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CN110863063B - 与黄瓜开花时间性状相关的分子标记 - Google Patents

与黄瓜开花时间性状相关的分子标记 Download PDF

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CN110863063B CN201911285375.6A CN201911285375A CN110863063B CN 110863063 B CN110863063 B CN 110863063B CN 201911285375 A CN201911285375 A CN 201911285375A CN 110863063 B CN110863063 B CN 110863063B
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Northwest A&F University
Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
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Abstract

本发明提供了一种与黄瓜开花时间性状相关的分子标记，涉及生物育种的技术领域。与黄瓜开花时间性状相关的分子标记，包括Csa1G651710基因上游区域的short‑1、short‑2和long三种DNA序列。本发明还公开了鉴定或辅助鉴定黄瓜开花时间性状的方法，鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short‑1、short‑2或long三种DNA序列中的一种或多种。所述的分子标记和鉴定方法可以在黄瓜发育早期，通过利用所述的分子标记对样品DNA进行鉴定确定黄瓜开花时间的早晚表型，大大的节约时间成本和人力物力成本，促进了黄瓜早开花或者晚开花品种的选育进程，提高育种效率。

Description

与黄瓜开花时间性状相关的分子标记
技术领域
本发明涉及生物育种的技术领域，具体涉及一种与黄瓜开花时间性状相关的分子标记。
背景技术
黄瓜是世界上重要的蔬菜作物，是中国保护地栽培中第二大蔬菜作物，其生育期在商业化生产中非常重要。开花时间是植物从营养生长转向生殖生长的重要节点，是决定生育期的一个重要性状，受到外界环境和内源基因的共同调节。黄瓜早开花性状是影响黄瓜早熟性的重要性状之一，而早熟性直接影响早期产量，决定着保护地栽培中黄瓜生产早期的经济效益。同时，早开花早熟黄瓜品种缩短了生育期，可以在一定程度上节约生育期内的用水总量，在秋季茬口早熟还有利于避免低温带来的生产损害，所以早开花(早熟)的性状利于干旱和寒冷地区的黄瓜生产。在某种适宜生长的环境下(例如在热带或者亚热带地区)，晚开花的黄瓜种质虽然生育期较长，但是植株健壮，后期的黄瓜产量也较高。黄瓜的开花时间是一个重要的农艺性状。
在育种的过程中，对不同黄瓜材料的开花时间的筛选，往往需要将黄瓜材料进行种植，并在成株期观察开花时间，才能够确定该黄瓜材料的开花时间早晚的表型。这种传统方式的鉴定，具有严重的滞后性，耗费大量的时间，也消耗了大量的人力和物力，影响了黄瓜育种效率。
发明内容
有鉴于此，本发明致力于提供一种黄瓜开花时间性状相关的分子标记，可以在黄瓜发育早期，通过利用所述的分子标记对样品DNA进行鉴定确定黄瓜开花时间的早晚表型，大大的节约时间成本和人力物力成本，促进了黄瓜早开花或者晚开花品种的选育进程，提高育种效率。
本发明一方面提供了一种与黄瓜开花时间性状相关的分子标记，包括Csa1G651710基因上游区域的short-1、short-2和long三种DNA序列。
Csa1G651710基因是拟南芥成花素基因Flowering Locus T(拟南芥中该成花素基因具有调节开花时间的功能)的直系同源基因，两者的CDS序列一致性约为74％，氨基酸序列的一致性约为78％。Csa1G651710基因的表达情况与黄瓜开花时间的早晚密切相关，Csa1G651710基因在早开花黄瓜中的表达量显著的高于晚开花黄瓜。
本发明通过分析大量的黄瓜种质，发现位于黄瓜基因组1号染色体Csa1G651710基因上游约16.5kb-28.7kb处，物理区间为25,870,000-25,890,000中存在short-1、short-2和long三种DNA序列。
本发明中Csa1G651710基因上游区域的三种DNA序列(short-1、short-2和long)的位置是基于黄瓜9930参考基因组序列V2版本(http://cucurbitgenomics.org)确定的，本发明中所述的基因Csa1G651710也是基于黄瓜9930参考基因组序列V2版本(http://cucurbitgenomics.org)确定的。
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA序列。与含有long分子标记的黄瓜基因组相比，short-1分子标记为Csa1G651710基因上游约16.5kb处缺失了约39.9kb的核苷酸序列，short-2分子标记为Csa1G651710基因上游约28.7kb处缺失了约16.2kb的核苷酸序列。
通过大量的黄瓜种质重测序数据分析，还基于结构变异断裂位点的位置，分析获得了short-1、short-2和long三种分子标记的的核心保守序列。
进一步，所述short-1的核心DNA序列包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或，2)SEQ ID NO.1所示的DNA序列的互补序列或同源序列。
