CN110840887A - 三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，包括：本发明提供的三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用；治疗乳腺癌的药物为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊中任一；包含三氯苯达唑的组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用；待治疗的乳腺癌的癌细胞为MCF‑7或MDA‑MB‑231。本发明的有益效果是：在体外和体内，三氯苯达唑均能诱导细胞凋亡性细胞焦亡，其通过活化的caspase‑3切割GSDME产生GSDME‑NT而发挥作用并呈现形成空泡特点。该发现表明，三氯苯达唑通过诱导癌细胞发生凋亡性细胞焦亡，三氯苯达唑通过活化caspase‑3，至少部分地通过增强ROS/JNK/bax线粒体凋亡通路，诱导GSDME依赖的细胞焦亡，凸显其具有治疗癌症的作用。
Description
技术领域
本发明涉及治疗乳腺癌药物的制备领域，尤其是涉及三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌仍然是一个主要的健康问题，并且是威胁女性健康的主要癌症。乳腺癌最常见的原因是遗传性，环境和生活方式也增加了乳腺癌的发病率，如辐射、竞争和工作压力、饮酒和肥胖。尽管通过使用各种疗法，包括化疗、内分泌治疗和放疗，在乳腺癌的治疗方面取得了很大进展；但乳腺癌患者化疗的总体反应率不理想，同时发生不良反应。实际上，主要由于对细胞凋亡的抗性的发展，这些疗法最终会变得难以治愈。因此，需要发现用于治疗乳腺癌具有较少副作用的可扩展治疗和更有影响的药物，包括治疗乳腺癌的非凋亡程序性细胞死亡(PCD)。
程序性细胞死亡途径在所有多细胞生物的生长、生存、稳态和先天免疫中具有重要的生理作用。根据表型差异，PCD分两种重要形式：包括细胞凋亡和程序性坏死。程序性坏死也称为非凋亡性PCD，已报道两种形式的PCD：一种是细胞坏死，另一种是细胞焦亡。通过激活受体相互作用蛋白激酶-3(RIPK3)触发坏死性凋亡，其使假激酶MLKL磷酸化，然后导致细胞裂解。然而，细胞焦亡的特征在于质膜上的孔隙形成，随后导致细胞膨胀和质膜中的孔隙，这最初被认为是脊椎动物先天免疫的一般炎症反应。然而，最近的研究表明，化疗药物活化的caspase-3还可以诱导癌症和正常细胞的二次坏死/细胞焦亡，这些细胞表达Gasdermin家族成员Gasdermin E(GSDME)。当引起细胞凋亡，活性的caspase-3可切割GSDME产生GSDME的N-末端片段(GSDME-NT)。然后GSDME-NT将转移并穿透质膜，从而破坏细胞的渗透屏障，导致二次坏死/细胞焦亡。
细胞焦亡是一种程序性死亡，其中Gasdermin E(GSDME)在癌细胞中起重要作用，其可被凋亡相关的caspase-3诱导活化。三氯苯达唑是一种新型的咪唑抗吸虫剂，已成为治疗家畜肝吸虫感染的首选药物并持续了20多年。并且最近已被成功用于治疗人类的片吸虫病。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明提供的三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
作为优选：所述治疗乳腺癌的药物为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊中任一。
作为优选：主要包含三氯苯达唑的组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
