CN110836935A

CN110836935A - 测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法

Info

Publication number: CN110836935A
Application number: CN201911153738.0A
Authority: CN
Inventors: 杨再香; 吴雪; 牟祥; 卢念红; 雷海燕
Original assignee: Chongqing Liujiang River Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Liujiang River Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-02-25
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110836935B

Abstract

本发明公开了测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法。本发明的方法使用高效液相色谱‑质谱联用仪，经加入本底原料建立线性方程，使得本发明所公开的方法时间短，同时控制3种杂质，克服了回收率偏高、高浓度样品污染质谱且影响重复性的技术问题，建立了专属性、灵敏度及准确度符合原料药质量控制需要的可靠方法。

Description

测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体地，涉及测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法。

背景技术

甲磺司特是1995年日本大鹏药品工业株式会社研制的新型抗过敏药，通过抑制T细胞诱导的白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-5（IL-5）的产生，从而抑制酸性粒细胞的侵润和抑制IgE抗体产生等作用，发挥抗过敏作用。主要用于治疗儿童及成人的支气管哮喘。根据临床表现，甲磺司特可完全或部分替代激素类药物，不仅具有较好疗效、而且具有长期用药安全、方便的特点。

甲磺司特原料药现有合成工艺所用起始物料，多含有脂肪族硝基、单卤代烷烃、磺酸的烷基酯等基因毒性警示结构。根据ICH M7（R1），需将起始物料、中间体、原料药中可能存在的1、2、3类杂质制定在特定限度、可接受限度（TCC）以下或进行细菌突变试验。

发明内容

原料药的制备包括合成甲磺司特的关键中间体，该中间体制备过程如下：

。

该原料药制备过程中可能残留反应的中间体杂质A：1-氯-3-(4-硝基苯氧基)-2-丙醇，对硝基苯酚对化合物D进行亲核开环的杂质B：1,3-二(4-硝基苯氧基)-2-丙醇，化合物E与杂质A亲核取代的杂质C：1-((1-乙氧基-3-(4-硝基苯氧基)-2-丙基)氧基)-3-(4-硝基苯氧基)-2-丙醇，未查到药典、进口注册标准或相关文献报道3种基因毒性杂质在原料药中的检测方法。

为对原料药进行质量控制，本发明提供了一种测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，对3种基因毒性杂质建立专属性、灵敏度及准确度符合原料药质量控制要求的方法。需要控制的杂质结构分别为：

本发明的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，包括如下步骤：

1）使用高效液相色谱-质谱联用仪，并设置参数如下：

色谱柱：C18；

检测器：紫外检测器VWD；

进样盘不控温度；

进样体积20µL；

测试时间：30～60min；

柱温：30～40℃；

波长：220-250nm；

流速：0.2～1.0 ml/min；

流动相：由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为0.005～0.010mol/L乙酸铵缓冲盐溶液或0.05～0.1体积%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈、或含0.05～0.1体积%甲酸的乙腈混合溶液；进行等度或梯度分离；

采用二维色谱将高浓度的原料药切入废液，同时用第二组泵向质谱泵入清洗流动相；

质谱质量分离器类型：四极杆；

电离方式：电喷雾电离；

毛细管电压：3000～3500V；

干燥气流速：12L/min；

雾化气压力45psig；

碎裂电压：50～100V；

2）溶液配制

稀释溶剂：乙腈水溶液，30-80体积%优选地，30-80体积%乙腈水溶液，更优选地，50体积%乙腈水溶液；

供试液：应用乙腈和稀释溶剂配制供试液，供试液的浓度为10 mg/ml；

杂质对照液：应用乙腈和稀释溶剂配制杂质对照液，杂质对照液的浓度为0.05µg/ml；

供试品加标液：应用乙腈和稀释溶剂配制供试品加标液，所述供试品加标液中样品原料药的浓度为2～10 mg/ml优选地为10mg/ml，杂质A、B、C的浓度均为0.05µg/ml；