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相似度约90％或以上、约91％或以上、约92％或以上、约93％或以上、约94％或以上、约95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.9％或以上的DNA序列。
优选地，所述互补序列为能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
示例性地，所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针至少90％互补的靶序列。
进一步，所述short-2的核心DNA序列包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO.2所示的DNA序列；或，2)SEQ ID NO.2所示的DNA序列的互补序列或同源序列。
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相似度约90％或以上、约91％或以上、约92％或以上、约93％或以上、约94％或以上、约95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.9％或以上的DNA序列。
优选地，所述互补序列为能够与SEQ ID NO.2的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
进一步，long的核心DNA序列包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO.3所示的DNA序列；或，2)SEQ ID NO.3所示的DNA序列的互补序列或同源序列。
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列相似度约85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上的DNA序列。
优选地，所述互补序列为能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
开发与黄瓜开花时间直接相关的分子标记，可以在黄瓜发育早期，通过利用分子标记对样品DNA进行分析鉴定黄瓜开花时间的早晚表型，大大的节约时间成本和人力物力成本，具有重要的应用价值。
本发明二方面提供了一种鉴定或辅助鉴定黄瓜开花时间性状的方法，鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long三种DNA序列中的一种或多种。
由于黄瓜Csa1G651710基因上游区域存在short-1、short-2或long三种DNA序列不同而有不同的开花时间，如：Csa1G651710基因上游中存在short-1和/或short-2，黄瓜的开花时间显著的早于只含有long DNA序列的黄瓜；Csa1G651710基因上游中只存在short-2DNA序列时，黄瓜的开花时间略早于只含有short-1DNA序列的黄瓜；Csa1G651710基因上游中只存在long DNA序列时，开花时间最晚。
所以，通过鉴定Csa1G651710基因上游区域存在short-1、short-2或long中的哪一种或哪几种，就可以在黄瓜发育早期，通过分子标记来鉴定黄瓜开花时间的早晚表型，有利于黄瓜开花时间性状的早期预测和筛选，为黄瓜开花时间性状的分子标记辅助选择育种提供理论依据，促进了黄瓜早开花或者晚开花品种的选育进程。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，通过全基因组测序的方法，鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，采用DNA探针鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
DNA探针是最常用的核酸探针，为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂(如同位素、酶或有色基团)进行标记。根据short-1、short-2或long的核心保守序列开发相应的DNA探针，在适当的pH值、温度和离子强度下，与待测样本中互补的非标记单链DNA(short-1、short-2或long的核心保守序列)，杂交形成双链复合物，用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果，来达到鉴定的目的。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，采用PCR引物，或含有所述PCR引物的试剂，或含有所述PCR引物和/或所述试剂的试剂盒进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行分析，鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
需要说明的是，“含有所述PCR引物和/或所述试剂的试剂盒”中的“和/或”代表三种意思：1)含有所述PCR引物的试剂盒；2)含有所述试剂的试剂盒；3)含有所述PCR引物和所述试剂的试剂盒。
对扩增short-1、short-2或long的PCR引物的具体序列不作限定，凡是能够特异性扩增所述三种分子标记的DNA序列的引物均在本发明的保护范围之内。
