CN110804602B

CN110804602B - 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110804602B
Application number: CN201911127316.6A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 刘中美; 于佳印; 赵庭; 周丽; 崔文璟; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110804602A

Abstract

本发明公开了一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E，pH 7.0条件下催化酶活性分别提高238％、244％。pH 4.5条件下处理12h酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。因此，本发明提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E具有较好的酶学性质。

Description

一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风味；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。

在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差、合成路线长、收率低、成本高、环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。

目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L(引用文献：周丽，邓璨，崔文暻，刘中美，周哲敏.温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L丙氨酸[J].微生物学通报,2015,42(11):10.)。另一种方法是生物酶法，即通过表达L-天冬氨酸β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。目前发现的L-天冬氨酸β-脱羧酶大多具有较差的酸稳定性，在中性条件(pH 7.0)下催化活性较低。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长(引用文献：徐虹,王雪根,刘济瑞,等.利用假单胞菌天冬氨酸_脱羧酶高效生产L_丙氨酸[J].南京化工学院学报,1995,17(1).)；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonas sp.ATCC 19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活较低(引用文献：Wang N-C,Lee C-Y.Molecular cloning of the aspartate 4-decarboxylase gene from Pseudomonas sp.ATCC 19121 and characterization of thebifunctional recombinant enzyme[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,73(2):339-348.)。

因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高、酸稳定性更高的L-天冬氨酸β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。

发明内容

为了解决这些问题，本发明通过对编码抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因进行突变，构建得到两个酸稳定性提高的突变体N35D、A179E。

本发明的第一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸β-脱羧酶含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码上述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达上述的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a。

本发明的第六个目的是提供一种制备L-天冬氨酸β-脱羧酶的方法，将表达所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-30℃诱导15-25h。

本发明还提供所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及所述基因工程菌在制备含有L-丙氨酸的产品中的应用。

本发明的有益效果：

第一，本发明提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体N35D(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、A179E(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，pH 7.0条件下催化酶活性分别提高238％、244％。pH 4.5条件下处理12h残余酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。50℃处理3h残余酶活分别为76.7％、51.3％，相比对照酶突变体50℃处理30min残余酶活为86％，热稳定性降低较少。因此，本发明提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体N35D、A179E具有较好的酶学性质，有利于生物法生产β-丙氨酸。

第二，本发明通过构建表达L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的重组大肠杆菌，获得在pH 7.0条件下具有高酶活的L-天冬氨酸β-脱羧酶菌株N35D、A179E，其纯酶比酶活达793U/mg、765U/mg。将重组菌摇瓶发酵，以L-天冬氨酸钠作为底物，进行全细胞催化反应制备L-丙氨酸，L-丙氨酸的产量达26.7g/L。

附图说明

图1：ArASD野生型及突变型纯酶SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准，1为野生型纯化后蛋白；2为N35D纯化后蛋白；3为A179E纯化后蛋白。

图2：在pH 7.0时的酶活以及pH 4.5条件下处理12h酶活剩余。

图3：在50℃条件下孵育3h后酶的热稳定性曲线。

图4：pH 4.5条件下野生型菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。

图5：pH 4.5条件下突变菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。

图6：pH 7.0条件下突变菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。

具体实施方式

(一)L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活的测定方法

发酵液酶活测定方法：取100μL发酵后重组大肠杆菌细胞，加入100μL 1mol/L L-天冬氨酸钠溶液，加入800μL pH 4.5磷酸盐缓冲液，于37℃反应30min后置于100℃灭活10min。12000rpm离心2min，取上清衍生后检测L-丙氨酸产量。反应液经0.22μm微孔滤膜过滤，载入C18色谱柱进行HPLC分析。

L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活测定方法：在1.5mL离心管中加入适量酶液，加入终浓度40mmol/L L-天冬氨酸钠，PLP终浓度0.5mmol/L，于37℃，pH 4.5条件下反应30min后检测酶活。

(二)培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。

2YT培养基(g/L)：蛋白胨16.0，酵母粉10.0，NaCl 5.0。

(三)HPLC检测L-天冬氨酸钠、L-丙氨酸含量的方法

反应液用苯异硫氰酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL 0.1mol/L PITC-乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺-乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置1.0h，加入750μL正己烷溶液终止衍生，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤后进样，进样量为10μL。