线性溶液：范围从定量下限至200%限度浓度水平，应用乙腈和稀释溶剂分别配制在2～10 mg/ml的样品溶液中；定量依据：面积或与内标的面积比；

3）计算公式：

C=a×A+b

X = C×S×1000/m

式中：X：供试品中待测物的含量（ppm）

A：供试品溶液色谱图中待测物与内标物的峰面积比

a：线性回归曲线斜率

b：线性回归曲线与Y轴截距

m：供试品的称样量，mg

S：供试品的稀释倍数

C：供试品溶液色谱图中待测物的浓度（µg/ml）。

在本发明的实施方案中，所述杂质A、B、C的定量离子可以根据流动相具体设置。

在本发明的实施方案中，所述杂质的安全限度均为5ppm；定量限要求至少为50%安全限度，即≦2.5ppm。

在上述实施方案中，优选地，步骤1）所述的液相色谱条件，优选岛津InertSustain C18，2.1mm*150mm 3µm，测试时间：30min，柱温40℃；流速：0.300 ml/min；流动相：流动相A为0.1体积%的甲酸水溶液，流动相B为含0.1体积%甲酸的乙腈混合溶液；梯度分离。

在上述实施方案中，优选地，所述的质谱条件，优选单四级杆质谱，毛细管电压：3000V；碎裂电压：70V；干燥气流速：12L/min；雾化气压力45psig；碎裂电压：100V。在含0.1体积%甲酸的流动相体系下，A、B、C定量分子离子峰m/z优选276、379、481。

在上述实施方案中，优选地，步骤1）所述的二维色谱包含只增加阀切换、两组或更多液相泵进行组合的色谱分离系统。

在上述实施方案中，所述定量离子的加合形式包括H⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、H^-、HCOO^-、CH₃COO^-。

在上述实施方案中，优选地，步骤2）所述稀释溶剂为50体积%乙腈水溶液；

其中，杂质对照液的配制为：取甲磺司特原料药、杂质A、B、C约10mg，精密称定后分别置于10ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，得到4种物质的1mg/ml贮备溶液；分别精密移取0.05ml的杂质A、B、C贮备液至10ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，得5µg/ml的杂质母液；同时移取50 µl杂质A、B、C上述母液于同一5ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，制成含杂质A、B、C各0.05µg/ml的对照溶液；

供试品加标液的配制为：取原料药 50mg，精密称定，置5ml量瓶中，同时移取50 µl上述杂质母液置该量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，制成含原料药 10mg/ml、杂质A、B、C各0.05µg/ml的溶液。

在上述实施方案中，优选地，步骤2）所述的线性溶液：范围从定量下限至200%限度浓度水平，分别配制在10 mg/ml的样品溶液中。

在上述实施方案中，优选地，步骤2）所述的定量依据优选：不加内标。

本发明的有益结果在于：

本发明所提供的方法在短时间内同时控制3种杂质，克服了回收率偏高、高浓度样品污染质谱且影响重复性的技术问题，给甲磺司特原料药的质量控制提供了专属性、灵敏度及准确度符合现行指导原则的方法。

附图说明

图1 表示的是空白样品图谱；

图2 表示的是专属性溶液图谱；

图3 表示的是定量下限溶液图谱；

图4 表示的是乙酸铵流动相体系下空白样品图谱；

图5 表示的是乙酸铵流动相体系下专属性溶液图谱；

图6 表示的是乙酸铵流动相体系下定量下限溶液图谱。

具体实施方式

下面通过本发明实施例对本发明的实施方案进行描述。

实施例1 酸性流动相体系下专属性及灵敏度

（1）样品溶液的配制

稀释溶剂：50体积%乙腈水溶液

专属性溶液：

取甲磺司特原料药、杂质A、B、C约10mg，精密称定后分别置于10ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，得到4种物质的1mg/ml贮备溶液；分别精密移取0.05ml的杂质A、B、C贮备液至10ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，得5µg/ml的杂质母液。取原料药50mg，精密称定，置5ml量瓶中，同时移取50 µl杂质母液置该量瓶中，加溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，制成含原料药 10mg/ml、杂质A、B、C各0.05µg/ml的溶液，作为专属性溶液。