在本发明的一种实施方式中，以黄瓜的基因组为模板，采用PCR引物，或含有所述PCR引物的试剂，或含有所述PCR引物和/或所述试剂的试剂盒进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序，和/或对PCR产物进行分型鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR引物包括：
扩增所述short-1的引物包括上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5′-CGAAGTAATGAGATCTGTAGCCTCTGA-3′(SEQ ID NO.4)的序列；下游引物包含5′-GTTCATTATTCATCTATTTTCATCTCGG-3′(SEQ ID NO.5)的序列；
扩增所述short-2的引物包括上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5′-AATGAAGCTATCTTGACGCAAT-3′(SEQ ID NO.6)的序列；下游引物包含5′-GGCCTGCTAAAACACGACTTAC-3′(SEQ ID NO.7)的序列；
扩增所述long的引物包括上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5′-ATAAGGTGGCATAAAGATAAACGA-3′(SEQ ID NO.8)的序列；下游引物包含5′-GTGTGTAGACTTCTCTCAATGGG-3′(SEQ ID NO.9)的序列。
本发明三方面提供了所述与黄瓜开花时间性状相关的分子标记，或所述的鉴定或辅助鉴定黄瓜开花时间性状的方法在鉴定或者辅助鉴定黄瓜开花时间中的应用。
本发明四方面提供了一种早开花黄瓜的育种方法，包含所述short-1和/或short-2，但不含long分子标记的黄瓜进行自交或杂交，获得早开花黄瓜。
本发明研究发现黄瓜基因组中包含所述short-1和/或short-2，但不含long分子标记的黄瓜均出现早开花的性状，以该早开花的黄瓜为亲本进行自交或杂交，获得的后代均为早开花黄瓜。
在本发明的一种实施方式中，以黄瓜基因组中只包含所述short-1分子标记(即short-1纯合，Csa1G651710基因上游约16.5kb处的两条DNA单链均缺失了约39.9kb的核苷酸序列)的黄瓜为亲本进行自交或杂交，获得的后代均为早开花黄瓜。
在本发明的一种实施方式中，以黄瓜基因组中只包含所述short-2分子标记(即short-2纯合，Csa1G651710基因上游约28.7kb处的两条DNA单链均缺失了约16.2kb的核苷酸序列)的黄瓜为亲本进行自交或杂交，获得的后代均为早开花黄瓜。
在本发明的一种实施方式中，以黄瓜基因组中只包含所述short-1和short-2分子标记(即short-1和short-2杂合，一条DNA单链的Csa1G651710基因上游约16.5kb处缺失了约39.9kb的核苷酸序列，另一条DNA单链Csa1G651710基因上游约28.7kb处缺失了约16.2kb的核苷酸序列)的黄瓜为亲本进行自交或杂交，获得的后代均为早开花黄瓜。
本发明五方面提供了一种晚开花黄瓜的育种方法，包含所述long，但不含short-1和short-2分子标记的黄瓜进行自交或杂交，获得晚开花黄瓜。
本发明研究发现黄瓜基因组中只包含所述long分子标记的黄瓜大概率的(85％概率)出现晚开花的性状，以含有long分子标记的晚开花的黄瓜为亲本进行自交或杂交，获得的后代均为晚开花黄瓜。
利用分子标记对黄瓜的开花时间进行鉴定，可以在黄瓜发育早期鉴定黄瓜开花时间的早晚表型，可加速育种进程，减少育种工作量，提高育种效率。
本发明六方面提供了所述早开花黄瓜的育种方法，或所述晚开花黄瓜的育种方法获得的黄瓜材料；优选地，所述黄瓜材料包括黄瓜种质、黄瓜株系、黄瓜品系、黄瓜杂合商品种。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明开发与黄瓜开花时间直接相关的分子标记，可以在黄瓜发育早期，通过对样品DNA中分子标记的类型分析来鉴定黄瓜开花时间的早晚表型，大大的节约时间成本和人力物力成本，具有重要的应用价值；
(2)本发明通过分子标记鉴定黄瓜开花时间的早晚表型，有利于黄瓜开花时间性状的早期预测和筛选，为黄瓜开花时间性状的分子标记辅助选择育种提供理论依据，促进了黄瓜早开花或者晚开花品种的选育进程；
(3)利用本发明所提供的Csa1G651710基因上游区域的三种分子标记(short-1、short-2和long)对黄瓜的开花时间性状的鉴定结果，与直接观测黄瓜开花时间的鉴定结果相比较，准确率达到了94％。
附图说明
图1所示为实施例1的实验结果图，其中，A为东亚黄瓜404、404-F1代和404-晚株系的开花图；B为东亚黄瓜404、404-F1代和404-晚株系的开花时间统计图；C为亲本CG9192和404，以及几种404-晚株系的基因组基因型对比示意图；D为对晚开花遗传位点Lf1.1的遗传定位示意图；E为东亚黄瓜404、404-F1代和404-晚株系中Csa1G651710基因表达情况统计图。
图2所示为实施例2的实验结果图，其中，A为东亚9930、9930-F1代和9930-早株系的开花图；B为东亚9930、9930-F1代和9930-早株系的开花时间统计图；C为利用重组单株的基因型和开花时间表型，对早开花遗传位点Ef1.1的遗传定位示意图；D为C中1号染色体25,845,628到25,891,993区间的放大示意图；E为东亚9930、9930-F1代和9930-早株系中Csa1G651710基因表达情况统计图。
图3所示为实施例3中，在基因Csa1G651710上游100kb区间，举例展示黄瓜核心种质中reads覆盖情况统计图。
图4所示为实施例3中针对short-1、short-2、long三种分子标记设计引物的示意图。