作为优选：待治疗的乳腺癌的癌细胞为MCF-7或MDA-MB-231。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的实验结果表明：三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)裂解性死亡，死亡细胞肿胀，有明显的大气泡。western blot结果显示，三氯苯达唑治疗可促进多种凋亡标志物的活化，促进GSDME-N末端片段的生成，说明活化的caspase-3可诱导二次坏死/细胞焦亡。与此一致的是，通过caspase-3特异性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)处理，三氯苯达唑诱导的GSDME-N末端片段生成和热解被抑制或减少。此外，三氯苯达唑还诱导活性氧(ROS)升高和JNK磷酸化。然而，ROS清除剂(NAC)降低了三氯苯达唑诱导的ROS升高、JNK磷酸化和裂解性细胞死亡，提示三氯苯达唑诱导的GSDME依赖的细胞焦亡与ROS/JNK/bax线粒体凋亡通路相关。此外还发现，在BALB/C裸鼠异种移植瘤模型中，给予三氯苯达唑治疗显著促进了caspase-3活化、parp活化和GSDME-N末端片段的形成，抑制了异种移植瘤的生长。
(2)本发明的实验结果表明：在体外和体内，三氯苯达唑均能诱导细胞凋亡性细胞焦亡，其通过活化的caspase-3切割GSDME产生GSDME-NT而发挥作用并呈现形成空泡特点。该发现表明，三氯苯达唑通过诱导癌细胞发生凋亡性细胞焦亡，三氯苯达唑通过活化caspase-3，至少部分地通过增强ROS/JNK/bax线粒体凋亡通路，诱导GSDME依赖的细胞焦亡，凸显其具有治疗癌症的作用。
附图说明
图1为三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞凋亡和细胞裂解性死亡的效果图；
图2为necrostatine-1预处理1小时，TRI处理，然后拍照观察的荧光图；
图3为三氯苯达唑影响膜电位和线粒体活性的效果图；
图4为三氯苯达唑处理的MCF-7细胞中凋亡和裂解性细胞死亡标记的蛋白质印迹分析图；
图5为三氯苯达唑处理的MDA-MB-231细胞中凋亡和裂解性细胞死亡标记的蛋白质印迹分析图；
图6为阻断caspase-3活性可抑制三氯苯达唑诱导的MCF-7细胞溶解性细胞死亡效果图；
图7为阻断caspase-3活性可抑制三氯苯达唑诱导的MDA-MB-231细胞溶解性细胞死亡效果图；
图8为三氯苯达唑通过ROS/JNK/Bax-线粒体途径诱导细胞凋亡和细胞溶解死亡效果图；
图9为三氯苯达唑在异种移植模型中的抗肿瘤作用效果图；
图10为WesternBlot结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
实施例1：使用乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231作为细胞模型，验证三氯苯达唑诱导乳腺癌细胞发生细胞凋亡和裂解性细胞死亡：
为确定三氯苯达唑对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的作用，将乳腺癌细胞MCF-7或MDA-MB-231细胞用指定浓度的三苯达唑(TRI)处理24小时。使用CCK-8检测方法来测定药物在这些细胞中的细胞毒性。如图1所示：
图1中的A、C为：将MCF-7和MDA-MB-231细胞用Annexin V-FITC和PI染色，然后通过流式细胞术分析。在流式细胞仪的代表性点状图的每个象限中显示的细胞的比例。
图1中的B、D为对A、C中凋亡细胞与坏死/化脓细胞的比率的定量分析，其中纵坐标Annexin-V-/PI-代表活细胞，Annexin-V+/PI-代表凋亡细胞，Annexin-V+/PI+表示坏死或凋亡细胞。数据显示为平均值SD(n＝3)。
图1中的E为用含有2μg/ml碘化丙啶的PI溶液(PI：红色，死细胞)加5μg/mlHoechst33342(蓝色，将所有细胞染色)的PI溶液染色10分钟，然后通过Leica共聚焦观察显微镜(63倍)，黑色箭头表示溶胞(坏死或焦亡)。比例尺为20μm。
图1中的F和G为：在5个随机选择的区域(每个区域包含约40个细胞)中的PI阳性细胞进行了定量。数据显示为平均值SD(n＝5)。通过单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析。图中*P<0.01；***P<0.001，ns代表的是无差异。