定量下限溶液：同时移取50 µl杂质A、B、C母液于同一5ml量瓶中，加稀释溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，制成含杂质A、B、C各0.05µg/ml的对照溶液（5ppm）。精密移取0.4ml对照溶液，精密加入1.6ml稀释溶剂混匀得定量下限溶液（1ppm）。

分别进空白溶液、专属性溶液、定量下限溶液各20µl，HPLC-MS的检测条件如下：

十八烷基硅胶色谱柱（150 mm × 2.1 mm，3µm），以含体积比为0.1%甲酸的水溶液为流动相A，含体积比为0.1%甲酸的乙腈为流动相B，流速为0.3000 ml/min；柱温为40℃，进样量为20µl，按如下梯度程序进行洗脱：

单四级杆质谱，毛细管电压：3000V；碎裂电压：70V；干燥气流速：12L/min；雾化气压力45psig；杂质A、B、C定量分子离子峰m/z优选276、379、481。

清洗质谱的另一组泵，流动相A1、B1分别与A、B相同，流速0.3000 ml/min，比例各占50%。阀切换时间及位置为：0min，B位；10mim，A位；22min，B位。其中A位表示色谱柱流出物进质谱，B位表示进废液。

空白样品在各个通道分析物出峰位置无干扰（见图1，杂质A、B、C出峰时间分别约在11.5min、16.2min、18.4min），专属性样品中276、379、481与相邻峰分离均符合要求。其中通道481中杂质C有2个手性中心，峰有裂分，按面积和进行计算（见图2）；定量下限（限度浓度水平的25%）灵敏度符合要求，276、379、481信噪比分别为9.3、15.9、55.5（见图3）。

实施例2 乙酸铵流动相体系下专属性及灵敏度

分别进实施例2中空白溶液、专属性溶液、定量下限溶液各20µl，HPLC-MS的检测条件如下：

十八烷基硅胶色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5µm），以含5mM乙酸铵的水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.000 ml/min；柱温为40℃，进样量为20µl，按如下梯度程序进行洗脱：

单四级杆质谱，毛细管电压：3000V；碎裂电压：70V；干燥气流速：12L/min；雾化气压力45psig；杂质A、B、C定量分子离子峰m/z优选290、393、459。清洗质谱的另一组泵，流动相A1、B1分别与A、B相同，流速0.4000 ml/min，比例各占50%。阀切换时间及位置为：0min，B位；20mim，A位；50min，B位。其中A位表示色谱柱流出物进质谱，B位表示进废液。空白样品在各个通道分析物出峰位置（杂质A、B、C出峰时间分别约在27.3min、32.5min、35.7min）无干扰（见图4），专属性样品中290、393、459与相邻峰分离均符合要求（见图5）；定量下限（限度浓度水平的25%）灵敏度符合要求，290、393、459信噪比分别为20.7、35.0、17.5（见图6）。

实施例3 在原料药 10mg/ml的样品中加标建立线性方程及回收率的测定

线性溶液配制：称取原料药约100mg于10ml量瓶中，加入杂质A、B、C 5µg/ml的线性母液各20µl配制成限度浓度25%的线性溶液（1ppm）。再按此方式依次配制成限度浓度40%、50%、80%、100%、150%、200%的线性溶液。准确度溶液配制：向原料药 10mg/ml的样品溶液中，分别加入限度浓度50%、100%、150%的杂质A、B、C，平行配制3份，作为准确度溶液。杂质A、B、C线性拟合系数分别为：0.9966、1.0000、0.9999；杂质A 的3个浓度水平回收率分别为：116.9%、102.2%、98.5%（见表1）；杂质B的 3个浓度水平回收率分别为：102.6%、103.1%、99.8%（见表2）；杂质C 的3个浓度水平回收率分别为：110.8%、110.9%、103.4%。均落在药典9101指导原则推荐的75%-120%之间。