图5所示为实施例3中short-1、short-2、long三种分子标记的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1黄瓜晚开花遗传位点Lf1.1的定位克隆
以开花时间较晚的西双版纳种质CG9192为供体亲本，以开花时间较早的东亚黄瓜404为受体亲本，构建近等基因系，经过回交3代自交2代，获得背景为404的晚开花株系404-晚。研究发现404-晚株系比种质404开花时间晚约40天(如图1中A和B所示)；同时发现所有的404-晚株系在1号染色体的末端包含一个共同区域(25.2Mb-28.1Mb)(如图1中C所示)，表明该区域存在赋予晚开花性状的遗传因子。
为了克隆晚开花位点Lf1.1，构建了近等基因系遗传分离群体约3000单株，将调控黄瓜晚开花位点Lf1.1定位在1号染色体末端标记SNP1和SNP2之间的约36kb的物理区间(9930参考基因组V2版本http://cucurbitgenomics.org，黄瓜1号染色体25,868,566到25,904,403)，在相应的F3世代中也证实了SNP1和SNP2标记之间的重组事件。检测了该36kb区间内的所有变异包括SNP、InDel和SV，最终发现该区间在双亲间仅存在一个变异，即西双版纳种质CG9192相对于东亚黄瓜404多了一段大约39.9kb的核苷酸序列(如图1中D所示)，命名为long分子标记。
检测了该39.9kb序列周围的基因，只有一个基因Csa1G651710在近等基因系里有显著性差异表达，即相对于种质404，404-晚株系中的Csa1G651710基因的表达下调了约85％(如图1中E所示)。来自于晚开花种质CG9192的39.9kb序列位于黄瓜Csa1G651710基因上游约16.5kb的区域，由此推测该39.9kb序列可能导致了黄瓜Csa1G651710基因表达下调，进而导致了黄瓜晚开花。
实施例2黄瓜早开花遗传位点Ef1.1的定位克隆
本发明研究发现黄瓜种质CG5479(欧亚型)的开花时间比种质9930(东亚型)早了约7天。为了克隆来自于种质CG5479的早开花Ef1.1遗传位点，以黄瓜CG5479为供体亲本，以东亚黄瓜9930为受体亲本，构建近等基因系，经过回交3代自交2代，获得了背景为9930的早开花株系9930-早，9930-早株系比种质9930开花时间早约7天(如图2中A和B所示)。为了克隆早开花遗传位点Ef1.1，构建了一个包含4320单株的BC3F2群体。
通过图位克隆的方法，将早开花遗传位点Ef1.1定位在1号染色体上的约46kb的物理区间，该区间介于SNP25845628和SNP25891993标记之间(9930参考基因组V2版本http://cucurbitgenomics.org，黄瓜1号染色体的25,845,628到25,891,993)(如图2中C所示)。在相应的F3世代中也证实了两种标记之间的重组事件。比较了9930和CG5479在定位区间46kb的序列差异，并鉴定了Csa1G651710基因上游16.5kb和28.7kb处存在2个结构变异(如图2中D所示)。检测2个结构变异周围的基因，只有一个基因Csa1G651710在近等基因系(9930-早和9930)里有显著性差异表达(如图2中E所示)，这表明基因上游的这两个结构变异可能影响了成花素基因Csa1G651710表达。
通过与以野生黄瓜CG0002基因组(参见http://cucurbitgenomics.org)比较，发现2个结构变异是：一个是种质9930相对于CG0002在基因Csa1G651710上游缺少39.9kb序列，命名为short-1分子标记；另一个是种质CG5479相对于CG0002在基因Csa1G651710上游缺少16.2kb序列，命名为short-2分子标记。通过在近等基因系(9930-早和9930)对基因Csa1G651710的表达检测结果，推测16.2kb的缺失比39.9kb的缺失，更能促进Csa1G651710的基因表达来促使黄瓜早开花。
实施例3验证Csa1G651710基因上游区域的三种类型的结构变异
实施例1和实施例2的研究结果表明，成花素基因Csa1G651710上游的区域存在着多种类型的结构变异，且这些结构变异影响着成花素基因Csa1G651710的表达。为了进一步全面的、清晰的分析成花素基因Csa1G651710上游区域的结构变异，利用已经发表的115份黄瓜核心种质重测序数据，以野生黄瓜基因组CG0002作为参考，分析了基因Csa1G651710位点的104.5kb区域(起始密码子上游的100kb区域和4.5kb基因区域)测序reads覆盖情况。
115份黄瓜核心种质重测序数据和野生黄瓜基因组CG0002的数据来源于文献Jianjian Qi,Xin Liu,Di Shen,Han Miao,Bingyan Xie,Xixiang Li,Peng Zeng,ShenhaoWang，et al.A genomic variation map provides insights into the genetic basisof cucumber domestication and diversity.Nature Genetics 2013(45):1510–1515。通过以上分析揭示了成花素基因Csa1G651710的上游区域存在三种类型结构变异，其大小各不相同：分别称为“long”，“short-1”和“short-2”(如图3所示)。
通过115份黄瓜核心种质重测序数据分析，还基于结构变异断裂位点的位置，分析获得了Csa1G651710的上游区域的三种类型结构变异的保守序列，即Csa1G651710的上游区域short-1类型结构变异的核心DNA序列如SEQ ID NO.1所示，short-2类型结构变异的核心DNA序列如SEQ ID NO.2所示，long类型结构变异的核心DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
