然，所述第二封闭层12的材质也可以为其他的封口膜等材料，也可以采用其他键合方式，又或者在组装时通过机械压紧的方式进行密封，并不限于此处所列举的示例。
如图4所示，在使用的过程中，液相dPCR试剂通过所述注入口121进入所述微流道101，基于所述第一封闭层13的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔111。然后注入dPCR油填充并保持对所述注入口121的压力，该压力可以有效防止芯片内形成气泡，避免气泡对PCR温控过程的影响。
实施例3
本实施例提供一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，包括步骤：
如图7所示，首先进行步骤1)S21，提供一硅基底，所述硅基底包括相对的第一面及第二面，将所述硅基底通过如研磨等工艺减薄至所需厚度后，采用硅穿孔工艺于所述硅基底中刻蚀出贯穿所述硅基底的微通孔111。硅基底具有刚性强度大、加工工艺成熟的优点。当然，在其他的实施例中，也可以采用如玻璃基底等其他刚性基底，并不限于此处所列举的硅基底。
如图7所示，然后进行步骤2)S22，于所述硅基底的第一面上形成光敏材料层，采用光刻工艺于所述光敏材料层中形成微流道101，所述微流道101贯穿所述光敏材料层以与所述微通孔111连通。，所述微流道101在所述光敏材料层中呈往返曲折延伸，以提高所述微流道101在所述光敏材料层中的密度，从而降低检验成本。
本实施例只需要对硅基底进行一次加工，可以避免对硅基底进行二次加工而造成的缺陷，光敏材料只需通过光刻工艺即可完成微流道101的制作，加工较为简单，可有效降低工艺需求，且可以有效降低成本。当然，在其他的实施例中，也可以采用如玻璃、硅、塑料(如PDMS)等可以用来制作微流道的材料，并不限于此处所列举的光敏材料。相应地，所述微流道的制作工艺不限制于曝光，也可以用湿法刻蚀、机加工等。
如图7及图8所示，其中，图8显示为本实施例的制作方法所呈现的分解结构示意图，最后进行步骤3)S23，于所述硅基底的第二面上密封覆盖第一封闭层13，所述第一封闭层13为透气而不透液的封闭层，于所述光敏材料层上密封覆盖第二封闭层12，所述第二封闭层12中形成有与所述微流道101连通的注入口121。
例如，所述第一封闭层13的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。先对所述硅基底的第二面及所述第一封闭层13进行氧等离子体处理，然后将所述硅基底与所述第一封闭层13进行化学键合。
所述第二封闭层12的材质包括光刻材料，直接采用所述光刻材料对所述微流道101进行密封处理即可，采用与所述微流道层10材料相同的光刻材料进行密封，可以有效提高密封的气密性及强度。当然，所述第二封闭层12的材质也可以为聚二甲基硅氧烷PDMS或其他的封口膜等材料，并不限于此处所列举的示例。
如图4所示，在使用的过程中，液相dPCR试剂通过所述注入口121进入所述微流道101，基于所述第一封闭层13的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔111。然后注入dPCR油填充并保持对所述注入口121的压力，该压力可以有效防止芯片内形成气泡，避免气泡对PCR温控过程的影响。
如上所述，本发明的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片及制作方法，具有以下有益效果：
1)本发明通过微流道101和微通孔111以及透气不透液的封闭层的结合，采用施加液压的方式即可完成dPCR试剂的分散，解决了基于穿孔dPCR技术试剂需要通过刮涂完成液体分散的不便。
2)本发明可以有效解决基于穿孔dPCR技术试剂通过刮涂时样本的损失，可大大降低检验成本。
3)本发明采用硅基底制作微通孔，降低了微通孔基体材料的热膨胀系数，可以解决操作时温度变化而引起反应体系差异过大的问题，从而使得每次检测中dPCR液滴具有较高的大小基本相同，提高检测的准确性。
4)本发明利用完整的半导体工艺的加工方式，保证了原位dPCR芯片的封闭性。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (18)
1.一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于，包括：
微流道层，所述微流道层中形成有微流道；
微通孔层，所述微通孔层中形成有多个微通孔，所述多个微通孔沿所述微流道的走向排布，且所述微通孔与所述微流道连通；
第一封闭层，密封覆盖于所述微通孔层上，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层；以及
第二封闭层，密封覆盖于所述微流道层上，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
2.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
3.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述微流道的宽度不小于所述微通孔的孔径。
4.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述微流道层及所述微通孔层分别形成于刚性基底的相对的第一面及第二面，且所述微通孔与所述微流道连通。
5.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：
所述微通孔层包括刚性基底，所述微通孔贯穿所述刚性基底；
所述微流道层包括光敏材料层，结合于所述刚性基底表面，所述微流道贯穿所述光敏材料层以与所述微通孔连通。
6.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
7.根据权利要求6所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述二甲基硅氧烷PDMS与所述微通孔层通过氧等离子体处理后化学键合。
8.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述第二封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS及光刻材料中的一种。
9.根据权利要求1所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片，其特征在于：所述微流道在所述微流道层中呈往返曲折延伸。
10.一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于，包括步骤：
1)提供一刚性基底，所述刚性基底包括相对的第一面及第二面；
2)于所述刚性基底的第一面刻蚀出微沟道；
3)于所述刚性基底的第二面刻蚀出多个微通孔，所述多个微通孔沿所述微流道的走向排布，且所述微通孔与所述微流道连通；
4)于所述刚性基底的微通孔上密封覆盖第一封闭层，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层，于所述刚性基底的微流道上密封覆盖第二封闭层，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
11.根据权利要求10所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
12.根据权利要求10所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
13.根据权利要求12所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：所述第二封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS，步骤4)包括：同时对所述刚性基底具有微流道的第一面及具有微通孔的第二面进行氧等离子体处理，然后将所述第二封闭层与所述第一封闭层同时与所述刚性基底进行化学键合。
14.一种基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于，包括步骤：
1)提供一刚性基底，所述刚性基底包括相对的第一面及第二面，于所述刚性基底中刻蚀出贯穿所述刚性基底的微通孔；
2)于所述刚性基底的第一面上形成微流道材料层，于所述微流道材料层中形成微流道，所述微流道贯穿所述微流道材料层以与所述微通孔连通；
3)于所述刚性基底的第二面上密封覆盖第一封闭层，所述第一封闭层为透气而不透液的封闭层，于所述微流道材料层上密封覆盖第二封闭层，所述第二封闭层中形成有与所述微流道连通的注入口。
15.根据权利要求14所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：液相dPCR试剂通过所述注入口进入所述微流道，基于所述第一封闭层的透气而不透液，通过压力将所述液相dPCR试剂充满每个所述微通孔。
16.根据权利要求14所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：所述第一封闭层的材质包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
17.根据权利要求16所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：步骤3)先对所述刚性基底的第二面及所述第一封闭层进行氧等离子体处理，然后将所述刚性基底与所述第一封闭层进行化学键合。
18.根据权利要求14所述的基于通孔结构和微流控的dPCR原位芯片的制作方法，其特征在于：所述第二封闭层的材质包括光刻材料。
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