数据显示，三氯苯达唑(160μM)在治疗16小时后可显着抑制乳腺癌细胞的活力。为了进一步探讨三氯苯达唑对乳腺癌细胞的作用，使用annexin-V-FITC/PI测定法检测和分析三氯苯达唑处理后的细胞。三氯苯达唑处理细胞16小时后，结果表明三氯苯达唑可诱导乳腺癌细胞发生细胞凋亡(膜联蛋白-V+/PI-)和溶解细胞死亡(annexin-V+/PI+)。比较高浓度(160μM)载体，三氯苯达唑可诱导更高水平的溶解细胞死亡，约20％(MCF-7)或11％(MDA-MB-231)，同时在一定程度上可诱导两种肿瘤细胞发生细胞凋亡。然而，也可以观察到低浓度处理对这些细胞没有影响。此外，使用PI溶液染色和荧光显微镜分析三氯苯达唑诱导的裂解性细胞死亡。PI染色结果显示，三氯苯达唑可显著诱导更高水平的裂解性细胞死亡(PI阳性细胞)，～40(MCF-7)或～35％(MDA-MB-231)，同时，可以观察到用三氯苯达唑处理的细胞变圆形并且裂解型死亡细胞变得肿胀，从质膜延伸出明显的空泡状，这被认为是不同于细胞凋亡的二次坏死/细胞焦亡的典型特征。同时，使用坏死抑制剂necrostatin-1预处理乳腺癌细胞，然后与三氯苯达唑共同孵育，数据显示necrostatin-1不能逆转三氯苯达唑诱导的细胞死亡。
因此，以上结果表明三氯苯达唑可诱导乳腺癌细胞发生细胞焦亡。
实施例2：验证三氯苯达唑通过内在的凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡：
三氯苯达唑是一种有效的凋亡抗吸虫药物，通过破坏干扰Tubulin的功能有效发挥抗吸虫作用，用160μM三氯苯达唑处理细胞，试图进一步探索它是否能够通过内在的凋亡途径诱导乳腺癌细胞凋亡。
首先，使用mito-tracker标记线粒体，其可被动地扩散穿过质膜并在有活性的线粒体中积累。结果显示三氯苯达唑显着降低MCF-7和MDA-MB-231细胞中线粒体的活性。此外，使用JC-1染色检测线粒体膜电位，结果显示三氯苯达唑能够降低JC-1聚集体(红色)的水平以及其与JC-1单体(绿色)的比率，表明膜电位下降。如图3所示：
图3中的A为通过
Green FM检测存活的线粒体，通过徕卡共聚焦显微镜观察细胞，并显示代表性图像；显微镜规格为63x、比例尺50μm。
图3中的B为通过JC-1测定法测定线粒体膜电位，通过徕卡共聚焦显微镜观察细胞，并显示代表性图像；显微镜的规格为63x、比例尺20μm。
图3中的C为通过Leica软件在十个随机选择的区域中分析MitoTracker MFI，每个区域包含～40个细胞。
图3中的D为通过Leica软件在十个随机选择的区域中分析JC-1聚集体/单体的比率，每个区域包含约40个细胞。数据显示为平均值(n＝10)。通过t检验进行统计分析。**P<0.01；***P<0.001；ns代表的是无差异。
总之，以上结果表明三氯苯达唑可能通过降低线粒体活性和膜电位的诱导内在凋亡途径的激活。
实施例3：三氯苯达唑诱导的乳腺癌细胞凋亡和裂解细胞死亡的潜在机制：
MCF-7细胞用指定浓度的三苯达唑处理24小时，使用蛋白质印迹分析凋亡的蛋白质标记，包括Bax，bcl-2，cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-8，cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-7和cleaved-PARP。
最近，gasdermin E(GSDME)已被证明为内源性和外源性凋亡途径的靶蛋白，并且活化的caspase-3诱导GSDME-N结构域(37kDa)形成并靶向膜形成孔洞，从而导致细胞焦亡。接下来探讨了GSDME是否在药物处理的细胞中表达并切割形成GSDME-N结构域。如图4和图5所示：
图4和图5中的A为通过蛋白质印迹检测凋亡和裂解性细胞死亡的标记蛋白；β-actin作为对照。
图4和图5中的B至I为以A为基础，bax，bcl-2，cleaved-caspase-9/8/7/3，cleaved-PARP和GSDME-NT印迹的相对灰度值。数据显示为平均值SD(n＝3)；通过单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；其中ns代表无差异；TRI为三氯苯达唑。