如图4和图5所示，设计三对引物，以待检测黄瓜的DNA为模板，经过PCR反应后，通过检测PCR产物大小可以确认三种类型的存在，或者通过Sanger测序PCR产物验证三种类型的结构变异的存在。
其中，扩增包括上述Csa1G651710基因上游区域的short-1类型结构变异的引物，上游引物为5′-CGAAGTAATGAGATCTGTAGCCTCTGA-3′(SEQ ID NO.4)的序列；
下游引物为5′-GTTCATTATTCATCTATTTTCATCTCGG-3′(SEQ ID NO.5)的序列，扩增PCR产物大小约为1.1kb。
扩增包括上述Csa1G651710基因上游区域的short-2类型结构变异的引物，上游引物为5′-AATGAAGCTATCTTGACGCAAT-3′(SEQ ID NO.6)的序列；下游引物为5′-GGCCTGCTAAAACACGACTTAC-3′(SEQ ID NO.7)的序列，扩增PCR产物大小约为2.0kb。
扩增包括上述Csa1G651710基因上游区域的long类型结构变异的引物，上游引物为5′-ATAAGGTGGCATAAAGATAAACGA-3′(SEQ ID NO.8)的序列；下游引物为5′-GTGTGTAGACTTCTCTCAATGGG-3′(SEQ ID NO.9)的序列，扩增PCR产物大小约为1.3kb。
实施例4 short-1、short-2和long三种分子标记在鉴定或者辅助鉴定黄瓜开花时间中的应用
随机选取88份黄瓜种质，如表1所示，提取这些种质的DNA为模板，使用实施例3中检测Csa1G651710上游区域结构变异的三对引物进行PCR扩增，通过检测PCR产物大小可以确认三种类型的存在，或者将得到的PCR产物进行测序。
按下述方法确定待测黄瓜基因Csa1G651710的上游区域三种类型结构变异：(1)若所述PCR产物只检测到short-1类型的条带，或者PCR产物测序只有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，则待测黄瓜Csa1G651710基因上游区域结构变异为short-1类型；(2)若所述PCR产物只检测到short-2类型的条带，或者PCR产物测序只有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，则待测黄瓜Csa1G651710基因上游区域结构变异为short-2类型；(3)若所述PCR产物只检测到long类型的条带，或者PCR产物测序只有SEQ ID NO.3的核苷酸序列，则待测黄瓜Csa1G651710基因上游区域结构变异为long类型。
其中，PCR反应体系为：10-20ng/μL模板DNA 1μL，10pmol/μL上游引物和下游引物各1μL，10mmol/L dNTP mix 0.4μL，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，10×PCR反应缓冲液2μL，余量为水。PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，35个循环；72℃10分钟。
将黄瓜开花时间(从黄瓜种子播种到黄瓜植株开花的时间)小于50天定义为早开花性状，将黄瓜开花时间大于60天定义为晚开花性状。在全部88个黄瓜种质中，Csa1G651710基因上游区域结构变异为long类型的黄瓜的平均开花时间天数，显著长于结构变异为short-1和/或short-2黄瓜的平均开花时间天数。表1的检测结果显示，short-1类型分子标记和short-2类型分子标记的检测结果准确率均为100％，long类型的分子标记的检测结果准确率均为85％。总体上，所述三种类型的分子标记在检测88个黄瓜种质时，有83个黄瓜种质的检测结果符合预期，总体的准确率为94％。
表1 88个黄瓜种质的开花时间和三种类型的结构变异
Figure BDA0002317832820000131
Figure BDA0002317832820000141
Figure BDA0002317832820000151
实施例5一种早开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG1031为早开花种质，CG1031的基因组中只包含short-1分子标记，CG1031进行自交获得的后代均为早开花黄瓜材料。
实施例6一种早开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG1031和CG1043为早开花种质，CG1031和CG1043的基因组中只包含short-1分子标记，CG1031和CG1043为亲本进行杂交，获得的后代均为早开花黄瓜材料。
实施例7一种早开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG5232为早开花种质，CG5232的基因组中只包含short-2分子标记，CG5232进行自交获得的后代均为早开花黄瓜材料。
实施例8一种早开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG5232和CG5234为早开花种质，CG5232和CG5234的基因组中只包含short-2分子标记，CG5232和CG5234为亲本进行杂交，获得的后代均为早开花黄瓜材料。