衍生产物用HPLC测定：色谱柱为La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。

(四)温度稳定性的测定

以野生型酶作为对照。将野生酶和突变体酶置于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，分别在50℃孵育3h后测定残余酶活，得到温度稳定性结果。

(五)pH稳定性的测定

以野生型酶作为对照。将野生酶和突变体酶置于pH 4.5的磷酸盐缓冲液中，并在0℃条件下放置12h后测定残余酶活，得到pH 4.5条件下稳定性结果。将野生酶和突变体酶置于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，并在0℃条件下放置12h后测定残余酶活，得到pH 7.0条件下稳定性结果。

实施例1重组大肠杆菌的构建

人工合成Asd基因序列(NCBI登录号为AP019740.1的基因的第1415236到1416837位)，设计特异性引物P1、P2(划线部分分别为EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点)。

表1引物表

P1	5'-CCG<u>GAATTC</u>ATGGGGAATGTAGATTATTCTAAAT-3'
		P2	5'-CCG<u>CTCGAG</u>TCAGGACTCATCTTTTTTAGTTCCC-3'

将L-天冬氨酸β-脱羧酶基因Asd通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的表达载体pET 28a(+)上，获得重组质粒pET 28a-ArAsd。

已有研究表明，改变酶分子表面的带电氨基酸残基对酶的最适反应pH有一定影响(Alan J.Russell A R F.Rational modification of enzyme catalysis byengineering surface charge[J].Nature,1987,328:5.)。根据这一原则，本实验选择了酶分子四个表面氨基酸：Asn35、Ala36、Leu44、Thr175、Ala179进行突变，构建N35D、A36D、L44D、A179E突变体。

(1)突变体BL21/pET28a-N35D、BL21/pET28a-A179E的构建：以pET28a-ArASD质粒为模板，在表1所示条件下进行PCR，N35D所用上下游引物序列信息分别如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示，A179E所用上下游引物序列信息分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

表1全质粒PCR扩增反应体系

PCR扩增反应条件为：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。PCR产物转入E.coli JM109后获得携带编码突变体基因的重组质粒pET28a-N35D、pET28a-A179E。将重组质粒pET28a-N35D、pET28a-A179E转化E.coli BL21菌株，获得重组菌株BL21/pET28a-N35D、BL21/pET28a-A179E。

(2)将BL21/pET28a-N35D、BL21/pET28a-A179E重组大肠杆菌接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基，37℃、200rpm振荡过夜培养。

实施例2 L-天冬氨酸β-脱羧酶的表达及纯化

将BL21/pET28a-N35D、BL21/pET28a-A179E重组大肠杆菌接种于5mL卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养基，37℃、200rpm振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为50μg/mL的2YT培养基，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，20℃诱导培养20h左右得到菌体。6000rpm离心收菌后，超声破碎，采用His Trap HP亲合柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE检测目标蛋白，结果如图1所示。测定纯酶比酶活，酶突变体N35D、A179E的比酶活分别达793U/mg、765U/mg。

实施例3 pH稳定性测定

如图2所示，pH 7.0条件下L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体N35D、A179E酶活性分别提高238％、244％。

pH 4.5条件下处理12h酶突变体N35D、A179E残余酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。

实施例4热稳定性测定

将纯化后的酶稀释到相同的浓度，分别于50℃处理3h，然后于37℃下反应10min后置于100℃处理10min终止反应。结果如图3所示。

实施例5 pH 4.5条件下野生型菌株一次性添加固体底物催化工艺

将诱导后的细胞离心收集后，进行全细胞催化反应。在50mL反应体系(包含菌体、pH 4.5的醋酸盐缓冲液、底物)中，细胞OD₆₀₀为20，pH为4.5，反应温度35-37℃，一次性添加固体底物L-天冬氨酸钠至终浓度为0.3mol/L。每隔一段时间取样检测L-丙氨酸生成量。结果如图4所示。转化生成L-丙氨酸173mmol/L，摩尔转化率57.7％。

实施例6 pH 4.5条件下突变菌株一次性添加固体底物催化工艺

将诱导后的细胞离心收集后，进行全细胞催化反应。在50mL反应体系(包含菌体、pH 4.5的醋酸盐缓冲液、底物)中，细胞OD₆₀₀为20，pH为4.5，反应温度35-37℃，一次性添加固体底物L-天冬氨酸钠至终浓度为0.3mol/L。每隔一段时间取样检测L-丙氨酸生成量。结果如图5所示。突变体N35D、A179E分别转化生成L-丙氨酸295mmol/L、293mmol/L，摩尔转化率为98.3％、97.6％。

