CN110819678A - 一种评估cart细胞有效性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评估CART细胞临床前药效学的方法。分为体内实验评估和体外实验评估，系统的阐述了CART细胞进入临床前的药效学检测指标。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种CART细胞制备方法。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
CART细胞在做临床实验之前要系统的做药效、药代、药动、药理、毒理的评估，全面摸清CART细胞的安全性有效性。本发明系统阐述CART临床前有效性评估方法。
发明内容
本发明的一个方面提供一种评估CD19-CART细胞有效性的方法包括体外实验评估方法和体内实验评估方法。
本发明的第二方面提供了体外实验评估方法，包括：
(Ⅰ)细胞表型检测；
(Ⅱ)CAR靶向性检测；
(Ⅲ)细胞因子胞内染色分析；
(Ⅳ)细胞杀伤实验分析。
优选的是，细胞表型检测包括成功感染病毒的CAR+细胞比例，CD8/CD4比例，CD45RO/CD62L比例。
优选的是，CART细胞靶向性检测包括CAR蛋白对肿瘤细胞亲和力检测。
优选的是，细胞因子胞内染色分析包括INFγ与CD107a检测分析。
优选的是，细胞杀伤实验即CART细胞对肿瘤细胞的杀伤分析。
本发明的第三方面提供了体内实验评估方法，包括：
(Ⅰ)免疫缺陷小鼠淋巴瘤模型；
(Ⅱ)正常免疫小鼠淋巴瘤模型。
优选的是，免疫缺陷小鼠为NOG小鼠。
优选的是，正常免疫小鼠为Balb/c小鼠。
优选的是，免疫缺陷小鼠淋巴瘤模型包括单剂量注射CART细胞模型和多剂量注射CART细胞模型来评估CART细胞对肿瘤细胞体内药效结果。
本发明具有以下有益效果：
本发明全面的评估CART细胞有效性的方法。
附图说明
图1 CART细胞体内能显著延长荷瘤小鼠生存期
具体实施方式
实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
实施例1：细胞表型检测
1.取感染和未感染的细胞分别1×10^6悬液，将细胞悬液离心去除培养基，PBS洗细胞两次，300g，4℃离心5分钟。弃上清，细胞重悬于PBS中，置于流式上样管中，并做好标记，每个样品约100μl细胞悬液(106细胞)。
2.每管加入适量CD3，CD4，CD8，CD45RO，CD62L，FITC-F(ab)’抗体(所有抗体来自Biolegend)，冰上避光孵育15-20分钟。
3.用每管1ml的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟，仔细吸去上清。
4.轻拍试管混匀细胞，再加入适量的7-AAD染料，冰上避光孵育15-20分钟。
5.用每管1ml的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟，仔细吸去上清。
6.轻拍试管混匀细胞，100-200μl PBS重悬细胞。
7.上流式细胞仪检测并分析数据。
实施例2：CAR靶向性检测
1.用针对肿瘤靶点亲和力高的抗体scFv是决定CAR-T细胞功能的关键。CAR靶向性检测即CART细胞对肿瘤抗原亲和力的检测。
2.本发明通过构建携带CD19过表达基因的PG13细胞(PG13-CD19)。以PG13-CD19和Raji作为CD19阳性细胞来测定亲和力。
实施例3：细胞因子胞内染色分析检测
1.取制备好的CAR-T细胞，重悬与Lonza培养基中，调整细胞浓度为1×106/mL。
2.实验组每孔含靶细胞或阴性对照细胞2×105个，CAR-T/NT细胞2×105个，200μl不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。加入BD GolgiStop(含monesin，每1ml培养基中加入1μl BD GolgiStop)，充分混匀后，37℃孵育5小时。收集细胞，作为实验组。
3.每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体CAR、CD3，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。
4.PBS洗细胞后，加入250μl/EP管Fixation/Permeabilization solution，4℃孵育20分钟以固定细胞及破膜。用1×BD Perm/WashTM buffer清洗细胞2次，1mL/次。
5.进行胞内因子染色，取适量IFN-γ细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BD Perm/WashTM buffer稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×BD Perm/WashTM buffer 1mL/次清洗细胞2次，然后用PBS重悬。
6.流式细胞仪检测CAR、CD3、IFN-γ。
实施例4细胞杀伤实验分析