实施例9一种晚开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG0020为晚开花种质，CG0020的基因组中只包含long分子标记，CG0020进行自交获得的后代均为晚开花黄瓜材料。
实施例10一种晚开花黄瓜的育种方法
黄瓜CG0020和CG0001为晚开花种质，CG0020和CG0001的基因组中只包含long分子标记，CG0020和CG0001为亲本进行杂交，获得的后代均为晚开花黄瓜材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 西北农林科技大学
中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与黄瓜开花时间性状相关的分子标记
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 黄瓜核苷酸序列
<400> 1
agtcattgcc tctaactcat gttttgctct catttgtaca 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 黄瓜核苷酸序列
<400> 2
tggcataaag ataatgtaca tgtgttcagt tgtgttgtat 40
<210> 3
<211> 1321
<212> DNA
<213> 黄瓜核苷酸序列
<400> 3
cataaggtgg cataaagata aacgagtcaa aatagaggat gtgttgagac atccagctga 60
tgcagagaga tggaagcatt ttaattatga ttttttttga gttcgtttca aattcacgga 120
acgttcgttt gggattagat tctgattggt ttaatttgtt tagccatata agtacctcat 180
acagtatgtg gcttgtggtg ttaattcctt acaatttgac atcttgaaaa tgcatgaaag 240
agtctaactt cttcatgtca ttgctcgtat tcggtccaag atatcctggt agagaaattg 300
atgtttacct ccaaccattg attgaggaac tgaaagagtt atggtgtttt ggtgtgcgta 360
tgtatgattc tcttatcgat caattctttc agttgtatac agctttgttg tggacaatta 420
ttggcttttc agtgtatggt gacttatctg agtggagtat gaaagggtat taggcaagtt 480
ccatatgcat gggagataaa tcatcatttg ggataagagg gaaaatatct ttcatggggc 540
accaacatta tctttcagat aaccatgttt agcatagacg taagttacat gatggaagtg 600
tagagtgtaa acctcctcta gttgtactta atcgacatga tatcttggaa caactgaatt 660
cactggagtt tccagtgatg agtaaagaaa aaaagctcta aattggacga agggaattat 720
ctttttcgaa cttcattatt gagcaagttt gctaatatat cataaattgg atgtaatgca 780
tattaaaaag aatctttgac aacttggtcg gtacatttta aaaatattga aggaaaaacg 840
aaggatacta tgaatgctct actggacctc catgatttga aaatagtaag gatttacacc 900
tcatagaagt tagtaataga ttgatgaagc caaatgaaag ttacatgttg actaacagat 960
agtgagttac gttttagaag tatctaaaat ctattaaatt tcgcaatgga ttcatttcta 1020
atatttcata atgtgtgaat aaaaaaaatg gaaaaatatc cgttcttaag acccacgact 1080
gtcatctttt actacattga cttctatcta ttggtgtttg agcatatata cttatagaaa 1140
aatgtgtaca ctattgttac tgcattgtgc agtttttttg tgacttgtgt gcaagaacga 1200
taagagtaag tgatttcttc agcataatga tacaccttgc tgttcactta ttgtatgaaa 1260
caaaagtcga tggtccgatt aattatagtt agatgtatcc cattgagaga agtctacaca 1320
c 1321
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaagtaatg agatctgtag cctctga 27
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttcattatt catctatttt catctcgg 28