实施例7 pH 7.0条件下一次性添加固体底物催化工艺

将诱导后的细胞离心收集后，进行全细胞催化反应。在50mL反应体系(包含菌体、pH 7.0的磷酸盐缓冲液、底物)中，细胞OD₆₀₀为50，pH为7.0，反应温度35-37℃，一次性添加固体底物L-天冬氨酸钠至终浓度为0.3mol/L。每隔一段时间取样检测L-丙氨酸生成量。结果如图6所示。突变体N35D、A179E分别转化生成L-丙氨酸260mmol/L、253mmol/L，摩尔转化率为86.7％、84.3％。

对比例1

以抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶为亲本酶(编码亲本酶的基因是NCBI登录号为AP019740.1的基因的第1415236到1416837位)，将突变位点修改为A36D(将第36位的丙氨酸突变为天冬氨酸)，其余同实施例。结果显示，A36D纯酶比酶活为野生型的21％，pH 4.5条件下全细胞催化底物L-天冬氨酸钠转化生成L-丙氨酸为32mmol/L。

对比例2

以抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶为亲本酶(编码亲本酶的基因是NCBI登录号为AP019740.1的基因的第1415236到1416837位)，将突变位点修改为L44D(将第44位的亮氨酸突变为天冬氨酸)，其余同实施例。结果显示，L44D纯酶比酶活为野生型的15％，pH 4.5条件下全细胞催化底物L-天冬氨酸钠转化生成L-丙氨酸为24mmol/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Gly Asn Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Ser Lys Leu Ser Pro Phe Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asp Ser Leu Ile Ala Leu Ala Gln Ser Lys Arg Asp Arg Leu

20 25 30

Met Leu Asp Ala Gly Arg Gly Asn Pro Asn Phe Leu Ala Thr Leu Pro

35 40 45

Arg Arg Ala Phe Phe Gln Leu Gly Leu Phe Ser Ala Thr Glu Ser Glu

50 55 60

Phe Ser Phe Ser Tyr Met Pro Glu Gly Leu Gly Gly Phe Pro Arg Pro

65 70 75 80

Val Gly Leu Gln Ser Arg Phe Asp Asn Phe Leu Met Gln Asn Arg Asp

85 90 95

Lys Pro Gly Val Leu Phe Leu Gly Lys Ala Val Ser Tyr Val Arg Asp

100 105 110

Gln Leu Gly Leu Asp Pro Asp Met Phe Leu Leu Glu Met Val Glu Gly

115 120 125

Ile Leu Gly Cys Asn Tyr Pro Val Pro Asp Arg Met Leu Arg Val Ser

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Glu Thr Ile Ile Lys Glu Tyr Leu Leu Gln Glu Met Gly Val Lys Ser

145 150 155 160

Met Pro Lys Glu Gly Leu Asp Leu Phe Ala Val Glu Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Ala Met Glu Tyr Ile Phe Asn Ser Leu Lys Glu Asn Lys Ile Ile Asn

180 185 190

Thr Asp Asp Arg Ile Ala Ile Gly Arg Pro Ile Phe Thr Pro Tyr Leu

195 200 205

Glu Ile Pro Lys Leu Asn Asp Tyr Gln Leu Glu Glu Ile Phe Ile Glu

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Ala Asp Pro Asn Leu Gly Trp Gln Tyr Pro Glu Ser Glu Leu Arg Lys

225 230 235 240

Leu Glu Asp Pro Ser Ile Lys Ala Phe Phe Leu Val Asn Pro Ser Asn

245 250 255

Pro Pro Ser Val Lys Ile Ser Asp Glu Gly Leu Leu Ile Leu Ala Asp

260 265 270

Ile Val Arg Lys Arg Pro Asp Leu Ile Ile Leu Thr Asp Asp Val Tyr

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Gly Thr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Ser Leu Phe Ala Ile Cys Pro Asn

290 295 300

Asn Thr Ile Leu Val Tyr Ser Phe Ser Lys Tyr Phe Gly Ala Thr Gly

305 310 315 320

Trp Arg Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ile Asp Gln

325 330 335

Lys Ile Ala Ala Leu Ser Asp Gln Glu Lys Gln Glu Leu Glu Glu Arg

340 345 350

Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Glu Pro Glu Lys Ile Lys Phe Ile Asp Arg