1.K562细胞(为阴性对照细胞)重悬在无血清培养基(1640)中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1H,5Hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μM。
2.混匀，37℃孵育30min。
3.室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无酚红1640+5％AB血清)中，37℃孵育60min。
4.新鲜细胞毒性培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
5.Raji细胞(含CD19，为靶细胞)悬浮在含有0.1％BSA的PBS中，调整浓度为1×106/ml。
6.加入荧光染料CFSE(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester)至终浓度为1μM。
7.混匀，37℃孵育10min。
8.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记反应。
9.清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
10.清洗效应T细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5×106/ml。
11.在所有的实验中，感染了CAR的效应T细胞(CAR-T cell)的细胞毒性和未感染的阴性对照效应T细胞(NT cell)的细胞毒性做比较，并且这些效应T细胞来自同一个病人。
12.CAR-T和阴性对照效应T细胞，按照T细胞：靶细胞＝5:1，1:1，的比例，于5ml无菌试验管(BD Biosciences)进行培养。每一个共培养组中，靶细胞为Raji细胞100,000个(50μl)，阴性对照细胞为100,000个K562细胞(50μl)。同时设置一组只包含Raj i靶细胞和K562阴性对照细胞。
13.将共培养细胞置于37℃孵育5h。
14.孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-AAD(7-aminoactinomycin D)，冰上孵育30min。
15.不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。
16.分析使用7AAD阴性的活细胞设门，测定T细胞和靶细胞共培养后活的靶细胞和活的阴性对照细胞的比例。
细胞毒性杀伤细胞％＝(1-(含效应细胞时靶细胞活细胞数/含效应细胞时K562活细胞数)/(无效应细胞时靶细胞活细胞数/无效应细胞时K562活细胞数))*100％。
实施例5体内模型检测CART细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
1.NOG小鼠，雌性，6周龄。分为溶剂对照组、NT细胞对照组、CAR-T低剂量组、CAR-T中剂量组、CAR-T高剂量组。
2.Nalm6肿瘤细胞，3×105个细胞/只，尾静脉注射，建立血液系统肿瘤模型。
3.三天后，尾静脉注射相应溶剂或CAR-T注射液，每只小鼠给药体积200μl。CAR-T低剂量组给药1×106个细胞/只，CAR-T中剂量组给药5×106个细胞/只，CAR-T高剂量组给药1×107个细胞/只。给药当天标记为0D。
4.观察各组小鼠生存时间，并绘制生存曲线。
本实施例结果如图所示，溶媒对照组平均生存期24天，NT对照组平均生存期27.5天，两组间无明显差异。CAR-T低剂量组平均生存期64天，相对于NT组平均生存延长133％，CAR-T细胞显著延长了肿瘤模型小鼠的生存(P<0.0001)。至回输T细胞后140天，CAR-T中剂量组仍有3只存活，CAR-T高剂量组仍有1只存活。仍在继续观察中。
Claims (10)
1.一种评估CD19-CART细胞有效性的方法包括体外实验评估方法和体内实验评估方法。
2.权利要求1所述体外实验评估包括细胞表型检测、CART细胞靶向性检测、细胞因子胞内染色分析、细胞杀伤实验分析。
3.权利要求1所述体内实验评估包括免疫缺陷小鼠淋巴瘤模型、正常免疫小鼠淋巴瘤模型。
4.权利要求2所述细胞表型检测包括成功感染病毒的CAR+细胞比例，CD8/CD4比例，CD45RO/CD62L比例。
5.权利要求2所述CART细胞靶向性检测包括CAR蛋白对肿瘤细胞亲和力检测。
6.权利要求2所述细胞因子胞内染色分析包括INFγ与CD107a检测分析。
7.权利要求2所述细胞杀伤实验即CART细胞对肿瘤细胞的杀伤分析。
8.权利要求3所述的免疫缺陷小鼠为NOG小鼠。
9.权利要求3所述的正常免疫小鼠为Balb/c小鼠。
10.权利要求3所述的免疫缺陷小鼠淋巴瘤模型包括单剂量注射CART细胞模型和多剂量注射CART细胞模型来评估CART细胞对肿瘤细胞体内药效结果。
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- 2018-08-07 CN CN201810888570.7A patent/CN110819678A/zh active Pending
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