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatgaagcta tcttgacgca at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcctgctaa aacacgactt ac 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ataaggtggc ataaagataa acga 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtgtgtagac ttctctcaat ggg 23

Claims (8)

1.与黄瓜开花时间性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Csa1G651710基因上游区域的short-1、short-2和long；
所述short-1的DNA序列为：1）SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或，2）SEQ ID NO.1所示的DNA序列的互补序列；
所述short-2的DNA序列为：1）SEQ ID NO.2所示的DNA序列；或，2）SEQ ID NO.2所示的DNA序列的互补序列；
所述long的DNA序列为：1）SEQ ID NO.3所示的DNA序列；或，2）SEQ ID NO.3所示的DNA序列的互补序列；
包含所述long的黄瓜比包含short-1或short-2的黄瓜开花时间晚。
2.一种鉴定或辅助鉴定黄瓜开花时间性状的方法，其特征在于，鉴定黄瓜的基因组中是否包含权利要求1所述的short-1、short-2或long中的一种或多种；包含所述long的黄瓜比包含short-1或short-2的黄瓜开花时间晚。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括采用全基因组测序鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种；
或者，采用DNA探针鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用PCR引物，或含有所述PCR引物的试剂，或含有所述PCR引物的试剂盒进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行分析，鉴定黄瓜的基因组中是否包含所述的short-1、short-2或long中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR引物包括：
扩增所述short-1的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.4所示的序列：5′-CGAAGTAATGAGATCTGTAGCCTCTGA-3′；下游引物为SEQ ID NO.5所示的序列：5′-GTTCATTATTCATCTATTTTCATCTCGG-3′；和，
扩增所述short-2的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.6所示的序列5′-AATGAAGCTATCTTGACGCAAT-3′；下游引物为SEQ ID NO.7所示的序列：5′-GGCCTGCTAAAACACGACTTAC-3′；和，
扩增所述long的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.8所示的序列：5′-ATAAGGTGGCATAAAGATAAACGA-3′；下游引物为SEQ ID NO.9所示的序列：5′-GTGTGTAGACTTCTCTCAATGGG-3′。
6.检测权利要求1所述分子标记的引物在鉴定或者辅助鉴定黄瓜开花时间中的应用，
扩增所述short-1的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.4所示的序列：5′-CGAAGTAATGAGATCTGTAGCCTCTGA-3′；下游引物为SEQ ID NO.5所示的序列：5′-GTTCATTATTCATCTATTTTCATCTCGG-3′；和，
扩增所述short-2的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.6所示的序列5′-AATGAAGCTATCTTGACGCAAT-3′；下游引物为SEQ ID NO.7所示的序列：5′-GGCCTGCTAAAACACGACTTAC-3′；和，
扩增所述long的引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物为SEQ ID NO.8所示的序列：5′-ATAAGGTGGCATAAAGATAAACGA-3′；下游引物为SEQ ID NO.9所示的序列：5′-GTGTGTAGACTTCTCTCAATGGG-3′；
包含所述long的黄瓜比包含short-1或short-2的黄瓜开花时间晚。
7.一种早开花黄瓜的育种方法，其特征在于，鉴定黄瓜的基因组中是否包含权利要求1所述的short-1、short-2或long中的一种或多种，选择包含权利要求1所述short-1和/或short-2，但不含long分子标记的黄瓜进行自交或杂交，获得早开花黄瓜，包含所述long的黄瓜比包含short-1或short-2的黄瓜开花时间晚。
8.一种晚开花黄瓜的育种方法，其特征在于，鉴定黄瓜的基因组中是否包含权利要求1所述的short-1、short-2或long中的一种或多种，选择包含权利要求1所述long，但不含short-1和short-2分子标记的黄瓜进行自交或杂交，获得晚开花黄瓜，包含所述long的黄瓜比包含short-1或short-2的黄瓜开花时间晚。
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