355 360 365

Leu Val Ala Asp Ser Arg Asn Val Ala Leu Asn His Thr Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Thr Pro Gln Gln Val Gln Met Val Leu Phe Ala Leu Phe Asn Met

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Met Asp Ser Arg Gln Ala Tyr Lys Lys Ala Val Lys Ser Val Val Arg

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Asp Leu Asn Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Leu Val Asp Leu Glu Arg Thr

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atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatgt atatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

gcactttata gacagcttgg tgttgaagtc cctgaagatc ttaacgctgt tgactattac 1320

accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcct ga 1602

<210> 4

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggggaatg tagattattc taaatattca aaacttagcc cattcgagtt aaaagatagc 60

ctgattgctt tggcacagag taagcgggac cgcttaatgc tcaatgctgg acgaggaaac 120

cctaattttc tggctaccct gccacgtagg gctttttttc aattaggttt attttctgcc 180

acagaatcag aattttcatt ttcttacatg ccagaaggct taggtgggtt cccccgtcct 240

gtcggtttgc aatcacgttt tgataatttt ctcatgcaga accgggataa acctggagtt 300

ttatttctgg gaaaagcagt gtcttatgtg agagaccaat tgggtttaga tccagatatg 360

tttctgcttg aaatggtcga agggattcta ggatgtaact accctgtacc tgatcgcatg 420

ctccgtgtca gtgaaacaat tattaaagag tatctgttac aggaaatggg cgtaaaaagt 480

atgcccaagg aaggcttgga cctgtttgcg gttgaaggcg gaaccgcagc catggaatat 540

atatttaact ccttaaaaga aaacaagatt attaatactg acgaccgaat tgcaatcggc 600

agaccgattt ttacgccgta tctggaaatt cccaaactga atgactatca gcttgaagaa 660

atttttattg aagctgatcc caatctgggc tggcaatatc ctgagtctga attaagaaag 720

ttagaagacc cttcaatcaa ggcattcttt ttagtcaatc cgagcaaccc gccttctgtc 780

aaaataagtg atgaaggatt gctaatactg gcagatattg taagaaaacg tcctgacctg 840

attattttga cagatgatgt atatggaact tttgcagatg actttaagtc actttttgca 900

atttgcccaa ataatactat tttagtttat tcattctcaa agtactttgg ggctacaggc 960

tggagacttg gcattattgc gctgtcgaat aacaatatca ttgatcagaa gattgcagcg 1020

ctttcagatc aggaaaagca ggaacttgaa gaacgttatt catcattaac tactgaacca 1080

gaaaaaatca agtttattga ccgtttggta gcagatagcc gtaatgttgc actgaatcac 1140

accgcaggtc tgtcaacacc gcagcaggta cagatggttc tttttgccct gtttaatatg 1200

atggattctc gtcaggctta taaaaaagct gtcaagtctg tagtccggga acgcgatgct 1260

gcactttata gacagcttgg tgttgaagtc cctgaagatc ttaacgctgt tgactattac 1320

accttggtag atctggaaag aacagcccgc atattatatg gtgacgattt tgccaactgg 1380

gtcatggtca ataaaaaccc gacagaatta ttatttcggg tagcagatga aaccggtgtc 1440

gttctgttgc caggttctgg ctttggggta tcccatccat cggcacgtgc ttcattagcc 1500

aatctgaatg cttaccaata tgctgcaatc ggtgattctc tacgacgctt tgccgaagat 1560

gcctatcagg aatatctggg aactaaaaaa gatgagtcct ga 1602

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gggaccgctt aatgctcgat gctggacgag gaaac 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtttcctcgt ccagcatcga gcattaagcg gtccc 35

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cggaaccgca gccatggaat atatatttaa ctcctt 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaggagttaa atatatattc catggctgcg gttccg 36

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccggaattca tggggaatgt agattattct aaat 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ccgctcgagt caggactcat cttttttagt tccc 34

Claims

1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因。

3.含权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的细胞。

5.一种基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

7.如权利要求5或6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述载体为pET28a。

9.一种制备L-天冬氨酸β-脱羧酶的方法，其特征在于，将表达权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-30℃诱导15-25h。

10.权利要求1所述的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体或权利要求5-8任一所述的基因工程菌在制备含有L-丙氨酸的产品中的应用。