数据显示GSDME在MCF-7细胞中高表达，但在MDA-MB-231细胞中低表达GSDME。在三氯苯达唑处理后，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中GSDME被切割，其与caspase-3的活化水平和裂解性细胞死亡水平相一致。而结果正如预期，蛋白质印迹结果显示三氯苯达唑处理可以上调细胞裂解物中bax的表达并下调bcl-2。此外，三氯苯达唑处理能够剂量依赖性方式诱导凋亡启动蛋白caspase-8和caspase-9的活化(通过检测它们的活化片段)。与此相一致，其下游的caspase-3和caspase-7相应地被激活并加工成具有活性的caspase-3和caspase-7。伴随着它们的活化，其底物聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)被切割并产生89kDa片段，其表明内源性和外源性凋亡途径均被启动。
以上结果表明，三氯苯达唑诱导的裂解细胞死亡是由caspase-3介导的GSDME-N结构域形成所导致的。
实施例4：Cleaved-caspase-3是三氯苯达唑治疗乳腺癌细胞中GSDME介导的细胞死亡的关键开关；由于Cleaved-caspase-3是将GSDME加工成GSDME-NT(37kDa)片段的关键转换，因此来探讨使用caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO(DEVD)阻断caspase-3活性是否阻碍三氯苯达唑诱导的细胞死亡。
将MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO(DEVD)预处理1h，然后用三苯达唑处理24h。如图6和图7所示，
图6和图7的A为使用荧光显微镜通过实时成像观察细胞，并显示出代表性的明场图像。
比例尺为20μm。
图6和图7的B为代表性的蛋白质印迹，用于凋亡和裂解细胞死亡的标志物，包括裂解的PARP和GSDME-NT；β-actin作为对照。
图6和图7的C为在五个随机选择的区域中每个含有约60个细胞的裂解性细胞死亡(坏死或焦亡)的比率被定量；数据显示为平均值SD(n＝5)。
图6和图7的D和E为用直方图显示(B)中cleaved-PARP和GSDME-NT的相对灰度值；通过单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析。***P<0.001；ns为无差异；TRI为三氯苯达唑。
结果显示通过DEVD预处理减弱了三氯苯达唑诱导细胞死亡的效果，Western印迹显示DEVD预处理显着抑制GSDME-NT(37kDa)和cleaved-PARP(89kDa)的形成。
总之，以上结果表明，三氯苯达唑诱导的caspase-3介导的GSDME切割导致的裂解细胞死亡，并且GSDME-NT的水平与裂解性细胞死亡相一致，表明这种裂解细胞死亡是一种细胞焦亡。
实施例5：探讨ROS/JNK信号在细胞焦亡中对三氯苯达唑治疗的作用。
探讨三氯苯达唑是否通过ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径诱导细胞焦亡时，因为三氯苯达唑诱导的GSDME依赖性pyroptosis处于ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径的下游；鉴于先前的实验结果表明ROS/JNK信号传导对Bax-线粒体凋亡途径很重要，因此三氯苯达唑可以改变bax和bcl-2的蛋白表达；结果显示三氯苯达唑处理增加了MCF-7和MDA-MB-231中的ROS水平。同时观察到三氯苯达唑处理大大增加了JNK的磷酸化，但没有改变JNK的表达。这些结果表明，ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径可能与三氯苯达唑诱导的GSDME依赖性细胞凋亡有关。
为进一步探讨ROS/JNK信号在细胞焦亡中对三氯苯达唑治疗的作用，乳腺癌细胞(MCF-7或MDA-MB-231)在有或没有5mM NAC(抗氧化剂)的情况下进行预处理，然后与三氯苯达唑共孵育24小时。使用NAC(活性氧清除剂)预处理乳腺癌细胞，然后与三氯苯达唑共同孵育。如图8所示：