表1：杂质A回收率计算表

表2：杂质B回收率计算表

表3：杂质C回收率计算表

对照例1 不加本底原料药时建立线性方程及回收率的测定

线性溶液配制：向同一10ml量瓶中，加入杂质A、B、C 5µg/ml的线性母液各20µl配制成限度浓度25%的线性溶液（1ppm）。按此方式依次配制成限度浓度40%、50%、80%、100%、150%、200%的线性溶液。用杂质A、B、C 5µg/ml的线性母液系列稀释成限度浓度25%、40%、50%、80%、100%、150%的线性溶液。准确度溶液配制：向原料药 10mg/ml的样品溶液中，分别加入限度浓度50%、100%、150%的杂质A、B、C，平行配制3份，作为准确度溶液。杂质A、B、C线性拟合系数分别为：0.9965、0.9990、0.9907；杂质A 的3个浓度水平回收率分别为：79.1%、106.9%、106.9%；杂质B的 3个浓度水平回收率分别为：96.3%、141.0%、213.7%；杂质C 的3个浓度水平回收率分别为：75.6%、151.7%、197.0%。线性拟合系数符合要求，但回收率远均未落在药典9101指导原则推荐的75%-120%之间。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作为各种各样的改变，而不偏离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法：

1）使用高效液相色谱-质谱联用仪，并设置参数如下：

色谱柱：C18；检测器：紫外检测器VWD；进样盘不控温；进样体积20µl；测试时间：30～60min；柱温：30～40℃；波长：220-250nm；流速：0.2～1.0 ml/min；流动相：由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为0.005～0.010mol/L乙酸铵缓冲盐溶液或0.05～0.1体积%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈、或含0.05～0.1体积%甲酸的乙腈混合溶液，等度或梯度分离；采用二维色谱将高浓度的原料药切入废液，同时第二组泵向质谱泵入清洗流动相；

质谱质量分离器类型：四极杆；电离方式：电喷雾电离；毛细管电压：3000～3500V；干燥气流速：12L/min；雾化气压力45psig；碎裂电压：50～100V；

2）溶液配制方式

稀释溶剂：乙腈水溶液；

供试品加标液：应用乙腈和稀释溶剂配制供试品加标液，所述供试品加标液中样品原料药的浓度为10mg/ml，杂质的浓度为0.05µg/ml；

计算公式：

C=a×A+b

X = C×S×1000/m

式中：X：供试品中待测物的含量（ppm）

A：供试品溶液色谱图中待测物与内标物的峰面积比

a：线性回归曲线斜率

b：线性回归曲线与Y轴截距

m：供试品的称样量，mg

S：供试品的稀释倍数

C：供试品溶液色谱图中待测物的浓度（µg/ml）。

2.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤1）所述的色谱柱的固定性为十八烷基硅胶色谱柱，粒径为3～5µm，长度为150～250mm，内径为2.1～4.6mm。

3.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，所述杂质的安全限度均为5ppm；定量限要求至少为50%安全限度，即≦2.5ppm。

4.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤1）所述的液相色谱条件，优选岛津Inert Sustain C18，2.1mm*150mm 3µm，测试时间：30min，柱温40℃；流速：0.300 ml/min；流动相：流动相A为0.1体积%的甲酸水溶液，流动相B为含0.1体积%甲酸的乙腈混合溶液；梯度分离。

5.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，所述的质谱条件，优选单四极杆质谱，毛细管电压：3000V；碎裂电压：70V；干燥气流速：12L/min；雾化气压力45psig；碎裂电压：100V；在含0.1体积%甲酸的流动相体系下，A、B、C定量分子离子峰m/z优选276、379、481。

6.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤1）所述的二维色谱技术包含只增加阀切换、两组或更多液相泵进行组合的色谱分离系统。

7.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤1）所述杂质A、B和C的定量离子的加合形式包括H⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、H^-、HCOO^-、CH₃COO^-。

8.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤2）所述的稀释溶剂中乙腈体积占比为30-80%，优选地，为50%。

9. 如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤2）所述的线性溶液配制在原料药恒定浓度的溶液中，浓度为2～10 mg/ml，优选地，为10mg/ml。

10.如权利要求1所述的测定甲磺司特原料药中3种基因毒性杂质的方法，其中，步骤2）所述的定量依据指峰面积或峰面积比值。