图8中的A为通过探针DCFH-DA测量MCF-7和MDA-MB-231中的ROS水平。通过徕卡共聚焦显微镜观察细胞，并显示代表性图像；显微镜的规格为63x、比例尺20μm。
图8中的B为在十个随机选择的字段中，由Leica软件分析的相对ROS水平，A中每个字段包含大约40个细胞。数据显示为平均值SD(n＝10)。
图8中的D为蛋白质水平和蛋白质磷酸化水平的代表性蛋白质印迹，包括bax，bcl-2，JNK和p-JNK。
图8中的E为使用荧光显微镜通过实时成像立即观察细胞，并显示代表性的明场图像。比例尺为20μm。通过单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析；*P<0.05；***P<0.001；ns代表无差异；TRI为三氯苯达唑。
结果显示NAC抑制三氯苯达唑诱导的ROS升高；还发现NAC预处理能够部分逆转三氯苯达唑对bax和bcl-2表达的影响以及JNK的磷酸化。与这些结果一致，流式细胞术和细胞死亡检测分析显示，与对照相比，NAC处理降低了三氯苯达唑诱导的裂解性细胞死亡，其中形成空泡状和凋亡形态的细胞数量减少。
以上结果揭示了三氯苯达唑诱导的GSDME依赖性细胞焦亡，至少部分是通过增加ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径。
实施例6：探讨三氯苯达唑是否抑制体内肿瘤生长。
将MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下植入BALB/C裸体的右侧腋部。当小鼠异种移植肿瘤生长至约100mm3时，通过腹腔注射三氯苯达唑溶液(20或100mg/kg体重)或空白处理裸鼠，每周两次。如图9所示：
图9中的A为BALB/C裸鼠中的肿瘤；
图9中的B为实验结束时MDA-MB-231衍生的异种移植肿瘤的图像。用三氯苯达唑治疗2周后处死裸鼠，然后仔细解剖并拍照(n＝6)。
图9中的C为肿瘤大小的曲线。数据显示为平均值SD(n＝6)，通过双向方差分析进行统计分析。
图9中的D为蛋白质印迹分析在用三氯苯达唑或溶剂治疗的肿瘤中cleaved-caspase-3，cleaved-PARP和GSDME的蛋白表达。
图9中的E为在肿瘤切片(n＝3)中Ki-67和cleaved-caspase-3蛋白表达的免疫组织化学分析，通过徕卡显微镜捕获图像，并且显示代表性图像。显微镜的规格为40x、比例尺20μm；***P<0.001；TRI为三氯苯达唑。
结果显示用三氯苯达唑处理的异种移植肿瘤的生长明显慢于对照组，但小鼠的体重在三氯苯达唑溶液处理和载体之间没有差异。此外，三氯苯达唑给药显着促进了cleaved-caspase-3,cleaved-PARP and GSDME-NT的形成，表明三氯苯达唑诱导细胞焦亡。这与体外实验显示三氯苯达唑的效果一致。通过免疫组织化学分析、三氯苯达唑处理后，观察到其可以降低Ki-67和凋亡蛋白(cleaved-caspase-3)的表达。
如图10所示，三氯苯达唑诱导的caspase-3/GSDME依赖的细胞焦亡至少部分通过ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径。通过诱导cleaved-caspase-3和GSDME-NT片段的形成，三氯苯达唑有效地抑制了BALB/C裸鼠异种移植模型中异种移植肿瘤的生长。
以上结果突出显示了三氯苯达唑具有治疗乳腺癌的作用。
Claims (4)
1.三氯苯达唑在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗乳腺癌的药物为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊中任一。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：主要包含三氯苯达唑的组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：待治疗的乳腺癌的癌细胞为MCF-7或MDA-MB-231。
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